Resposta imune à infecção por Mycobacterium bovis em linhagens de camundongos geneticamente selecionados (Seleção IV-A)

Resposta imune à infecção por Mycobacterium

bovis – AN

em linhagens de camundongos

geneticamente

selecionados (Seleção IV-A).

Dissertação apresentada a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista – UNESP- Campus de Botucatu, para a obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Vigilância Sanitária.

Botucatu – SP 2004

Resposta imune à infecção por

Mycobacterium bovis – AN

em linhagens de

camundongos geneticamente

selecionados (Seleção IV-A).

Dissertação apresentada a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista – UNESP- Campus de Botucatu, para a obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Vigilância Sanitária.

Orientador: Prof. Ass. Dr. Antônio Carlos Paes.

Botucatu – SP 2004

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS

Cavalheiro, Juliana Semim.

Resposta imune à infecção por Mycobacterium bovis em linhagens de camundongos geneticamente selecionados (Seleção IV-A) / Juliana Semim Cavalheiro. – 2004.

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2004. Orientador: Antônio Carlos Paes

Assunto CAPES: 50502034

1. Resposta imune 2. Imunologia veterinária

CDD 636.0896079

Palavras-chave: Aspectos imunológicos; Estudos experimentais; Mycobacterium bovis

A minha avó Anna (in

memorian), que de uma forma muito especial está sempre olhando por mim, dando-me força para prosseguir.

Aos meus pais JOSÉ CARLOS e IRACEMA:

Dedico a vocês este trabalho, as dificuldades foram grandes, a saudade maior ainda, vocês abriram mão de seus sonhos para que mais uma vez

eu pudesse realizar o meu. As palavras nunca serão suficientes para agradecer.

“Se um dia, já homem feito e realizado, sentires que a terra cede a teus pés e que tuas obras desmoronam, que não há ninguém à tua volta para te estender a mão, esquece a tua maturidade, passa pela tua mocidade, volta a tua infância e balbucia, entre lágrimas e esperança, as últimas palavras que sempre estarão n’alma: Minha mãe, Meu pai”

Rui Barbosa.

“Você não é um ser humano que está passando por uma experiência espiritual. Você é um ser espiritual que está

vivenciando uma experiência humana”.

RAFAELA. A distância não permite um convívio mais intenso com

minha sobrinha, mas meu amor por ela não tem limites.

Ao meu irmão RAFAEL, que também está longe de casa, dando os primeiros passos para conseguir alcançar seus objetivos. Não desista nunca!

Ao meu namorado DANILO:

Muitas vezes chorei em seu ombro, cansada de tudo, querendo

desistir, mas você sempre me deu força e me ensinou o significado da palavra otimismo.

Muito obrigada por fazer parte da minha vida. Te amo.

O caminho foi longo, o convívio intenso e a conquista de grandes amigos se torna fundamental.

Especial ao Prof o Ass. Dr. Antonio Carlos Paes, meu orientador, que me proporcionou ingressar no mestrado e construir novos caminhos.

Especial ao Prof o Dr Sílvio Luis de Oliveira, que não apenas me proporcionou as condições para a realização deste trabalho, como o assumiu com toda dedicação. Muito obrigada pela atenção e amizade.

Aos professores do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, pelas colaborações e ensinamentos prestados.

Aos professores do Departamento de Microbiologia e Imunologia, pela atenção desprendida e disponibilidade para ensinar.

A Profa Dra. Lisiane de Almeida Martins, pela sua competência e ensinamentos práticos de grande valia na execução do meu trabalho.

Aos técnicos de laboratório Fernando José Paganini Listoni, Adriana Cristina Pavan Vieira e Tânia Maria Martins, por toda ajuda para elaboração deste trabalho.

A todos os funcionários do Departamento de Microbiologia e Imunologia, em especial Luís Severino (Lula), Maria de Lurdes e Luís Alquati.

As secretárias do Departamento de Microbiologia e Imunologia, Sônia Faraldo e Leonice Garcia, por toda ajuda prestada.

As secretárias do curso de pós-graduação Denise e Maria, sempre dispostas a ajudar.

Ao meu amigo Welligton Borges da Silva, pela amizade e companhia nesses anos todos. Obrigada por ter sua amizade.

Aos meus amigos de República, que mesmo longe nunca esquecerão que já fomos uma família: Daniel Moura de Aguiar, Keila Cristina de Lima, Amanda Keller Siqueira, Isabela Bazzo da Costa, Cristiane Bazzo da Costa, Cristiano Galhardi, Rodrigo Perenette.

Aos meus amigos Pós-Graduandos, João Gustavo, Maria Cristina, Ricardo, Fabiane, Gladston e Michele.

A todos da minha família, pelos momentos que passamos juntos: tias, tios e primas.

A família Carreira, que hoje também se tornou minha família, em especial aos meus futuros sogros Lucélia e Ednei, muito obrigada pelo carinho.

À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia e Instituto de Biociências - UNESP – Campus Botucatu, pela oportunidade de realizar este trabalho e por permitir que meus conhecimentos fossem ampliados.

tubérculos característicos, tendo como agente etiológico o Mycobacterium bovis - um patógeno intracelular.

A imunidade celular é o mecanismo mais efetivo para o controle da infecção por Mycobacterium spp. Esta resposta resulta no acúmulo de fagócitos e na formação de lesão macroscópica (tubérculo ou granuloma tuberculoso), na tentativa de impedir a proliferação e disseminação bacteriana.

Neste trabalho foram utilizados modelos experimentais murinos, obtidos por seleção genética bidirecional de camundongos bons (High=H) e maus (Low=L) produtores de anticorpos (Seleção IV-A) contra antígenos naturais complexos.

Trabalhos anteriores demonstraram alterações funcionais de células imunocompetentes, particularmente de macrófagos,

sugerindo que os animais H_IV-A seriam mais susceptíveis à infecção causada por patógenos intracelulares, enquanto que ocorreria maior susceptibilidade dos L_IV-A à infecção por patógenos extracelulares, quando a imunidade humoral seria o mecanismo mais importante.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade macrofágica e caracterizar a resposta imune de camundongos inoculados com Mycobacterium bovis- AN₅.

O perfil de resposta anteriormente observado nestas linhagens não se manteve na infecção por Mycobacterium bovis,

Mycobacterium tuberculosis e Bacilo Calmette-Guérin.

Quanto à recuperação bacteriana no pulmão, a linhagem LIV-A apresentou maior contenção do processo infeccioso, não sendo

observado o mesmo no baço, onde a linhagem HIV-A apresentou-se

mais resistente.

Quanto à atividade macrofágica, observamos a não participação do peróxido de hidrogênio (H2O2) na contenção do

processo infeccioso nas linhagens, visto que obtivemos inibição da produção deste metabólito.

A produção de óxido nítrico (NO) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) também foi analisada, e estes demonstraram-se importantes no controle da multiplicação bacteriana, variando de acordo com a linhagem, período e compartimento analisado.

A produção de anticorpos também foi avaliada, e verificou-se que o efeito multiespecífico normalmente observado nestas linhagens não foi mantido para resposta ao Mycobacterium bovis.

A linhagem LIV-A apresentou concentração de anticorpos

superior ao HIV-A no início do processo infeccioso, igualando-se a

resposta nos períodos subseqüentes.

Estes dados foram comparados com a expressão da Reação de Hipersensibilidade Tardia (HT) a qual apresentou-se maior

genética quantitativa independente.

Houve variação de acordo com o órgão analisado e o metabólito envolvido, indicando que diferentes mecanismos intervém na fase avançada da infecção por Mycobacterium bovis em populações naturais heterogênias, sugerindo que a produção de NO, TNF-α e citocinas liberadas por células Th1, indiretamente avaliadas pela reação de HT, estão envolvidas na contenção do processo infeccioso.

Palavras-chave: Aspectos Imunológicos; Estudos Experimentais; Mycobacterium bovis-AN5.

chronic and progressive character, with typic tubercles. Its etiological agent,

Mycobacterium bovis, is an intracellular pathogen.

Cell-mediated immunity is the most effective mechanism for this infection control, with phagocytes accumulum and formation of a

macroscopic lesion, aiming to avoid the bacteria proliferation and dissemination.

