Anticorpos reativos contra painel em episódios de disfunção do
enxerto no transplante renal
Panel reactive antibodies in episodes of kidney allograft dysfunction
Arnauld Kaufman
a, Luciane Faria de Souza Pontes
b, Maria Teresa Queiroz Marques
b, José
Cavaliere Sampaio
a, Luís Cristóvão de Moraes Sobrino Porto
be Edison Régio de
Moraes Souza
a aaa
aaServiço de Nefrologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Serviço de Nefrologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Serviço de Nefrologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Serviço de Nefrologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Serviço de Nefrologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Rio de Janeiro, RJ, Brasil. bbbbbLaboratório deLaboratório deLaboratório deLaboratório deLaboratório de
HLA da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Rio de Janeiro, RJ, Brasil HLA da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Rio de Janeiro, RJ, Brasil HLA da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Rio de Janeiro, RJ, Brasil HLA da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Rio de Janeiro, RJ, Brasil HLA da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Disfunção do enxerto. Anticorpos anti-HLA. ELISA. CDC. Transplante renal. Allograft dysfunction. Anti-HLA antibodies. ELISA. CDC. Kidney transplant.
Resumo
ObjetivoO objetivo deste trabalho foi avaliar a correlação entre episódios de disfunção do enxerto e a presença de anticorpos anti-HLA classe I em pacientes transplantados renais pelas metodologias de citotoxicidade dependente de complemento (CDC), CDC sensibilizado por antiglobulina humana (AGH) e ELISA.
Métodos
Foram estudados 30 pacientes consecutivos transplantados renais no Serviço de Nefrologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto da UERJ, no período de dezembro de 1998 a outubro de 1999. Dezenove pacientes deste grupo apresentaram 27 episódios de disfunção do enxerto, diagnosticados pela presença dos critérios clássicos (febre, dor no enxerto, oligúria, ganho de peso) e rápido aumento na creatinina sérica. O diagnóstico de rejeição aguda foi confirmado em quatro casos submetidos à biópsia renal, de acordo com a classificação de Banff. Foram avaliadas 322 amostras semanais de soro, pré e pós-transplante, por CDC e CDC com AGH e 298 delas por ELISA. A análise do tempo decorrido até o episódio de disfunção do enxerto, em função do percentual do PRA das amostras, foi realizada através do teste da Regressão de Cox e teste do Qui-quadrado.
Resultados
A detecção de anticorpos anti-HLA classe I, pelo método de CDC com AGH, apresentou correlação estatisticamente significativa com os episódios de disfunção do enxerto, com razão de risco acumulado =10,06 e p=0,006.
Conclusão
Os dados sugerem que a pesquisa de PRA pode ser um dos métodos utilizados para o monitorização de episódios de disfunção do enxerto.
Abstract
ObjectiveTo assess the correlation between allograft dysfunction episodes and presence of anti-HLA class I antibodies in serum samples from kidney transplanted patients using standard CDC, AHG-enhanced CDC and ELISA.
Methods
Thirty patients who underwent kidney transplantation at Pedro Ernesto University Hospital, between December 1998 and October 1999, were studied. There were 27 allograft dysfunction episodes in 19 patients. The allograft dysfunction episode was diagnosed based on classical criteria (fever, graft swelling and tenderness, oliguria, weight gain) and a rapid rise in serum creatinine levels. Acute rejection was confirmed in four cases by graft biopsy, graded using the Banff working classification. There were tested 322 pre- and post-transplant weekly serum samples using CDC and AHG-CDC, and 298 using ELISA. The analysis of the time elapsed until the allograft dysfunction episode and PRA results was performed using Cox proportional hazard regression model test and Chi-square test.
Results
The detection of anti-HLA class I antibodies using AHG-CDC presented a statistically significant correlation with allograft dysfunction episodes, with Hazard ratio =10.06 and p=0.006. Conclusion
The study suggests that PRA can be one method for kidney transplant follow-up monitoring.
