Catabolismo da trealose extracelular e caracterização bioquímica da trealase ácida de Candida glabrata

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA. DENISE MOTTA WANDERLEY ZILLI. CATABOLISMO DA TREALOSE EXTRACELULAR E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DA TREALASE ÁCIDA DE Candida glabrata. Florianópolis 2006.

(2) 2. DENISE MOTTA WANDERLEY ZILLI. CATABOLISMO DA TREALOSE EXTRACELULAR E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DA TREALASE ÁCIDA DE Candida glabrata. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Santa Catarina, visando à obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia.. Orientador: Prof. Dr. Boris U. Stambuk Co-orientador: Prof. Dr. Luiz Cláudio Miletti. Florianópolis 2006.

(3) 3. “CATABOLISMO DA TREALOSE EXTRACELULAR E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DA TREALASE ÁCIDA DE Candida glabrata” POR. DENISE MOTTA WANDERLEY ZILLI Dissertação julgada e aprovada em sua forma final, pelo Orientador e membros da Comissão Examinadora.. Comissão Examinadora: ________________________________ Prof. Dr. Luiz Cláudio Miletti. ________________________________ Prof. Dr. Hector Terenzi. ________________________________ Prof. Dr. Mário Stendel MIP/CCB/UFSC ________________________________ Prof. Dr. Nelson Horácio Gabilan BQA/CCB/UFSC __________________________________________________________________ Prof. Dr. Mário Stendel - MIP/CCB/UFSC Coordenador do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da UFSC Florianópolis, julho de 2006..

(4) 4. Dedico este trabalho ao meu marido Daniel e a minha filha Gabriela..

(5) 5. AGRADECIMENTOS. Ao professor Boris U. Stambuk que com sabedoria e profissionalismo conduziu a orientação deste trabalho, esclarecendo minhas incontáveis dúvidas e despertando outras tantas. Agradeço pela oportunidade do aprendizado e por sua amizade. Ao professor Cláudio Miletti, pelo companheirismo e cumplicidade nos experimentos, por sua contribuição intelectual. Ao Prof. Hernán Terenzi pelos empréstimos de seus equipamentos e pela doação de alguns reagentes. Ao Prof. Nelson Gabilan que gentilmente liofilizou as amostras e à Profa. Andréa Villarino, que com grande generosidade e conhecimento, acompanhoume nos passos de purificação protéica. Aos colegas do laboratório Fernanda, Ricardo, Marcelo, Débora, Sérgio, Maria Luíza e Fábio pela amizade e solidariedade. A coordenação, aos professores do curso e a secretaria pelo apoio e esclarecimentos prestados ao longo desses dois anos. Ao meu marido Daniel que me ajudou durante esta trajetória, agradeço seu incentivo e sua confiança. A Gabriela, pela compreensão de minha ausência e por seu companheirismo, mesmo que virtual (na tela de descanso do computador), durante a escrita dessa dissertação. Aos amigos e familiares que sempre me apoiaram, mostrando interesse pelas minhas realizações e conquistas. E, ao Conselho Científico e Tecnológico (CNPQ), à Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro..

(6) 6. RESUMO. A levedura Candida glabrata tem sido apontada como importante patógeno emergente, sendo a segunda espécie mais comumente envolvida na etiologia das candidíases, infectando principalmente indivíduos imunodeficientes e imunocomprometidos. Devido à resistencia natural aos antifúngicos azólicos e à alta taxa de mortalidade associada a C. glabrata, os testes rápidos para sua identificação constituem importante ferramenta para a escolha terapêutica. Este microrganismo se destaca da maioria das leveduras por ser capaz de apenas consumir dois açúcares: a glicose e o dissacarídeo trealose (Gliα1-1αGli). De fato, os testes rápidos de identificação têm como princípio justamente a habilidade desta levedura em hidrolisar as moléculas de trealose em duas de glicose. Dada a importância da metabolização da trealose para C. glabrata, no presente trabalho foi realizada uma caracterização bioquímica do catabolismo de trealose por esta levedura. Nossos resultados mostram que C. glabrata consome e fermenta eficientemente a trealose presente no meio de cultura, com parâmetros cinéticos e produtividades de biomassa e etanol semelhantes aos observados durante a fermentação da glicose. De fato, o crescimento em trealose não foi afetado pelo inibidor mitocondrial antimicina A, confirmando a eficiente fermentação deste dissacarídeo por C. glabrata. Na fase exponencial de crescimento em trealose foi detectado acúmulo de até 2,5 g/L de glicose no meio, indicando a possível hidrólise extracelular do dissacarídeo. A análise de uma possível atividade trealase na superficie das células revelou a presença de uma trealase ácida com um pH ótimo de 4,4. Esta enzima é sintetizada durante o crescimento em trealose, mas este açúcar não é aparentemente o indutor da atividade uma vez que níveis altos da enzima foram detectados também após o crescimento em glicerol, o mesmo ocorrendo durante a desrepressão das células após o consumo da glicose. Nossos resultados mostram também que C. glabrata secreta a trealase ácida para o meio de cultura, sendo que aproximadamente 30% da atividade enzimática total é secretada após o crescimento em trealose ou glicerol. A trealase ácida secretada para o meio de cultura apresenta uma massa molecular aparente, deduzida por filtração em gel, de 275 kDa na sua forma ativa. Entretanto, a análise de proteínas através de eletroforese em gel desnaturante (SDSPAGE) revelou uma proteína com massa molecular aparente de aproximadamente 130 kDa, que pelo padrão de migração e forte ligação à lectina concanavalina A, indica tratar-se de uma glicoproteína. Esta glicoproteína apresenta uma massa molecular coincidente com o peso teórico da proteína codificada pelo gene CAGLOK05137g de C. glabrata, gene com ~60% de homologia a outras trealases ácidas de leveduras, sugerindo que a enzima ativa seja um dímero. A trealase ácida secretada por C. glabrata apresentou alta afinidade pela trealose, com valores de Km e Vmax de 3,4 mM e 80 U (mg de proteína)-1, respectivamente, além de possuir relativa estabilidade, mostrando-se altamente específica para seu substrato, a trealose.. Palavras-chave: Catabolismo. Trealose. Trealase ácida. C. glabrata..

(7) 7. ABSTRACT. The yeast C. glabrata has been recognized as an important emergent pathogen, and is considered the second most common cause of candidiasis, infecting predominantly immunodeficient and immunocompromised patients. Due to its low sensitivity to antifungal azoles and high mortality, rapid identification tests are important in order to choose the appropriate therapeutic treatment. This microorganism differs from other yeasts because it assimilates only two sugars: glucose and the disaccharide trehalose (Gluα1-1αGlu). Indeed, the rapid identification tests are based on the ability of this yeast to hydrolyze trehalose into two molecules of glucose. Due to the importance that trehalose metabolism has for C. glabrata, in this work a biochemical characterization of trehalose catabolism by this yeast was performed. Our results show that C. glabrata consumes and ferments efficiently the trehalose present in the medium, with kinetic parameters and biomass and ethanol productivities similar to those observed during glucose fermentation. Indeed, growth on trehalose was not affected by the mitochondrial inhibitor antimycin A, confirming the efficient fermentation of this disaccharide by C. glabrata. During the exponential growth phase on trehalose up to 2.5 g/L of glucose was accumulated in the medium, suggesting the possible extracellular hydrolysis of the disaccharide. The analysis of a putative trehalase activity at the cell surface revealed the presence of an acid trehalase with pH optimum of 4.4. This enzyme is synthesized during growth on trehalose, but this sugar seems not to be an inducer of the activity as high levels of this enzyme were also detected after growth on glycerol, the same occurring during the derepression of the cells after glucose consumption. Our results also indicate that C. glabrata secretes the acid trehalase into the medium, and approximately 30% of the total enzymatic activity is secreted after growth on trehalose or glycerol. The acid trehalase secreted into the culture medium shows an apparent molecular mass, deduced by gel filtration, of 275 kDa in its native form. However, the analysis of proteins by denaturant gel electrophoresis (SDS-PAGE) reveled a protein with a molecular mass of approximately 130 kDa, which due to its migration pattern and strong binding to concanavalin A, indicates is a glycoprotein. This glycoprotein has a molecular mass coincident with the theorical weight of the protein encoded by the C. glabrata CAGLOK05137g gene, a gene with ~60% of homology with other yeast acid trehalases, suggesting that the active enzyme is a dimer. The acid trehalase secreted by C. glabrata shows a relative high affinity for trehalose, with Km and Vmax values of 3.4 mM and 80 U (mg of protein)-1, respectively. In addition, this enzyme was relatively stable, and seem to be highly specific for its substrate, trehalose.. Key-words: Catabolism. Trehalose. Acid Trehalase. C. glabrata..