In this work, a murine experimental model was used, with mice genetically selected for high (H) and low (L) antibody production (Selection IV-A).

Previous works related functional alterations in immunecompetent cells, manily macrophages, suggesting that HIV-A mice

were more susceptible to intracellular pathogens, whereas LIV-A were more

susceptible to extracellular ones, when humoral-mediated immunity would be the most important mechanism.

The goal of this work was to evaluate the macrophagic activity and to characterize the immune response of Mycobacterium bovis-AN5

-infected mice.

The response prolife previously observed in these strains was not similar in the Mycobacterium bovis infection; however, it was in agreement with works carried out with selection I, which is very similar the selection IV-A with regards to infection with Mycobacterium tuberculosis and Bacillus Calmette-Guérin.

an inibition of this metabolite generation.

NO and TNF-α production was also analysed, and seemed to be important in the control of bacterial replication, varying according to the strain, time period and compartiment.

Antibody production was also evaluated, verifying that the multi-especific effect commonly observed in these strains was not the same in response to Mycobacterium bovis. LIV-A selection showed higher antibody

concentrations than HIV-A in the beginning of the infection, being similar

afterwards. These data were compared with the expression of delayed-type hypersensitivity (DTH), which was higher in the HIV-A selection than in LIV-A,

showing that antibody production is independent of the ability to produce DTH reactions, and that cellular and humoral responses to Mycobacterium

bovis antigens show a polygenic control and an independent quantitative

genetic regulation. Differences were observed in the organs and metabolites, suggesting that different mechanisms play an important role in this infection in natural heterogeneous populations, indicating that NO,

TNF-α and Th1 cytokines are involved in the containnment of this infection.

1.1. Infecção por Mycobacterium bovis...20

1.2. Mecanismos de ativação macrofágica...31

1.3. Modelos Experimentais...35

2. Objetivos...41

3. Material e Métodos...42

3.1. Animais...42

3.2. Inóculo...42

3.3. Infecção dos animais...43

3.4. Sacrifício dos animais...43

3.5. Recuperação de bactérias viáveis...44

3.6. Avaliação da atividade macrofágica...45

3.6.1. Cultura de macrófagos peritoneais, esplênicos e pulmonares...45

3.6.2. Determinação da produção de intermediários reativos do oxigênio...46

. 3.6.3. Determinação da produção de intermediários reativos do nitrogênio...47

3.6.4. Ensaio Biológico para produção de TNF-α...48

3.7. Titulação de Anticorpos totais...50

3.8. Reação de Hipersensibilidade Tardia...50

4.2.1. Produção de H2O2 por macrófagos peritoneais...54

4.2.2. Produção de H2O2 por macrófagos esplênicos...57

4.2.3. Produção de H2O2 por macrófagos pulmonares...59

4.3. Produção de óxido nítrico...61

4.3.1. produção de NO por macrófagos peritoneais...61

4.3.2. produção de NO por macrófagos esplênicos...63

4.3.3. produção de NO por macrófagos pulmonares...64

4.4. Produção de TNF-α...65

4.5. Produção de Anticorpos Totais...66

4.6. Reação de Hipersensibilidade Tardia ...67

5. Discussão...68

6. Conclusão...80

CO₂ – gás carbônico

ELISA – ensaio imuno-enzimático (Enzyme-Linked Imunosorbent

Assay)

GM-CSF – fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos HE – eritrócitos humanos

HT – hipersensibilidade tardia

H_IV-A – camundongos bons (H=High) produtores de anticorpo-Seleção IV-A

LIV-A – camundongos maus (L=low) produtores de

anticorpos-Seleção IV-A

H_I – camundongos bons produtores de anticorpos - Seleção I L_I – camundongos maus produtores de anticorpos - Seleção I

LPS – lipopolissacaride I.V. – intra-venoso

H₂O₂ – peróxido de hidrogênio

IFN-γ – interferon-gama

MCCC – meio completo para cultura de células MHC – complexo principal de histocompatibilidade

O-₂ – superóxido OONO- – peroxinitrito

PBS – solução salina tamponada (Phosphate Buffer Saline) PMA – fhorbol mirestate acetate

RNIs – intermediários reativos do nitrogênio ROIs – intermediários reativos do oxigênio SE – eritrócito de carneiro

TNF-α – fator de necrose tumoral alfa Th1 – linfócito T auxiliar tipo 1

pulmonares, de camundongos H_IV-A e L_IV-A, infectados com Mycobacterium bovis-AN₅.

Figura 2: Recuperação de bactérias viáveis em fragmentos

esplênicos, de camundongos H_IV-A e L_IV-A, infectados com

Mycobacterium bovis-AN5.

Figura 3: Comparação da produção de H₂O₂ por macrófagos

peritoneais de camundongos HIV-A e LIV-A infectados com

Mycobacterium bovis-AN₅ em diferentes períodos e em relação a seus respectivos controles.#: diferença interlinhagens. +: diferença entre infectados e seus respectivos controles.

.

Figura 3-A: Produção endógena de H₂O₂ por macrófagos de

camundongos das linhagens HIV-A e LIV-A, infectados.

Figura 3-B: Produção de H₂O₂ por macrófagos de camundongos H_IV-A e LIV-A infectados e submetidos a estimulo adicional por PMA.

Figura 4: Comparação da produção de H₂O₂ por macrófagos

esplênicos de camundongos HIV-A e LIV-A infectados com

Mycobacterium bovis-AN₅ em diferentes períodos e em relação a seus respectivos controles. .#: diferença interlinhagens. +: diferença entre infectados e seus respectivos controles.

Figura 4-A: Produção endógena de H₂O₂ por macrófagos de

camundongos das linhagens HIV-A e LIV-A, infectados.

Figura 4-B: Produção de H₂O₂ por macrófagos de camundongos H_IV-A e LIV-A infectados e submetidos a estimulo adicional por PMA.

Figura 5: Comparação da produção de H₂O₂ por macrófagos

Figura 5-B: Produção de H₂O₂ por macrófagos de camundongos H_IV-A e L_IV-A infectados e submetidos a estimulo adicional por PMA.

Figura 6: Concentração micromolar (µM) da produção de NO em

sobrenadantes de cultura de macrófagos peritoneais de

camundongos HIV-A e LIV-A controles e infectados com Mycobacterium

bovis-AN₅.

Figura 7: Concentração micromolar (µM) da produção de NO em

sobrenadantes de cultura de macrófagos esplênicos de

camundongos H_IV-A e L_IV-A controles e infectados com Mycobacterium bovis-AN5.

Figura 8: Concentração micromolar (µM) da produção de NO em

sobrenadantes de cultura de macrófagos pulmonares de

camundongos H_IV-A e L_IV-A controles e infectados com Mycobacterium bovis-AN₅.

Figura 9: Concentração de TNF-α em soros de animais H_IV-A e L_IV-A controles e infectados com Mycobacterium bovis-AN₅.

Figura 10: Titulação de anticorpos totais anti-Mycobacterium

bovis-AN5. Resultados expressos em log2 referentes à média +/- DP.

Figura 11: Média +/- DP da Reação de hipersensibilidade tardia

desencadeada com inóculo inativado aos 14 dias da sensibilização de camundongos H_IV-A e L_IV-A com suspensão viva de 3,0x107 bactérias/0,2mL de Mycobacterium bovis-AN5.

1) INTRODUÇÃO

1.1 Infecção por Mycobacterium bovis

A tuberculose acompanha a espécie humana desde a mais remota antiguidade, afligindo-a desde o período neolítico, sendo objeto de relatos nos Vedas e outros textos antigos da Índia, sob a denominação de “rajayakshman”, ou seja, “o rei das doenças” (GRANGE, 1990).

Múmias da Dinastia de RAMSÉS, com mais de três mil anos de existência apresentavam lesões tuberculosas em coluna vertebral, chamado de mal de POTT (CORRÊA & CORRÊA, 1992).

Hipócrates descreveu as lesões tuberculosas humanas, pulmonares e vertebrais, no ano de 400 AC e a doença era comum em populações da Grécia e Império Romano, sendo que Aristóteles suspeitava que fosse contagiosa já naquela época (GRANGE, 1990; CORRÊA & CORRÊA, 1992).

