7- As Técnicas de Genética Molecular_

(1)

As Técnicas de Genética

Molecular

Profª. Nédia C. Ghisi

(2)

AS TÉCNICAS DE

GENÉTICA MOLECULAR

Profª. Nédia C. Ghisi

(3)

Técnicas de Genética Molecular

• 1982 Insulina humana foi o 1º fármaco produzido em E. coli aprovado para uso em humanos nos EUA;

• 1985 hGH (hormônio do crescimento humano)

(4)

gene obtido da bactéria

Agrobacterium sp.

convertido em vitamina A no organismo

(5)

Tecnologia do DNA Recombinante

• Início com a clonagem gênica

– Isolamento do gene

– Inserção em elementos genéticos auto-replicantes Plasmídio ou crs viral: vetor de clonagem

– Amplificação com a replicação do vetor

• Geral/e após a clonagem  sequenciamento: determinação da sequência de p.b. do gene; • Se a função for desconhecida

– comparar com sequências de genes conhecidos em bancos de dados (GenBank)

(6)

Clonagem do organismo: cópia do organismo a partir de uma célula do adulto

Clonagem gênica: separação e replicação de um gene de interesse dentro de um vetor

(7)

Técnicas Básicas usadas para

Identificar, Amplificar e Clonar Genes

• Genoma haploide de mamífero – 3X 109_p.b.

• 1 gene ~ 3.000 pb (éxon)

• 1 em 1 milhão de sequências

Como procurar uma agulha em um palheiro!!! Então, como identificar o segmento de

uma única molécula de DNA que leva um único gene e isolar o suficiente desta sequência para permitir análises moleculares de sua estrutura e função?

(8)

Extração Laboratorial com Kit

http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/ RNase

Nuclei Lysis solution

Cell Lysis solution Protein precipitation solution

DNA Rehydratation solution

(9)

DNA Purificado Remoção do RNA Remoção de outros contaminantes Remoção de lipídeos da Membrana

Lise Celular (física ou quimica)

Extração de DNA

Detergente ou separação por adsorção específica através de membranas

Lavagem

Tratamento com protease Lavagem

Tratamento com Rnase Precipitação com sal

(10)

Extração do DNA

Aula da semana que vem – dia 15/05

Adicionar solução de lise celular. incubar

Centrifugar

Descartar o sobrenadante agite no vórtex

Adicione Solução de lise nuclear Adicione RNase

incubar por 15min a 37°C 5 min temperatura ambiente Adicione solução precipitação de

proteínas  vórtex

Centrifugar

Transfira o sobrenadante para um novo tubo com

isopropanol Centrifugar Descartar o sobrenadante Adicione etanol 70%. Centrifugar Aspire o etanol. Deixe o pellet secar ao ar Ressuspenda o DNA. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

(11)

(12)

Como separar os genes de interesse?

A capacidade de clonar e sequenciar qualquer gene ou sequência de interesse depende de uma classe especial de enzimas

(13)

Enzima de Restrição (1970)

• Endonuclease de restrição bacterianas  reconhecem sequências curtas de DNA de

duplo filamento específicas e dividem o DNA no sítio de reconhecimento (Sitio de restrição)

•  sistema imunológico de procariontes:

protege o material genético de bactérias da invasão de vírus;

(14)

Enzima de Restrição (1970)

• A maioria das enzimas de restrição reconhecem sítios de restrição PALÍNDROMOS

– isto é, são idênticas no sentido 5’3’ em ambos os filamentos

 quando encontra estes sítios, os cortam, independente da origem.

Subi no ônibus

A grama é amarga

(15)

Sítios de restrição

Extremidades aderentes

Extremidades aderentes são úteis para reações de junção subsequentes na reconstrução da molécula recombinante

(16)

(17)

Juntando o DNA

DNA ligase

DNA ligase Enzima de Restrição

Como unir os DNAs de origens diferentes?