(8) 8. LISTA DE FIGURAS Figura IV.1. Efeito da Antimicina A no crescimento de S. cerevisiae, C. albicans e C. glabrata em trealose........................................................................................................38 Figura IV.2. Crescimento de C. glabrata e C. albicans em glicose...................................39 Figura IV.3. Crescimento de C. glabrata e C. albicans em trealose..................................40 Figura IV.4. Crescimento de C. glabrata em meio mínimo com glicose...........................42 Figura IV.5. Crescimento de C. glabrata em meio mínimo com trealose..........................43 Figura IV.6. Efeito do pH na atividade trealase em células íntegras de C. glabrata..........45 Figura IV.7. Análise cinética da atividade trealase em células íntegras de C. glabrata.....46 Figura IV.8. Efeito do pré-crescimento em diferentes fontes de carbono na capacidade de C. glabrata catabolizar a trealose................................................................................48 Figura IV.9. Atividade trealase celular e trealase extracelular ao longo do crescimento de C. glabrata em meio rico YP contendo 2% glicose como fonte de carbono.....................49 Figura IV.10. Atividade trealase celular e trealase extracelular ao longo do crescimento de C. glabrata em meio rico YP contendo 2% trealose como fonte de carbono...............51 Figura IV.11. Atividade trealase celular e trealase extracelular ao longo do crescimento de C. glabrata em meio rico YP contendo 3% glicerol como fonte de carbono................52 Figura IV.12. Atividade trealase extracelular ao longo do crescimento da linhagem LEMI 8228 em meio rico YP contendo 3% glicerol como fonte de carbono..............................55 Figura IV.13. Cromatograma do sobrenadante de cultura analisado por filtração em gel em coluna Superdex S-200..............................................................................................56 Figura IV.14. Determinação da massa molecular da fração com atividade trealase secretada por C. glabrata................................................................................................58.

(9) 9 Figura IV.15. Eletroforese (SDS-PAGE) das frações com atividade trealase eluidas da filtração em gel..... ..........................................................................................................59 Figura IV.16. Eletroforese (SDS-PAGE) das frações vizinhas às com atividade trealase eluídas da filtração em gel...............................................................................................60 Figura IV.17. Cromatograma de uma outra amostra de sobrenadante de cultura analisado por filtração em gel em coluna Superdex S-200..............................................................61 Figura IV.18. Eletroforese (SDS-PAGE) das frações com atividade trealase eluídas da filtração em gel em Superdex S-200 mostrada na Figura IV.17........................................62 Figura IV.19. Análise cinética da atividade trealase extracelular de C. glabrata...............64 Figura IV.20. Construção do módulo de deleção do gene CAGLOK05137g de C. glabrata 67. Figura V.1. Alinhamento da sequência de aminoácidos das trealases ácidas de C. glabrata, S. cerevisiae e C. albicans................................................................................73.

(10) 10. LISTA DE TABELAS Tabela III.1. Cepas de levedura estudadas.................................................................30 Tabela III.2. Oligonucleotídeos utilizados..................................................................36 Tabela IV.1. Comparação da atividade trealase celular e secretada por algumas cepas de C. glabrata crescidas em glicose, trealose ou glicerol...........................................................................................................................53. Tabela IV.2. Especificidade da Trealase extracelular de C. glabrata.......................65.

(11) 11. LISTA DE ABREVIATURAS. ACT1. trealase ácida de C. albicans. AGT1. transportador α- glicosídeos. EDTA. ácido etilenodiamino tetra-acético. KM. constante de Michaellis Menten. LEMI. Laboratório Especial de Micologia UNIFESP. MIC. concentração inibitória mínima. NTH1. trealase neutra. OPC. candidíase de orofaringe. PCR. reação em cadeia da polimerase. SDS. dodecil sulfato de sódio. SDS-PAGE. eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS. SNF1. Sucrose Non-Fermenting 1. TPS1. trealose 6-fosfato sintase. TreA. trealase ácida de A. nidulans. YNB. yeast nitrogen base (meio mínimo). YP. yeast peptone (meio rico).

(12) 12. SUMÁRIO I INTRODUÇÃO.........................................................................................................13 I.1 Candida glabrata................................................................................................13 I.2 Manifestações clínicas e epidemiologia das Candidíases.................15 I.2.1 Infecções superficiais por Candida....................................................................15 I.2.2 Forma invasiva ou sistêmica das infecções por Candida................................16. I.3 Fatores de virulência para C. glabrata.......................................................19 I.4 Diagnóstico laboratorial das infecções por C. glabrata......................21 I.5 Metabolização de Trealose por leveduras................................................25 I.5.1 Catabolismo da trealose......................................................................................26. II JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS........................................................................29 III MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................30 III.1 Cepas utilizadas...............................................................................................30 III.2 Meios e condições de cultivo......................................................................31 III.3 Determinação de glicose, trealose e etanol...........................................31 III.4 Determinação da atividade trealase.........................................................32 III.5 Dosagem de proteínas...................................................................................33 III.6 Técnicas de purificação de proteínas......................................................33 III.6.1 Preparação das amostras..................................................................................33 III.6.2 Filtração em gel..................................................................................................33 III.6.3 Coluna de afinidade com lectina.......................................................................34. III.7 Eletroforese de proteínas.............................................................................34 III.8 Técnicas de Biologia Molecular.................................................................35 IV RESULTADOS......................................................................................................36 V DISCUSSÃO...........................................................................................................69 VI CONCLUSÃO........................................................................................................77 VII REFERÊNCIAS...................................................................................................79 ANEXO A – Identificação das principais leveduras de interesse clínico........................94.

(13) 13. I INTRODUÇÃO. I.1 Candida glabrata C. glabrata, junto com as demais espécies de Candida, pertence à classe dos Fungos Imperfeitos, ordem Moniliales, família Cryptococcaceae. C. glabrata é encontrada sob uma única forma, a de levedura, que se reproduz assexuadamente por brotamento, sem nenhum ciclo sexual conhecido. Esta levedura foi isolada de fezes humanas em 1917, e recebeu a denominação de Cryptococcus glabrata. Em 1938, Lodder e De Vries transferiram-na para o gênero Torulopsis. Entretanto, em 1978, quando se determinou que a habilidade de produzir pseudo-hifa não seria um critério de distinção dos membros pertencentes ao gênero Candida, foi sugerida a reclassificação de T. glabrata dentro do gênero Candida (LACAZ et al., 1991; FIDEL et al., 1999). As leveduras do gênero Candida têm grande importância pela alta freqüência com que colonizam e infectam o hospedeiro humano, sendo a maioria das infecções fúngicas causada por estas leveduras. Espécies de Candida são normalmente encontradas no trato gastrointestinal em 20 a 80% da população adulta saudável. Entre as mulheres, cerca de 20 a 30% apresentam colonização vaginal por leveduras do gênero Candida. Entretanto, estes microorganismos podem tornar-se patogênicos devido. a. alterações. nos. mecanismos. de. defesa. do. hospedeiro,. ou. ao. comprometimento de barreiras anatômicas, como consequência de procedimentos médicos invasivos ou queimaduras. As alterações dos mecanismos de defesa do hospedeiro podem ser decorrentes de mudanças fisiológicas como prematuridade ou envelhecimento, ou ainda consequencia de doenças degenerativas, neoplasias, imunodeficiências congênitas ou adquiridas, e imunossupressão. Na maioria das vezes, a espécie mais freqüentemente envolvida na etiologia das infecções por Candida é C. albicans. No entanto, nas últimas duas décadas, dados epidemiológicos apontam a emergência de outras espécies de Candida não albicans, entre elas, C. glabrata. Historicamente, C. glabrata foi considerada como organismo saprófita não patogênico, de microbiota normal em indivíduos sadios, raramente causador de infecção em humanos. Contudo, a freqüência de infecções sistêmicas e de mucosa.

