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Imobilização de β-galactosidase de Kluyveromyces lactis e L-arabinose
isomerase expressa em E. coli DH10B em MANAE-Agarose para síntese de
D-galactose e D-tagatose
(um espaço) (um espaço) C. S. BEZERRA1, L. S. CAVALCANTE1, M. SOUSA1, B. C. PESSELA2 e L. R. B. GONÇALVES1 (um espaço)
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Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia, Departamento de Engenharia Química
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Universidad Autonoma de Madrid, Consejo Superior de Investigaciónes Científicas E-mail para contato: lrg@ufc.br
(um espaço) (um espaço) RESUMO – O desenvolvimento de processos para obtenção de D-tagatose tem sido estudado com o uso de biocatalisadores, sendo a obtenção direta de D-tagatose a partir da lactose uma solução para o tratamento do soro de leite gerado na indústria de laticínios. Este trabalho tem como objetivo desenvolver biocatalisadores a partir da imobilização das enzimas β-galactosidase e L-arabinose isomerase em suporte MANAE-Agarose para obtenção direta de D-tagatose a partir de lactose. Ofereceram-se cargas de 20 e 40 mg de proteína/mL de extrato das enzimas L-arabinose isomerase DH10B e β-galactosidase de Kluyveromyces lactis, respectivamente, para 1g de suporte (MANAE-LAI e MANAE-LAC). O rendimento de imobilização foi de 99 e 88% (99 e 83% de proteína, respectivamente), para MANAE-LAC e MANAE-LAI, e atividade recuperada de 2,97 e 66,9%; conversão em 24h de 98,7% a partir de lactose e 6,6 % a partir de D-galactose, respectivamente. Estes resultados trazem avanços ao desenvolvimento de catalisadores co-imobilizados.
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1. INTRODUÇÃO
A geração de resíduos sólidos em indústrias de derivados lácteos demanda preocupação no tocante com relação ao volume de soro de leite gerado a cada produção, representado desta forma, um rejeito de grande impacto ambiental devido sua elevada Demanda Bioquímica de Oxigênio - DBO, em torno de 30 a 60 kg/m3 (HATZINIKOLAOU et al., 2005). Diante disto, buscam-se estratégias efetivas e menos onerosas para tratamento e aproveitamento do subproduto lactose presente no soro.
O uso de biocatalisadores têm adquirido grande importância para aplicação em processos industriais (RODRIGUES et al., 2008; BRÍGIDA et al., 2014; dos SANTOS et al., 2015), destacando-se, em especial, o uso voltado para a indústria de laticínios (BEZERRA, 2012; MANZO et al., 2015). Contudo, a utilização de enzimas em sua forma solúvel traz diversos pontos negativos como não reutilização, difícil separação do produto, entre outros, assim a imobilização de enzimas, confinamento do biocatalisador em um suporte sólido, toma destaque como manobra para estes pontos negativos, além de tornar o menos oneroso (ADRIANO, 2008; GUISÁN, 2006).
Neste contexto, podemos destacar os estudos acerca de imobilização das enzimas galactosidase e L-arabinose isomerase (BEZERRA, 2012; MANZO et al., 2015). Uma vez que a β-galactosidase hidrólisa a lactose formando D-galactose e glicose (PESSELA et al., 2008), a L-arabinose isomerase isomerisa a D-galactose gerando por sua vez D-tagatose, edulcorante de alto valor agregado (MANZO et al., 2015).
Diante do exposto, o presente trabalho objetivou desenvolver biocatalisadores realizando a imobilização das enzimas β-galactosidase de Kluyveromyces lactis e L-arabinose isomerase expressa em E. coli DH10B em suporte MANAE-Agarose como estudo preliminar para obtenção direta de D-tagatose a partir de lactose.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Preparação do Suporte MANAE-Agarose
Para o desenvolvimento do suporte utilizado no presente trabalho seguiu-se os protocolos dispostos por FERNANDEZ-LAFUENTE et al. (1993), BOLIVAR et al. (2010) e DE SOUSA (2015).
2.2. Imobilização em Suporte MANAE-Agarose
Ressuspendeu-se 1 g de suporte em 10 mL de uma solução composta pela enzima em tampão fosfato de potássio 5 mM, pH 7,0. As imobilizações foram conduzidas a 25 ºC por 3 h, sob agitação constante. Ofereceram-se 20 mg de proteina.g-1 e 40 mg de proteina.g-1 aos suportes, de β-galactosidase e L-arabinose isomerase, respectivamente. Em paralelo aos ensaios, conduziu-se um experimento controle (branco da reação), para se avaliar a provável desativação da enzima nas mesmas condições de imobilização. As condições operacionais de temperatura e agitação foram mantidas constantes durante os experimentos. Os processos de imobilização foram também acompanhados com determinação de proteína (BRADFORD, 1976).