A tuberculose tem sido considerada uma das mais temíveis mazelas da humanidade, já causou mais mortes do que qualquer outra doença conhecida, sendo por isso, denominada de “o grande flagelo branco”; a mais temível doença contagiosa que a humanidade já sofreu (GRANGE, 1990; BLANCOU, 1994).

O termo tuberculose teve sua origem a partir do vocábulo “tubércles” utilizado por SYLVIUS, em 1671, para descrever as lesões da doença nos pulmões de pessoas por ela vitimadas. LAENEC estabeleceu a distinção entre as formas miliar, caseosa e exsudativa; e

BAILLIE, em 1908, descreveu as lesões granulomatosas (PERRONE, 1996).

A localização pulmonar da tuberculose humana, pelo Mycobacterium bovis, ocorre com menor intensidade, porém sua freqüência não é desprezível nos grupos ocupacionais que estão em contato com bovinos afetados. Os recursos diagnósticos, clínicos, radiológicos ou imunoalérgicos (Mantoux) não são satisfatórios para distinguí-la do agravo decorrente da infecção pelo Mycobacterium tuberculosis (ACHA & SZYFRES, 1986).

A localização extra-pulmonar do bacilo da tuberculose bovina na espécie humana não se deve à afinidade pelos tecidos, e sim, pelo mecanismo de transmissão, que envolve quase sempre a ingestão de leite cru e subprodutos lácteos não pasteurizados (BEER, 1981).

A primeira descrição da forma pulmonar de tuberculose em bovinos foi realizada por COLUMELA, no ano 40 da era cristã, até a metade do século passado não havia sido realizada a correlação entre a tuberculose humana e animal (BEER, 1981).

O mal perolado das membranas serosas, descrito sob a forma de múltiplas lesões, similares a tumores, nas serosas dos bovinos, hoje conhecido como tuberculose miliar ou de pequenos nódulos, era considerado, até o final do século XVIII, como uma forma de sífilis

transmitida por pessoas doentes que mantinham relações zoofílicas com esses animais (BEER, 1981; CORRÊA & CORRÊA, 1992).

KLENKE, um médico em Braunschweig, relacionou pela primeira vez, o consumo de leite de vaca e o aparecimento de escrófulas. Na primeira metade do século XIX ocorreram alterações nos conhecimentos sobre tuberculose, destacando-se contribuições de GURLT em 1831, HERIN em 1849 e FUCHS em 1859, que passaram a considerar a tuberculose pulmonar dos bovinos igual à tuberculose pulmonar humana; e de SPINOLA, em 1855, HAUBNER, em 1862 e GERLACH, em 1869, que estabeleceram a mesma correlação em relação à tuberculose miliar ou de pequenos nódulos; apesar do ponto de vista discordante de VIRCHOW que considerava a tuberculose bovina uma forma de sarcoma similar aos linfossarcomas humanos, não admitindo a ocorrência de tubérculos verdadeiros nos animais (BEER, 1981).

Foi JEAN ANTOINE VILLEMIN, em 1868, que estabeleceu claramente a natureza da transmissibilidade da tuberculose. Este autor demonstrou que a tuberculose podia ser produzida em coelhos e cobaias através da inoculação de material retirado das lesões tuberculosas humanas e bovinas; podia ser passada de animal para animal; e que existia diferença de virulência entre os materiais provenientes de seres humanos e de bovinos (BEER, 1981; GRANGE, 1990; CORRÊA & CORRÊA, 1992).

ROBERT KOCH, em 1882, valendo-se de uma série de inoculações de culturas puras do agente, por ele isolado, transmitiu a doença para muitas espécies animais, provando que havia realmente isolado o agente etiológico da tuberculose, posteriormente chamado por LEHMAN e NEUMMAN, em 1896, de Mycobacterium tuberculosis (WOLINSKY, 1979; BEER, 1981; GRANGE, 1990; CORRÊA & CORRÊA, 1992).

A Real Comissão Britânica da Tuberculose referia-se a amostra bovina como Mycobacterium bovis, porém essa nomenclatura não foi legitimada para publicação até 1970 (PRITCHARD, 1988).

Apesar da afirmação de KOCH, em 1901, no Congresso Britânico de Tuberculose, que o homem era muito mais resistente ao bacilo bovino, a Real Comissão Britânica da Tuberculose, em 1911, afirmou, em seu relatório final, que o bacilo bovino apresentava alto grau de patogenicidade para espécie humana, especialmente para as crianças, podendo afetar os adultos inclusive através da forma pulmonar da doença e que os bovinos eram inteiramente refratários ao bacilo humano (CORRÊA & CORRÊA, 1992).

A tuberculose bovina é uma doença transmissível, de natureza granulomatosa crônica e caráter progressivo, apresenta tubérculos característicos; tem como agente etiológico específico o Mycobacterium bovis, e o seu aparecimento está estreitamente associado a múltiplos fatores condicionantes (BEER, 1981; JONES & HUNT 1983;

GRANGE, 1990; CORRÊA & CORRÊA, 1992; BLOOD et al., 1994; NEILL, 1994).

O agente da tuberculose pertence a ordem Actinomycetalis;

gênero Mycobacterium; e atualmente considera-se que o Mycobacterium tuberculosis constitui o protótipo de um complexo tuberculose, composto ainda pelo Mycobacterium bovis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium microti, Mycobacterium africanum e Bacilo Calmette-Guérin (BCG), fenotípicos e geneticamente similares (MAGARÃO et al., 1980; MARKS, 1993; WARREN & BODY, 1995).

O bacilo cresce lentamente e possui uma parede celular que o protege dos agentes químicos, sendo destruído por agentes físicos como o calor, raios ultra-violeta da luz solar e radiações ionizantes, bem como por desinfetantes a base de fenóis orgânicos, e ao abrigo da luz, sobrevive em instalações por longos períodos. Sua população duplica-se em 18 à 48 horas, dependendo da maior ou menor oferta de oxigênio, do pH do meio e da facilidade de nutrientes, este crescimento lento do bacilo condiciona a evolução crônica da doença. O agente não consegue sobreviver no meio externo, a não ser por algumas horas fora do organismo hospedeiro, onde cresce e se multiplica; fora do hospedeiro só consegue se desenvolver em meios de cultura especiais como os meios Petragnani, Stonebrink e Loewenstein-Jensen (BATES, 1980; MOULDING, 1988).

Corados pelo método de Ziehl-Nieelsen, são bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), por reterem a coloração vermelha da fucsina fenicada, mesmo após tratamento da lâmina por ácido sulfúrico 1N e álcool 70. São imóveis, não possuem cápsula e não formam esporos (CORRÊA & CORRÊA, 1992; BEER, 1981).

Por ser um microrganismo aeróbico estrito, infecta os pulmões e aí permanece; e a ligação deste órgão com o meio exterior favorece sua transmissão. Possui um período de incubação de 60 à 90 dias em aerobiose, uma taxa de letalidade de 8 a 10% e de morbidade de 50%, independe de sexo, clima e região (BATES, 1980; MOULDING, 1988).

A parede celular do Mycobacterium bovis é composta por quatro camadas a partir da membrana celular. A camada mais profunda é composta de mureína ou peptidioglican; esta por sua vez é coberta por uma segunda camada de arabinogalactan, uma macromolécula ramificada constituída de arabinose e galactose. A cadeia lateral do arabinogalactan é ligada a uma terceira camada, composta de ácido micólico, que é constituído por uma longa cadeia de ácidos graxos e é o maior componente da parede celular, contribuindo para sua espessura e retenção de corantes ácidos. A camada mais superficial é composta por vários lipídeos, como glicosídeos fenólicos, peptidoglicolipídios denominados micosídios que protegem a micobactéria no meio intracelular contra os efeitos nocivos de intermediários reativos do

oxigênio e nitrogênio e trealose-6-6’- dimicolato ou fator corda, sendo este responsável pelo crescimento bacteriano em forma de serpentina, quando em meio líquido e determinante de patogenicidade (WOLINSKY, 1979; GRANGE, 1990; THOEN & STEELE, 1995; COLLINS, 1996).