(14) 14 causadas por esta espécie vem crescendo de forma significativa, principalmente em pacientes imunocomprometidos, neonatos e idosos (PRICE et al., 1994; FIDEL et al., 1999; DIEKEMA et al., 2002), fazendo de C. glabrata um importante patógeno oportunista e emergente. A emergência de C. glabrata como microrganismo patogênico está provavelmente associada ao uso sistemático de terapia imunossupressora concomitante ao uso de antibióticos de amplo espectro, e pelo aumento do número de indivíduos com AIDS (PFALLER et. al., 1998; 2001; BADDLEY et al., 2001; RUHNKE, 2006). Um agravante é que uma parcela significativa dos isolados de C. glabrata apresenta menor sensibilidade a anfotericina B, e resistência ao antifúngico azólico fluconazol. Desta forma, para alguns autores, o uso prolongado de fluconazol, que constitui medida profilática comum em pacientes com AIDS, em pacientes transplantados, ou após quimio ou radioterapia, pode contribuir para o aumento das infecções por C. glabrata (WINGARD et al., 1993, PRICE et al., 1994; PFALLER et al., 1998; 2001; BADDLEY et al., 2001; BODEY et al., 2002; SENDID et al., 2006; PANACKAL et al., 2006). A seqüência do DNA mitocondrial de C. glabrata descrita por Koszul e colaboradores (2003), revelou o menor genoma mitocrondial (20 Kb) conhecido dentre as seqüências obtidas para um hemiascomiceto. Consequentemente, mutações nos genes ou até mesmo perda total do DNA mitocondrial podem ocorrer em C. glabrata, porém sem o comprometimento da viabilidade celular, característica que a define como uma levedura “petite” positiva. A levedura Saccharomyces cerevisiae também é uma “petite” positiva, enquanto que C. albicans é considerada “petite” negativa por não sobreviver sem a capacidade de respirar. O genoma de C. glabrata, com 13 cromossomos e 12,3 Mb, foi recentemente seqüenciado pelo programa Genolevures (http://cbi.labri.fr/Genolevures/elt/GAGL), apresentando 38,8% de G+C, o que é bem próximo do encontrado para S. cerevisiae (DUJON et al, 2004). De fato, as características do genoma de C. glabrata e de vários outros hemiascomicetos indicam que aproximadamente há 100 milhões de anos um ancestral comum das leveduras do grupo Saccharomyces (no momento da divergência entre os gêneros Saccharomyces e Kluyveromyces) sofreu uma duplicação do genoma (“whole genome duplication” ou WGD), seguida de significativa remodelagem no conteúdo gênico conforme as espécies se diferenciavam. Como consequência do WGD, verifica-se que aproximadamente 60% dos genes em C. glabrata se encontram em regiões cromossômicas semelhantes às de S. cerevisiae (denominadas regiões.

(15) 15 “sintenicas” por apresentarem genes homólogos com inclusive a mesma orientação cromossomica conservada), além de ser observado em média cerca de 65% de identidade entre as sequências de aminoácidos das proteínas de C. glabrata e S. cerevisiae (DUJON et al, 2004; FISCHER et al, 2006; SCANNELL et al, 2006; WOLFE, 2006). Estes resultados e a restrita homologia com C. albicans têm levado muitos pesquisadores a propor uma nova denominação para C. glabrata: “Saccharomyces glabrata”. Entretanto, enquanto as espécies de leveduras do grupo Saccharomyces “senso stricto” (p. ex. S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S. bayanus) aproveitaram a WGD para se tornarem eficientes fermentadores de açúcares, no caso de C. glabrata ocorreu significativa perda de genes (aproximadamente 9% menos genes comparado ao total de genes presentes em S. cerevisiae), principalmente genes envolvidos na utilização de algumas fontes de carbono, no metabolismo do fosfato, nitrogênio e enxofre, e genes necessários para a biosíntese de vitaminas como tiamina (B1), piridoxina (B6) e niacina. Logicamente que estas perdas gênicas são reflexo da adaptação deste microrganismo ao seu nicho ecológico como patógeno e/ou comensal oportunista em mamiferos, onde não são encontradas fontes de carbono como galactose, sacarose ou maltose, e as vitaminas podem ser facilmente obtidas do hospedeiro (DUJON et al, 2004; HITTINGER et al, 2004; WOLFE, 2006). Portanto, o genoma desta levedura certamente fornecerá importantes informações sobre a biologia, patogenicidade e possíveis alvos terapêuticos deste patógeno oportunista.. I.2 Manifestações clínicas e epidemiologia das Candidíases Leveduras do grupo Candida podem provocar tanto infecções superficiais (geralmente nas mucosas) quanto sistêmicas no ser humano. I.2.1 Infecções superficiais por Candida As principais infecções de mucosa são as candidíases de orofaringe, esofágica e vaginal. As candidíases de orofaringe (OPC) e esofágica estão comumente relacionadas a diferentes populações de risco, como pacientes com infecção por HIV, com deficiência nutricional, com desordens metabólicas (como o diabetes), portadores de neoplasias, de xerostomia (secundária à radioterapia ou por efeitos colaterais da medicação), envelhecimento, Síndrome de Sjogren, e pelo uso de prótese dentária. Em.

(16) 16 particular, a candidíase oral ocorre em mais de 90% dos indivíduos portadores do HIV, e estima-se que aproximadamente de 10 a 15% dos pacientes com AIDS irão sofrer também de esofagite por Candida durante o progresso da doença. Predominantemente, o agente etiológico das candidíases orais e esofágicas é a levedura C. albicans. E quando cepas de C. glabrata são detectadas geralmente estão associadas a infecções por C. albicans. Infecções mistas de C. albicans com outras espécies de Candida são responsáveis pela não resposta ao protocolo terapêutico e pelo agravamento sintomático das OPC, principalmente em indivíduos HIV positivos (CARTLEDGE; MIDGLEY; GAZZARD, 1999). Infecções devidas exclusivamente a C. glabrata também têm sido descritas, sendo responsáveis por 14% das OPC em pacientes portadores de HIV (CANUTO et al., 2002). Outro relato aponta C. glabrata como causa emergente de OPC em indivíduos portadores de neoplasia de cabeça e pescoço, que se tornam neutropênicos após radioterapia (REDDING et al., 2004). Além disso, C. glabrata é descrita como a segunda espécie de Candida encontrada na cavidade bucal de indivíduos sadios, principalmente em usuários de próteses dentárias (LYON et al., 2006). E, no Brasil, embora os dados epidemiológicos sejam raros, Melo e colaboradores, em 2004, relatam uma baixa incidência desta espécie em indivíduos portadores de HIV sob terapêutica retroviral. Mesmo assim, a maioria dos isolados de C. glabrata apresentaram concentração inibitória mínima (MIC) para o fluconazol maior que 32 µg/ml. Candidíase vulvovaginal (VVC) é a infecção mais comum do trato genital. Tem sido estimado que 75% de todas as mulheres terão pelo menos um episódio de vulvovaginite ao longo de suas vidas, caracterizada por quadro sintomático esporádico de severidade média a moderada devido a C. albicans e sem nenhum fator de predisposição. Em contraste, cerca de 10% das mulheres sofrem de uma forma complicada da doença com episódios mais severos e recorrentes ou devido a outras espécies de candida não albicans, sendo C. glabrata a espécie mais comumente isolada. Em geral, estes pacientes com forma complicada de vaginite por Candida têm fatores de predisposição como o diabetes descompensado ou se encontram sob imunossupressão. Não há comprovação de que mulheres infectadas pelo HIV poderiam ter um aumento na taxa de colonização vaginal por espécies de Candida não-albicans e assim, maior susceptibilidade a vaginites, diferente do que ocorre nas OPC (SOBEL et al., 1998; GOSWAMI et al., 2000)..

