846 Rev. 3 A93A01022M PT
A11A01702
1 x 23 ml 1 x 23 ml 1 x 110 ml 2 x 21 ml 1 x 25 mlHORIBA ABX SAS
BP 7290
34184 Montpellier- cedex 4 - France
Reagente para a determinação quantitativa in-vitro da
Hemoglobina A1c (HbA1c).
Interesse clínico (1-7)
O valor HbA1c é obtido pela fixação não-enzimática do fragmento N-terminal da cadeia β da hemoglobina A0. Os níveis de HbA1c, que são proporcionais aos níveis de glicose no sangue, reflectem a concentração diária média de glicose durante os dois meses que antecedem a amostra de sangue. Estudos recentes mostram que a medição regular de HbA1c pode levar a alterações no tratamento da diabetes e ao aumento do controlo metabólico, indicado por uma redução nos valores de HbA1c.
O presente método de diagnóstico in-vitro é, assim, utilizado para a determinação quantitativa da hemoglobina A1c (HbA1c), um marcador de diabetes, no sangue humano. As medições obtidas com este procedimento podem ser utilizadas para o controlo da diabetes a longo prazo.
Método
HbA1c é expresso como uma percentagem do conteúdo total de hemoglobina. De forma a que se determine as concentrações de THb por espectrofotometria, as diferentes formas de hemoglobina têm de ser convertidas em uma única forma, com um espectro de absorvância uniforme.
Os valores de HbA1c e hemoglobina total (THb) em μmol, obtidos com o teste, são utilizados para calcular a relação HbA1c/THb e não deverão ser utilizados individualmente para efeitos de diagnóstico. Princípio (8):
As concentrações de hemoglobina total e o HbA1c são medidos, e a relação é expressa como uma percentagem de HbA1c. De modo a determinar o HbA1c como uma percentagem, são utilizados cinco reagentes: Antibody Reagent (R1) diluído com Diluent I (R5), Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3) e Total Hemoglobin Reagent (R4).
A amostra de sangue total é misturada com o Hemolysis Reagent (R3) pelo analisador: Os glóbulos vermelhos são lisados e a cadeia da hemoglobina é hidrolisada, pela acção de uma protease presente no reagente.
O Total Hemoglobin Reagent (R4) é utilizado para deteminar a hemoglobina total. O método baseia-se na conversão de todas as formas de hemoglobina em hematina alcalina, numa solução alcalina de detergente não iónico, consoante a descrição no procedimento original, de Wolf et al. A reacção é activada pela adição de uma amostra de sangue previamente processada com Total Hemoglobin Reagent (R4), resultando na coloração verde da solução.
A conversão dos diferentes tipos de hemoglobina em hematina alcalina com um espectro de absorvância definido permite calcular a concentração total de hemoglobina. A hemoglobina é medida através do método do ponto final, a 550 nm.
Os níveis de hemoglobina são directamente proporcionais ao aumento no OD observado.
O teste de inibição da aglutinação de partículas de latex é utilizado para medir o HbA1c específico. Uma aglutinina (polímero sintético contendo várias cópias da porção imunorreactiva de HbA1c) causa a aglutinação das partículas de latex cobertas com anticorpos monoclonais de ratinhos, específicos para HbA1c.
Na ausência de HbA1c na amostra, a aglutinina no Agglutinator Reagent (R2) e as micropartículas cobertas com aglutinado do Antibody Reagent (R1).
A aglutinação leva ao aumento na absorvância da suspensão. A presença de HbA1c na amostra reduz a taxa de aglutinação, uma vez que o HbA1c entra em competição com o Agglutinator Reagent (R2) nos pontos de docking dos anticorpos das micropartículas.
Quanto maior a quantidade de HbA1c na amostra, menor a taxa de aglutinação. A reacção é medida pela absorvância a 550 nm, e a taxa de aglutinação é utilizada para calcular a concentração a partir de uma curva de calibração.
A percentagem de HbA1c é, então, calculada, utilizando-se os valores de HbA1c e hemoglobina total, em µmol.