Nos bovinos adultos 80 a 90 % das infecções ocorrem pela via aerógena e 10 à 20 % pela via digestiva, contrariamente ao que ocorre com bezerros que usualmente se infectam por via digestiva, em consequência à ingestão de leite oriundo de vacas tuberculosas, embora a via aerógena possa contribuir no caso de convívio com outros animais portadores de tuberculose aberta das vias aéreas; constituindo uma raridade a infecção transplacentária (ALHAJI, 1976; BEER, 1981; CORRÊA & CORRÊA, 1992).

Uma vez instalada, a evolução do processo encaminha-se para o estabelecimento de uma doença progressiva, devido a fatores de patogenicidade presentes no Mycobacterium bovis, ligados aos componentes lipídicos da parede celular. Após fagocitar o bacilo os macrófagos tentam destruí-lo, porém o bacilo virulento possui capacidade de resistir ou escapar da destruição (THOEN & STEELE, 1995). Radicais reativos do oxigênio liberados após contato com o bacilo são capazes de matar outras bactérias, porém exercem pequeno efeito sobre o bacilo virulento devido a ação dos micosídeos (THOEN & STEELE, 1995; COLLINS, 1996).

O glicolipídio trealose-6-6’dimicolato, chamado fator corda, inibe a migração de leucócitos, possui ação leucotóxica, induz degeneração e destruição de mitocôndrias, ribossomos e retículo endoplasmático de hepatócitos (THOEN & HIMES, 1994; THOEN & STEELE, 1995).

Técnicas bioquímicas permitem o isolamento e identificação de glicolipídeos contendo enxofre na molécula, denominados sulfolipídios ou sulfatidas, responsáveis pela sobrevivência do Mycobacterium bovis virulento no interior de macrófagos pela inibição da formação do fagolisossomo evitando a exposição do agente às enzimas líticas presentes nos lisossomos. Os sulfolipídios também inibem a fosforilação oxidativa nas mitocôndrias e induzem alterações na função fagocítica celular que contribui para o decréscimo da capacidade dos macrófagos em responder com eficiência ao bacilo da tuberculose (THOEN & HIMES, 1994; THOEN & STEELE, 1995; COLLINS, 1996).

Inúmeros produtos microbianos ativam diretamente os monócitos e macrófagos, ou indiretamente, pelo desencadeamento da liberação de citocinas destas ou das células natural killer (NK). As citocinas ativam então os fagócitos, e para que estes se tornem completamente ativados, freqüentemente é necessária a presença de linfocinas liberadas in vivo, durante as respostas mediadas por células T. A linfocina mais freqüentemente envolvida é o interferon-gama (INF-γ),

que favorece os mecanismos de destruição do patógeno, oxigênio-dependente. Existem também, informações envolvendo a interleucina-2 (IL-2), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos

(GM-CSF), fator de necrose tumoral (TNF-α) e outras linfocinas (ROIT et al., 1997).

A imunidade celular, mediada por linfócitos T, é o mecanismo mais efetivo para o controle de uma infecção por Mycobacterium spp. Este fato é comprovado por estudos que, utilizando material de lavado broncoalveolar, demonstraram quantidade de linfócitos T CD4+ (predominantemente linfócitos T helper ) aumentada

em relação a indivíduos normais. A produção de anticorpos contra antígenos polissacarídicos da micobactéria já foi demonstrada, porém, não existem evidências que comprovem um papel efetivo destes anticorpos nos mecanismos de imunidade, hipersensibilidade e patogenicidade e, um método que indica a efetividade do sistema imune na tuberculose consiste na Reação de Hipersensibilidade Tardia (HT). A resposta celular na tentativa de controlar a doença resulta no acúmulo de grande número de fagócitos e finalmente, na formação de uma lesão macroscópica referida como tubérculo ou granuloma tuberculoso. A formação do granuloma tuberculoso é uma tentativa por parte do hospedeiro de localizar o processo da doença e desenvolver mecanismos inflamatórios e imunes para destruir o bacilo. O tecido conectivo fibroso

desenvolvido na dinâmica de formação do granuloma contribui para a localização das lesões (THOEN & STEELE, 1995).

As células que compõem o granuloma tuberculoso típico são os macrófagos, células epitelióides, macrófagos policariontes ou células gigantes de inflamação e linfócitos; sendo a célula epitelióide o componente característico da reação granulomatosa (MARIANO, 1995). O granuloma também protege a bactéria frente a resposta imune e é provavelmente o responsável pela persistência ou latência da infecção natural (ABBAS et al., 1998).

Por motivos ainda não esclarecidos, os lisossomos dos macrófagos, que contém enzimas capazes de destruir o bacilo, não conseguem se fundir com os fagossomas onde eles estão contidos. Uma primeira tentativa de combater a micobactéria pelo macrófago se faz com a produção de ácidos, praticamente inócuos para um bacilo álcool-ácido resistente. A multiplicação bacilar provoca a morte do macrófago, com liberação de lisossomas e destruição tecidual. Forma-se, então, uma reação inflamatória inespecífica, com acúmulo de polimorfonucleares na região em que os bacilos se instalaram, que uma vez organizada em granuloma constitui a lesão inicial da tuberculose (BATES, 1980; FIUZA & AFIUNDE, 1993; GONTIJO, 1978; MOULDING, 1988).

Na tuberculose cabe ao macrófago alveolar assumir o papel de célula apresentadora, decodificando os componentes antigênicos do bacilo e apresentando-os ao sistema imunológico celular, representado

por células linfocitárias do tipo T, categoria CD4. Pelo menos dois sub-tipos de linfócitos CD4 parecem ter um papel no reconhecimento de antígenos bacilares: o alfa/beta, responsável pelo reconhecimento de antígenos de alto peso molecular, e os gama/delta, pelos de baixo peso molecular. Quanto ao sistema imune humoral, há estimulação de plasmócitos e produção de anticorpos, que não tem importância na defesa contra a doença, na medida em que não conseguem agir contra o bacilo.

Apesar da ineficácia do mecanismo de destruição, o macrófago infectado passa a liberar substâncias que atraem os linfócitos T para o sítio de infecção, ao mesmo tempo em que apresenta epítopos imunogênicos (proteínas e polissacarídeos) em sua superfície, via complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe II. Os linfócitos T estimulados elaboram linfocinas (exemplo: INF-γ), as quais tornam os macrófagos mais eficientes no processo de digestão enzimática, mediante a formação de óxido nítrico (NO), que é um potente agente antimicobacteriano. Todo este mecanismo representa o combate do sistema imune contra a proliferação e disseminação bacteriana (CASTELO, 1993; FIUZA & AFIUNDE, 1993).

1.2 Mecanismos de Ativação Macrofágica

Os macrófagos são conhecidos como células essenciais do sistema imunológico do indivíduo, podendo aumentar ou suprimir reações imunes. Várias mudanças na estrutura e função, envolvendo eventos endógenos e secretórios, tem sido observados durante a estimulação destas células (KARNOVSKY & LAZDING, 1978; COHN, 1978).

São dois os principais mecanismos pelos quais os macrófagos podem ser ativados: em consequência da sua interação com microorganismos e seus produtos, tais como endotoxinas e componentes da parede celular (MORRISON & RUDBACK, 1981; ADAMS & HAMILTON, 1987; MOONIS et al., 1992); e ainda através de linfocinas produzidas por linfócitos CD4, tais como interferon-gama (INF-γ) (NATHAN et al., 1979), fator estimulador de colônias de granulócitos e

macrófagos (GM-CSF) e fator de necrose tumoral (TNF-α) (REED et al., 1987; HOFFMAN & WEINBERG, 1987).

O INF-γ, produzido por linfócitos T ativados, foi descrito como um potente ativador de macrófagos (NATHAN et al., 1979). Após exposição ao INF-γ, macrófagos desenvolvem a capacidade de secretar peróxido de hidrogênio (H2O2), estimulando sua atividade microbicida

protozoários (NATHAN, 1983) e fungos (BEAMAN et al., 1983; BRUMMER et al., 1985; FLESH et al., 1989).

Uma das alterações metabólicas que ocorre quando o macrófago é ativado, devido a exposição aos estímulos acima citados, é o aumento da atividade microbicida, fagocítica e citotóxica (MACKENESS, 1964; RABINOVITCH, 1975). Essas alterações envolvem também modificações bioquímicas (KARNOVSKY & LAZDING, 1978), aumento da capacidade de aderência, espraiamento sobre superfícies de vidro (MACKENESS & BLANDER, 1967; RABINOVITCH, 1975) e expressão de moléculas de classe II (MOONIS et al., 1992).