(17) 17 Os principais sinais e sintomas de vaginite por Candida independentemente da espécie são: prurido, sensação de queimação e leucorréia. Como já mencionado C. albicans é a espécie predominante seguida de C. glabrata com 14,6% dos isolados (CORSELLO et al., 2003). No Brasil, os poucos relatos epidemiológicos apontam C. albicans como espécie presente em 90% dos isolados, seguida de C. glabrata com 6% (RIBEIRO et al., 2000). Quanto a susceptibilidade aos antifúngicos azólicos pelas espécies de Candida associadas a vulvovaginite, dados indicam que mais da metade dos isolados de C. glabrata tiveram susceptibilidade dose dependente, e 15,2% mostraram resistência (MIC ≥16 µg/ml) ao fluconazol (RICHTER et al., 2005). Desta forma, para mulheres que falham na resposta à terapia com azólicos, o uso de cápsulas vaginais de ácido bórico ou uso tópico de flucitocina são preconizados (SOBEL et. al., 2003). Estudos recentes indicam que a ventilação mecânica por mais de 2 dias predispõe a colonização do trato respiratório por Candida em 26,6% dos casos. Geralmente, essa colonização está associada ao tempo prolongado de internação nas UTIs e ao aumento do risco de pneumonia por bactérias, principalmente do genero Pseudomonas. E, nestes casos, C. glabrata tambem é a segunda espécie mais freqüentemente encontrada (AZOULAY et al., 2006). Situaçao semelhante é observada com relação à incidência de Candida, e particularmente de C. glabrata, nas infecções do trato urinario, que em muitos casos podem provocar complicações sistêmicas e/ou abscessos renais (LUNDSTROM; SOBEL, 2001; OLIVEIRA; MAFFEI; MARTINEZ, 2001). I.2.2 Forma invasiva ou sistêmica das infecções por Candida São denominadas candidíases invasivas as candidemias, as candidíases disseminadas hematogênicas, e as infecções de órgão(s) por via hematogênica ou por inoculação direta. A candidemia pode difundir a levedura por meio hematogênico para um ou múltiplos órgãos, originando a candidíase disseminada aguda. Acredita-se que a maioria dos casos de candidemias seja adquirida por via endógena, pela translocação do patógeno através do trato gastrointestinal. Porém, estas infecções também podem ser adquiridas por via exógena, através do contato das mãos de profissionais de saúde, de catéteres vasculares em posição central, de implantes, de próteses, bem como pela administração parenteral de soluções. De fato, C. glabrata pode ser um importante.

(18) 18 agente das infecções nosocomiais, e longos períodos de internação, o uso de antibióticos de largo espectro, a contaminação pelas mãos de enfermeiros e pelo próprio ambiente hospitalar constituem formas de difusão deste microrganismo (VAZQUEZ et al., 1998; VALERIO, WELKERT-OLIVEIRA, RESENDE, 2006). Os relatos de infecções invasivas por leveduras do gênero Candida eram escassos até a metade do século XX. Nas últimas décadas, C. albicans e espécies não-albicans vêm se tornando cada vez mais importantes como causa destas infecções. A transformação da levedura, de comensal a importante agente de infecções, ocorreu principalmente em ambiente hospitalar e resulta do próprio progresso da medicina: com o aumento do número de procedimentos invasivos, levando a quebra de barreiras de proteção natural; o uso de antibióticos de amplo espectro; e a capacidade de sustentar a vida de pessoas muito debilitadas e susceptíveis a microorganismos oportunistas (EDWARDS, 1991). Na década de 1980, o Centro de Controle de Doenças (USA) constatou um aumento de 400% na incidência de candidemia nos principais hospitais americanos. Neste mesmo período, leveduras do genero Candida que representavam o sexto agente mais comum das infecções das unidades de tratamento intensivo, passaram a ocupar a quarta posição, atrás apenas de infecções por Staphylococcus e enterococos (EDMOND et al., 1999; RUHNKE, 2006). Observou-se também mudança significativa no que se refere à espécie de Candida prevalente nas candidemias. Na década de 80, 75% das candidemias era causada por C. albicans, porém, esta proporção caíu para menos de 60% nos anos 90 e, nesta última década, várias fontes apontam uma redução dos episódios de candidoses por C. albicans para 30%. No caso das infecções causadas por espécies não albicans observou-se um aumento significativo: C. glabrata, passou de 2 para 26%, C. parapsilosis de 10 para 20%, e C. tropicalis de 2 para 24%. Entretanto, variações geográficas importantes no padrão etiológico das infecções invasivas por Candida podem ocorrer: nos países da América Latina (incluindo o Brasil) e do Pacífico-Ásia, isolados de C. glabrata podem não ser tão frequentes (McMULLAN et al., 2002; COLOMBO et al., 2003; PFALLER; DIEKEMA, 2004), embora na Irlanda do Norte, C. glabrata é a espécie não albicans predominante, responsável por 18% das candidemias (McMULLAN et al., 2002). Desta forma, nos EUA e na Europa, C. glabrata já é considerada o segundo agente causal de candidemias. A taxa de mortalidade diretamente atribuída a candidemia é alta, atingindo em média cerca de 44%. Dentre as várias espécies de Candida, verifica-se que C. glabrata.

(19) 19 é a que provoca a mais rápida e letal forma de candidemia em, por exemplo, pacientes com câncer (VISCOLI et al., 1999). Portanto, as infecções por C. glabrata, assim como idade avançada, doença em estágio degenerativo, e retenção de catéter intravascular, são considerados fatores de risco independentes para a mortalidade.. I.3 Fatores de virulência para C. glabrata Em C. albicans varios fatores de virulência já foram descritos, como a capacidade de secretar hidrolases (proteases e fosfolipases) e a capacidade de formar filamentos (hifas e pseudohifas) (GHANNOUM, 2000; NAGLIK et al., 2004; WHITEWAY; OBERHOLZER, 2004). Embora algumas destas atividades e/ou propriedades estejam presentes em C. glabrata, seu papel na patogenicidade desta levedura é ainda questionável (KAUR et al., 2005). Entretanto, algumas outras características desta levedura importantes para a sua patogenicidade, já foram elucidadas. A capacidade das leveduras de aderir-se a superfícies abióticas (como cateteres, próteses) assim como umas às outras e também à superfície das células do hospedeiro tem grande relevância médica, uma vez que, esta capacidade propicia a fixação e colonização microbiana. E, o biofilme formado pelas leveduras pode, muitas vezes, beneficiar a seleção de cepas resistentes a drogas (KOJIC; DAROUICHE, 2004). A adesão de espécies de Candida a resinas acrílicas de próteses dentárias, por exemplo, é considerado o primeiro passo da patogênese de estomatites. Da análise da colonização de quatro principais resinas constitutivas destas próteses, C. glabrata foi a única espécie que foi capaz de aderir a todas as resinas, e a única que se aderiu à resina Vertex (XY et al., 2006). A adesão das leveduras a superficies é consequência de moléculas existentes na superfície celular, denominadas adesinas, aglutininas ou floculinas, que geralmente incrementam a hidrofobicidade da superficie celular, permitindo a fixação da levedura a uma variabilidade de substratos (VERSTREPEN; KLIN, 2006). Geralmente os genes que codificam para estas proteínas (genes FLO em Saccharomyces, genes ALS e EPA em C. albicans ou C. glabrata) são formados por famílias gênicas com diversos membros, geralmente situados em regiões teloméricas. Desta forma, estes genes não só estão sujeitos a ampla heterogeneidade no tamanho das proteínas que eles.

