LUCIANA SANTOS SOUZA PAULI
PAPEL DO EXERCÍCIO FÍSICO NA REGULAÇÃO DA PROTEÍNA
ROCK EM HIPOTÁLAMO DE CAMUNDONGOS OBESOS:
EFEITOS SOBRE A SINALIZAÇÃO DA INSULINA E LEPTINA
LIMEIRA 2017
PAPEL DO EXERCÍCIO FÍSICO NA REGULAÇÃO DA PROTEÍNA ROCK EM HIPOTÁLAMO DE CAMUNDONGOS OBESOS: EFEITOS SOBRE A
SINALIZAÇÃO DA INSULINA E LEPTINA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Aplicadas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo, na área de concentração Metabolismo e Biologia Molecular.
Orientador: EDUARDO ROCHETE ROPELLE
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO DE DEFESA DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA LUCIANA
SANTOS SOUZA PAULI, E
ORIENTADA PELO PROF. DR. EDUARDO ROCHETE ROPELLE
LIMEIRA 2017
Presidente
Prof. Dr. Eduardo Rochete Ropelle (Faculdade de Ciências Aplicadas /Unicamp)
Membros
Prof. Dr. Leandro Pereira de Moura (Faculdade de Ciências Aplicadas/Unicamp)
Prof. Dr. Adelino Sanchez Ramos da Silva (Escola de Educação Física e Esporte de Ribeirão Preto/USP)
Profa. Dra. Angélica Rossi Sartori Cintra (Faculdade Anhanguera de Indaiatuba/Anhanguera)
Profa. Dra. Ellen Cristini de Freitas (Escola de Educação Física e Esporte de Ribeirão Preto/USP)
Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno
Macedo de Souza, que sempre me incentivaram e se dedicaram intensamente para a minha formação educacional e desenvolvimento pessoal. Esta tese é pra vocês, pai e mãe.
Início meus agradecimentos à Deus. Pois ele me concede a certeza de que somos humanos e por isso estamos sempre em evolução e aprendendo. Me permite ser misericordioso e perseverante, ter coragem e sabedoria pra melhor compreender as alegrias e as tristezas da vida.
Quero agradecer minha família, minha mãe, meu pai e irmão por fazerem parte da minha vida, por contribuírem no meu desenvolvimento pessoal e intelectual e sempre serem a fonte de apoio inesgotável.
Agradeço muito o auxílio do meu marido e de meu filho. Os amores da minha vida. Agradeço o carinho e a força nesta trajetória.
Meus sinceros agradecimentos ao meu orientador Eduardo Ropelle. Pelos ensinamentos, dedicação e paciência em todo o processo do doutorado.
De modo muito importante, também quero agradecer aos alunos do Laboratório de Biologia Molecular do Exercício (LABMEX). Ao laboratório de Fisiologia do Exercício e Metabolismo (LAFEM) da USP de Ribeirão Preto e ao Laboratório de Genômica Nutricional (LABGEN) da FCA. Agradeço também ao Laboratório da Profa. Eliete da Unesp de Rio Claro.
Quero agradecer aos professores do programa de pós-graduação em ciências da nutrição e do esporte e metabolismo da FCA pelas disciplinas ministradas e que muito contribuíram na minha formação acadêmica.
Agradeço aos professores que fizeram parte da qualificação e defesa de tese pela leitura, sugestões e críticas construtivas.
Novamente quero agradecer a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP pelo apoio financeiro (processo n° 2013/21061-8).
O objetivo deste estudo foi avaliar se o exercício físico agudo tem efeitos no conteúdo da proteína Rock1 em hipotálamo e relacionar esse fenômeno com a sensibilidade à insulina, leptina e regulação da ingestão alimentar de camundongos obesos. Para alcançar os objetivos foram utilizados camundongos Swiss distribuídos nos seguintes grupos: controle (CTL) animais que receberam uma dieta padrão; obesos induzido por dieta rica em gordura (Hiper-SD) animais que receberam uma dieta rica em gordura; e obeso exercitado agudamente (Hiper-EA) animais que receberam a dieta rica em gordura e foram submetidos a um protocolo de exercício agudo. Foram realizadas coletas de sangue para análise sanguínea de insulina e glicemia de jejum, a extração do hipotálamo e análise das proteínas de interesse através da técnica de Western Blot. Os dados foram analisados através de teste “t de Student”, quando comparados dois grupos. E análise de variância (Anova), seguida do teste de múltiplas médias de Bonferroni, quando apropriado para comparar os grupos controle e experimentais. A significância estatística adotada foi de p<0,05. Os resultados obtidos mostram que camundongos obesos apresentam alteração na via de sinalização da leptina e insulina no hipotálamo e isso é acompanhado por alterações no conteúdo da proteína Rock e aumento da ingestão alimentar. Ao contrário, os animais submetidos ao protocolo de exercício apresentaram aumento na sensibilidade a leptina e insulina e maior conteúdo proteico de Rock1 no hipotálamo se comparado a seus pares obesos não exercitados. Em adição, foram observados aumentos de fosforilação de JAK2 e Akt, da associação JAK2 com Rock1 e Rock1 com IRS-1 e também, aumento da fosforilação do IRS-1 em serina 632/635 no hipotálamo. A luz desses achados, é possível considerar, no mínimo em parte, que alteração nos níveis proteicos da proteína Rock1 no hipotálamo pode estar associado a condição de redução da sensibilidade à leptina e insulina e aumento da ingestão alimentar na obesidade. Por outro lado, o exercício físico foi capaz de agir positivamente sobre a via da Rock e aumentar a sensibilidade tanto da leptina quanto da insulina no hipotálamo e com isso atenuar a hiperfagia nos camundongos obesos. Tal descoberta amplia o conhecimento acerca dos efeitos do exercício físico sobre processo de controle da fome e abre portas para novas ações terapêuticas contra a obesidade e doenças associadas.
Palavras-chaves: Obesidade, insulina, leptina, exercício físico, hipotálamo, ingestão
The objective of this study was to evaluate the effects of acute physical exercise on the expression of protein Rock1 in hypothalamus and to relate this phenomenon with insulin and leptin sensitivity and food intake of obese mice. To achieve the objectives Swiss mice were used in the control groups (CTL), animals that received a standard diet; Obese-induced high-fat diet (Hyper-SD), animals that received a high- fat diet; And obese exercised acutely (Hyper-EA), animals that received a high-fat diet and were submitted an acute exercise protocol. Blood samples were collected for analysis of insulinemia and glycemia fasting. Subsequently, hypothalamus extraction and Western blot analysis of the proteins of interest were performed. The data were analyzed by Student's test, when two groups were compared. And analysis of variance (Anova), followed by Bonferroni's multiple means test, when appropriate for the controlled and experimental groups. The statistical significance was set at p <0.05. The results show that obese mice present a change in the signaling pathway of leptin and insulin in the hypothalamus and this resulted were accompanied by not increased in content of Rock protein and increased food intake. Contrary to the animals submitted to the acute exercise protocol showed increased sensitivity to leptin and insulin and higher protein content of Rock1 in the hypothalamus compared to their non-exercised obese mice. In addition, there was an increases in phosphorylation of JAK2 and AKT proteins, the association of JAK2 with Rock1 and IRS-1 with Rock1, and increased phosphorylation of IRS-1 in serine 632/635 in the hypothalamus. Considering these data, it is possible to consider, at least in part, that protein levels of the Rock protein can be associated with a condition of reduced sensitivity to leptin and insulin in hypothalamus and increased food intake in obesity. On the other hand, physical exercise was able to act positively on a rock pathway and increase a sensitivity of both leptin and insulin in hypothalamic neurons and attenuate hyperphagia in obese mice. This discovery broadens the knowledge about the effects of physical exercise on the process of food intake control and opens the door to new therapeutic actions against obesity and associated diseases.