I n t r o d u ç ã o
O desenvolvimento de episódios de disfunção do enxerto é um dos principais eventos preditivos da re-jeição e da sobrevida do enxerto. O diagnóstico e tra-tamento precoces da rejeição devem ser os principais objetivos para a melhoria da sobrevida do enxerto re-nal.1 Entre os fatores associados à disfunção do
enxer-to, merece destaque a formação de anticorpos anti-HLA pelo receptor.
A produção de anticorpos anti-HLA após o trans-plante já foi relacionada com uma maior incidência e gravidade dos episódios de rejeição aguda e com a menor sobrevida do enxerto, desde o final da dé-cada de 80.2 Embora até os dias atuais vários
auto-res descrevam uma forte correlação entre o aumento nos níveis de anticorpos anti-HLA classe I e
episódi-os de rejeição aguda,3 o valor da monitorização da
presença de anticorpos anti-HLA classe I após o trans-plante ainda é controverso. Para monitorar essa alo-imunização HLA é realizado um teste, no soro do receptor, conhecido como determinação de anticor-pos reativos contra painel (PRA). Pacientes com PRA elevado no período pré-transplante apresentam mai-or incidência de perda do enxerto.4 Várias
metodo-logias são empregadas para a realização do PRA tais como a linfocitotoxicidade dependente de comple-mento, com ou sem a adição de antiglobulina huma-na (AGH), e o ELISA.
O PRA utilizando o teste de linfocitotoxicidade dependente de complemento (PRA-CDC) foi introdu-zido em 1971, sendo realizado pela reação de uma amostra de soro do receptor com linfócitos de um pa-inel de indivíduos criteriosamente selecionados,
en-volvendo a ativação da cascata do complemento pelo complexo formado pela reação do anticorpo presente no soro com o antígeno correspondente na superfície dos linfócitos.5,6 A adição de AGH ao teste de
linfocito-toxicidade dependente de complemento (PRA-CDC), tem como objetivos a eliminação dos anticorpos de baixa afinidade, a amplificação da reação de citotoxi-cidade promovida por anticorpos fixadores de com-plemento presentes em baixo título e a detecção de anticorpos não-fixadores de complemento, aumentan-do a sensibilidade aumentan-do teste.7
A metodologia do PRA por ELISA (PRA-ELISA) uti-lizando moléculas de HLA solúveis foi introduzida em 1993, como um método alternativo para a realização do PRA.8 Vários autores, comparando o PRA-CDC com
o PRA-ELISA, determinaram uma maior correlação en-tre a ocorrência de episódios de rejeição pós-transplan-te e o PRA-ELISA.3,9,10
No presente estudo, comparamos os métodos con-vencionais de determinação de PRA por linfocitotoxici-dade (PRA-CDC) e por citotoxicilinfocitotoxici-dade sensibilizada por antiglobulina humana (PRA-AGH), com o método imu-noenzimático mais recentemente descrito, PRA-ELISA.11
M é t o d o s
Pacientes
Foram estudados 30 receptores de rim, consecuti-vamente transplantados no Serviço de Nefrologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, no perío-do de dezembro de 1998 a outubro de 1999. Doze doadores eram cadáveres e 18 estavam vivos. Dentre os vivos, cinco eram HLA idênticos, nove haplo-idên-ticos e quatro não relacionados. Dezessete recepto-res eram homens (57%) e 13 eram mulherecepto-res (43%). Quinze receptores eram brancos, dez mestiços e cin-co negros. A média de idade era de 32 anos (de nove a 58 anos). Vinte e cinco pacientes receberam trans-fusão sangüínea e seis mulheres engravidaram antes do transplante. Todos os receptores foram transplan-tados após o resultado negativo da prova cruzada, realizada de acordo com os protocolos preconizados pela Associação Brasileira de Histocompatibilidade (ABH) e Sociedade Americana de Histocompatibili-dade e Imunogenética (ASHI).12-14
Todos os receptores receberam azatioprina e pred-nisona após o transplante e, naqueles não idênticos,
foi incluída a ciclosporina. Apenas quatro receptores de rim de cadáver receberam anticorpo monoclonal anti-CD3 (OKT3 Orthoclone Jansen-Cilag Inc.) como terapia de indução.