(20) 20 codificam (permitindo também significativa variação antigênica), mas também a diversos mecanismos regulatórios envolvidos na sua expressão, permitindo a adesão (ou não) do microrganismo, conforme as necessidades e em resposta a estímulos ambientais. (VERSTEPEN;. REYNOLDS;. FINK,. 2004;. HALME. et. al.,. 2004;. VERSTEPEN, et al., 2005). Por exemplo, a expressão da floculina FLO11 depende não só de cascatas de regulação envolvendo a via de regulação do crescimento filamentoso (via MAPK quinases), como também pela disponibilidade de açúcares que regulam a via proteína quinase AMPc-dependente, e a via de repressão pela glicose. Além destes mecanismos regulatórios, este gene é também regulado por fatores epigenéticos que envolvem a formação de heterocromatina na região telomérica dos cromossomos, atividade regulada pela disponibilidade de NAD+ e mediada pelo complexo de proteínas SIR2-4 (RUSCHE; KIRCHMAIER; RINE, 2003; HALME et al., 2004). Em C. glabrata encontramos situação semelhante, na medida que, genes EPA, responsáveis pela aderência às celulas do hospedeiro, também são telomêricos e sujeitos a mecanismos regulatórios semelhantes aos encontrados para os genes FLO de S. cerevisiae (CORMACK; GHORI; FALKOW, 1999; DE LA PENAS et al., 2003; CASTANO et al., 2005). Na verdade, nesta levedura patogênica as características do genoma permitiram descobrir mais um mecanismo regulatório envolvido na expressão de adesinas (e, portanto, um determinante na patogenicidade deste microrganismo): a expressão de alguns genes EPA, envolvidos na aderência das leveduras durante infecção do trato urinário, são induzidos pela limitação de ácido nicotínico neste ambiente, um precursor da nicotinamina adenina dinucleotídeo (NAD+). Portanto, a levedura C. glabrata aproveita o auxotrofismo de uma vitamina (o ácido nicotínico) para monitorar ambientes pobres nesta coenzima (p.ex. urina), e sinalizar a expressão de uma adesina especifica permitindo a infeção (DOMERGUE et al., 2005). Os conhecimentos já adquiridos com outras leveduras permitiram também elucidar os mecanismos de resistência (alta) aos antifúngicos apresentada por significativa percentagem de isolados de C. glabrata. Os antifúngicos azólicos, sobretudo o fluconazol, têm sido amplamente usados na profilaxia e na terapêutica de candidose em indivíduos imunossuprimidos (receptores de órgãos e medula óssea e pacientes sob quimioterapia) e indivíduos imunocomprometidos (portadores de imunodeficiência e indivíduos com AIDS). C. glabrata apresenta uma baixa suscetibilidade intrínseca aos antifúngicos azólicos, o que para alguns autores pode.

(21) 21 estar relacionado com o amplo e sistemático uso deste antifúngico em alguns países (PANACKAL et al., 2006; SENDID et al., 2006), embora certamente a exposição ao antifúngico não seja a única causa (KAUR et al., 2005). Os antifúngicos azólicos agem sobre a via de biosíntese do ergosterol, o principal esteróide da membrana antifúngica. Estes fármacos inibem seletivamente uma enzima do complexo citocromo P450 denominada 14-α-demetilase, bloqueando a demetilação do lanosterol em ergosterol. Ao interferir com a biosíntese do ergosterol, comprometem a permeabilidade da membrana. O mecanismo de resistência aos azólicos foi estudado primeiramente em C. albicans (MORSCHHAUSER, 2002). Neste microrganismo, como em C. glabrata, a expressão incrementada de transportadores de membrana permite o eficiente efluxo da droga (HITCHCOCK et al,1993; MIYAZAKI et al, 1998; SANGLARD et al, 2001; VERMITSKY, EDLIND, 2004). Entretanto, a resistência ao azólico pode resultar também do aumento na expressão e conteúdo celular da proteína alvo do antifúngico, a 14-α-demetilase (MIYAZAKI et al, 1998; HENRY, NICKELS, EDLIND, 2000). Além dos mecanismos já descritos, altos índices de resistência azólica são decorrentes de mutações no DNA mitocondrial que freqüentemente ocorrem nesta espécie, gerando leveduras com deficiência respiratória (DEFONTAINE et al., 1999; BOUCHARA et al., 2000; KAUR, CASTANO, CORMACK, 2004). Alguns autores sugerem que mutantes petites sejam selecionados pela terapia com fluconazol. A maior resistência dos mutantes petite provavelmente envolve não só um aumento do conteúdo de ergosterol livre (o que também explica sua maior susceptibilidade aos antifúngicos poliênicos), como também maior expressão dos transportadores que permitem o efluxo do composto azólico (BRUN et al, 2004; TSAI et al., 2006).. I.4 Diagnóstico laboratorial das infecções por C. glabrata Normalmente as leveduras são identificadas por uma combinação de critérios morfológicos e fisiológicos (também denominados “bioquímicos”). O aspécto da colônia, as características inerentes à levedura (como tamanho, presença de hifa, pseudo-hifa e/ou de cápsula) e a formação de tubo germinativo e clamidósporo em provas específicas, são alguns dos critérios morfológicos analisados. Os testes bioquímicos, por sua vez, avaliam a capacidade das leveduras de utilizarem.

(22) 22 determinados açúcares como fonte de carbono e energia (testes de assimilação e/ou fermentação de carboidratos), e de assimilarem o nitrato como fonte de nitrogênio (SIDRIM; MOREIRA, 1999). Desta forma, existem no mercado muitos meios de cultivo diferenciais e kits que permitem a identificação de leveduras. Quanto aos aspectos morfológicos, C. glabrata forma colônias brancas, lisas, circulares e de bordas bem definidas, que são relativamente indistinguíveis das outras espécies de Candida, exceto pelo seu tamanho relativo, que é um pouco menor. Os blastoconídios de C. glabrata medem cerca de 1 a 4 µm e, os blastoconídios de C. albicans de 4 a 6 µm. Em contraste com outras espécies de Candida, C. glabrata não apresenta dimorfismo, portanto, não forma pseudo-hifa em temperaturas acima de 37°C, e seu resultado na prova do tubo germinativo é, conseqüentemente, negativo (FIDEL et al., 1999). O agar cromogênico CHROMagar® (Becton Dickinson), é um meio seletivo e diferencial que permite o isolamento e a identificação (por coloração e morfologia da colônia) de algumas espécies de Candida: C. albicans, C. tropicalis e C. krusei (PFALLER et al., 1996). Colônias de C. glabrata neste meio seletivo apresentam cor intermediária entre o róseo e lilás e que, por gerar dúvida (já que, para as demais leveduras não identificadas neste meio a tonalidade esperada é rósea) este não deve ser o único fator para a interpretação final. De forma semelhante, os outros meios cromogênicos comerciais Candida ID® (Biomerieux) e CandiSelect® (Bio-Rad) são usados para identificação de C. albicans, porém não específicos para identificar C. glabrata. Os chamados testes bioquímicos avaliam a capacidade de assimilação de carboidratos por diferentes espécies de leveduras, existindo no mercado vários kits comerciais como o API20C® e o ID32C® (BioMérieux), e o Auxacolor® (Bio-Rad). Os resultados se traduzem pelo aparecimento de turvação ou pela viragem de um indicador de pH quando uma suspensão de leveduras é colocada na presença do carboidrato. Já, o teste taxonômico padrão para a avaliar a capacidade fermentativa das leveduras baseia-se na produção de gás carbônico pelas células durante a utilização do carboidrato, e geralmente tubos de Durham invertidos são utilizados para reter o gás formado. Existem também sistemas automatizados como o Vitek® (BioMérieux) e o Microscan Rapid Yeast Indet® (Baxter) onde a incubação e leitura são feitas pelo próprio equipamento (KITCH, et al., 1996; SIDRIM; MOREIRA, 1999). Estes testes bioquímicos clássicos de identificação são laboriosos e demorados (3-7 dias), o.

(23) 23 que os tornam, muitas vezes, impraticáveis em laboratórios de rotina. Nessas provas bioquímicas usuais para identificação, uma característica bastante peculiar de C. glabrata a diferencia das demais espécies de Candida: C. glabrata assimila e fermenta apenas dois dos doze açúcares testados: a glicose e o dissacarídeo trealose, formado por duas moléculas de glicose (Glcp(α1→1)Glcp) ligadas através do carbono anomérico (LACAZ et al., 1991). Essa característica é visualizada no anexo A, que apresenta uma tabela comumente encontrada em livros de micologia clínica e é utilizada na identificação das principais leveduras de interesse clínico. Devido à freqüência nos isolados, e à reduzida sensibilidade aos antifúngicos azólicos, um teste diagnóstico rápido que permita a identificação de C. glabrata pode ser de suma importância para a decisão terapêutica, especialmente em candidemias sistêmicas. No final dos anos 90, vários testes rápidos foram desenvolvidos prometendo uma rápida e presuntiva identificação de C. glabrata. Estes testes baseiam-se na habilidade desta levedura em utilizar eficientemente trealose como fonte de carbono, hidrolisando de forma rápida as moléculas de trealose em duas de glicose. A trealase, enzima responsável pela hidrólise específica da trealose (e não de outros dissacarídeos), é freqüentemente encontrada em várias espécies de leveduras, mas em nenhuma dessas outras espécies a hidrólise da trealose é aparentemente tão rápida quanto em C. glabrata (PELTROCHE-LLACSAHUANGA et al., 1999, LOPEZ et al., 2001, FREYDIERE et al., 2002; 2003). Nestes testes rápidos, uma suspensão de leveduras com grande densidade celular é incubada na presença de trealose, e a glicose gerada pela ação da trealase é então detectada por reativo de cor (PELTROCHE-LLACSAHUANGA et al., 1999; FREYDIERE et al., 2002). Visando aumentar a especificidade do teste da trealase, agregou-se teste paralelo de hidrólise do dissacarídeo maltose (Glcp(α-1→4)Glcp). Enquanto a maioria das outras espécies de Candida são eficientes fermentadoras deste açúcar por possuir altos níveis da enzima maltase, C. glabrata é incapaz de utilizar a maltose. A sensibilidade atribuída aos testes rápidos da trealase é de 94 a 98%, e sua especificidade pode ser ainda maior, de 95 a 100%, especialmente quando o teste da maltase é realizado em conjunto. Porém, o meio de cultivo utilizado para a obtenção das leveduras pode interferir no desempenho dos testes rápidos, e as primeiras formulações do CHROMagar por exemplo, geravam resultados errôneos no teste rápido, reduzindo sua sensibilidade para 25% (FREYDIERE et al., 2002). Outros trabalhos observaram redução da sensibilidade em até 20% para o teste RAT (rápida.