Reagentes
O ABX Pentra HbA1c WB é um kit de vários reagentes. Conteúdo do kit:
Antibody Reagent (R1)
contém: partículas acopladas com anticorpos HbA1c (ratinho); albumina de soro bovino; solução tampão; surfactantes; conservantes. Agglutinator Reagent (R2)
contém: hapteno de ligação covalente de polímeros; albumina de soro bovino; solução tampão; conservante; surfactantes.
Hemolysis Reagent (R3)
contém: pepsina de suíno; solução tampão; conservante.
Este reagente também é vendido em separado, sob a referência A11A01730.
Total Hemoglobin Reagent (R4) contém: hidróxido de sódio; surfactante. Diluent I (R5)
Contém: Conservante; NaCl.
O ABX Pentra HbA1c WB deve ser utilizado de acordo com esta nota de reagente. O fabricante não se responsabiliza pelo seu desempenho caso seja utilizado de outro modo.
Preparaçãoa
1. Misture 1 volume de Antibody Reagent (R1) com 1 volume de Diluent I (R5) num frasco MBU de 100 ml, Ref. A11A01759. 2. Misture cuidadosamente o Agglutinator Reagent (R2) virando-o
ao contrário, e entorne-o num frasco de reagente.
3. Misture cuidadosamente o Hemolysis Reagent (R3) virando-o ao contrário, e entorne-o num frasco de reagente.
4. Misture cuidadosamente o Total Hemoglobin Reagent (R4) virando-o ao contrário, e entorne-o num frasco de reagente. 5. Antes de os utilizar, aguarde até que os reagentes se estabilizem
no compartimento de refrigeração do ABX Pentra 400 durante uma hora.
Veja o diagrama que se segue (os sectores A, B e C são tomados como exemplo):
Utilize apenas a quantidade necessária, e depois de os utilizar, coloque imediatamente os reagentes num ambiente frio, num frasco fechado. As amostras de sangue total, o calibrador e o controlo não necessitam de qualquer processamento prévio.
A utilização de uma pipeta de deslocamento positivo é recomendada, para a recolha do sangue total.
Nota:
• É possível testar simultaneamente até 4 amostras. Se for necessário testar mais do que 4 amostras, espere até que o instrumento mude para o estado “A analisar”, antes de colocar as próximas amostras, após a homogenização.
• Os ensaios têm de ser solicitados apenas utilizando a relação. Nunca solicite os ensaios HbA1c e THb em separado. A fórmula da relação tem de ser criada a partir da relação do NGSP (ver o Manual do Utilizador do ABX Pentra 400).
Calibrador Para calibrar, utilize:
O ABX Pentra HbA1c WB Cal, Ref. A11A01703 (não incluído) 1 x 8 ml + 5 x 2 ml
A hemoglobina total é calibrada com o ABX Pentra HbA1c WB Cal (CAL 1), utilizando um valor alvo de hemoglobina total.
Os calibradores e reagentes não dependem do lote, e são submetidos a um controlo de qualidade interno na HORIBA Medical.
A calibração do método HbA1c é levada a cabo utilizando o ABX Pentra HbA1c WB Cal, que contém seis níveis de calibrador de HbA1c. Esses procedimentos de calibração são compatíveis com o certificado NGSP/DCCT.
Posição dos calibradores na prateleira de amostras correspondente:
1. CAL 1 (200 µl) para THb 2. CAL 1 (200 µl) para HbA1c 3. CAL 2 (150 µl)
4. CAL 3 (150 µl) 5. CAL 4 (150 µl) 6. CAL 5 (150 µl) 7. CAL 6 (150 µl)
Nota: o CAL 1 na posição 1 é tomado como exemplo, e também também pode ser colocado na posição 8, 9 ou 10.
Reagente 1: Antibody Reagent 1 x 23 ml
Reagente 2: Agglutinator Reagent 1 x 23 ml
Reagente 3: Hemolysis Reagent 1 x 110 ml
Reagente 4: Total Hemoglobin Reagent 2 x 21 ml
Reagente 5: Diluent I 1 x 25 ml
a.Modificação do índice L para M: modificação da preparação.