As avaliações clínica e laboratorial foram monito-rizadas por um período de três meses. Foram testadas uma amostra de soro pré-transplante e 10 amostras semanais pós-transplante (primeira à oitava, décima e décima segunda semanas) de cada receptor, com exce-ção de um deles, que perdeu o enxerto no 6º dia pós-transplante, por rejeição aguda com explosão da cáp-sula renal.
O diagnóstico de disfunção do enxerto foi basea-do nos critérios clássicos (febre, basea-dor no enxerto, oli-gúria, ganho de peso) e rápido aumento da creatinina sérica, com níveis séricos normais ou diminuídos de ciclosporina e aparência normal do enxerto ao ultra-som, sendo que quatro episódios de disfunção do en-xerto submetidos à biópsia renal foram diagnostica-dos como rejeição aguda, classificada de acordo com os critérios de Banff.15 Os episódios de disfunção do
enxerto foram tratados com bolus de 3 g de metilpred-nisolona venosa. Apenas um paciente apresentou epi-sódio de disfunção resistente ao esteróide, sendo tra-tado com OKT3.
Linfocitotoxicidade
Foram testadas 322 amostras de soro para a detec-ção de anticorpos linfocitotóxicos usando as técnicas PRA-CDC e PRA-AGH.5,13,16 O painel foi constituído por
46 a 49 doadores fenotipados para HLA classe I, parea-dos com os doadores parea-dos pacientes estudaparea-dos quanto à raça, e cujas freqüências antigênicas eram representa-tivas da população brasileira. O teste foi considerado positivo quando a amostra de soro reagia com 10% ou mais do painel testado, com reação 4+ ou mais para o PRA-CDC e 6+ ou mais para o PRA-AGH.
ELISA. Foram testadas 298 amostras de soro utili-zando o kit LAT-M (One Lambda Inc., Canoga Park, CA),17 constituído por placas com 96 poços cobertos
com antígenos HLA purificados e solubilizados, que detectam anticorpos da classe IgG anti-HLA classe I e II. Estes antígenos são obtidos de culturas de células humanas modificadas pelo vírus Epstein-Barr.
Após a incubação das placas com o soro do paci-ente, os anticorpos ligados são detectados através de um anticorpo anti-IgG humana conjugado à fosfatase alcalina. As reações positivas são reveladas através da adição de um substrato colorimétrico e a sua
ab-sorbância lida em um espectrofotômetro para placas de ELISA em comprimento de onda de 630 nm.
A identificação das reações positivas é feita atra-vés da comparação com os controles positivos. O va-lor de corte (cut-off) foi determinado usando a média entre o soro controle positivo anti-HLA e os controles dos diluentes (blanks). O teste foi considerado positi-vo quando a amostra de soro apresentava intensidade de reação acima de 4+, segundo parâmetros forneci-dos pelo próprio aparelho.
Análise estatística
A correlação entre os resultados dos testes PRA e os episódios de disfunção do enxerto foi analisada utili-zando o teste da regressão de Cox, o método kappa de concordância entre os testes e o teste do Qui-quadrado.
R e s u l t a d o s
Houve 27 episódios de disfunção do enxerto em 19 pacientes. Doze pacientes apresentaram um episódio de disfunção do enxerto, enquanto seis apresentaram dois episódios e apenas um receptor apresentou três episódios. Oito episódios de disfunção do enxerto ocor-reram na primeira semana pós-transplante, seis na se-gunda, quatro na terceira, dois na quarta, dois na quin-ta, dois na sexquin-ta, um na sétima, um na oitava e um na décima segunda semana. Quase todos os episódios de disfunção do enxerto apresentaram recuperação após o tratamento da disfunção, exceto em um receptor que apresentou explosão da cápsula do enxerto.
As correlações entre CDC, AGH e PRA-ELISA e disfunção do enxerto foram analisadas. O grau de concordância (κ) foi de 0,63 entre AGH e PRA-ELISA, 0,60 entre PRA-AGH e PRA-CDC, e 0,42 entre PRA-CDC e PRA-ELISA.
A análise do tempo até o episódio de disfunção do enxerto, em função dos resultados dos testes PRA para as amostras, foi realizada através do modelo da
re-gressão de Cox. Os resultados para cada metodologia são apresentados na Tabela 1.