(24) 24 assimilação da trealose) realizado com leveduras isoladas em meio Sabouraud dextrose, e a precisa explicação para esta interferência ainda não é conhecida (MURRAY; ZINCHUK; LARONE, 2005). Recentemente, numerosas técnicas baseadas no DNA têm sido também desenvolvidas para a identificação de espécies de Candida. Em eletroforese em campo elétrico homogênio (CHEF) o DNA cromossômico de C. glabrata pode ser separado em 10 a 13 bandas (VAZQUEZ et al., 1998). Desta forma, várias cepas de C. glabrata são identificadas por análise comparativa dos padrões obtidos por CHEF. As técnicas de PCR (reação em cadeia da polimerase) e PCR “real time” usadas para a amplificação de DNA alvo de Candida são promissoras devido à simplicidade, especificidade e sensibilidade e estão otimizadas para detecção de Candida em sangue ou hemocultura, cultura de raspado cutâneo, etc. (CHEN et al., 2000; DASSANAYAKE; SAMARANAYAKE, 2003; KAMIYA et al., 2005). Outras estratégias inovadoras que combinam metodologias como o PCR “real time” e sequenciamento por bioluminescência ou pirosequenciamento são capazes de detectar espécies de Candida a partir do DNA extraído diretamente do raspado vaginal (TRAMA; MORDECHAI; ADELSON, 2005). Variações intra-específicas de C. glabrata podem ser avaliadas através das análises: de polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP); de DNA polimórfico amplificado randomicamente (RAPD) ou ainda; da seqüência gênica mitocondrial do citocromo c oxidase subunidade 2 (COX2), e têm sido bastante úteis em estudos epidemiológicos e na investigação de focos de infecções hospitalares (DE MEEUS et al., 2002; BOLDO et al., 2003; ERGON; GULAY, 2005; VALERIO; WEIKERT-OLIVEIRA; RESENDE, 2006; WENJIN; JYFU, 2006). Foi através da análise do padrão polimórfico das seqüências de COX2 que pesquisadores brasileiros propuseram a existência de dois “clusters” de cepas de C. glabrata associados com suas procedências geográficas, uma dos Estados Unidos e outra do Brasil (SANSON; BRIONES, 2000). Embora promissoras, o emprego dessas técnicas na rotina laboratorial é inviável devido ao alto custo e à necessidade de pessoal qualificado. No Brasil, na maioria das vezes, o diagnóstico de vulvovaginite por Candida é apenas clínico, não havendo remessa de raspado vaginal para análise microbiológica. E, quando feita, a análise laboratorial compreende além da observação microscópica com KOH, provas de formação do tubo germinativo em soro e da produção de clamidósporos em ágar fubá acrescido de Tween 80. Assim, só nos é perrmitido.

(25) 25 discriminar se a levedura é C. albicans ou não. A identificação de outras espécies, por necessitarem de provas complementares de assimilação e fermentação de carbono não são realizadas, isto se deve ao fato destas técnicas serem trabalhosas, demoradas e caras. O diagnóstico mais minucioso até a identificação da espécie da levedura, fica restrito a amostras de sangue.. I.5 Metabolização de Trealose por leveduras A trealose é um dissacarídeo formado pela união de duas moléculas de glicose em uma ligação (α1→1)-glicosídica. Este dissacarídeo não redutor foi identificado e caracterizado em uma variedade de organismos, como bactérias, fungos, leveduras, plantas e insetos. O interesse biotecnológico da trealose está em suas propriedades como agente protetor ou estabilizante de biomoléculas (vacinas, proteínas, enzimas, membranas), incluindo células inteiras, ou mesmo de produtos alimentícios, farmacêuticos e cosméticos (ELBEIN, 1974; THEVELEIN, 1984; COUTINHO et al., 1988; ROSER, 1991; COLAÇO et al., 1992; ELBEIN et al., 2003). O metabolismo da trealose vem sendo extensivamente estudado na levedura S. cerevisiae, onde a trealose é usada como principal carboidrato de reserva, chegando a 20% ou mais de peso seco da célula dependendo das condições de crescimento, de estresse do meio e do estágio do ciclo de vida (SINGER; LINSQUIST, 1998b). Durante períodos de escassez de nutriente, a trealose acumulada pode ser utilizada como fonte de energia. Além disso, a trealose pode também atuar como agente protetor de membrana. e. proteínas. durante. situações. estressantes,. como. desidratação,. congelamento ou altas concentrações de etanol (HINO et al., 1990; MANSURE et al., 1994; SANO et al., 1999; CERRUTTI et al., 2000). Neste microrganismo, a concentração de trealose celular é controlada pelo balanço entre os processos de biossíntese e hidrólise da trealose. Em leveduras, a via de síntese da trealose foi elucidada por Cabib e Leloir há mais de 50 anos. A síntese começa com a transferência do resíduo glicosil da uridinadifosfato-glicose (UDP-Glc) para a glicose 6-fosfato (G-6P), resultando em trealose 6fosfato (T-6P), que é subseqüentemente desfosforilada a trealose. Em S. cerevisiae, as enzimas que catalisam estas reações de biosíntese da trealose, a T-6P sintase (Tps1p) e T-6P fosfatase (Tps2p), fazem parte de um complexo com duas outras proteínas.

(26) 26 (Tsl1p e Tps3p), que estabilizam a holoenzima. Todas as subunidades do complexo são requeridas para uma atividade ótima, mas a deleção do gene TPS1 resulta em perda total da atividade de síntese e produção de trealose (BELL et al., 1998). A trealose-6P sintase (TPS1) está envolvida também na regulação de uma série de outros processos fisiológicos, incluindo o influxo da glicose na glicólise (THEVELEIN; HOHMANN, 1995). Esta via de síntese é encontrada em várias outras leveduras (GANCEDO; FLORES, 2004), sendo que existem evidências que em C. albicans, os genes TPS1 e TPS2 são necessários para a patogenicidade da levedura (ZARAGOZA et al., 1998; VAN DIJCK et al., 2002). I.5.1 Catabolismo da trealose Existem dois sistemas enzimáticos para o catabolismo da trealose nos fungos, um reversível, envolvendo a fosforilação da trealose pela trealose foforilase resultando em duas moléculas, uma de glicose e uma α-glicose-1-fosfato, e outro irreversível, através da hidrólise do dissacarídeo por trealases gerando duas moléculas de glicose. A trealose fosforilase tem sido isolada em um número restrito de fungos e leveduras (SCHICK; HALTRICH; KULBE, 1995; EIS et al., 2001; ELBEIN et al., 2003) Em S. cerevisiae, assim como na maioria dos fungos, a hidrólise da trealose envolve basicamente duas trealases (E.C.3.2.1.28), denominadas de trealase ácida e trealase neutra. Estas enzimas apresentam várias diferenças no que se refere à localização, propriedades catalíticas e regulação. A trealase neutra (Nth1p) é citoplasmática e exibe atividade máxima em pH neutro (pH 6,7 a 7,0), sendo ativada por Ca2+ e Mn2+ e regulada por mecanismo de fosforilação que envolve a proteína quinase cAMP-dependente, convertendo a enzima para sua forma ativa fosforilada (THEVELEIN, 1988). O gene que codifica a trealase neutra foi clonado e seqüenciado em alguns fungos como Aspergillus nidulans e Neurospora crassa (DÈNFERT et al., 1999),. nas. leveduras. S.. cerevisiae. (KOPP;. MÜLLER;. HOLZER,. 1993),. Schizosaccharomyces pombe (SOTO et al., 1998), Kluyveromyces lactis (AMARAL et al., 1997), e C. albicans (ECK et al., 1997), Mais recentemente, o gene desta enzima foi caraterizado no fitopatógeno Magnaporthe grisea (FOSTER; JENKINSON; TALBOT, 2003), e no patógeno de insetos Metarhizium anisopliae (XIA; CLARKSON; CHARNLEY, 2002; XIA et al., 2002; SMALL; DONALDSON; BIDOCHKA, 2004). Comparativamente, o gene da trealase ácida foi clonado apenas na levedura S. cerevisiae (DESTRUELLE et al., 1995) e no fungo filamentoso A. nidulans (DÉNFERT;.