Total Hemoglobin Reagent Reagente 4 Antibody Reagent Reagente 1 (diluído) Agglutinator Reagent Reagente 2 Hemolysis Reagent Reagente
Controlo
Para controlo de qualidade interno, utilize:
O ABX Pentra HbA1C WB Control, Ref. A11A01704 (não incluído) Controlo normal: 2 x 0.25 ml (liofilizado)
Controlo patológico: 2 x 0.25 ml (liofilizado)
Cada controlo deve ser analisado diariamente e/ou após cada calibração.
A frequência dos controlos e os intervalos de confiança devem estar de acordo com as normas laboratoriais e com as directivas específicas de cada país. Os resultados devem ficar dentro do intervalo dos limites de confiança definidos. Cada laboratório deve estabelecer o procedimento a seguir se os resultados excederem esses limites de confiança.
Materiais necessários mas não fornecidos
• Analisador automático de química clínica: ABX Pentra 400 • Calibrador: ABX Pentra HbA1c WB Cal, Ref. A11A01703 • Controlo: ABX Pentra HbA1c WB Control, Ref. A11A01704 • ABX Pentra HbA1c WB Hemolysis Reagent, Ref. A11A01730 • Frasco MBU de 100 ml, Ref. A11A01759
• Equipamento standard de laboratório Amostraa(9)
• Sangue total em EDTA. Estabilidade(10):
As amostras congeladas devem ser descongeladas à temperatura ambiente e, de seguida, devem ser cuidadosamente misturadas, antes de serem utilizadas.
Misture cuidadosamente as amostras de sangue, imediatamente antes de proceder ao teste, de forma a poder garantir a precisão dos resultados de THb.
Intervalo de referência (4,11,13,14,15,16)
Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios intervalos de referência. Os valores aqui fornecidos são utilizados apenas como linhas de orientação.
Cada laboratório deverá certificar-se de que os seus valores standard são compatíveis com os valores de referência do NGSP.
Esta técnica obteve o certificado NGSP, com 4 a 6 % de HbA1c como valor standard em não diabéticos, com o objectivo terapêutico de obter valores < 7 %, consoante recomendação da ADA (American Diabetes Association).
Todos os resultados deverão ser interpretados à luz das análises clínicas gerais dos pacientes.
Limites do método (11):
A maioria dos pacientes possui níveis de hemoglobina entre 4.4 mmol/l e 14.4 mmol/l.
No entanto, as publicações especializadas demonstram que os níveis de hemoglobina dos pacientes com anemia grave podem ser inferiores a 4.4 mmol/l, e que os níveis de hemoglobina dos pacientes com policitemia podem exceder 14.4 mmol/l. Quando forem conhecidos pacientes que tenham estes sintomas, estes deverão ser testados utilizando-se outro método, se os seus valores de hemoglobina estiverem fora do intervalo de medição.
Qualquer condição que afecte o ciclo de vida dos glóbulos vermelhos (tal como uma anemia hemolítica ou outras doenças hemolíticas, gravidez ou uma perda de sangue significativa...) causa uma redução na exposição dessas células à glicose e, consequentemente, uma redução nos níveis de hemoglobina glicada (GHb).
Os resultados de Ghb % não são fiáveis nos pacientes que sofrem de perda de sangue crónica e, consequentemente, ciclos de vida variáveis dos eritrócitos.
As amostras contendo hemoglobina C e S podem causar um aumento do valor esperado de HbA1c. Para além disso, as amostras contendo altos níveis de hemoglobina F (> 15 %) poderão gerar resultados de HbA1c menores do que os esperados.
Não existe interferência com a hemoglobina carbamilada e acetilada. Este teste não é fiável para o diagnóstico de diabetes mellitus (14,16). Este teste não é útil para avaliar o controlo diário de glicose, e não deverá ser utilizado para subsituir os testes diários caseiros de glicose sanguínea(14).
Armazenamento e Estabilidade
Proteger contra temperaturas extremamente quentes ou frias e manter ao abrigo da luz.
Período de validade dos reagentes (selados e depois de abertos): Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada no rótulo, se forem armazenados entre 2 e 8 °C nas embalagens originais e forem protegidos contra contaminação.