(18)

(19)

Devido as extremidades coesivas, moléculas de DNA de diferentes origens podem ser cortadas em pedaços, chamados fragmentos de restrição, e os pedaços podem ser novamente unidos com DNA ligase

(20)

DNA sp 1

DNA sp 2

(21)

• Mas se o DNA for em pouca quantidade??

• Há a necessidade de fazer uma multiplicação deste DNA

(22)

Clonagem de DNA

• Por dois métodos:

(1) Incorporação do DNA de interesse em um pequeno cromossomo autorreplicante (in

vivo vetores de clonagem)

(2) Amplificação do DNA de interesse em um sistema fechado artificial (in vitro)

(23)

Clonagem Molecular in vivo

• Envolve o isolamento de uma sequência de DNA

desejada e a obtenção de múltiplas cópias desta dentro de um organismo hospedeiro (em geral uma bactéria) • É o fundamento da tecnologia do DNA Recombinante

ex. combinações novas de DNA criadas entre sequências de DNA humano de interesse e o DNA bacteriano.

• PS. O organismo utilizado Hospedeiro geralmente possui crescimento rápido e por longos períodos em lab

(24)

FAZENDO UM DNA RECOMBINANTE

• DNA do organismo doador

• Extrair e cortá-lo em fragmentos

• Inseri-lo em pequenas moléculas de DNA abertas, de replicação autônoma (como plasmídios)  vetores

• DNA recombinante: são as moléculas vetoras com suas inserções. Novas combinações de

(25)

(26)

Clonagem de DNA: Vetores de

clonagem

• Na prática insere-se o DNA de interesse em um vetor de clonagem especialmente escolhido – a maioria derivado de plasmídeos ou crs virais.

• Vetor de clonagem= em biologia molecular, uma molécula de DNA usada como veículo para carregar sequências de DNA alheias em uma célula hospedeira

• O vetor deve ter 3 componentes essenciais:

(1) uma origem de replicação (onde se liga a DNA polimerase);

(2) Um gene marcador de presença do plasmídio, geralmente um gene que confere resistência a alguma droga para a cell hospedeira

(3) Pelo menos um sítio de clivagem para a enzima de restrição (sítios de policlonagem)

(27)

Clonagem de DNA: Vetores de

clonagem

• Vetores plasmidiais

– Moléculas extracromossômicas circulares bifilamentares de bactérias;

– Variam de 1kb a 200kb

– Muitos levam resistência a antibióticos: marcadores selecionáveis ideais;

– Ex. Plasmídio pBR322 – leva resistência a ampicilina e tetraciclina

(28)

(29)

(30)

Clonagem de DNA: Vetores de

clonagem

• VETORES DE BACTERIÓFAGOS:

• A maioria derivada do crs do fago λ ;

• 48.502 p.b.  1/3 são genes para lisogenia • 15kb são cortados por enzima de restrição e

podem substituídos por DNA exógeno.

• São introduzidos em E. coli, onde reproduzirão milhares de clones do DNA de interesse

(31)

Estratégia empregada no uso do fago λ

como vetor de clonagem

(32)

• Vetores Cosmidiais

• Alguns genes eucariotos são muito maiores que 15kb.

• Desenvolveu-se o cosmídio  união de fago λ e plasmídio. • Combinam vantagens importantes de fagos e plasmídios: (1) Capacidade dos plasmídios de se replicar autonomamente

em E. coli

(2) Capacidade de embalagem in vitro do crs λ, que facita a transformação eficiente de E. coli

 Levam a origem de replicação e um gene de resistência a antibióticos do plasmídio, mais o sítio cos do fago λ

 Aceitam inserções de DNA de 35-45 kb e ainda podem ser embalado na cabeça do fago.

Clonagem de DNA: Vetores de

clonagem

(33)

(34)

Clonagem de DNA: Vetores de

clonagem

• Vetores eucarióticos e de transporte:

• todos os vetores anteriores replicam-se em E. coli

• Outras espécies ( eucariotos) também foram desenvolvidas para replicação de vetores: S. cerevisae, D. melanogaster, mamíferos, plantas e outras spp.