2.3. Determinação da Atividade Hidrolítica da β-Galactosidase Solúvel e
Imobilizada em MANAE-Agarose
A atividade enzimática para determinação dos parâmetros de imobilização foi medida espectrofotometricamente (420 nm) utilizando 1,25 mM de o-NPG em solução tampão fosfato de sódio com 2 mM MgCl2 pH 6,6 como substrato. Desta forma, 50 µL de amostra da solução
enzimática ou suspensão de derivado foram adicionados a cubeta com 2 mL do substrato.
Assim, determinou-se: rendimento de imobilização (RI, %), atividade recuperada (AR, %) e atividade do derivado (AtD, U.g-1 Support), segundo SILVA et al. (2012).
2.4. Determinação da Atividade de Isomerização da L-Arabinose Isomerase
Solúvel e Imobilizada em MANAE-Agarose
Determinou-se a atividade da L-arabinose isomerase utilizando como substrato uma solução de 0,5 M de D-galactose (SIGMA) em tampão Fosfato de potássio (25 mM) pH 7, suplementado com 0,0001 M MnCl2. As amostras foram incubadas a 50 ºC. A quantidade de D-tagatose foi avaliada
mediante o ensaio colorimétrico pelo método Carbazol-Cisteína-Ácido sulfúrico (DISCHE e BORENFREUND, 1951). A leitura foi realizada em espectrofotômetro segundo MANZO et al. (2013).
2.5. Cinética Enzimática de β-Galactosidase e L-Arabinose Isomerase
Imobilizadas em MANAE-Agarose
Para o estudo cinético do MANAE-LAC, a reação ocorreu utilizando-se lactose (58,4 a 233,6 mM) em tampão fosfato de potássio 25 mM pH 7,0 suplementado com 0,0001 M MnCl2, sob 50°C.
Amostras foram coletadas para determinação da concentração de D-galactose formada, de acordo com (BEZERRA, 2012).
A cinética enzimática do MANAE-LAI foi avaliada utilizando como substrato D-galactose (50 a 1100 mM) nas mesmas condições citadas para MANAE-LAC. Amostras foram coletadas para determinação da concentração de D-tagatose formada, de acordo com o item 2.4.
2.6. Conversão de Substrato com as Enzimas β-Galactosidase e L-Arabinose
Isomerase Imobilizadas em MANAE-Agarose
MANAE-LAC foi incubado em 146 mM de lactose em tampão fosfato de potássio 25 mM pH 7,0 suplementado com 0,0001 M MnCl2, sob 50°C, durante 24 h. Amostras foram coletadas para
determinação da concentração de D-galactose formada, de acordo com BEZERRA, 2012.
Em outro reator, MANAE-LAI foi incubado em 50 mM de D-galactose nas mesmas condições citadas para MANAE-LAC. Amostras foram coletadas para determinação da concentração de D-tagatose formada, de acordo com o item 2.4.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1. Imobilização das Enzimas β-Galactosidase e L-Arabinose Isomerase em
MANAE-Agarose
As enzimas β-galactosidase (LAC) e L-arabinose isomerase (LAI), foram imobilizadas em suporte MANAE-Agarose, por adsorção iônica reversível. Os resultados das imobilizações podem ser observados na Tabela 1. Observou-se que ambos os derivados apresentaram significativos rendimentos de imobilização ao final de 3h de contato enzima com o suporte MANAE, com resultados de 99% e 88%, para derivados MANAE-LAC e MANAE-LAI, respectivamente.
Ao analisarmos a atividade recuperada, começa-se a notar diferença entre os dois biocatalisadores desenvolvidos. O MANAE-LAC apresentou AR de 2,97% e AtD de 57,7 U.g-1 ao
Tabela 1 – Parâmetros de imobilização de β-galactosidase e L-arabinose isomerase em MANAE-Agarose. Fosfato de potássio 5 mM, pH 7,0, suplementado com 0,0001 M MnCl2. Rendimento de
imobilização (RI) - Atividade recuperada (AR) - Atividade do derivado (AtD)
Biocatalisador RI (%) AR (%) AtD (U.g-1)
MANAE-LAC 99 2,97 57,7
MANAE-LAI 88 66,9 1,35
Ao comparar com De SOUSA (2015), que obteve resultados de AR de 46%, percebeu-se que o
presente trabalho apresentou resultado superior de atividade recuperada para o MANAE-LAI, 66,9%.
3.2. Cinética Enzimática das Enzimas β-Galactosidase e L-Arabinose Isomerase
Imobilizadas em MANAE-Agarose
A cinética enzimática revela parâmetros importantes do biocatalisador, ou seja, qual concentração de substrato na qual o biocatalisador atingirá sua velocidade máxima. Esta informação torna-se mais importante ainda quando tratam-se de estudos de co-imobilização, onde no mínimo, dois biocatalisadores serão confinados e necessitarão agir de forma simbiótica e simultânea. Ao passo que a enzima β-galactosidase hidrolise lactose em D-galactose, a enzima L-arabinose isomerase irá consumir esta D-galactose produzida resultando em D-tagatose como produto final, evitando, por exemplo, acúmulo de D-galactose no meio, o que causaria inibição (GROSOVÁ et al., 2008) pelo produto para a primeira enzima.