A ativação do burst respiratório com conseqüente aumento da produção de metabólitos do oxigênio, tais como o ânion superóxido (O₂-) e peróxido de hidrogênio (H₂O₂) é considerada como uma importante medida de ativação macrofágica, sendo este aumento altamente relacionado para vários microrganismos com concomitante aumento da atividade microbicida. Assim, a habilidade que os macrófagos ativados possuem de destruir Leishmania, Micobactéria e

Cândida correlaciona-se com sua capacidade de produzir peróxido de

hidrogênio (H₂O₂). No entanto, os macrófagos podem destruir microrganismos por mecanismos não oxidativos tais como acidificação dos fagossomos, lisozima, proteínas catiônicas e componentes do sistema complemento (MOONIS et al., 1992).

O superóxido e o peróxido de hidrogênio, além de possuírem atividade citotóxica, microbicida e tumoricida (ROSEN & KLEBANOFF, 1979; NATHAN et al., 1979) são também mediadores importantes nos processos imunorreguladores e inflamatórios (WEISS, 1989; WINROW et al., 1993; LOS et al., 1995), onde participam como indutores da expressão de citocinas (IL-6, TNF-α, INF-γ, GM-CSF) (ROTH & DROGE, 1987; SCHRECK & BAEUERLE, 1991) e alteram a expressão de moléculas de adesão (PATEL et al., 1991; SELLAK et al., 1994).

Entre os agentes capazes de desencadear o burst respiratório estão microorganismos opsonizados (vírus, bactérias, parasitas), ésteres de forbol, radiação gama, luz ultra-violeta, zimosan, esferas de látex, componentes do complememto (CHESON et al., 1977; PHILLIPS & HAMILTON, 1989), além de outras substâncias como o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (NATHAN et al., 1979; PHILLIPS & HAMILTON, 1989) e o lipopolissacaride (LPS) de bactérias Gram-negativas e algumas citocinas, como o INF-γ e o TNF-α e GM-CSF.

Um outro importante mecanismo microbicida dos macrófagos ativados por citocinas é o óxido nítrico (NO). O óxido nítrico é uma molécula pequena e simples, composta por átomos simples de oxigênio e nitrogênio, sintetizada do aminoácido L-arginina por uma família de enzimas chamadas NO sintases (ADAMS, 1996).

Macrófagos (HIBBS et al., 1988; HEVEL et al., 1991), monócitos (SALVEMINI et al., 1990), neutrófilos (McCALL et al., 1989) e linfócitos (KIRK et al., 1990) produzem grande quantidade de NO durante as reações imunológicas (NATHAN & HIBBS, 1991) e choque séptico (SZABO et al., 1993).

Os macrófagos produzem alta quantidade de NO, suficientes para matar ou retardar o crescimento de bactérias como

Mycobacterium (CHAN et al., 1992), Escherichia (PARK, 1992);

parasitas como Schistosoma mansoni, Trypanosoma cruzi (VESPA et al., 1994), fungos como Histoplasma (LANE et al., 1994), Cryptococcus

neoformans (GRANGER, 1988; ALSPAUGH & GRANGER, 1991;

TOHYAMA et al., 1996), Candida albicans (CENCI et al., 1993),

Pneumocystis (SHERMAN et al., 1991) e vírus como Vaccinia

(KARUPIAH et al., 1993), herpes simplex (CROEN, 1993), Epstein-Barr (MANNICK et al., 1994).

Os mecanismos responsáveis pela citólise ou morte celular dos microrganismos ainda são desconhecidos. Esta questão é complicada devido à complexa reatividade e dos diferentes estágios de redox do NO. As principais reatividades do radical NO são com superóxido (O₂-), metais e tióis. Reação do NO com superóxido produz peroxinitrito (OONO-), uma molécula altamente tóxica e reativa, com potencial de oxidar várias células alvo. Isto fornece a base bioquímica para o sinergismo entre NO e outros sistemas antimicrobicidas das células

fagocitárias, como o burst respiratório (De GROOTE & FANG, 1995). Reações com ferro podem resultar em inativação de enzimas essenciais, contribuindo para aumentar o dano oxidativo e pode depletar os estoques celulares de ferro. Reações com tióis podem alterar a função de proteínas e catalisar a formação da ponte dissulfídica ou outras modificações (De GROOTE & FANG, 1995). O NO também pode interagir diretamente com o ácido desoxirribonucléico (DNA), resultando em deaminação ou ligação cruzada (WINK et al., 1991).

1.3 Linhagens High e Low – Seleção IV-A

As linhagens de camundongos geneticamente selecionados foram inicialmente desenvolvidos por BIOZZI et al. (1968), para o estudo e caracterização dos mecanismos reguladores dos fenômenos que participam da resposta imunológica.

Este modelo foi obtido pela Seleção genética bidirecional de camundongos bons (High=H) e maus (Low=L) produtores de anticorpos contra antígenos naturais complexos. A alta ou a baixa capacidade de resposta resulta do efeito aditivo de alelos localizados em vários loci independentes (controle poligênico), que são acumulados progressivamente nos animais H e L durante o processo seletivo. No limite da seleção, estas linhagens consideradas homozigotas para os

alelos relacionados com o caráter selecionador, representam fenótipos extremos encontrados em populações naturais heterogênias.

Tendo como população inicial diferentes colônias de camundongos albinos outbred, foram descritas cinco Seleções originais (I a V), utilizando-se diferentes antígenos selecionadores. As Seleções I e II foram desenvolvidas no laboratório de Imunogenética do Instituto Curie de Paris, de acordo com os títulos de anticorpos produzidos contra eritrócitos heterólogos de carneiro e pombo (BIOZZI et al., 1968). As Seleções III e IV foram desenvolvidas na Seção de Imunologia do Instituto Biológico de São Paulo, segundo os títulos de anticorpos e antígenos flagelar e somático, respectivamente de Salmonella typhimurium e Salmonella oraniemburg (SIQUEIRA et al., 1976).

A Seleção V foi obtida por hiperimunização com proteínas heterólogas no Departamento de Microbiologia e Imunologia da Escola Paulista de Medicina (PASSOS et al., 1977).

Os parâmetros imunogenéticos obtidos nas Seleções I a V foram semelhantes, apesar das diferentes origens das suas populações iniciais, da natureza dos antígenos selecionadores e dos vários processos de imunização. As linhagens diferiram em características imunológicas importantes, assim como em relação ao efeito multiespecífico (BIOZZI et al., 1979).

Para a análise deste efeito multiespecífico foram escolhidos grupos de imunógenos antigenicamente distintos, mas de

natureza semelhante aqueles empregados nos vários processos seletivos; ou seja, eritrócitos heterólogos, bactérias, proteínas heterólogas e conjugados haptênicos. Esse efeito foi variável, sendo amplo nas Seleções I, II e III; isto é, o comportamento das linhagens H e L foi semelhante à obtida com antígenos de Seleção, mas mais restrito nas Seleções IV e V. Entre as restrições destacam-se as que ocorreram na Seleção IV, em que animais HIV e LIV não diferiram quanto à resposta

quantitativa de anticorpos contra eritrócitos de carneiro (SE) e eritrócitos humanos (HE), além de apresentarem total inversão de fenótipos na resposta contra gamaglobulina de coelho (SANT’ANNA et al., 1983).

Os números diferentes de alelos para boa e má resposta acumulados nas várias Seleções e os resultados dos estudos do efeito multiespecífico, levaram a hipótese de que, embora os vários processos seletivos conduzam e uma grande modificação fenotípica geral do caráter de produção quantitativa de anticorpos, pressões seletivas induzidas por diferentes antígenos e processos de imunização podem envolver lotes gênicos diferentes e independentes.

Para demonstrar esta hipótese, foi iniciada uma nova Seleção bidirecional, denominada IV-A, considerando-se a Seleção IV, obtida pela resposta à antígenos somáticos de Salmonella e pela resposta indiferenciada das linhagens à SE e HE. Esta semelhança de reatividade sugere que os acasalamentos seletivos baseados na resposta secundária ao

antígeno somático da Salmonella não afetaram os alelos reguladores da resposta a eritrócitos heterólogos e, conseqüentemente, estes alelos de efeito “bom” e “mau” estariam distribuídos aleatoriamente nas linhagens H _IV e L_IV.