A detecção de anticorpos anti-HLA classe I pelo método PRA-AGH apresentou correlação estatistica-mente significativa com os episódios de disfunção do enxerto, com razão de risco acumulado (Hazard ratio) de 10,06 e p=0,006. Esses resultados sugerem que os níveis crescentes de anticorpos detectados através da metodologia PRA por CDC com AGH indicam maior probabilidade de disfunção do enxerto.
Ao analizarmos os resultados das amostras colhi-das, dividimos em seis grupos de acordo com a sema-na do evento disfunção em [D] = semasema-na da disfun-ção, [D-1], [D-2] =1 ou 2 semanas pré-disfunção e [D+1], [D+2] =1 ou 2 semanas pós-disfunção. O grupo [ND] englobou todas as demais semanas do estudo e as amostras dos pacientes que não apresentaram episó-dios de disfunção.
Ao estudarmos as amostras [D] para o grupo total de pacientes (n=30), não observamos uma correlação estatisticamente significativa entre os resultados de PRA positivos em comparação com as outras amostras de
Tabela 3
Correlação entre o evento disfunção e o PRA das amostras [D] Amostras CDC CDC + AGH ELISA
+ - + - + -D 6 21 3 24 4 22 Outras 66 229 34 261 36 236 χ² ≅0 ≅0 0,09 P 0,986 0,949 0,759 Sensibilidade 0,22 0,11 0,15 Especificidade 0,78 0,89 0,87 VPP 0,08 0,08 0,10 VPN 0,95 0,92 0,92 Acurácia 0,73 0,82 0,81
Amostras CDC CDC + AGH ELISA
+ - + - + -D-2 2 9 2 9 2 9 Outras 70 241 35 276 38 249 χ² 0,11 0,5 0,22 P 0,735 0,48 0,638 Sensibilidade 0,18 0,18 0,18 Especificidade 0,77 0,89 0,87 VPP 0,03 0,05 0,05 VPN 0,96 0,97 0,97 Acurácia 0,76 0,86 0,84 Tabela 2
Correlação entre o evento disfunção e o PRA das amostras [D-2]
Tabela 1
Análise da regressão de Cox. Regressão do modelo da taxa de falha proporcional de Cox. (p=0,4423)
Co-variável Beta Razão de risco acumulado p (Hazard Ratio)
PRA-CDC -1,85676 0,15618 0,031329 PRA-AGH 2,30809 10,05516 0,006022 PRA-ELISA -0,01232 0,98775 0,985477
soro, para as metodologias de PRA por CDC, PRA por CDC com AGH ou PRA por ELISA, utilizando-se o teste do Qui-quadrado com intervalo de confiança maior que 95%. Resultados semelhantes foram observados na primeira e na segunda semana pós-rejeição e duas se-manas pré-rejeição. Esses resultados encontram-se demonstrados nas Tabelas de 2 a 5.
Ao estudarmos os resultados do PRA na semana [D-1], excluímos 14 amostras de soro daqueles pacien-tes que apresentaram tal evento na primeira semana pós-transplante, já que, para esses, as amostras [D-1] correspondiam às amostras obtidas pré-transplante, quando esses receptores ainda não haviam sido ex-postos à estimulação imunológica do enxerto renal. A análise das outras 13 amostras pela metodologia PRA por CDC com AGH, demonstrou uma correlação esta-tisticamente significativa com os episódios de disfun-ção (χ2 =4,94 e p=0,026), embora com sensibilidade
de 31%, especificidade de 89%, valor preditivo positi-vo 0,11 e valor preditipositi-vo negatipositi-vo 0,97, com acurácia 87%. Esses achados não foram confirmados através das metodologias do PRA por CDC ou PRA por ELISA para a semana [D-1] e para as três metodologias nas demais amostras, conforme apresentado na Tabela 6.
D i s c u s s ã o
A avaliação do grau de sensibilização dos recepto-res de enxertos aos aloantígenos do sistema HLA é realizada através da pesquisa de anticorpos reativos contra painel (PRA).