Key words: Obesity, insulin, leptin, exercise, hypothalamus, food intake and protein
Figura 1. Via de transdução do sinal da insulina e leptina em neurônios
hipotalâmicos...20
Figura 2. Ativação de vias inflamatórias e de estresse de retículo endoplasmático e os
efeitos inibitórios sobre a via da insulina e
leptina...23
Figura 3. Mecanismo de ação pelo qual a Rock regula a sinalização e o metabolismo de
glicose mediado pela insulina no músculo esquelético e aumenta a captação de glicose...26
Figura 4. Esquema ilustrativo das etapas experimentais desenvolvidas no projeto de
pesquisa...31
Figura 5. Esquema ilustrativo do protocolo de exercício físico agudo...33
Figura 6. Esquema ilustrativo do protocolo de análise de ingestão alimentar...34
Figura 7. Ingestão alimentar em resposta ao estímulos com insulina ou leptina nos
diferentes grupos experimentais...40
Figura 8. Análise da via de sinalização da leptina e da Rock em hipotálamo nos diferentes
grupos experimentais...42
Figura 9. Via de sinalização da insulina e associação da Rock com o
IRS-1...45
Figura 10. Esquema ilustrativo da hipótese do efeito do exercício físico sobre o
metabolismo da Rock e a melhora na sinalização da insulina e leptina no hipotálamo...52
AgRP – Peptídeo relacionado ao gene Agouti
Akt - Protein quinase B ou proteína serina/treonina quinase APAF1 - Apoptotic peptidase activating factor 1
CART – Transcrito relacionado à cocaína e à anfetamina CRH - hormônio liberador de corticotrofina
eIF2α - eukaryotic translation initiation factor 2A FADD - Fas-Associated protein with Death Domain Foxo1 - Fator de transcrição da família forkhead BOX O IKK – Proteína Iκappa kinase
IL-1β – Interleucina-1β IL-6 – Interleucina-6 IL-10 – Interleucina-10 IR – Receptor de insulina
IRS-1 – Substrato do receptor de insulina 1 IRS-2 – Substrato do receptor de insulina 2 JAK2 – Proteína Janus kinase 2
JNK – Proteína c-jun N-terminal quinase
MAPK – Proteína quinase ativada por mitógenos
MyDD88 - Myeloid differentiation primary response gene 88 NFκB – fator nuclear kappa B
NPY – Neuropeptídeo Y
PERK – Proteína quinase tipo PKR residente no retículo endoplasmático PI3q – fosfatidilinositol 3-quinase
POMC - Pró-opiomelanocortina
PTP1B – Proteína tirosina fosfatase 1B
PDK – Proteína quinase dependente de fosfoinosítideos de membrana Rock – proteína Rho-Kinase
SOCS3 - Proteína supressora da sinalização de citocinas
STAT3 - Proteína que transmite o sinal da superfície celular ao núcleo ativando a transcrição nuclear
RESUMO...07
ABSTRACT...08
LISTA DE FIIGURAS...09
LISTA DE ABREVIATURAS...10
INTRODUÇÃO...13
Transmissão do sinal da insulina e leptina no hipotálamo...14
Obesidade e inflamação hipotalâmica...20
Papel da Rho-kinase (Rock) em mediar a sinalização da insulina e leptina...25
Efeito protetor do exercício físico sobre a sinalização da insulina e leptina...27
OBJETIVOS...30
Objetivos gerais...30
Objetivos específicos...30
MATERIAIS E MÉTODOS...31
Animais experimentais...31
Implante das cânulas...32
Protocolo de exercício físico e lactacidemia...33
Imunoblot...36
DISCUSÃO...47
CONCLUSÕES...53
1. INTRODUÇÃO
A obesidade é considerada um dos grandes fenômenos clínico-epidemiológicos da atualidade e fatores como sedentarismo (inatividade fisiológica) e hábitos alimentares inadequados (alimentos ricos em calorias e gordura saturada) desempenham papeis relevantes na gênese da doença. O acúmulo excessivo de gordura corporal é considerado um fator crucial para o desenvolvimento do risco cardiometabólico e está associado a doenças vasculares e do coração, doenças respiratórias (como exemplo, asma), dislipidemias, esteatose hepática não alcoólica, osteoartrite, síndrome dos ovários policísticos, alguns tipos de câncer, hipertensão e diabetes mellitus tipo 2 (1-6). Desse modo, a obesidade constitui uma das mais importantes questões de saúde pública e o desenvolvimento de diferentes abordagens terapêuticas para a doença é um ponto de grande importância na sociedade atual.
Neste cenário, o cérebro ocupa lugar de destaque no desenvolvimento de obesidade, tendo a insulina e a leptina papel relevante sobre o hipotálamo, um centro controlador da fome e da termogênese (7). Alterações na sinalização intracelular dessas biomoléculas no hipotálamo tem proeminente relação com o descontrole da fome e aumento da massa adiposa corporal (7, 8). Por outro lado, o exercício físico é um importante componente no controle do peso corpóreo em longo prazo. A prática regular do exercício tem impacto não somente no gasto energético diário, mas também, participa do processo de regulação da fome. De acordo com os estudos científicos relacionados a esta temática, o exercício físico é capaz de regular positivamente diversas proteínas envolvidas na transdução do sinal da insulina e leptina no sistema nervoso central (9, 10). Parte desses efeitos positivos do exercício estão relacionados a miocinas produzidas durante a contração muscular com efeitos anti-inflamatórios em neurônios hipotalâmicos (9-12). Esses achados dão suporte à hipótese de que o efeito supressor do exercício sobre a fome na obesidade possa ser mediado através do sistema nervoso central pelo hipotálamo, sendo essencial para a redução da adiposidade ou a manutenção em longo prazo do fenótipo magro.
Entretanto, embora seja crescente o número de evidências que suportam a participação do exercício físico na modulação do sistema nervoso central para o controle das respostas hiperfágicas decorrentes da obesidade, ainda não é totalmente compreendido os mecanismos moleculares envolvidos neste processo. A hipótese desse trabalho de pesquisa é de que o exercício físico além de efeitos anti-inflamatórios atrelados ao desfecho positivo sobre a via de transdução do sinal da insulina e leptina, também tenha ação em outras moléculas
intracelulares envolvidos com um aumento na fosforilação de proteínas integrantes destas vias. Com destaque ao papel da Rho-Kinase (Rock) que se estabelece como uma proteína com efeitos positivos tanto sobre a via da insulina quanto da leptina, aumentando o sinal e os efeitos biológicos destes dois hormônios a nível periférico e central do organismo (13).
Mediante um cenário caótico no qual ainda não há uma estratégica totalmente efetiva de combate a obesidade, a descoberta e o entendimento de novas rotas de sinalização intracelular, em especial, no centro regulador da fome (o hipotálamo), permitirá novas ações contra a obesidade. Porém, antes de partirmos para o objetivo deste trabalho, se faz necessário apresentar o conteúdo teórico relacionado ao tema de pesquisa aqui abordado, para que seja possível, compreender os principais mecanismos envolvidos no processo de controle da fome e termogênese e as adaptações decorrentes da obesidade e do exercício nesse complexo sistema.
1.1. TRANSMISSÃO DO SINAL DE INSULINA E LEPTINA NO HIPOTÁLAMO
Na década de 40 e 50, estudos realizados em animais com estimulação elétrica permitiu a compreensão de que o cérebro e especificamente o hipotálamo consistia no centro regulador da fome. Após estímulos em áreas específicas do hipotálamo (hipotálamo lateral e núcleo paraventricular), verificou-se que animais (roedores e gatos) apresentavam um comportamento hipofágico (fome atenuada) ou hiperfágico (fome acentuada), respectivamente (14, 15). Em seguida, foi sendo compreendido que sinais provenientes da periferia como adipócitos, sistema gastrointestinal e hormônios advindos de vários tecidos e órgãos ao atingirem o hipotálamo participam da regulação da fome e do gasto energético (16). Os estudos de parabiose (intercomunicação circulatória entre dois organismos) nesse período também foram muito importantes no entendimento do fatores que comunicam o cérebro e, portanto, regulam o controle da fome (17). Além disso, os trabalhos com a técnica de estereotaxia permitiram elucidar melhor quais biomoléculas têm crucial papel no controle da ingestão alimentar em animais (18). Foi então, que tanto a insulina como a leptina ganharam notório destaque nesta função. Estas e outras questões serão abordadas no decorrer dessa revisão de literatura.
A leptina é um hormônio peptídeo produzido principalmente no tecido adiposo branco (proporcionalmente ao volume deste tecido) e, está envolvida no controle da ingestão alimentar e no dispêndio de energia, atuando em células neuronais do hipotálamo (19). Este
hormônio possui uma estrutura semelhante a família das citocinas (20-23). Seu papel sobre o controle da fome foi descoberto em estudos primários de parabiose, no qual um componente ainda desconhecido presente no sistema circulatório de camundongos magros ao passar para o sistema circulatório de um camundongo obeso (ob/ob) conduziu este animal a redução da massa corporal (magresa) (17). Assim, definiu-se que esse componente pelo efeito robusto sobre a perda de peso receberia o nome de leptina, termo que é derivado da palavra em latim “leptos” que significa magro. Depois em 1994, em publicação que foi destaque na capa da revista científica Nature, identificou-se o gene responsável pela síntese dessa citocina (leptina) no organismo, com papel crucial sobre o controle da ingestão alimentar e gasto energético (24). Portanto, alguns organismos deficientes do gene da leptina como os camundongos ob/ob podem se beneficiar do tratamento com leptina.