Este fato foi confirmado pela grande variabilidade encontrada nas respostas anti SE dos segregantes F2 obtidos pela hibridização das linhagens HIV e LIV. Assim, a nova Seleção denominada

IV-A foi iniciada segundo a resposta primária contra SE e HE, mas utilizando como população inicial os segregantes F2 da Seleção IV.

Apesar das diferentes populações originais e pressões ambientais distintas a que foram submetidas as Seleções I e IV-A, foi verificada grande semelhança entre os parâmetros genéticos e multiespecíficos destes dois processos seletivos. A Seleção IV-A apresentou efeito multiespecífico muito superior ao da Seleção IV, da qual se originou, excetuando-se a resposta ao antígeno somático de Salmonella, em que as linhagens HIV e LIV apresentaram produções

idênticas (CABRERA et al., 1982).

O grupo de genes acumulados nestas várias linhagens H e L vem sendo extensivamente estudado em relação à sua expressão fenotípica relacionada aos segmentos da resposta imune.

Apesar das modificações induzidas pelos processos seletivos terem causado alterações na atividade de linfócitos B, as várias Seleções não apresentam diferenças à resposta imune celular, quando

avaliadas por reações de enxerto de pele (LIACOPOULOS-BRIOT et al., 1972), reação de enxerto versus hospedeiro (BYFIELD & HOWARD, 1972), reação de hipersensibilidade tardia (HT) a vários antígenos (OLIVEIRA et al., 1985), e resposta proliferativa de linfócitos ativados in vitro por mitógenos (LIACOPOULOS-BRIOT et al., 1974, FERREIRA et al., 1985).

Adicionalmente, COUDERC et al (1990), utilizando citometria de fluxo, não detectaram diferenças na freqüência de células T auxiliares entre os animais H_I e L_I. No entanto, os mesmos autores observaram que os animais L_I eram susceptíveis ao bloqueio da resposta humoral induzida por tratamento com anticorpo monoclonal anti-CD-4, apresentando índices menores à proliferação específica de células T.

Sabe-se que os macrófagos de camundongos L das Seleções I, II e IV-A possuem maior atividade metabólica quando comparadas às dos camundongos H. Esse metabolismo mais intenso, com a diminuição da capacidade de apresentação antigênica na membrana dessas células, seria o principal mecanismo envolvido na má resposta de anticorpos da linhagem L, nas seleções supracitadas (ADORINI & DORIA, 1981; GENNARI et al., 1987; BIOZZI et al., 1984; IBAÑEZ et al., 1988).

Apesar da maior atividade metabólica apresentada pelos macrófagos dos animais L, estudos que avaliaram as outras funções macrofágicas na Seleção I, demonstraram que o burst metabólico,

avaliado pela produção de ânion superóxido ou peróxido de hidrogênio, assim como a citotoxicidade sobre células tumorais, mostraram-se mais elevados nos macrófagos de animais H. Entretanto a produção de interleucina 1 (IL-1) mostrou-se semelhante para as duas linhagens (DOCKRELL et al., 1985). CABRERA (1993), não encontrou diferenças entre as linhagens com relação à capacidade de fagocitar partículas de Zimosan, após ativação de macrófagos.

Estudos semelhantes aos da Seleção I, II e IV-A, realizados nas Seleções III e IV não mostraram diferenças na atividade catabólica de macrófagos.

A compilação dos trabalhos realizados em camundongos H e L, demonstrou alterações funcionais de células, particularmente de macrófagos, permitindo aventar que as infecções causadas por patógenos intracelulares, cuja imunidade ocorre na dependência de macrófagos, os animais H seriam mais susceptíveis, enquanto que, no caso de patógenos extracelulares, em que a imunidade dependente de anticorpos seria o mecanismo mais importante, ocorreria maior susceptibilidade dos animais L a esses agentes (BIOZZI et al., 1984).

Pelo exposto e por saber que o principal mecanismo de defesa ao Mycobacterium bovis está ligado à dependência de macrófagos, optou-se pela escolha de camundongos das linhagens H e L Seleção IV-A como modelo experimental no presente trabalho, para que determinados aspectos da resposta imune de uma população natural heterogênia, contra este patógeno possam ser melhor elucidados.

2) OBJETIVOS

O objetivo foi avaliar a modulação da resposta imune em camundongos bons e maus produtores de anticorpos da Seleção IV-A, inoculados com cepa patogênica de Mycobacterium bovis AN₅.

Para tanto foram estudados os seguintes parâmetros:

Ø Recuperação de bactérias viáveis a partir de órgãos alvo como baço, fígado e pulmão;

Ø Avaliação da atividade de macrófagos peritoneais, esplênicos e pulmonares, pela determinação da produção de intermediários reativos do oxigênio (ROIs) e do nitrogênio (RNIs):

Ø Quantificação da produção de fator de necrose tumoral (TNF-α) por macrófagos peritoneais, esplênicos e pulmonares;

Ø Quantificação de anticorpos totais;

Ø Avaliar a atividade de células T in vivo através da medida da reação de hipersensibilidade tardia (HT).

3) MATERIAL e MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados camundongos machos das linhagens High e Low da Seleção IV-A, com 6 à 8 semanas de idade, com peso médio de 25g, proveniente do Biotério do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências – UNESP, Campus de Botucatu.

Em cada período foram utilizados 05 (cinco) animais de cada linhagem, previamente inoculados com cepa patogênica de Mycobacterium bovis-AN₅. Foram utilizados ainda 05 (cinco) animais controle de cada linhagem como base de comparação.

3.2 Inóculo

Em todos os ensaios foi utilizada a cepa de Mycobacterium bovis–AN5 cultivada em meio de Petragnani, fornecida pelo Laboratório

de Zoonoses Bacterianas do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Pública (VPS) da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de São Paulo e mantidos no Laboratório de Microbiologia da disciplina de Enfermidades Infecciosas, da Faculdade

de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Campus Botucatu.

Foram pesados 100 mg do substrato contendo colônias do agente, logo após este material foi dissolvido em 100 mL de solução fisiológica esterilizada contendo 5 (cinco) gotas de Tween 80, um detergente aniônico, essencial para boa dispersão das colônias na solução. A seguir esta solução foi submetida a 8 (oito) horas de agitação magnética,em temperatura de refrigeração. Após o preparo foi obtido uma suspensão com 1,5x108 bactérias/mL, padronizada segundo a escala no 0,5 de McFarland.

3.3 Infecção dos animais

Cada animal foi inoculado com 0,2mL da suspensão contendo 1,5x108 bactérias/mL, o que equivalente a 3,0x107 bactérias/0,2mL. A via de inoculação foi intra-venosa (I.V.), pelo plexo retro-orbital.

3.4 Sacrifício dos animais

Após a sangria pelo plexo retro-orbital para obtenção do soro, os animais foram sedados com halotano para posterior deslocamento cervical, em seguida , foi feita a lavagem peritoneal para obtenção de uma suspensão de células para cultura. Foram retirados

ainda fragmentos de baço, fígado e pulmão para realização da recuperação bacteriana e fragmentos esplênicos e pulmonarares para a realização de cultura de células.

Este procedimento recebeu parecer favorável da Comissão de Ética na Experimentação Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia desta Universidade, segundo os Princípios Éticos em Experimentação Animal adotados pelo Código Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

Os animais foram sacrificados cronologicamente aos sete 14, 21, 28, 35 e 42 dias após a infecção.

3.5 Recuperação de bactérias viáveis

A recuperação de bactérias viáveis foi realizada através de isolamento e contagem das UFC a partir de órgãos alvo de cada animal, ou seja, baço, fígado e pulmão. Fragmentos de 1mg destes órgãos foram pesados e diluídos em 1 mL de solução salina estéril, posteriormente foi realizado todo processo de descontaminação do órgão e ajuste do pH. A descontaminação foi feita com hidróxido de sódio (NaOH a 8%), o ajuste do pH entre 6,8 a 7,6 foi feito com ácido sulfúrico (H2SO4) a 8%.