A determinação da presença de anticorpos circu-lantes no período pós-transplante não é usada na roti-na laboratorial pós-transplante, embora possa ser
cli-nicamente útil na medida em que determine a presen-ça e a alteração no padrão de anticorpos anti-HLA do paciente, pré e pós-transplante, já que os mesmos po-derão estar envolvidos no mecanismo de disfunção do enxerto e rejeição aguda e na redução da sobrevida do enxerto.3,18,19 Tais fatos introduzem um novo
con-ceito para o monitorização do transplante, sendo o teste de PRA para fins de monitorização pós-transplante, realizado experimentalmente por vários centros, atra-vés da utilização de diferentes metodologias.18
Diferentes experiências foram relatadas por vários autores, onde a correlação entre os resultados do PRA-CDC e a evolução clínica não foi observada.5,20
McKen-na et al18 sugeriram que a presença de anticorpos
anti-HLA não necessariamente causa a rejeição imediata e vários pacientes podem ter enxertos funcionantes a despeito da presença destes. Por outro lado, a presen-ça de anticorpos anti-HLA, que não são doador-espe-cíficos, também pode estar associada com rejeição, sig-nificando inadequada imunossupressão.
Herzenberg et al22 correlacionaram a presença de
depósitos peritubulares de C4d na biópsia do enxerto
Tabela 6
Correlação entre o evento disfunção e o PRA das amostras [D-1] Amostras CDC CDC + AGH ELISA
+ - + - + -D-1 4 9 4 9 3 10 Outras 68 241 33 276 37 248 χ² 0,55 4,94 1,09 P 0,458 0,026 0,297 Sensibilidade 0,31 0,31 0,23 Especificidade 0,78 0,89 0,96 VPP 0,05 0,11 0,08 VPN 0,96 0,97 0,96 Acurácia 0,76 0,87 0,84 Tabela 5
Correlação entre o evento disfunção e o PRA das amostras [D+2] Amostras CDC CDC + AGH ELISA
+ - + - + -D+2 4 14 2 16 3 13 Outras 68 236 35 269 37 245 χ² ≅0 ≅0 0,41 P 0,989 0,959 0,521 Sensibilidade 0,22 0,11 0,19 Especificidade 0,78 0,89 0,87 VPP 0,06 0,05 0,08 VPN 0,94 0,94 0,95 Acurácia 0,75 0,84 0,83 Tabela 4
Correlação entre o evento disfunção e o PRA das amostras [D+1] Amostras CDC CDC + AGH ELISA
+ - + - + -D+1 4 15 1 18 3 15 Outras 68 235 36 267 37 243 χ² 0,02 0,77 0,17 P 0,888 0,381 0,678 Sensibilidade 0,21 0,05 0,17 Especificidade 0,78 0,88 0,87 VPP 0,06 0,03 0,08 VPN 0,94 0,94 0,94 Acurácia 0,74 0,83 0,83
com a sua sobrevida, estando correlacionado com epi-sódio de rejeição e perda do enxerto.
Estudos comparando a metodologia do PRA-ELISA com o PRA-CDC ou PRA-AGH determinaram que a mesma é mais específica e sensível para a determina-ção de anticorpos anti-HLA no soro de receptores de transplante. Isso se deve à reação de anticorpos anti-HLA contra moléculas anti-HLA purificadas adsorvidas nas placas de ELISA.8,21 A correlação entre a presença de
tais anticorpos nas amostras de soro pós-transplante avaliada por essa metodologia e a perda do enxerto por episódio de rejeição aguda tem sido relatada por vários autores.2,9,23,24
Nanni Costa et al9 determinaram uma correlação
altamente significativa entre anticorpos anti-HLA da classe IgG e os episódios de rejeição, confirmando a ação destes anticorpos nos episódios de rejeição vas-cular e na rejeição crônica. Não foi encontrada a pre-sença de anticorpos anti-HLA nos casos de rejeição córtico-sensível, ocorrendo a sua presença em episó-dios de rejeição córtico-resistente e rejeição crônica, com significância estatística. A utilização do teste PRA-ELISA foi mais rápida no screening de amostras séri-cas contra painel, indicando o melhor tratamento e possível prognóstico para os episódios de rejeição.9
Os autores determinaram ainda que o PRA-CDC é in-capaz de identificar anticorpos não fixadores de com-plemento implicados na rejeição.9
Suberbielle-Bois-sel et al24 determinaram uma maior sensibilidade na
detecção de anticorpos específicos contra antígenos semelhantes aos do doador em comparação com o PRA-CDC, não sofrendo influência de OKT3, ATG ou anticorpos não-HLA.