O receptor de leptina ObRb foi identificado inicialmente e expresso de forma abundante em neurônios do núcleo arqueado do hipotálamo, sendo responsável por receber e iniciar a transdução do sinal da leptina no hipotálamo (25). O núcleo arqueado é constituído de um número significativo de neurônios que recebem os estímulos de sinais provenientes da periferia, sendo uma área de muito interesse pelos pesquisadores que estudam a obesidade. Porém, não é a única área de importância e outras estruturas tem ganhado destaque nos últimos anos. O receptor de leptina não possui atividade catalítica intrínseca e depende para propagação do seu sinal de uma proteína intracelular chamada Janus quinase-2 (JAK-2). A JAK2 recebe este nome em virtude da analogia com o Deus da mitologia grega chamado Janus. De acordo com a mitologia Janus tinha duas faces, e como a proteína JAK é capaz de se conectar ao receptor de leptina por um lado e de outro lado da molécula fosforilar a proteína STAT3, conforme será descrito a seguir (26), recebeu esta denominação de proteína Janus Kinase ou JAK. A conexão da leptina ao seu receptor promove o recrutamento de outra unidade de receptor, induzindo mudança conformacional e ativação da JAK2 (27). Esse fenômeno resulta na fosforilação da JAK2 em vários resíduos tirosina tornando-se ativa para que a seguir fosforile e ative outra molécula de JAK-2 associada ao segundo receptor (25). Subsequentemente as JAK-2 uma vez ativas catalisam a fosforilação dos receptores de leptina (ObRb) nos sítios de tirosinas (28). Desse modo ocorre a transdução do sinal da leptina.
Nessa cascata de sinalização, cabe destacar que a leptina também promove o recrutamento e a fosforilação das proteínas da família dos substratos do receptor de insulina (IRSs) (29). Os IRSs (IRS-1 e IRS-2) fosforilados são responsáveis pela ativação da enzima fosfatidilinositol 3-quinase (PI3q) que desempenha um papel relevante na transdução do sinal
da leptina (30, 31). Isso, porquê a ativação da via da insulina culmina na fosforilação e extrusão do núcleo do fator de transcrição da família forkhead BOX O (FoxO1), levando a redução da expressão de neuropeptídeos orexigênicos como o neuropeptídeo Y (NPY) e o peptídeo relacionado ao gene agouti (AgRP). No entanto, outro sítio de ativação do receptor de leptina leva ao recrutamento e ativação de moléculas da família de transdutores-e-sinal-e-ativadores-de-transcrição (STATs, predominantemente STAT-3) responsáveis por conduzir o sinal gerado pela leptina ao núcleo onde coordenam a transcrição de genes de neuropeptídeos responsivos ao sinal hormonal (32). Nessa situação serão expressos os neuropeptídeos como o transcrito relacionado à cocaína e à anfetamina (CART) (35) e o hormônio alfa-melanócito estimulador (-MSH) derivado de POMC (proopiomelanocortina), relacionados aos efeitos anorexigênicos do hormônio.
Após a ativação dos receptores de leptina no cérebro e das proteínas envolvidas na transmissão do sinal desse hormônio, respostas neuronais integradas são necessárias para modular a ingestão alimentar e o gasto energético. Alguns neuropeptídeos importantes para o funcionamento dessa rede neuronal estimulam a ingestão alimentar como NPY (33) e o AGRP (34), enquanto outros provocam redução da ingestão alimentar como o CART (35) e o -MSH (36). Sabidamente, a leptina regula o balanço energético diminuindo os níveis de neuropeptídeos anabólicos NPY e AGRP e aumentando a concentração de neuropeptídeos catabólicos CART e -MSH. Esta regulação parece envolver também neurônios que expressam ácido gama-aminobutírico (GABA) (neurônios GABérgicos) e glutamina (Glutaminérgicos) localizado no hipotálamo. Estes neurotransmissores participam do controle da fome de maneira muito relevante. Corroborando com isto, a expressão hipotalâmica da POMC está reduzida no camundongo deficiente em leptina ob/ob e esta é aumentada pela suplementação por leptina (37, 38, 39, 40). Em seguida, foi também observado que diversos fatores influenciam o sinal da leptina, incluindo o hormônio insulina (41-44).
A insulina circula em níveis proporcionais ao conteúdo de tecido adiposo (atrelado a resistência à ação ou secreção desse hormônio) e atravessa a barreira hematoencefálica atingindo o hipotálamo (45). Os receptores de insulina são expressos em neurônios envolvidos na ingestão alimentar e presentes no núcleo arqueado e outras áreas do hipotálamo (46, 47). A administração de insulina diretamente no sistema nervoso central reduz a ingestão alimentar e diminui a massa corporal, enquanto a deficiência desse hormônio causa hiperfagia (48). Cabe
salientar que a via de sinalização da insulina presente no hipotálamo é exatamente a mesma presente em outros tecidos do organismo.
A correlação dos níveis séricos de insulina com o conteúdo de gordura corporal é consequência da resistência à insulina induzida pelo aumento da adiposidade corporal (49). Assim, à medida que o conteúdo de tecido adiposo no organismo aumenta a insulina deve aumentar para compensar a resistência à insulina e manter a homeostase de glicose (50, 51). Contudo, mesmo com altos níveis de insulina circulante é possível observar a deficiência na transmissão do sinal desse hormônio no tecido hipotalâmico de roedores. Isso significa que a resistência à insulina já muito bem conhecida na periferia também acontece no hipotálamo em modelos de animais obesos como camundongos ob/ob e db/db ou ratos Zucher (52-54) e em ratos Wistar alimentados com dieta hiperlipídica (54), demonstrando que fatores ambientais são capazes de modular a via de sinalização da insulina no sistema nervoso central.
Estudos pioneiros que identificaram o receptor de insulina no sistema nervoso central foram fundamentais para o progresso do entendimento sobre o papel da insulina sobre o controle da fome, demonstrado que não é somente crucial em funções metabólicas em tecidos periféricos (43, 55-58). Muitos desses avanços deve-se a utilização de equipamentos de estereotaxia que permitem o implante de cânulas no sistema nervoso central que atingindo a região do hipotálamo permite a micro infusão ou injeção de substâncias diversas e o estudo do comportamento alimentar, incluindo a insulina. Mais recentemente outros equipamentos (como por exemplo, lâminas de multi-cortes em matriz de aço coronal) tem permitido não só a análise do hipotálamo mais de segmentos específicos desta região ampliando ainda mais o conhecimento sobre esta área importante do cérebro em funções como controle da fome, controle da sede, libido, entre outras.
Após a ligação da insulina ao seu receptor de membrana de estrutura heterotetramérica ocorre uma alteração conformacional da molécula e a auto-fosforilação da subunidade beta nos resíduos de tirosina (56, 59). Em seguida ocorre o recrutamento e a fosforilação em tirosina de substratos do IR, os IRSs, principalmente o IRS-1 e o IRS-2 (41, 60). A fosforilação de IRSs promove a ligação e ativação da enzima PI3q (41, 60). Na sequência a proteína quinase dependente de fosfoinoinosítedeos (PDK) e fosforilada e isso induz a fosforilação da Akt. A Akt tem importante participação nos diferentes efeitos biológicos da insulina, dentre eles, a Akt fosforila o fator de transcrição Foxo1 no hipotálamo, promovendo a sua extrusão e isso diminui a transcrição de neuropeptídeos orexigênicos (NPY e AgRP).
Além disso, a insulina modula, em paralelo à a via de sinalização da leptina, com efeitos anorexigênicos (61). Esta comunicação entre as vias da insulina e leptina e vice-versa é denominado de inter-relação ou cross-talk. Em seguida conexões com outros neurônios localizados no hipotálamo permitem a regulação da fome e do gasto energético.
Os neurônios presentes no núcleo arqueado do hipotálamo possui conexões axonais com outros neurônios localizados em áreas como o hipotálamo lateral (LH), núcleo paraventricular (NPV) e núcleo dorsomedial (DMH). Mais recentemente tem sido explorado também o núcleo ventromedial (VMH). Ademais, estudos realizados pelo pesquisador Bradford Lowell, têm demonstrado a presença de receptores de insulina e leptina em outras áreas do cérebro, com participação no fino processo de controle da ingestão alimentar e do gasto energético do organismo (39, 40). A identificação da participação de outras áreas do cérebro nesse processo ocorreu através de experimentos em que foi realizado a deleção específica de receptores de leptina em neurônios POMC do núcleo arqueado e ocorreu apenas um modesto aumento na ingestão alimentar (40).