Estabilidade da solução de latex reconstituída: consulte o parágrafo "Desempenho do ABX Pentra 400".
Procedimento do ensaio
Encontram-se disponíveis, a pedido, instruções de teste para outros sistemas automáticos diferentes do ABX Pentra 400.
Gestão de resíduos
É favor consultar os requisitos da legislação local.
a. Modificação do índice L para M: alteração da estabilidade da amostra. 3 dias a 20 - 25 °C
8 dias a 2 - 8 °C 60 dias a -20 °C
Precauções gerais
1. Este reagente destina-se apenas a diagnóstico in-vitro profissional. 2. Antibody Reagent (R1) : Na preparação deste produto foram utilizados componentes derivados humanos. Cada unidade de dador foi testada individualmente por métodos aprovados pela FDA, tendo sido considerada negativa para o antigénio de superfície da sepatite B (HBsAg), para os anticorpos do vírus da imnunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2) e para o vírus da hepatite C (HCV).
Cuidado. No entanto, uma vez que nenhum método de análise pode excluir completamente o risco potencial de infecção, o material deve ser tratado com o mesmo cuidado que uma amostra de paciente: como sendo potencialmente infeccioso, devendo ser manuseado com a devida precaução. Em caso de exposição, siga as directrizes das autoridades de saúde competentes.
Irritante.
S24: Evitar o contacto com a pele. S37: Usar luvas adequadas.
R43: O contacto com a pele poderá causar sensibilidade. 3. Agglutinator Reagent (R2): Irritante.
S24: Evitar o contacto com a pele. S37: Usar luvas adequadas.
R43: O contacto com a pele poderá causar sensibilidade.
4. Antibody Reagent (R1), Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3) e Total Hemoglobin Reagent (R4): Evitar o contacto com os olhos, pele e vestuário. Lavar as mãos cuidadosamente com água, depois de manusear o produto. Não ingerir.
5. Diluent I (R5): Irritante.
R36/38: Irritante para os olhos e pele.
R43: O contacto com a pele poderá causar sensibilidade. 6. Os frascos de reagente devem ser eliminados após a utilização. 7. Consulte a MSDS (folha de dados de segurança do material)
relacionada com o reagente. Desempenho do ABX Pentra 400a
O dados de desempenho enumerados em seguida foram determinados no analisador ABX Pentra 400.
Número de testes: 381 testes
Período de validade da solução de latex reconstituída:
O período de validade da solução de latex reconstituída é de 60 dias, se for armazenada a 2 - 8 °C depois da reconstituição. Utilize apenas a quantidade necessária, e depois de os utilizar, coloque imediatamente os reagentes num ambiente frio.
Volume da amostra (após o processamento): Hb: 25 µl/teste
HbA1c: 3 µl/teste
Limite de detecção:
O limite de detecção da hemoglobina total é determinado de acordo com o protocolo CLSI (NCCLS), EP17-A (17) e é igual a 1.60 µmol/l (0.42 g/dl).
Limite mínimo de interpretação:
O limite mínimo de interpretação (MIL) do HbA1c é avaliado através de várias determinações de amostras de baixa concentração, e equivale a 0.17 µmol/l (0.05 g/dl).
Exactidão e Precisão:
• Repetibilidade (precisão no mesmo ciclo)
3 amostras de concentrações baixa, média e alta e 2 controlos são testados 20 vezes de acordo com as recomendações especificadas no protocolo Valtec (18).
• Reprodutibilidade (precisão ciclo a ciclo)
3 amostras de nível baixo, médio e elevado e 2 controlos foram testados em duplicado durante 20 dias (2 séries por dia) de acordo com as recomendações incluídas no protocolo CLSI (NCCLS), EP5-A2 (19).
Linearidade e Gama de Medição:
A linearidade do reagente é determinada de acordo com as recomendações incluídas no protocolo CLSI (NCCLS), EP6-A (20).
O intervalo do método de hemoglobina total no qual o valor %HbA1c é considerado preciso, encontra-se entre 17.5 e 85.0 µmol/l (4.61 e 22.41 g/dl).