(27) 27 FONTAINE, 1997). A trealase ácida é ativa como monômero nas leveduras e aparentemente como um dímero em A. nidulans. É considerada altamente específica para a trealose, tendo Km entre 0,2 a 5 mM, e seu pH ótimo de atividade está entre o pH 4,5 a 5,0 (LONDESBOROUGH; VARIMO, 1984; JORGE et al.,1997; AQUINO et al., 2005). Além dessas características este tipo de trealase parece não ser regulada por mecanismos pós-transcricionais, e na análise de suas seqüências protéicas um alto número de possíveis sítios de N-glicosilações e a presença de peptídeo sinal ou transmembrana podem ser observados (MITTENBUHLER; HOLZER, 1988; 1991). Em S. cerevisiae, esta enzima está localizada nos vacúolos e sua atividade é independente de cátions bivalentes (DESTRUELLE et al., 1995). Enquanto a trealase neutra hidrolisa a reserva de trealose intracelular (KOPP et al., 1993), a trealase ácida seria necessária para o crescimento da levedura utilizando trealose como fonte de carbono (NWAKA et al., 1996; NWAKA; HOLZER, 1998). Estas enzimas exibem também um padrão de atividade oposto ao longo do ciclo de crescimento. A atividade da trealase citossólica é mais alta durante crescimento exponencial com açúcares fermentáveis (glicose, manose ou galactose), com uma queda na atividade à medida que as células entram na fase estacionária, coincidindo com o início da biosíntese da trealose. Já, no caso da trealase ácida, sua principal atividade é detectada durante a fase estacionária ou em culturas que cresceram com substratos respiráveis (glicerol e etanol), indicando que esta enzima é sujeita a repressão catabólica pela glicose (SAN MIGUEL; ARGUELLES, 1994). Como já mencionado, a trealose pode ser usada como fonte de carbono para o crescimento de fungos e leveduras. As células de S. cerevisiae possuem um transportador ativo para trealose na membrana plasmática (STAMBUK et al., 1996; 1998; STAMBUK; DE ARAUJO, 2001), codificado pelo gene AGT1, também necessário para o crescimento em trealose (MALLUTA et al., 2000) Entretanto, para que a hidrólise da trealose extracelular pudesse acontecer dentro dos vacúolos (NWAKA et al., 1996; NWAKA; HOLZER, 1998), seria imprescindível que a trealose atravessasse a membrana vacuolar, e as moléculas de glicose produzidas teriam que sair do vacúolo para serem metabolizadas pela célula. Independentemente do mecanismo molecular envolvido, a utilização de trealose por esta levedura ocorre através do metabolismo aeróbico (quer dizer, o açúcar não é fermentado até etanol e CO2), provavelmente causado pelo lento influxo de moléculas de açúcar para a via glicolítica (MALLUTA et al., 2000)..

(28) 28 Em contraste, em fungos filamentosos como A. nidulans (DÉNFERT; FONTAINE, 1997) e N. crassa (HECKER; SUSSMAN, 1973) e nos zigomicetos termotolerantes Mucor rouxii (ALMEIDA et al., 1997; LUCIO et al., 2000) e Rhizopus microsporus (AQUINO et al., 2005), a utilização de trealose envolve outra via, onde o açúcar é hidrolisado extracelularmente por uma trealase ácida e a seguir as moléculas de glicose geradas são metabolizadas pelas células. Nestes organismos e em outros fungos, a atividade trealase extracelular se encontra ligada à parede celular dos ascósporos e conidiósporos, no espaço periplásmico (HECKER; SUSSMAN, 1973, DÉNFERT; FONTAINE, 1997; LUCIO et al., 2000) ou, no meio de cultura (WILLIAMS; NIEDERPRUEM, 1968; THEVELEIN, 1984; KADOWAKI et al., 1996; DEKKER et al, 1997; WISSER et al., 2000; AQUINO et al., 2005). A trealase ácida presente nos conidiósporos de A. nidulans foi purificada, e seu gene (treA) clonado. O gene treA apresenta grande homologia com o gene ATH1 da trealase ácida vacuolar de S. cerevisiae e, da mesma forma, mostrou-se ser essencial para o crescimento em trealose já que mutantes que sofreram substituição no locus deste gene se tornavam incapazes de crescer em trealose (DÉNFERT; FONTAINE, 1997). Pouco é conhecido sobre os mecanismos de utilização de trealose em outras leveduras. Em C. albicans, por exemplo, foi sugerido que a trealase ácida esteja associada à superfície externa (RAM et al., 1984; ALVAREZ-PERAL; ARGUELLES, 2000). A presença de trealases ácidas extracelulares ja foi descrita também em Phycomyces blakesleeanus e Rhodotorula rubra (MANSURE; SILVA; PANEK, 1992; LOPEZ-GALLARDO et al., 1995). Já, em C. utilis, não há evidência de atividade trealase extracelular ou ligada à parede, e foi reportado ainda que algumas linhagens de C. utilis sem atividade trealase ácida são capazes de crescer em trealose. Numa outra linhagem desta levedura o crescimento em trealose depende da atividade de um transportador de trealose e de trealases ácidas e neutras intracelulares, sendo que estas atividades são reguladas pela fonte de carbono, sendo induzidas na presença de trealose ou maltose e reprimidas na presença de glicose ou glicerol (ARGUELLES; GACTO, 1985; ROY; GHOSH, 1998; ROY et al., 2001; ROLIM et al., 2003)..

(29) 29. II JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS A utilização de trealose por C. glabrata constitui a base para sua identificação, principalmente nos testes rápidos recentemente introduzidos na pratica laboratorial. Entretanto, pouco é conhecido a respeito da metabolização de trealose por esta levedura patogênica. Existe apenas um único trabalho descrevendo o gene SNF1 como necessário para a utilização deste açúcar como fonte de carbono por C. glabrata (PETTER, KWON-CHUNG, 1996). O gene SNF1 em S. cerevisiae controla o mecanismo de repressão/desrepresão pela glicose e foi descoberto pela incapacidade de mutantes neste gene fermentarem a sacarose (CELENZA, CARLSON, 1986). O gene SNF1 de C. glabrata apresenta maior homologia com o gene de S. cerevisiae do que com o gene correspondente em C. albicans (PETTER, KWON-CHUNG, 1996) Dada a importância da metabolização de trealose em leveduras e, em particular em C. glabrata, por constituir a base para sua identificação laboratorial, prentendemos: - Caracterizar o tipo de metabolismo (aeróbico ou fermentativo) realizado por C. glabrata para utilizar trealose como fonte de carbono. Com este objetivo, pretendemos avaliar os parâmetros de crescimento, como biomassa formada, consumo dos açúcares, produção de etanol, etc. - Caracterizar bioquimicamente a trealase de C. glabrata que é utilizada para o crescimento em trealose. Serão avaliados a especificidade, afinidade pelo substrato, pH ótimo e massa molecular aparente da enzima. - Analisar os mecanismos regulatórios envolvidos na expressão da atividade trealase nas células. - Analisar in silico possíveis genes necessários para a utilização de trealose por C. glabrata, incluindo sua clonagem e/ou disrupção do genoma, e analisar as consequências fenótipicas produzidas nas leveduras modificadas..