Estes achados permitem considerar que os receptores de leptina localizados em neurônios POMC no arqueado não são exclusivamente responsáveis pela regulação da leptina e homeostase do peso corporal e que estes receptores em outros neurônios em outras áreas do hipotálamo também são importantes. Em adição, outras áreas como o núcleo do trato solitário (NTS) tem sido sugerido como um importante local da ação anoréxica do leptina. Tais achados tem expandido o conhecimento da ação da leptina e insulina sobre o controle a fome. Revelando que experimentos adicionais serão necessários para melhor conhecer a ação dos hormônios no controle da fome.
Classicamente, no hipotálamo lateral existem neurônios que expressam orexina e -MSH e no núcleo paraventricular localizam os neurônios que sintetizam o hormônio liberador de corticotrofina (CRH) e o hormônio liberador de tireotrofina (TSH) (62-63). Através destas conexões neuronais ocorrem o controle da fome e do gasto energético do organismo. Em condição de jejum, neurônios que expressam NPY/AGRP encontram-se ativados e através de conexões axonais com os neurônios de segunda ordem provocam à inibição da produção de neurotransmissores anorexigênicos e ativadores da termogênese TSH e CRH no núcleo paraventricular, e ativação da produção de neurotransmissores orexigênicos e inibidores da termogênese (orexina e MCH) no núcleo hipotalâmico lateral (62-63). O desfecho final desta regulação é o aumento da fome e a redução da termogênese. Ao contrário quando há
desregulação neste controle da fome exercido pelo hipotálamo têm-se aumento da fome e redução do gasto energético. Assim no hipotálamo a ação da insulina e leptina isoladamente ou em conjunto se mostra primordial para manutenção de um balanço energético equilibrado e manutenção da massa corporal do organismo. Embora o entendimento sobre as ações da leptina e insulina tenha avançado bastante ainda tem muito a que ser estudado. Destaca-se ainda que a inter-relação (cross-talk) entre as vias de sinalização da leptina e insulina possui resultados funcionais relevantes (29). De acordo com os estudos a via JAK2/STAT3 pode ser ativada por insulina assim como a via IRS/PI3q pode ser ativada por leptina (62-63)).
Por outro lado, prejuízos na via de sinalização tanto da insulina quando da leptina induzidos pela obesidade induzem alteração no controle da fome. Na prática, embora organismos obesos apresentem um aumento tanto dos níveis de leptina quanto de insulina o sinal destes hormônios se mostram prejudicados no hipotálamo, o que explica, no mínimo em parte, a disfunção hipotalâmica e a hiperfagia associada ao aumento excessivo de massa adiposa.
Atualmente se conhece alguns mecanismos que induzem a resistência à insulina e leptina nos centros controladores da fome e que estão envolvidos com a hiperfagia e obesidade (62-63). Há um processo inflamatório de baixa magnitude que é capaz de induzir descontrole dos sinais de saciedade (64-67). Animais obesos induzidos por dieta rica em gordura apresentam um aumento da expressão e da atividade de proteínas próinflamatórias no hipotálamo, e este processo inflamatório seria o principal evento intracelular responsável pela resistência central à insulina e à leptina em roedores, contribuindo com a hiperfagia e o desenvolvimento da obesidade (68). Desta forma, faz-se importante o entendimento de como ocorre o fenômeno de resistência à estes dois hormônios. A figura 1 representa um esquema ilustrativo da via de sinalização da insulina e leptina no hipotálamo e o efeito em regular a ingestão alimentar.
Figura 1. Via de transdução do sinal da insulina e leptina em neurônios hipotalâmicos. A
ligação da insulina a seu receptor de membrana induz uma cascata de sinalização intracelular que culmina na ativação da Akt. A Akt por sua vez leva a fosforilação da Foxo1 nuclear e a sua extrusão para o citoplasma. O fator de transcrição Foxo1 participa da transcrição de neuropeptídeos oregxigênicos (NPY e AGRP) que aumentam a fome. Dessa maneira, a insulina exerce seu efeito anorexigênio no hipotálamo. O hormônio leptina ao se ligar ao seu receptor de membrana induz uma cascata de sinalização que culmina na migração do fator transcricional STAT3 para o núcleo da célula neuronal. A proteína STAT3 no núcleo participa da transcrição de neuropeptídeos denominados anorexigênicos (POMC e CART) que suprimem a fome. Existe ainda uma inter-relação “Cross-Talk” entre estes dois hormônios e na presença de leptina, a via de sinalização da insulina é acentuada. De maneira similar a via da JAK2 pode ser intensificada na presença simultânea de insulina. Portanto, esses dois hormônios agindo isoladamente ou em conjunto são responsáveis pelo controle da fome (redução) e aumento do gasto energético. NPY, Neuropeptídeo Y, AGRP, peptídeo relacionado ao gene Agouti; POMC, pró-ópiomelanocortina; CART, transcrito relacionado a anfetamina e cocaína. Foxo1, fator de transcrição da família forkhead BOX O; JAK2, proteína Janus Kinase 2, STAT3, proteína que transmite o sinal da superfície celular ao núcleo ativando a transcrição nuclear [Figura realizada pelo próprio autor deste trabalho].
1.2. OBESIDADE E INFLAMAÇÃO HIPOTALÂMICA
Em 2005 foi observado que alterações inflamatórias são detectadas no sistema nervoso central de animais obesos induzidos pela oferta de uma dieta hiperlipídica. De Souza et al. (66) demonstraram que moléculas relacionadas à imunidade, incluindo citocinas próinflamatórias como as interleucinas 1 e 6 (IL-1 e IL-6) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF, representaram a maior classe de genes com expressão hipotalâmica alterada após 16 semanas de dieta hiperlipídica. A via da c-jun N-terminal quinase (JNK) (66) e do complexo
Ikappa kinase/fator nuclear kappa B (IKK/NF-B), assim como indução de estresse do retículo endoplasmático (ER estresse) (67, 69) são ativadas e relacionadas com prejuízos na sinalização de insulina e leptina no hipotálamo nessa condição de obesidade induzida por oferta de uam dieta rica em gordura saturada e hipercalórica..
A sinalização inflamatória pode influenciar a ação da leptina e da insulina no hipotálamo de diversas maneiras. Em tecidos periféricos, IKK e JNK fosforilam os IRSs em serina 307, tornando-o menos sensível aos sinais de transdução do receptor de insulina (inibição da fosforilação em tirosina) (70-72). A administração intracerebroventricular de um inibidor da IKK ou o exercício físico é capaz de reverter ou atenuar a resistência à insulina hipotalâmica induzida por dieta hiperlipídica (9, 73). Além disso, a deleção do IKK ou da proteína que se acopla ao Toll Like Receptor 4 (TLR4), a proteína MyD88 neuronal restaura sensibilidade à insulina e leptina em camundongos submetidos a dieta hiperlipídica (74). Esses achados permitiam compreender que estas vias inflamatórias podem ser alvos de ação contra a hiperfagia e obesidade.
Outro mecanismo pelo qual a inflamação hipotalâmica está ligada a resistência à insulina e leptina é através de auto-regulação do supressor de sinalização de citocinas SOCS3. Um membro de uma família de proteínas originalmente caracterizada como reguladores de feedback negativo de inflamação (70, 75). SOCS3 inibe a sinalização da insulina e a leptina por ligação direta aos seus receptores (70-75). A ingestão de dieta hiperlipídica aumenta a expressão SOCS3 hipotalâmica e isso está coincidentemente relacionado com o aparecimento de resistência à leptina (28).
Assim como a SOCS3, a proteína tirosina fosfatase PTP1B é uma molécula de interrupção de sinal que inibe a sinalização da leptina e insulina. Os mecanismos responsáveis por estes efeitos envolve sua habilidade de desfosforilar o IR, a proteína JAK2 e outros componentes das duas vias de sinalização (76). Dados recentes sugerem que dieta hiperlipídica aumenta a expressão da PTP1-B em diversos tecidos, incluindo o hipotálamo (77, 79). A ativação de IKK e a ativação do fator transcricional NF-B eleva os níveis de PTP1B que então culmina com o desfecho negativo sobre a via de sinalização tanto de insulina como de leptina no hipotálamo. Camundongos nocaute da PTP1B em todos os neurônios (78) ou especificamente em neurônios POMC são resistentes a obesidade induzida por dieta rica em gordura. Assim, alternativas terapêuticas capazes de bloquear a sinalização desta proteína especificamente no hipotálamo pode ser algo promissor contra a obesidade.