Nas amostras de soro por nós estudadas não foi encontrada correlação estatisticamente significativa entre os resultados obtidos no teste PRA-ELISA com os kits utilizados e os episódios de disfunção do enxerto. Christiaans et al25 concluíram, em um estudo
re-cente, que o ELISA e o CDC são técnicas complemen-tares para pesquisa de anticorpos anti-HLA, visto que a concordância entre o PRA-CDC e o PRA-ELISA foi baixa, sendo desaconselhável a substituição de um método pelo outro.
Observamos em nosso estudo uma diferença de sensibilidade entre os três métodos utilizados, indica-da pelos diferentes graus de concordância (κ) entre os testes, a qual pode ser explicada pela presença de au-toanticorpos ou anticorpos não-HLA específicos detec-tados pelos testes de PRA-CDC e PRA-AGH.
Observamos uma correlação estatisticamente sig-nificativa para o episódio de disfunção do enxerto com o PRA-AGH. A metodologia de sensibilização da rea-ção de linfocitotoxicidade pela AGH é muito utilizada nas provas cruzadas pré-transplante renal por diver-sos laboratórios de histocompatibilidade. A mesma, considerando o PRA pós-transplante para as amostras ora estudadas, apresentou uma correlação estatistica-mente significativa para episódios de disfunção do enxerto que poderão ocorrer na semana seguinte à detecção dos anticorpos, embora com baixo grau de sensibilidade (31%) e valor preditivo positivo (11%), sugerindo que a monitorização pós-transplante por PRA-AGH pode ser um dos métodos complementares para o diagnóstico de disfunção do enxerto e o acom-panhamento da evolução do transplante renal.
A g r a d e c i m e n t o s
Os autores agradecem ao Prof. Dr. Haroldo Mat-tos, do Laboratório de Informática Médica da UERJ, pelo tratamento estatístico dos resultados, a Mariana Oliveira, Fabiane Cosendey, Carla Corrêa, Mônica Falci, Maria Eny Queiroz e Aline Benjamin, pelo suporte téc-nico, e Dra. Ana Cristina Kaufman, por comentários e sugestões.
R e f e r ê n c i a s
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Aceito em 1/11/2002. Aprovado em 24/5/2003.
Fonte de financiamento e conflito de interesses inexistentes.
Endereço para correspondência: Endereço para correspondência:Endereço para correspondência: Endereço para correspondência:Endereço para correspondência: Luciane Faria de Souza Pontes Luciane Faria de Souza Pontes Luciane Faria de Souza Pontes Luciane Faria de Souza Pontes Luciane Faria de Souza Pontes Laboratório de HLA - UERJ Laboratório de HLA - UERJLaboratório de HLA - UERJ Laboratório de HLA - UERJLaboratório de HLA - UERJ Av
AvAv
AvAv. Marechal R. Marechal R. Marechal R. Marechal R. Marechal Rondon, 381 Térreo - Pondon, 381 Térreo - Pondon, 381 Térreo - Policlínica Pondon, 381 Térreo - Pondon, 381 Térreo - Policlínica Policlínica Policlínica Policlínica Piquet Carneiroiquet Carneiroiquet Carneiroiquet Carneiroiquet Carneiro 20950-000 Rio de Janeiro, RJ, Brasil 20950-000 Rio de Janeiro, RJ, Brasil 20950-000 Rio de Janeiro, RJ, Brasil 20950-000 Rio de Janeiro, RJ, Brasil 20950-000 Rio de Janeiro, RJ, Brasil E-mail: lupontes@msn.com E-mail: lupontes@msn.comE-mail: lupontes@msn.com E-mail: lupontes@msn.com E-mail: lupontes@msn.com 3. Monteiro F, Mineiro C, Rodrigues H, de Paula FJ, Kalil J.
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