O ensaio confirmou uma gama de medição de 4.46 a 16.04 para % HbA1c.
a.Modificação do índice L para M: alteração dos dados de desempenho.
Valor médio %HbA1c CV %
Amostra de controlo 1 5.09 0.63
Amostra de controlo 2 10.44 1.12
Amostra 1 5.25 0.68
Amostra 2 6.80 1.57
Amostra 3 10.94 1.24
Valor médio %HbA1c CV %
Amostra de controlo 1 4.94 1.67 Amostra de controlo 2 10.21 2.16 Amostra 1 4.90 2.13 Amostra 2 6.66 2.20 Amostra 3 9.53 2.17 Linearidade baixa: para Hemoglobina total: 1.60 µmol/l (0.42 g/dl))
para HbA1c: 0.17 µmol/l (0.05 g/dl))
Linearidade elevada:
para Hemoglobina
total: 85.00 µmol/l (22.41 g/dl))
As amostras não devem ser diluídas, caso a concentração de HbA1c seja superior ao ponto mais elevado de calibração de 10.80 µmol/l (2.85 g/dl).
No caso em que a concentração em HbA1c é superior ao ponto mais elevado de calibração, as amostras não devem ser diluídas. No entanto, é possível calcular o menor valor de %HbA1c da amostra com a concentração em THb, fornecendo o resultado como: “Superior a...xxx”. Exemplo: se a concentração de THb for 44.0 µmol/l (11.6 g/dl), o menor valor de %HbA1c para o método será:
- em µmol/l: (10.80)/44.00 x 100 = 20.00 %HbA1c (aplicar a estes resultados o factor de correcção NGSP = 15.9 %).
O resultado de %HbA1c para esta amostra é: “Superior a 15.9 %“. - em g/dl (2.85)/11.6 x 100 = 24.6 %HbA1c (aplicar a estes resultados o factor de correcção NGSP = 15.9 %).
O resultado de %HbA1c para esta amostra é: “Superior a 15.9 %“.
Correlação:
118 amostras de sangue total dos pacientes foram correlacionadas com um reagente já comercializado tomado como referência de acordo com as recomendações incluídas no protocolo CLSI (NCCLS), EP9-A (21). Valores no intervalo de 4.53 a 13.01 % de HbA1c.
A equação da linha alométrica obtida por meio do procedimento de regressão Passing-Bablock (22) é:
Y = 1.03 X - 0.19 (%HbA1c)
com um coeficiente de correlação r2= 0.9904. Interferências:
Outros limites são fornecidos por Young através de uma lista de medicamentos e variáveis pré-analíticas conhecidas que afectam esta metodologia (23, 24).
Estabilidade de calibração:
O reagente é calibrado no Dia 0. A estabilidade de calibração é verificada testando 2 amostras de controlo.
A estabilidade da calibração é de 30 dias.
Nota: Recomenda-se uma recalibração quando os lotes de reagente mudam, quando a suspensão de latex é alterada e quando os resultados do controlo de qualidade ficam fora do intervalo estabelecido.
Relação do NGSPa:
Y = (581400*(HbA1c/Hb) + 17442)/10000
Versão da aplicação para o ensaio de HbA1c (A1c-WB)b: 6.xx
Versão da aplicação para o ensaio de hemoglobina total (THb-WB)c: 7.xx
Aviso
É da responsabilidade do utilizador verificar se este documento se aplica ao reagente utilizado.
Bibliografia
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Triglicéridos: Não se observa influência significativa até 7 mmol/l (612.5 mg/dl), (como o Intralipid®, representativo da lipémia). Bilirrubina total: Não se observa influência significativa
até 561 µmol/l (32.8 mg/dl).
Bilirrubina directa: Não se observa influência significativa até 587 µmol/l (34.3 mg/dl).
Ácido ascórbico: Não se observa influência significativa até 3.40 mmol/l (59.8 mg/dl). Hemoglobina lábil: Não se observa interferência com a
hemoglobina lábil.
a.Modificação do índice L para M: nova relação do NGSP. b.Modificação do índice L para M: nova versão da aplicação. c.Modificação do índice L para M: nova versão da aplicação.
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