O excesso de adiposidade na obesidade está atrelada a outro fenômeno que envolve a participação do retículo endoplasmático (RE). O RE tem inúmeras funções relevantes, sendo responsáveis pela biossíntese de lipídios e principalmente proteínas. Na condição de estresse metabólico, como no estado de obesidade, a homeostase funcional do RE é rompida, levando ao acúmulo de proteínas mal formadas (inoveladas) no seu interior. Nessa situação, as células acometidas ativam um complexo sistema de sinalização conhecido como Unfolded Protein Response (UPR). Sobre condição de estresse proteínas provenientes do RE tem ações negativas na via de sinalização da insulina (80). Estes efeitos podem ocorrer também no sistema nervoso central e desregular o controle da fome 80-81). Isso porque componentes do UPR (como por exemplo, as proteínas eIF2fator de iniciação eucariótico 2) e PERK (Proteína quinase tipo PKR residente no retículo endoplasmático)) desencadeiam ativação da serina quinase JNK e IKK/NFB, exacerbando os efeitos inflamatórios da dieta hiperlipídica (81). Tais proteínas também são sinalizadas a nível hipotalâmico ativando as mesmas quinases inflamatórias envolvidas com prejuízos no sinal da insulina e leptina no hipotálamo.
Quando intervenções farmacológicas ou a realização de exercício físico tem se mostrado capaz de inibir o estresse de RE em camundongos submetidos à dieta hiperlipídica e diminuem a ingestão alimentar e peso corporal (9, 69). Ao contrário, a indução do estresse do RE através de fármacos (tapsigargina) em neurônios resulta em hiperleptinemia, obesidade, hiperfagia e redução de taxa metabólica associada com severa resistência à leptina hipotalâmica (81). Caso a homeostase energética não seja restaurada, a UPR culmina com a indução de mecanismos de morte (apoptose), recentemente descrita em hipotálamo (82). A figura 2, ilustra de maneira resumida as vias inflamatórias e de estresse de retículo endoplasmático envolvido no descontrole da fome na obesidade e consumo de dieta rica em gordura.
Figura 2. Ativação de vias inflamatórias e de estresse de retículo endoplasmático e os efeitos inibitórios sobre a via de sinalização da insulina e leptina. A obesidade e o consumo
excessivo de gordura está atrelado ao aumento dos níveis de TNF-α. A ligação desta citocina ao seu receptor leva a ativação de vias inflamatórias como das serinas quinases JNK e o IKK. O IKK ao estar ativado, desencadeia a fosforilação do Iκβ e deste modo, sua dissociação do fator de transcrição NFκB. Quando liberado, o NFκB se transloca para o núcleo e aumenta a transcrição de citocinas pró-inflamatórias (IL1-β, iNOS, IL-6, TNF-α, etc.) e de outras proteínas como a SOCS3 e a PTP-1B. A SOCS3 tem a capacidade de se ligar fisicamente a proteínas da via da leptina (JAK2) e impede que estas proteínas sejam ativadas. Já, a PTP-1B, por ser uma proteína tirosina fosfatase, induz a desfosforilação das proteínas JAK2, IR e IRS, diminuindo a ativação da via da leptina e insulina e assim, sua ação inibitória sobre a fome. Já o estresse de retículo endoplasmático induz a ativação das proteínas eIF2 e PERK que ativam o IKK desencadeando o processo inflamatório e o prejuízo nas vias da insulina e leptina em neurônios hipotalâmicos. IR, receptor de insulina; IRSs, substratos do receptor de insulina; PI3K, fosfatilinositol 3-quinse; IKK, Ikappa Kinase; NF-B, fator nuclear Kappa B; TNF-, fator de necrose tumoral alpha; ObR, receptor de leptina; JAK2, Janus Kinase 2; STAT3, proteína que transmite o sinal da superfície celular ao núcleo ativando a transcrição nuclear; PTP1B, proteína tirosina fosfatase 1B; eiF2, fator de iniciação eucariótico 2; PERK, Proteína cinase tipo PKR residente no retículo endoplasmático. [Figura realizada pelo próprio autor deste trabalho].
No intuito de melhor compreender qual tipo de gordura saturada é capaz de induzir o processo inflamatório, outro estudo muito elegante conduzido por Velloso e colaboradores mostrou que a infusão de alguns tipos de ácidos graxos purificados, infundidos diretamente no hipotálamo alterava o padrão de indução inflamatória (67). Ácidos graxos saturados e de cadeia longa como o esteárico e araquídico foram mais prejudiciais do que gorduras como o palmítico.. Assim, o processo inflamatório induzido por alguns tipos de ácidos graxos no hipotálamo
prejudica a sinalização da insulina e leptina e favorece o estado de hiperfagia. As proteínas aqui ativadas são as mesmas anteriormente descritas (IKK, JNK, SOCS3, PTP1B, e de estresse de RE) presentes em tecidos periféricos e que também são encontradas no sistema nervoso central. Perigosamente, a manutenção da inflamação de baixo grau pode levar a apoptose de neurônios controladores da fome.
Entende-se hoje que o consumo de gordura alterando o padrão de resposta neuronal a hormônios, altera o comportamento alimentar mediado pelo hipotálamo. Mais do que isso, em 2012 foi demonstrado em humanos que, com apenas um dia de consumo de uma dieta rica em gordura, o processo inflamatório é acionado (83). Isso significa que a manutenção de uma dieta rica em gordura e hipercalórica levará a um estado de disfunção hipotalâmica e hiperfagia. Neste momento é preciso compreender bem que a obesidade é uma doença nefária, que se instala de forma silenciosa e insidiosa. Sendo que o hipotálamo parece ser uma região muito sensível aos desajustes alimentares e com participação primária e efetiva para o aumento da adiposidade corporal. Havendo a manutenção da obesidade e os desajustes hipotalâmicos existe indicativos fortes que pode ocorrer morte de neurônios que controlam a fome, em especial daqueles anorexigênicos em roedores (82). Embora sejam necessários mais estudos nessa área, não é descartada a hipótese de que o processo apoptótico em células hipotalâmicas aconteça também em seres humanos que fazem consumo permanente de alimentos com alto teor de gordura saturada e que se tornam obesos (84). Isso redobra a necessidade de intervenções que sejam capazes de prevenir e tratar a inflamação subclínica e a obesidade.
Embora seja reconhecido o grande avanço na área e na compreensão dos mecanismos atrelados a disfunção hipotalâmica e na regulação da fome, não é ainda totalmente conhecido os mecanismos pelos quais isso acontece e como se dá a interação entre eles. Além disso, recente estudo demonstrou que o prejuízo na sinalização da leptina no hipotálamo poder estar relacionado a menor expressão e atividade de uma proteína denominada Rho-Kinase (Rock) que é capaz de interagir fisicamente com a JAK2 e com isso aumentar sua atividade, causando a ativação de STAT3 e Foxo1 no hipotálamo (85). Sendo proposto que a presença de Rock1 no hipotálamo potencializa a sinalização da leptina através da sinalização tanto da STAT3 quanto da PI3q, provendo um novo mecanismo para o entendimento da ação central da leptina na regulação do peso corporal. Em adição, esta proteína se mostra capaz também de aumentar a fosforilação em serina 632/635 do IRS-1 e potencializar a sinalização da insulina em tecidos periféricos (85). No entanto a ação da Rock diretamente sobre a via da insulina no hipotálamo é desconhecido.
PAPEL DA RHO-KINASE (ROCK) EM MEDIAR A SINALIZAÇÃO DA INSULINA E LEPTINA
A proteína Rho-Kinase (Rock) é uma serina/treonina quinase e possui duas isoformas Rock1 ou alfa e Rock2 ou beta (86). Suas ações no organismo ainda não é totalmente compreendido, mas são diversas. Esta molécula pode ser ativada pela ligação no domínio RhoA/GTP ou pode ser inativa pela ligação RhoE/GTP (86). Assim RhoA seria a enzima ativadora da molécula Rock e RhoE a enzima inativadora da Rock. Esse conhecimento tem permitido estudar possíveis biomoléculas de ação regulatória sobre estas enzimas ampliando o conhecimento sobre o metabolismo da Rock (entenda-se metabolismo da Rock como a via de sinalização desta molécula e seus efeitos biológicos). A Rock está envolvida em várias funções celulares tais como: captação de glicose, adesão celular, organização da actina, motilidade celular e vascular e contração do músculo liso. Os primeiros estudos realizados envolvendo proteínas da família Rho foram realizados na década de 90, por um grupo de autores que que propuseram que proteínas da família Rho poderiam desempenhar a importante função de transmitir sinais intracelulares em diferentes tecidos (87-89). A partir destes achados uma série de estudos tem sido realizados para melhor compreender a função da Rock sobre o metabolismo, especialmente sobre sua ação sobre a via da insulina e leptina em diversos tecidos.