Diante do exposto, a Figura 1 e Tabela 2 demonstram os resultados de análise cinética para os biocatalisadores MANAE-LAC e MANAE-LAI.
Figura 1 – Influência da concentração de substrato na velocidade da reação enzimática. Os símbolos representam os pontos experimentais e as retas, o ajuste do modelo de Michaelis-Menten, utilizando
software Origin 8.1. MANAE-LAC (A) e MANAE-LAI (B).
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 V (mM. mi n -1 ) Lactose (mM) (A) 0 200 400 600 800 1000 1200 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035 0,040 V (mM. mi n -1) Galactose (mM) (B)
Os biocatalisadores MANAE-LAC e MANAE-LAI apresentaram 243,7 e 391,4 mM para Km,
bem como 7,0 e 0,04 mM.min-1 para velocidade máxima, utilizando como substratos lactose e D-galactose, respectivamente.
Tabela 2 – Parâmetros cinéticos dos biocatalisadores MANAE-LAC e MANAE-LAI. Constante de Michaelis-Menten (Km) - Velocidade máxima (Vmáx)
Biocatalisador Km (mM) Vmáx (mM.min-1) R2
MANAE-LAC 243,7 7,0 0,95
MANAE-LAI 391,4 0,04 0,99
De acordo com os resultados, nota-se que a velocidade máxima do MANAE-LAC é quase 180 vezes superior ao resultado para o MANAE-LAI. Assim, espera-se que hidrólise de lactose em D-galactose seja muito mais acelerada do que a isomerização da D-D-galactose em D-tagatose. Diante destes resultados, haverá um acúmulo de D-galactose no meio reacional, causando possivelmente uma inibição pelo substrato, para a L-arabinose isomerase. Faz-se necessários ensaios futuros com maiores concentrações de L-arabinose isomerase, haja vista que se necessita de uma produção inicial de D-galactose para que assim esta seja consumida gerando D-tagatose.
O presente estudo apresentou bons resultados quando comparou-se aos valores de Vmáx, o
MANAE-LAC (7,0 mM.min-1) com o derivado com a mesma enzima imobilizada em quitosana ativada com glutaraldeído (2,3 mM.min-1) desenvolvido por BEZERRA (2012). Contudo, ainda em comparação com este autor, o valor para Km foi maior para MANAE-LAC, 243,7 mM, de acordo com
BEZERRA (2012), 70,6 mM, revelando uma menor afinidade ao substrato.
Já com relação ao MANAE-LAI, o resultado obtido para Vmáx (0,04 mM.min-1) refletiu como
bom avanço, tendo em vista o obtido por De SOUSA (2015), 0,013 mM.min-1, apesar do elevado valor de Km para MANAE-LAI (391,4 mM) comparado ao definido por De SOUSA (2015), 28 mM.
3.3. Conversão do Substrato com as Enzimas β-Galactosidase e L-Arabinose
Isomerase Imobilizadas em MANAE-Agarose
A Figura 2 demonstra o comparativo de conversões utilizando os biocatalisadores MANAE-LAC (lactose hidrolisada em D-galactose) e MANAE-LAI (D-galactose isomerizada em D-tagatose).
0 5 10 15 20 25 0 20 40 60 80 100 120 140 160 La ct ose (mM) Tempo (h) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 G al act ose (mM) (A) 0 5 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 G a la ct o se (mM) Tempo (h) 0 10 20 30 40 50 T a g a to se (mM) (B)
Figura 2 – (A) Conversão de lactose (■) em D-galactose (●) através do uso de MANAE-LAC e, (B) D-galactose (■) em D-tagatose (●) através do uso de MANAE-LAI.
A partir de 146 mM de lactose, o biocatalisador MANAE-LAC promoveu 98,7 % (144 mM) de conversão em D-galactose ao atingir 24 h, representando um resultado muito relevante, haja vista que em poucas horas (5h) cerca de 97 % (141 mM) de D-galactose foi produzida. Assim, esse estudo revela um biocatalisador promissor para estudos futuros de co-imobilização das enzimas β-galactosidase e L-arabinose isomerase. Contudo, estudos serão necessários para otimizar a conversão de D-galactose em D-tagatose, como pode ser visto na Figura 2, a isomerização a partir de 50 mM de D-galactose em D-tagatose atingiu baixo percentual em D-tagatose, 6,6 % (3,3 mM), em 24 h.
4. CONCLUSÕES
Ambas enzimas imobilizadas em suporte MANAE-Agarose atingiram significativos resultados de rendimento de imobilização, bem como bons resultados para atividade do derivado, como foi verificado comparando-se com outros estudos. Os ensaios cinéticos e os rendimentos de bioconversão para as duas enzimas testadas (LAC e LAI) mostraram uma diferença na atuação quando imobilizadas em MANAE-Agarose. As conversões máximas em D-galactose e D-tagatose corresponderam a 98,7% e 6,6 % em 24 h, para MANAE-LAC e MANAE-LAI, respectivamente.
5. AGRADECIMENTO
Os autores agradecem à CAPES, CNPq e FUNCAP.
6. REFERÊNCIAS
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