(30) 30. III MATERIAL E MÉTODOS III.1 Cepas utilizadas As cepas de leveduras usadas no presente trabalho estão relacionadas na Tabela 1. As cepas de C. glabrata LEMI 6099 a LEMI 8228 fazem parte da coleção do Laboratório Especial de Micologia Médica da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP-EPM), e foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo. Todas estas cepas foram isoladas a partir das indicadas amostras biológicas (vide Tabela 1) no Hospital São Paulo, com exceção do isolado LEMI 7186A obtido no Hospital do Rim e Hipertensão. A cepa 72 nos foi doada pela Profa. Dra. Nancy Porto do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (USP). A cepa Bg2 e Bg14 foram gentilmente cedidas do Prof. Dr. Brendan P. Cormack do Departamento de Biologia Molecular e Genética da Faculdade de Medicina Johns Hopkins, em Baltimore (USA). Tabela III.1 Cepas de levedura estudadas Espécie e cepa. Característica e/ou genótipo. C. glabrata LEMI 6099. Isolado clínico (fezes). LEMI 6469A. Isolado clínico (urina). LEMI 6947. Isolado clínico (secreção traqueal). LEMI 7186A. Isolado clínico (lavado bronco-alveolar). LEMI 8228. Isolado clínico (urina). 72. Isolado clínico. Bg2. Isolado clínico (vagina). Bg14. Cepa Bg2, mas ura3∆::Tn903 NeoR. C. albicans 3153. Isolado clínico. S. cerevisiae CEN.PK2-1C. MATa ura3-52 his3∆1 leu2-3,112 trp1-289 MAL 2-8c SUC2.

(31) 31 A cepa de C. albicans 3153 foi cedida pelo Prof. Dr. Jairo Santos do Departamento de Ciências Farmaceuticas da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), e obtida do London School of Hygiene & Tropical Medicine (UK). Finalmente, a cepa de S. cerevisiae CEN.PK2-1C foi cedida pela Dra. Angélika. F. Maris, e obtida da EUROSCARF (European S. cerevisiae Archive for Functional Analysis), Frankfurt, Alemanha.. III.2 Meios e condições de cultivo As células de levedura foram crescidas em meio rico YP contendo 1% de extrato levedura (Sigma) e 2% de bacto-peptona (Difco), suplementado com 2% de trealose (Sigma), glicose (Casa da Química ou Sigma), ou 2% etanol/ 3% glicerol, ou 3% (v/v) glicerol. Alternativamente, as cepas foram crescidas em meio mínimo YNB contendo 0,7% base nitrogenada de levedura sem aminoácidos (Sigma), 2% da fonte de carbono e suplementados com 22 mg/L uracila quando requerido. Os meios ricos tiveram o pH ajustado para 5,0 com ácido clorídrico, e o meio mínimo foi tamponado com 50 mM succinato-Tris, pH 5,0. Foi adicionado 2% bacto-agar (Sigma) aos meios sólidos, e os meios foram esterilizados em autoclave a 120°C por 20 min. Quando indicado, foi adicionado 5 µg/ml de antimicina A (Sigma, solução estoque 5 mg/ml em etanol) ou até 800 µg/ml de geneticina (G-418, Gibco) aos meios após a esterilização. O meio de crescimento líquido não ocupou mais que 1/5 do volume total do frasco para garantir aeração adequada, e as culturas foram mantidas a 28°C sob agitação orbital (160 rpm). O crescimento celular foi determinado pela leitura da densidade óptica das culturas a 570 nm.. III.3 Determinação de glicose, trealose e etanol Amostras das culturas foram centrifugadas a 2.600 g por 1 min, e os sobrenadantes usados para a determinação de trealose, glicose e produção de etanol. A concentração de glicose foi determinada enzimaticamente utilizando-se glicose oxidase e peroxidase através de um kit enzimático comercial (Bio Técnica, Brasil).

(32) 32 seguindo as instruções do fabricante. A concentração de etanol foi determinada enzimaticamente com álcool oxidase (de P. pastoris, Sigma) e peroxidase (de raizforte, Toyobo do Brasil), conforme descrito por Salgado e colaboradores (2000) e Rodinov e colaboradores (2002). A trealose foi dosada enzimaticamente com 0,17 U/ml de trealase de rim de porco (Sigma) em tampão 100 mM succinato-Tris, pH 5,5, a 37°C por 4h, sendo a glicose liberada pela ação da trealase determinada como descrito acima.. III.4 Determinação da atividade trealase A atividade trealase foi determinada nas células íntegras através da adaptação de um método para dosar atividade invertase extracelular em S. cerevisiae (SILVEIRA et al., 1996). As células (aproximadamente 10 mg), previamente centrifugadas (3000 g, 5 min) e lavadas duas vezes com água gelada, eram ressuspensas em 1 ml de tampão 50 mM acetato de sódio (pH 5,0) contendo 50 mM fluoreto de sódio, e incubadas por 30 min a 30°C. A seguir 50 µl desta suspensão celular foi adicionada a 50 µl de tampão 100 mM succinato-Tris (pH 4,4), e a reação enzimática iniciada pela adição de 100 µl de 200 mM trealose. Após incubação por 10 min a 30°C, a reação foi interrompida através de fervura das amostras por 5 min. Para a dosagem da atividade enzimática nos sobrenadantes de cultura (previamente filtrados em membrana Millipore com poro de 0,22 µm), ou frações obtidas durante a purificação da enzima, as células foram substituidas por 50 µl das amostras em análise, e em alguns casos as reações extendidas até 30 min a 30°C. Após fervura as amostras foram centrifugadas, e 10 µl do sobrenadante usados para determinar a concentração de glicose liberada como descrito acima. A reações foram realizadas em triplicata, e controles contendo amostras previamente fervidas foram sempre utilizados. Somente foram aceitos valores com menos de 10% de variação entre as triplicatas. A atividade enzimática foi expressa em unidades (U), onde uma unidade é a quantidade de enzima que produz 1 µmol de glicose min-1 nas condições do ensaio (30°C e pH 4,4)..

(33) 33. III.5 Dosagem de proteínas A concentração protéica das amostras foi estimada pelo método de Bradford (1976), utilizando albumina de soro bovino (Sigma) como padrão.. III.6 Técnicas de purificação de proteínas III.6.1 Preparação das amostras A enzima foi obtida do sobrenadante de cultura de células de C. glabrata crescidas em meio rico YP contendo 3% glicerol, obtido após centrifugação (3000 g, 5 min), e filtração em membrana Millipore (0,22 µm). Os sobrenadantes foram congelados. (-20oC),. liofilizados. (liofilizador. Pirani. 78/1,. Edwards. do. Brasil),. ressuspensos no menor volume de água destilada, e dialisados em sacos de diálise (permeáveis para peptídeos de até 3,5 kDa) por 12 horas sob refrigeração em tampão 10 mM fosfato de sódio, pH 7,4. Após a diálise, as amostras foram concentradas em microconcentradores Amicon® Centricon® YM 50 (MIllipore) por centrifugação, a 4°C e 5000 g (centrífuga Hitachi modelo CP 30mX) pelo tempo necessário até a obtenção de um volume de amostra próximo a 500 µl. A seguir as amostras foram acrescidas de 10% glicerol e mantidas congeladas a -20oC. III.6.2 Filtração em gel Para a filtração em gel foi usada uma coluna Superdex S-200 30/100GL (Amersham) com volume de 24 ml, acoplada a um sistema de cromatografia de alta resolução AKTAFLPCTM (Amersham). A coluna foi previamente equilibrada com tampão 100 mM succinato-Tris (pH 4,4) contendo 10% glicerol. Após aplicar 100 µl da amostra, a cromatografia foi realizada com o mesmo tampão sob um fluxo de 0,75 ml/min, sendo coletadas frações de 300 µl. As leituras espectrofotométricas das frações eluídas da coluna foram realizadas a 280 nm. A coluna foi calibrada com padrões de peso molecular (Sigma MW/GF1000) contendo anidrase carbônica bovina (29 kDa), albumina sérica bovina (66 kDa), álcool desidrogenase (150 kDa), amilase (200 kDa), anfotericina de baço de cavalo (443 kDa), e tiroglubulina bovina (669 kDa)..