Em estudo muito bem elaborado, Furukawa e colaboradores no ano de 2005 sugeriram que a proteína Rho Kinase poderia controlar a homeostase glicêmica através do aumento da fosforilação da Akt tanto em células musculares bem como em adipócitos (90), demostrando o possível potencial desta proteína em interagir com a via de sinalização da insulina. Para isso, neste mesmo estudo os autores propõem o mecanismo de atuação da proteína Rock em aumentar as fosforilação da Akt por fosforilar diretamente os substratos do receptor de insulina 1 (IRS-1) em serina nos resíduos 632/635 (Figura 3). Segundo os autores, a proteína Rock fosforila o IRS-1 em seus resíduos de serina 632/635, e isso promove a ativação da enzima PI3q levando assim, ao aumento da captação de glicose pelo músculo esquelético. Cabe ressaltar que diferentemente do mecanismo de fosforilação em serina no resíduo 307 induzido por serina qunases como a JNK e IKK, Furukawa apresentou que a fosforilação dos resíduos serin 632/635 aumenta a transdução do sinal da insulina no músculo esquelético (90). Em adição, os autores mostraram que a inibição farmacológica da proteína Rock, por reduzir a sinalização da insulina, reduz a captação de glicose em célula muscular e em adipócito e, ainda, os autores concluem que quando inibida a Rock, pode levar ao estado de resistência à insulina
no músculo esquelético (90). Portanto, a fosforilação em serina do IRS-1 nos resíduos 632/635 leva a um aumento na transdução do sinal da insulina e seus efeitos biológicos.
Figura 3. Mecanismo de ação pelo qual a Rock regula a sinalização e o metabolismo de glicose mediado pela insulina no músculo esquelético e aumenta a captação de glicose. A
Rock induz a fosforilação em serina dos resíduos 632/635 do substrato 1 do receptor de insulina (IRS-1) e consequentemente aumenta a fosforilação da Akt no músculo esquelético. Como consequência há um aumento na translocação de GLUT-4 para a membrana celular e do aumento na entrada de glicose para o meio intracelular [Figura realizada pelo próprio autor deste trabalho].
Outro estudo também importante ocorreu no final do ano 2000, onde pesquisadores analisaram os efeitos da inibição da Rock1 em camundongos e mostraram que independentemente deste ser macho ou fêmea, quando há a anulação da Rock1 desenvolvem a resistência à insulina por apresentarem menor fosforilação do IRS-1 em serina 632/635 e com isso menor ativação da PI3q (91). Em análises de tecido muscular de humanos, foi demonstrado que após o estímulo com insulina não houve o aumento da fosforilação da Rock1 nos indivíduos obesos diabéticos se comparados aos sujeitos magros (92). Ainda em indivíduos portadores de diabetes, Nakamura et al., 2006, mostraram que indivíduos com concentrações elevadas de glicose no sangue apresentaram maiores níveis de RNAm de insulina e com isso o aumento na transcrição do gene de insulina por meio da supressão da via Rho-kinase, levando esses indivíduos ao estado de hiperinsulinemia (93). Já os efeitos da proteína Rock em potencializar
a sinalização da insulina em hipotálamo são desconhecidos. As poucas evidências que existem apontam um efeito positivo da proteína Rock agindo sobre a via de sinalização da leptina hipotalâmica.
Depois de estudos mostrando a atuação da Rock em músculo e adipócito, Huang et al., (2012) mostraram que a Rock1 também pode atuar como regulador central da leptina, por se comportar como mediador intracelular específico deste hormônio no hipotálamo e assim, regular o balanço energético. Neste estudo os autores identificaram Rock1 em duas distintas populações de neurônios no núcleo arqueado do hipotálamo que são controladas pela leptina: POMC e AgRP/NPY (85). No estudo verificaram que após infusão intracerebroventricular de leptina, ocorreu aumento na atividade da Rock1 em camundongos C57BL/6 e ob/ob, mas não para db/db mostrando assim que a atividade da Rock em decorrência da leptina é mediada pelo receptor específico da leptina (85). Ainda, os autores mostraram que após a administração de leptina a Rock1 induziu a fosforilação direta da JAK2 em resíduos de serina, que por sua vez continuou a cascata de fosforilações dessa via incluindo STAT3 e PI3q no hipotálamo. Já quando a Rock1 foi inibida em neurônios POMC, os animais aumentaram o consumo alimentar diário e consequentemente a quantidade de tecido adiposo, mostrando assim que a Rock1 atua também como forte controladora do balanço energético. Assim, a Rock seria capaz de se associar tanto com o IRS-1 quanto com a JAK2 e aumentar a sinalização desses dois hormônios.
Mediante estes achados, parece evidente que a proteína Rock tem efeitos importantes no controle metabólico e na sinalização da insulina e leptina, podendo estar envolvida no desenvolvimento de algumas doenças, especialmente obesidade e diabetes mellitus tipo 2 (94). Como o exercício físico tem efeitos positivos sobre a sinalização da insulina e da leptina em células hipotalâmicas (9, 10), é possível que ele regule positivamente a Rock e com isso melhore o sinal desses hormônios auxiliando no controle da fome. Dados ainda não publicados de nosso laboratório tem evidenciado um papel positivo do exercício em regular a Rock 1 e 2 no músculo esquelético de camundongos Swiss e ratos obesos.
EFEITO PROTETOR DO EXERCÍCIO SOBRE RESISTÊNCIA À INSULINA E LEPTINA HIPOTALÂMICA
A prática do exercício físico está associada a atenuação do processo inflamatório decorrente da obesidade com consequente melhoria da resistência à insulina e leptina (9, 10). Trabalho com roedores revelou que o exercício pode aumentar temporariamente os níveis de citocinas antiinflamatórias, tais como a IL-10, sem que haja mudança da massa corporal (9). A IL-10 é uma citocina importante com efeitos biológicos múltiplos. Esta citocina regula a ativação inflamatória em diferentes tipos de células, como monócitos/macrófagos e células T através da inibição da transcrição e póstranscricional de toda a gama de citocinas próinflamatórias (9).
Recentemente, nosso grupo focando no hipotálamo demonstrou que o exercício físico melhora a sensibilidade à insulina e leptina (9, 10). Este fenômeno decorre de uma potente atividade anti-inflamatória no tecido hipotalâmico desencadeado agudamente pelo exercício (9). O exercício aumenta a concentração da citoquina anti-inflamatória, IL-10, no hipotálamo, a qual inibe a sinalização da via IKK/NF-kB e o estresse de retículo endoplasmático, sendo estes efeitos provenientes do aumento do aumento da miocina IL-6 e consequentemente IL-10 circulantes (9). A injeção diretamente no hipotálamo de anticorpo anti-IL-10 suprimiu o efeito do exercício em aumentar a sinalização da insulina e leptina no hipotálamo.
Estudo com humano demonstrou que sessão única de exercício físico é capaz de produzir um efeito sobre a ingestão alimentar em adolescentes obesos. Foi observado que o exercício físico de moderada a alta intensidade (75% VO2máx) produz respostas positivas para o controle da ingestão alimentar nesta população. Os adolescentes obesos que realizaram exercício físico a 75% do VO2máx apresentaram redução da ingestão alimentar tanto no almoço, como no jantar, quando comparados aos seus pares sedentários e aos indivíduos obesos que realizaram exercício físico agudo de baixa intensidade (40% do VO2máx) (95). Esse achado reforça os resultados primariamente encontrados em roedores.
Em estudo também com humanos Broom e colaboradores demonstraram que tanto o exercício aeróbio de corrida a 70% do VO2máx por 60 minutos quanto o exercício resistido a 80% de 1RM tiveram efeito supressivo sobre a ingestão alimentar e isso foi acompanhado por menores níveis de grelina circulante (96). Mais relacionado ao nosso estudo, Petterson e colaboradores que expos roedores a roda de atividade verificaram redução da ingestão alimentar, do peso corporal e aumento da pSTAT3 em neurônios do núcleo arqueado
comparados aos animais não expostos a mesma atividade (97). Ao encontro a este estudo, Laing e colaboradores verificaram que camundongos C57BL6 treinados em esteira rolante tiveram aumento na pSTAT3 hipotalâmica (98).