Amostras de 100µL da suspensão foram semeadas em meio Petragnani, sendo os tubos lacrados com algodão queimado e rolhas de cortiça, incubados a 37oC durante 60 dias, quando foi realizada a contagem das UFC por mg de órgão (UFC/mg).

3.6 Avaliação da atividade macrofágica

3.6.1 Cultura de macrófagos peritoneais, esplênicos e pulmonares

Após o sacrifício, os animais foram colocados no interior de uma câmara asséptica de fluxo laminar e fixados em decúbito dorsal em suporte de dissecação. A parede abdominal foi exposta rebatendo-se a pele da região. A parede abdominal foi lavada com 10 mL de solução salina tamponada - phosphate buffer saline (PBS) gelado, injetados na porção mediana superior do abdômen. A cavidade foi massageada e o líquido peritoneal obtido com uma seringa hipodérmica de 10 mL com agulha 25x7. O material foi colocado em tubos de vidro, mantidos em gelo, e centrifugados a 1500 rotações por minuto (rpm) por 10 minutos. As células do baço e pulmão foram obtidas macerando-se os órgãos em peneiras de nylon, com ajuda de pistilo estéril, os quais foram lavados com 10 mL do meio RPMI 1640 (Sigma Chemical, San Diego, CA, USA) para coleta de células. Igualmente mantidos em banho de gelo, os tubos com as células e o meio também foram centrifugados a 1500 rpm por 10 minutos. As células peritoneais, esplênicas e pulmonares foram ressuspensas em meio RPMI completo para cultura de células (MCCC), o qual consiste em RPMI acrescido de 1% de L-glutamina (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA) e 10% de soro fetal bovino. Desta suspensão foi tomada uma alíquota de 50µL, para incubação com 0,45 mL de solução de vermelho neutro a 0,02% a 37oC por 15 minutos, para

identificação e contagem dos macrófagos pela incorporação do corante. A contagem dos macrófagos foi realizada em câmara de Neubauer, com concentração ajustada para 2,0 x 106 células/mL de MCCC.

Volumes de 0,1 mL dessa suspensão foram distribuídos em microplacas de fundo chato com 96 orifícios para cultura (Costar, Cambridge, Mass. USA), sendo incubadas a 37oC em tensão de 5% de gás carbônico (CO₂) durante uma a duas horas. As células não aderentes foram retiradas através de lavagem das placas com meio RPMI. As células aderentes foram novamente incubadas com RPMI completo,em duplicata, submetidas ou não a estímulo por 100µL de LPS (E.coli Lipopolysaccharide L2654 – Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ou INF-γ recombinante murino (R&D Systems – Minneapolis, MN, USA) a 100 U/mL, por 24 horas a 37oC, em tensão de 5% de CO₂.

3.6.2 Determinação da produção de intermediários reativos do oxigênio.

A produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) foi

determinada pelo método descrito por Pick e Keisari (PICK et al., 1980) e adaptado por Pick e Misel (PICK et al., 1981). Os macrófagos obtidos conforme descrição no item 3.8.1, foram distribuídos em placas de 96 orifícios e incubados por 24 horas a 37o_{C com ou sem INF-}γ_{. Após este}

período, os sobrenadantes das culturas foram coletados para dosagem de óxido nítrico (NO) e as células aderentes foram ressuspensas ao volume original (0,1mL) em solução de vermelho fenol contendo: 140 nM NaCL;

10 nM de tampão fosfato, pH 7; 5,5 nM de dextrose; 0,56 nM de vermelho fenol; 0,01 mg/mL de peroxidase raiz forte tipo II, e na presença ou ausência de estímulo por 1 µg de forbol mirestato acetato (PMA) e incubados por uma hora a 370Cem câmara úmida e escura. Após este período, a reação foi interrompida pela adição de 0,01mL de NaOH 1N. A absorbância foi determinada em microleitor automático de ELISA (ensaio imuno-enzimático - Enzyme-Linked Imunosorbent Assay) , com filtro de 620nm, contra um branco constituído de solução de vermelho fenol e NaOH 1N. Todos os regentes foram provenientes do laboratório Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA. Os resultados foram expressos em nanomols (nmoles) de H₂O₂/3,0x107 bactérias, a partir de curva padrão estabelecida em cada ensaio.

3.6.3 Determinação da produção de intermediários reativos do nitrogênio

Com os sobrenadantes das culturas de macrófagos peritoneais, esplênicos e pulmonares foi realizada dosagem da produção de óxido nítrico (NO) pelo método colorimétrico baseado na reação de Griess (GREEN, 1981). Aos sobrenadantes, foram adicionados 100 µL do reagente de Griess, que contém n-(1-naftil – etil – enediamina) (NEED – Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) diluído 0,1% em água destilada, e sulfanilamida (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) diluída a 1% em ácido fosfórico (H₃PO₄) 5%. Estes reagentes, NEED e sulfanilamida, foram misturados em volumes iguais no mesmo momento

da reação. Os ensaios foram realizados em quadruplicata. As amostras foram lidas em microleitor de ELISA em comprimento de onda de 540nm contra um branco constituído por regente de Griess. Os resultados foram expressos na concentração µmolar (µM) do NO liberado, comparando-se a densidade óptica a uma curva com concentrações conhecidas de NO.

3.6.4 Ensaio Biológico para determinação de TNF-α

A linhagem tumoral de fibroblastos murinos denominadas L929, sensível ao TNF-α, foi utilizada para o ensaio de dosagem dessa citocina. As células foram cultivadas em MCCC e mantidas por repiques semanais, em frascos de plástico, em estufa a 37oC com atmosfera de 5% de CO2. O meio de cultura de manutenção das células foi desprezado e

substituído por uma solução de ATV (tripsina 0,2% e verseno 0,02%) para promover o deslocamento das células da parede da garrafa. Em seguida, o ATV foi desprezado, e as células foram lavadas e ressuspensas em meio RPMI completo (MCCC). Após a contagem das células em câmara de Neubauer, a suspensão foi ajustada para uma concentração de 2,0x106 células/mL. Volumes de 100 µL dessa suspensão foram distribuídos em microplacas de 96 orifícios para cultura de células (Costar, Cambridge, Mass., USA). Após incubação por 24 horas a 37oC em atmosfera constante de 5% de CO2, o meio contido nos orifícios foi

desprezado e substituído por 100 µL de meio RPMI completo (MCCC) contendo Actinomicina D na concentração de 1µg/mL.

Realizou-se, então, o ensaio de citotoxidade, utilizando-se o soro de 10 animais de cada linhagem (H_IV-A e L_IV-A) previamente inoculados, na concentração de 10µg/orifício, Os soros foram adicionados em volumes de 100µL de células L929 tratados com Actinomiocina por 3 horas. As culturas foram feitas em triplicata. Em três orifícios, foi adicionado apenas meio RPMI completo (cultura controle). Após incubação a 37oC em atmosfera constante de CO₂, por 18 horas, os sobrenadantes foram desprezados, e 100µL de uma suspensão de cristal violeta (0,2% em 20% de etanol) foram adicionados aos orifícios por 15 minutos para fixação e coloração das células. Em seguida, a placa foi lavada em água, por imersão, para remoção do excesso de corante, e 100µL de laurinil sulfato de sódio (SDS) a 1% em água destilada foram colocados em cada orifício, para solubilização das células. A leitura das densidades ópticas (DO) de cada orifício foi realizada a 490nm em espectrofotômetro automático de ELISA, modelo Multiskan (MD5000; Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, V.a.). A

quantidade de TNF-α no soro foi calculada sobre curva padrão realizada com TNF-α recombinante murino (R&D Systems – Minneapolis, MN, USA), empregado nas concentrações de 40 a 4000 U/mL.

3.7 Titulação de Anticorpos totais

Para a dosagem de anticorpos totais contra Mycobacterium bovis-AN₅, foram inoculados 10 (dez) animais por linhagem, via I.V. , com 0,2mL de uma suspensão de 3,0x107 bactérias/0,2mL. Os animais foram sacrificados conforme item 3.4. A titulação de anticorpos durante a resposta primária foi determinada pela técnica de microaglutinação direta em placas de 96 orifícios com fundo em U. Foram colocados nas placas 0,05mL de salina tamponada pH 7,2 acrescida de 0,1% de gelatina, como diluente. Em seguida, foram feitas diluições seriadas das amostras de 0,05mL dos soros. O antígeno foi 0,05mL da suspensão de bactéria inativada em autoclave por uma hora, previamente padronizada na escala 0,5 de Mc Farland. Os títulos de anticorpos foram expressos como log₂ da recíproca de maior diluição aglutinante do soro.