(35)

(36)

Clonagem de DNA: Vetores de

clonagem

• cromossomos artificiais:

• Alguns genes são realmente muito grandes. Ex. Distrofina humana- 2.000kb

• Crs artificiais de leveduras (YACs): podem acomodar DNA exógeno de 200 – 500kb.

• São minicromossomos de leveduras geneticamente construídos, que contém:

(1) Uma origem de replicação de levedura; (2) Um centrômero de levedura;

(3) Dois telômeros de levedura, 1 em cada ponta; (4) Um marcador selecionável;

(5) Um sítio de policlonagem

(37)

Clonagem de DNA: Vetores de

clonagem

• Crs artificiais de Bactérias (BACs) e crs artificiais P1 (PAC) de bacteriófago.

– Aceitam inserções de 150 -300 kb

– BACs e PACs são menos complexos e mais fáceis de construir que YACs.

– Replicam-se em E. coli

– pela sua simplicidade tem substituído os YACs nos estudos de grandes genomas como de humanos e grandes

mamíferos.

– Podem ser selecionados contra vetores que não tem o inserto do DNA de interesse – os plasmídios com inserto podem crescer em meio contendo 5% de sacarose,

(38)

(39)

• Mas se a quantidade de DNA for realmente muito pequena?

(40)

Reação em Cadeia da Polimerase - PCR

(1985)

• PCR amplifica seletivamente uma única molécula de DNA ou RNA várias milhões de vezes em algumas horas

• Permite a detecção e análise de sequências de genes específicos na amostra de um paciente, sem necessidade clonagem in vivo.

(41)

22_{= 4 cópias} N° de Ciclos cópias de DNA 21_{= 2 cópias de DNA} 23_{= 8 cópias} ₂₄_{=16 cópias} 230_{= 1.073.741.824 cópias}

(42)

PCR

• A PCR está desenhada de acordo com o princípio natural de replicação de DNA • Este é um processo que decorre em três

passos, que em conjunto se designam como um ciclo e que se repete um número

específico de vezes. Ciclo: 1. Desnaturação

2. Hibridização ou Annealing 3. Extensão

(43)

DNA do organismo de interesse

(44)

Termociclador –

Aparelho usado

para PCR

(45)

1)Desnaturação

• ~90°C= temperatura quebra as pontes de H • Abertura da dupla hélice _90°C

(46)

2) Hibridização

• O Primer se liga com o abaixamento da temperatura (entre 45 e 65°C)

• vai marcar onde começa a síntese de DNA

O primer determinará qual a sequência a ser amplificada.

(47)

3) Extensão

• Polimerização do novo DNA, realizado pela

Taq polimerase (72°C), uma proteína

termo-estável

(48)

(49)

(50)

Como visualizar o DNA?

Eletroforese

• Significa literalmente = deslocar com eletricidade

• Consiste na migração e separação de partículas em um suporte, submetidas a uma diferença de potencial elétrico

• Suporte= geralmente gel (agarose, poliacrilamida)

• O DNA é negativo graças aos seus oxigênios é atraído em direção ao pólo positivo e repelido pelo negativo

(51)

Eletroforese

• Os DNA’s distribuem-se por tamanho no gel.

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

Linha A: Ladder com fragmentos de DNA de tamanho conhecido

Linha B: Fragmentos de um DNA após a

(57)

PCR- Aplicações

• Detecção de mutações que causam doenças

– Deleções, inserções

– Detecção de portadores (heterozigotos)

• Detecção de doenças parasitárias

• Estudos evolutivos ou de variabilidade • Melhoramento genético

(58)

(59)

• 3 X mais testosterona

• Órgãos externos femininos • Internamente, órgãos

masculinos que produzem testosterona

(60)

PCR- Aplicações

• Detecção de doenças infecciosas por bactérias, vírus e fungos:

– Neisseria gonorrhoehae – Clamídia

– Tuberculose – HIV

– HPV

* Em substituição aos testes sorológicos e microbiológicos