Estes dados mostram que o exercício é uma ferramenta importante na prevenção e no tratamento da obesidade, com efeitos importantes sobre os mecanismos relacionados ao controle da fome em roedores (9, 10) e em humanos (95, 96). Além disso, é possível que o exercício físico possa agir positivamente modulando outras proteínas envolvidas no sinal molecular da insulina e da leptina no hipotálamo, regulando positivamente a proteína Rock. Tal descoberta trará avanços consideráveis sobre os mecanismos pelo qual o exercício físico promove benefícios no controle da ingestão alimentar e na massa corporal. Além disso, os achados no presente estudo poderão auxiliar na criação de novas estratégias terapêuticas contra a obesidade e doenças associadas.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
O objetivo principal do estudo foiinvestigar o papel do exercício físico na regulação da proteína Rock1 e os efeitos sobre a sinalização da insulina e leptina em hipotálamo de camundongos obesos induzidos por dieta rica em gordura.
2.2. Objetivos Específicos
Investigar em diferentes grupos experimentais (controle, obeso e obeso exercitado agudamente) os seguintes parâmetros nas diferentes etapas:
Etapa 1 – Caracterização do modelo experimental de obesidade induzido por dieta hiperlipídica
A – Avaliar a evolução da massa corporal, comprimento corporal, índice de Lee (relação peso/tamanho), ingestão hídrica e o peso do tecido adiposo epididimal dos animais durante o experimento; B – Avaliar a sensibilidade à insulina através do teste de tolerância à insulina; C – Investigar o efeito da infusão intracerebroventricular (i.c.v.) ou intraperitoneal (i.p.) de insulina e leptina na ingestão alimentar de 24 horas; D – investigar a glicemia e insulinemia; E – investigar a expressão proteica de Rock 1 no hipotálamo dos animais.
Etapa 2 – Avaliação da regulação da proteína Rock1 através da dieta hiperlipídica e do exercício físico
F – Avaliar a associação entre as proteínas IRS-1/Rock1 e JAK2/Rock1 no hipotálamo dos animais; G – Avaliar o nível proteico e a fosforilação das proteínas IRS-1, JAK2, Akt, no hipotálamo após infusão i.c.v. de insulina e leptina.
3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1.Animais experimentais.
Foram utilizados camundongos Swiss, com quatro semanas de idade, provenientes do Centro de Bioterismo da UNICAMP (CEMIB). Os animais foram previamente pesados, alocados em gaiolas individuais ou metabólicas quando necessário, e distribuídos em grupos de acordo com a similaridade do peso corporal. Os animais receberam água e dieta ad libitum. Foram acondicionados em ambiente com temperatura (21 °C ± 2) e fotoperíodo (12/12 horas claro/escuro) controlados. Todos os experimentos foram iniciados após a aprovação do projeto pelo comitê de ética e pesquisa da UNICAMP (n° do processo 4311-1).
3.2.Desenho Experimental.
O desenho experimental foi distribuído em duas fases, sendo a primeira delas dividida em duas partes: o desenvolvimento do modelo experimental (indução de obesidade), canulação hipotalâmica e o protocolo de exercício físico agudo. A segunda fase foi caracterizada pela realização dos procedimentos experimentais incluindo avaliação dos parâmetros metabólicos e extração do hipotálamo para análises moleculares. A figura 4, representa um resumo esquemático das etapas experimentais.
3.3.Fase 1: Preparo do Modelo Experimental:
Desenvolvimento de obesidade em animais submetidos à dieta hiperlipídica (Hiper). A dieta que que induz obesidade é estruturada a partir de uma dieta normal para roedores, proposta por Reeves et. al., em 1993, e adotada pelo American Institute of Nutrition (AIN) como padrão (99). Esse modelo originalmente proposto possui 4% lipídios em sua formulação, oriundos exclusivamente do óleo de soja. Animais que consumiram esta dieta fizeram parte do grupo controle (C). Os animais se tornam obesos e resistentes à insulina à partir do consumo de uma dieta semelhante à AIN, contudo, modificada em seu conteúdo de lipídios. Esta dieta possuiu 35% de lipídios, sendo 4% oriundos do óleo de soja e os outros 31% de gordura suína (banha) (100). Os animais que consumiram esta dieta fizeram parte dos grupos chamados hiperlipídicos (Hiper), sendo os animais Hiper não exercitados considerados como grupo sedentário (Hiper-SD) e o grupo submetido ao protocolo de exercício agudo considerado Hiper exercitado agudamente (Hiper-EA). A oferta da dieta hiperlipídica aos grupos Hiper-SD e Hiper-EA aconteceu por período de 8 semanas. Em seguida os animais foram canulados e em seguida o grupo Hiper-EA foi submetido ao protocolo de exercício físico agudo.
3.3.1. Implante das Cânulas:
Os animais controles, Hiper-SD e Hiper-EA foram submetidos à anestesia com ketamina na dose de 200ul/Kg, xilasina na dose de 400ul/kg, diazepan na dose de 200ul/Kg misturados com 200ul de salina. Receberam paracetamol na dose de 200mg/kg de peso, diluído em água. O procedimento foi iniciado quando os reflexos corneano e de retirada da pata a dor estiverem abolidos. Os camundongos foram adequadamente posicionados no aparelho para realização de cirurgia estereotáxica, após tricotomia e anti-sepsia da região craniana, realizamos incisão inter-parietal de aproximadamente 1 cm de extensão. A seguir, o periósteo foi divulsionado e com a calota craniana exposta, foi possível visualizar o Bregma Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordennates). A implantação das cânulas obedeceu às oordenadas estereotáxicas para alcance do terçeiro ventrículo hipotalâmico (antero posterior -1.8 e profundidade -.0) previamente estabelecidas pelo atlas estereotáxico. Depois de implantada, a cânula foi fixada ao crânio do animal om acrílico polimerizante. Após o período de uma semana de recuperação da cirurgia estereotáxica, os animais foram submetidos a um teste de resposta de ingestão hídrica subsequente ao tratamento com angiotensina II (2,0 μl de solução 10-6 M) para avaliação da adequação da posição da cânula. Camundongos com resposta
positiva à angiotensina II foram selecionados. Os procedimentos foram realizados de acordo com estudos prévios (9).
3.3.2. Protocolo de exercício físico agudo e lactacidemia
Todos os animais foram adaptados ao meio aquático. Para isso, os camundongos (controle e Hiper-SD) foram colocados por três dias/semana ao meio líquido com água na profundidade do tórax. Esse procedimento visou simular o estresse recebido pelos grupos exercitados. Os ratos Hiper-EA foram aclimatizados por três dias (10 min por dia) ao meio liquido. Em seguida, num único dia de experimento, os animais nadaram em grupos de 4 em baldes plásticos de 45 cm de diâmetro e 70 cm de profundidade. A temperatura da água foi mantida em 31-32°C. Os animais realizaram o exercício de natação em duas sessões de 3 horas, separadas por 45 minutos de repouso (9). Para todas as análises da fase 2 foram utilizados animais do grupo controle, obeso e obeso exercitado para devidas comparações. O Sacrifício foi realizado imediatamente após a última sessão de exercício físico. O exercício foi realizado no horário das 13:15 as 18:45 da tarde. Foi mensurado o lactato sanguíneo nas condições basal, após a primeira sessão de exercício e ao final da segunda sessão de exercício. O sangue foi coletado da cauda do animal. As concentrações de lactato sanguíneo foram determinadas pelo método enzimático. A figura 5, representa um esquema ilustrativo da etapa do protocolo de exercício físico agudo.
Figura 5. Esquema ilustrativo do protocolo de exercício físico agudo. Os camundongos do grupo Hiper-EA realizaram duas sessões de 3 horas de exercício, separadas por um período de 45 minutos de recuperação e imediatamente ao término do exercício foram realizados os procedimentos experimentais de interesse.
3.3.3. Tratamento intracerebroventricular e análise da ingestão alimentar
Os animais de todos os grupos experimentais foram privados de alimento por.7 horas (das 13:00h às 19:00h), sem restrição de acesso a água. Em seguida através de uma cânula implantada no crânio atingindo o terceiro ventrículo hipotalâmico, os animais receberão a injeção de veículo, insulina (200mU) ou leptina (10-6 M) (9), que ocorreu as 19:00 horas para avaliar a ingestão alimentar dos animais. Assim, após os respectivos tratamentos, os animais foram colocados em gaiolas metabólicas individuais. A ração foi previamente pesada. Após 12 horas, a ração consumida foi novamente avaliada, sendo a diferença entre as medidas (pesagem), o valor referente a ingestão alimentar em gramas. Para comparação do consumo alimentar entre os grupos os valores foram convertidos em quilocalorias (Kcal). A figura 6 traz um resumo do protocolo realizado para análise da ingestão alimentar dos animais.