3.8 Reação de Hipersensibilidade Tardia (HT)

Foram inoculados 10 camundongos de cada linhagem via I.V., com 0,2mL da suspensão de 3,0x107 bactérias/0,2mL como a dose inicial sensibilizante. Após quatorze dias, foi desencadeada a reação de HT através da inoculação de 50µL de uma suspensão inativada em autoclave por uma hora da mesma bactéria no coxim plantar esquerdo.

A leitura foi realizada pela medida do espessamento das patas com o auxílio de paquímetro, nos períodos de 24 e 48 horas após o desencadeamento da reação de HT. Os resultados foram expressos em milímetros (mm).

3.9 Análise Estatística

Os programas estatísticos foram desenvolvidos empregando-se o programa Graph Pad Software (Instat TM). Os resultados obtidos foram analisados pelo teste “t” de Student para determinar as diferenças entre grupo controle e cada grupo infectado e também as diferenças interlinhagens (H_{IV-A X} L_IV-A ) em cada período avaliado. As estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05.

Para a comparação de títulos sorológicos obtidos pelos camundongos High e Low utilizou-se a análise de Variância-ANOVA, não paramétrica através do teste de Kruskal-Wallis, para amostras independentes.

4) RESULTADOS

4.1 Recuperação de bactérias viáveis a partir de órgãos alvo de camundongos HIV-A e LIV-A infectados com Mycobacterium bovis.-AN5.

Foram inoculados 5 animais de cada linhagem por período, via I.V.,com 0,2mL de uma suspensão de 1,5x108 bactérias/mL, o que equivale a 3,0x107 _{bactérias/0,2mL, e sacrificados aos sete, 14, 21, 28, 35}

e 42 dias.

O grau de suscetibilidade à infecção por Mycobacterium bovis-AN₅foi analisado nas linhagens H_IV-A e L_IV-A através da obtenção do número de Unidades Formadores de Colônias (UFC/mg órgão) a partir de macerado pulmonar, esplênico e hepático.

A análise dos resultados obtidos nos diferentes períodos de infecção para cada órgão estão representados nas figuras 1 e 2. Na figura 1 observamos que a linhagem HIV-A apresentou maior recuperação de

bactérias viáveis no pulmão em todos os períodos de infecção em relação à L_IV-A, sendo as diferenças estatisticamente significativas (p<0,001); entretanto na figura 2, observamos que a recuperação bacteriana no baço ocorreu somente aos 35 dias na linhagem H_IV-A (p<0,001) e na linhagem L_IV-A, bactérias viáveis foram recuperadas no 21o (p<0,001) e 42o (P>0,05) dias de infecção. Não houve recuperação bacteriana nos períodos de sete e 14 dias em nenhum dos órgãos analisados, bem como não houve recuperação bacteriana no fígado em nenhum dos períodos.

Pulmão 0 100 200 300 400 500 600 21 28 35 42 Dias UFC/mg órgão High Low # # # #

Figura 1: Recuperação de bactérias viáveis de fragmentos pulmonarares, em camundongos HIV-A e LIV-A, infectados com Mycobacterium bovis-AN5.Valores médios da contagem de colônias +/- DP (n=10). Análise estatística: teste “t” de Student’s (p<0,05). #: indica diferença interlinhagens HIV-A e LIV-A, em cada período.

Baço 0 50 100 150 200 250 300 21 28 35 42 DIAS UFC/mg órgão High Low # #

Figura 2: Recuperação de bactérias viáveis de fragmentos esplênicos em camundongos HIV-A e LIV-A, infectados com Mycobacterium bovis-AN5. Valores médios da contagem de colônias +/- DP (n=10). Análise estatística: teste “t” de Student’s (p<0,05). #: indica diferença interlinhagens HIV-A e LIV-A, em cada período.

4.2 Produção de Peróxido de Hidrogênio

Os intermediários reativos do oxigênio foram avaliados pela produção de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) por macrófagos peritoneais, esplênicos e pulmonares de camundongos infectados com Mycobacterium bovis-AN5 .

Foram determinadas as produções espontâneas de H2O2 em

camundongos H_IV-A e L_IV-A não infectados, sendo considerados grupos controle. As culturas de macrófagos de camundongos infectados e não infectados foram submetidas a estímulo adicional por PMA, para estudo comparativo entre a capacidade de produção de H₂O₂ por macrófagos H_IV-A e L_IV-A. A dosagem foi realizada aos sete, 14, 21, 28, 35 e 42 dias; não havendo produção do metabólito aos sete e 14 dias em ambas as linhagens.

4.2.1 Produção de H2O2 por macrófagos peritoneais

A produção endógena de H₂O₂ por macrófagos peritoneais em animais controles H_IV-A e L_IV-A não apresentou diferença significativa. A linhagem L_IV-A infectada produziu mais H₂O₂ ao 28o (p<0,001) e 42o (p<0,05) dias em relação aos controles, enquanto que a linhagem H_IV-A produziu H₂O₂ apenas no 42o dia (p<0,01).

Diferenças significativas entre as linhagens H_IV-A e L_IV-A foram observadas no 28o (p<0,001) (L_IV-A > H_IV-A) e 42o (p<0,05) (H_IV-A > L_IV-A) dias de infecção (Figura 3- Quadro A).

Sob estimulo adicional de PMA, macrófagos peritoneais de H_IV-A e L_IV-A apresentaram aumento significativo da produção de H₂O_2.

A linhagem HIV-A produziu mais H2O2 em relação aos

controles apenas no 42odia (p<0,001) enquanto que a linhagem LIV-A

apresentou produção diminuída aos 21 dias, entretanto, esta produção foi aumentada aos 35 e 42 dias (p<0,001).

Diferenças significativas entre as linhagens foram observadas aos 21 (p<0,001) (H_IV-A > L_IV-A), 35 (p<0,001) (L_IV-A > H_IV-A) e 42 (p<0,001) (H_IV-A > L_IV-A) dias de infecção (Figura 3- Quadro B).

Quadro A 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 controle 21 28 35 42 Dias nmoles H 2 O2 /3x10 7 bactérias High s/e Low s/e + + + + + # # Quadro B 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 controle 21 28 35 42 Dias nmoles H 2 O2 /3x10 7 bactérias High pma Low pma + # + # + # + +

Figura 3: Comparação da produção de H2O2 por macrófagos pe ritoneais de camundongos HIV-A e LIV-A infectados com Mycobacterium bovis-AN5 em diferentes períodos e em relação a seus respectivos controle. Valores médios da contagem de colônias +/- DP (n=5). Análise estatística: “t”de Student’s (p<0,05). #:diferença interlinhagens (HIV-A e LIV-A) em cada período. +: diferença entre infectados e respectivo controle.

Quadro A: Produção endógena de H2O2 por macrófagos de camundongos das linhagens HIV-A e LIV-A infectados.

Quadro B: Produção de H2O2 por macrófagos de camundongos HIV-A e LIV-A infectados e submetidos a estimulo adicional por PMA.

4.2.2 Produção de H2O2 por macrófagos esplênicos

Animais controle HIV-A apresentaram maior produção

endógena de H2O 2 que os controle LIV-A Durante a infecção observamos

inibição da produção deste metabólito em ambas as linhagens em todos os períodos analisados (Figura 4-Quadro A).

Sob ação do PMA, animais controle HIV-A apresentaram

concentrações significantes em relação ao controle LIV-A, entretanto esta

linhagem durante a infecção demonstrou inibição deste metabólito. A linhagem L_IV-A infectada só apresentou diferença significativa em relação aos controles no 28o dia de infecção (p<0,001).

Diferenças entre as linhagens só foram observadas no 21o (p<0,01) (H_IV-A > L_IV-A); 28o _{(p<0,001) (L}

IV-A > HIV-A ) e 42o (p<0,001)