Figura 6. Esquema ilustrativo do protocolo de análise de ingestão alimentar
3.4. Fase 2: Demais procedimentos experimentais 3.4.1. Teste de tolerância à insulina intraperitoneal
O teste foi realizado ao final do período experimental dos protocolos descritos. O alimento para os diferentes grupos de animais foram retirados seis horas antes do procedimento e a primeira coleta de sangue equivaleu ao tempo 0 do teste. Após essa coleta, a insulina (2U/kg de peso corporal) foi injetada intraperitonealmente e amostras de sangue foram coletadas pela
cauda nos tempos 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos para a determinação da glicemia. A velocidade constante do decremento da glicose (Kitt) foi calculada usando a formula 0,693/t1/2. O t1/2 da
glicose foi calculado a partir da curva da análise dos mínimos quadrados da concentração da glicose durante a fase de decaimento linear. Determinação da glicemia ocorreu através do uso de glicosímetro portátil (Accu-Check – Roche).
3.4.2. Determinação da glicose e insulina sérica.
Os níveis séricos de insulina foram determinados através de kits colorimétricos específicos - ELISA (Thermo Scientific Rockford, IL, EUA), conforme recomendação do fabricante. A glicose no sangue foi determinada através de glicosímetro portátil (Accu-Check – Roche).
3.4.3. Extração do tecido hipotalâmico
Os animais receberam previamente aos procedimentos cirúrgicos e de extração dos tecidos injeção intraperitoneal (i.p.) de ketamina (50 mg/kg; Ketalar; Parke-Davis, Ann Arbor, MI) e xilasina (20 mg/kg; Rompun; Bayer, Leverkusen), e eutanásiados por decapitação. Todos os animais permaneceram em jejum de 7 horas antes dos procedimentos de extração dos tecidos. Os animais que receberam o tratamento com insulina ou leptina tiveram a injeção desses hormônios através da cânula implantada e atingindo o hipotálamo 20 minutos antes de serem eutanásiados para a extração do hipotálamo e respectivas análises de biologia molecular.
Em seguida a caixa craniana foi aberta para a remoção do hipotálamo. Esse tecido foi homogeneizado em tampão de imunoprecipitação contendo 1% de Triton X 100, 100 mM de Tris (pH 7,4), 100 mM de pirofosfato de sódio, 100 mM de fluoreto de sódio, 10 mM de EDTA, 10 mM de vanadato de sódio, 2 mM de PMSF e 0,1 mg/mL de aprotinina a 4 ºC. O homogenato foi centrifugado à 11000 rpm por 30 minutos. No sobrenadante foi determinada a concentração de proteína utilizando o método proposto por Bradford (101) e posteriormente foi realizada a determinação do extrato total e o ensaio de imunoprecipitação com anticorpo específico.
3.4.4. Imunoprecipitação
Após determinação da concentração das proteínas foi realizada a imunoprecipitação com anticorpo específico (Rock1). Após incubação, os imunocomplexos
foram recuperados com Proteina A Sepharose 6 MB por 2 horas à 4 ºC e decantados por centrifugação por 20 minutos à 4 ºC/ 11000 rpm. O precipitado foi lavado três vezes, em intervalos de 5 minutos, com tampão de lavagem (2 mM ortovanadato de sódio, 100 mM Tris-HCl; 1 mM RDTA; 0,5% Triton X-100). O sobrenadante foi descartado, ficando-se apenas com as proteínas precipitadas (imunocomplexos).
3.4.5. Imunoblot
Os imunocomplexos foram ressuspensos em tampão de Laemmli, contendo 100 mmol/L de DTT. Após rápida fervura foram aplicados em gel de poliacrilamida para separação por eletroforese (SDS-PAGE). As proteínas separadas em SDS-PAGE foram transferidas para membrana de nitrocelulose em aparelho de transferência da BIO-RAD. A membrana de nitrocelulose foi incubada “overnight” com anticorpo especifico. A ligação de anticorpo a proteínas não-específicas foi minimizada pela pré-incubação da membrana de nitrocelulose com tampão de bloqueio (5% de leite em pó desnatado; 10 mmol/L de Tris; 150 mmol/L de NaCl; 0.02% de Tween 20) por 1,5 hora. Posteriormente, as membranas foram incubadas por 2 horas na temperatura ambiente com o anticorpo secundário referente às especificações dispostas no pelo primeiro anticorpo utilizado. O sinal foi detectado por tratamento com 2 mL de solução quimioluminescente do reagente de quimioluminescência SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate, da Pierce Reagents, expostos a filmes fotossensíveis de RX Kodak e revelados por método tradicional. As bandas identificadas na autoradiografia foram quantificadas através de densitometria óptica.
3.4.6. Anticorpos
O anticorpo utilizado para imunoprecipitação foi anti-Rock1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Os anticorpos utilizados para o imunoblot foram anti-phospho-IRS-1 (Ser632 e 635), anti-Akt, antiphospho-Akt (Ser473), anti-JAK2, anti-phospho-JAK2 (Tyr1007) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), anti-IRS-1, antiphospho-IRS-1, Anti-Rock1, e GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA).
3.4.7. Análise Estatística
Todos os resultados foram expressos como média ± DP. Os resultados dos “Westerns blot ou imunoblot” foram apresentados como comparações diretas das bandas proteicas nas autorradiografias ou avaliadas por equipamento fotodocumentador. Os dados foram analisados através de teste “t de Student”, quando comparados dois grupos. E análise de variância (Anova), seguida do teste de múltiplas médias de Bonferroni, quando apropriado para
comparar os grupos controle e experimentais. A significância estatística adotada foi de p<0,05. O programa STATISTICA 6.0 foi empregado para efetuar as análises.
4. RESULTADOS
A seguir são apresentados os resultados obtidos com os diferentes grupos experimentais (C, controle; Hiper-SD, obesos sedentários; e Hiper-EA, obesos sedentários exercitados agudamente). Os dados foram expressos como média ± DP seguido do número indicado dos experimentos. Na tabela 1 são apresentados os resultados fisiológicos e de composição corporal dos animais.
Tabela 1. Caracterização da amostra.
Variáveis/Grupo C OB OB-E
Massa Corporal Inicial (g) 18,2 ± 0,5 18,0 ± 0,8 18,19 ± 1,0
Massa Corporal Final (g) 43,0± 1,5 52,1 ± 1,4* 52,4± 1,7*
Ganho de Massa Corporal (g) 24,7± 1,7 34,1± 1,8* 34,2 ± 2,2*
Comprimento (cm) 11,1 ± 0,2 11,2 ± 0,2 11,3 ± 0,3
Gordura epididimal (mg) 281,8 ± 12,6 371,6 ± 8,3* 376,0± 9,4#
Glicemia de jejum (mg/dL) 123,6 ± 4,1 250,4 ± 13,8* 214.7 ± 14,2*#
Insulinemia de jejum (ng/mL) 1,9 ± 0,2 4,5 ± 0,7* 3,5 ± 0,3*#
kITT (% consumo/min) 4,7 ± 0,3 2,6 ± 0,4* 3,6 ± 0,4*#
Lactato Basal (mmol/L) ND ND 1,12 ± 0,8
Lactato após 1° sessão de esforço Lactato após 2° sessão de esforço
ND ND ND ND 4,18 ± 0,5** 4,70 ± 0,4**
Resultados expressos como média e DP. n = 10 animais por grupo. *p<0.05 versus controle. E ** versus condição basal. KITT, constante de decaimento da glicose durante o teste de tolerância à insulina. ND, não determinados.
Na Tabela 1, estão apresentados os dados comparativos dos grupos controle (C); obeso sedentário dieta hiperlipídica (Hiper-SD); e obeso exercitado agudamente dieta hiperlipídica (Hiper-EA). Os grupos de animais obesos tiveram maior aumento da massa corporal quando comparados ao grupo controle. Isto mostra que a dieta hiperlipídica utilizada foi eficiente em induzir obesidade nos animais. O comprimento (distância focinho-ânus) não diferiu entre os grupos. O peso da gordura epididimal foi significativamente maior para os grupos que receberam a dieta hiperlipídica quando comparado ao grupo controle. Confirmando
