EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
JACKELINE GOMES DA SILVA ARAÚJO
Produção secretória da proteína recombinante do Capsídeo de Circovírus
Suíno 2 em Pichia pastoris e sua aplicação como antígeno
Recife
2014
Produção secretória da proteína recombinante do Capsídeo de Circovírus
Suíno 2 em Pichia pastoris e sua aplicação como antígeno
Tese
de
Doutorado
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em Inovação
Terapêutica da Universidade Federal de
Pernambuco, para a obtenção do Título de
Doutor em Inovação Terapêutica
Orientador: Prof(o). Dr. Antonio Carlos de Freitas
Recife
2014
Catalogação na fonte Elaine Barroso
CRB 1728
Araújo, Jackeline Gomes da Silva
Produção secretória da proteína recombinante do capsídeo de Circovírus Suíno 2 em Pichia pastoris e sua aplicação como antígeno/ Recife: O Autor, 2014.
89 folhas : il., fig., tab.
Orientador: Antonio Carlos Dias de Freitas
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Inovação Terapêutica, 2014.
Inclui bibliografia
1. Circovírus 2. Suíno- doenças I. Freitas, Antonio Carlos Dias de (orientador) II. Título
571.99211 CDD (22.ed.) UFPE/CCB- 2014- 195
REITOR
Prof. Dr Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
VICE-REITOR
Prof. Dr. Silvio Romero de Barros Marques
PRÓ-REITOR(A) PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof Dr. Francisco de Sousa Ramos
DIRETOR(A) DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Prof(a). Dr. Ângela Maria Isidro Farias
VICE- DIRETOR(A) DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Prof(a). Dr. Silvia Regina Arruda de Moraes
COORDENADOR(A) DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
Prof. Dr. César Augusto Souza de Andrade
VICE- COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
Nome: SILVA, Jackeline Gomes
Título: Produção secretória da proteína recombinante do capsídeo de Circovírus Suíno 2 em
Pichia pastoris e sua aplicação como antígeno.
Tese apresentada à Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do título de Doutor em Inovação Terapêutica
Aprovada em: 27/02/14
Banca Examinadora
Prof(a). Dr. Eliane Campos Coimbra
Instituição: Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE
Assinatura:______________________________________________________
Prof(a). Dr (a) Clara Nilce Barbosa
Instituição: Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE
Assinatura:______________________________________________________
Prof(a). Dr. André Luiz Santos de Jesus
Instituição: Universidade Federal de Pernambuco - UFPE
Assinatura:______________________________________________________
Prof(a). Dr (a) Maira Galdino da Rocha Pitta
Instituição: Universidade Federal de Pernambuco - UFPE
Assinatura:______________________________________________________
Prof(a). Dr. Antonio Carlos de Freitas
Instituição: Universidade Federal de Pernambuco
Dedico,
Unicamente aos meus pais, Pedro Marinho da Silva e Raimunda Gomes da Silva, pelo amor, dedicação e incentivo na minha carreira. E pela transposição dos reais valores do amor familiar recebidos de Deus.
A Deus, pelo seu amor incondicional, cuidadoso, zeloso e abundante. Pela sua graça ter me alcançado e por isso fazer total diferença em meu viver. Grata pelo seu favor imerecido, Senhor!
Ao meu marido, pelo incentivo e vontade de me ver crescer, através de sua amorosa forma de saber dividir os nossos dias, momentos, planos e conquistas. Por todo o seu cuidado, zelo e dedicação pelo nosso lar e essencialmente pelo nosso amor. Obrigada, amor!
A minha família, irmão e irmãs, por sermos uma família linda e cheia de alegria. Sendo eles mais velhos, agradeço por compartilharem comigo “o gene do esforço”, pois como filha caçula ainda consegui “pegar” muita coisa boa. Vocês se assemelham ao Ouro!
Ao Professor Antonio Carlos, meu orientador, pela confiança ao longo desse período. E porque não citar, a coragem em aceitar um mestre em Toxicologia de Produtos Naturais, para trabalhar com biologia molecular. Obrigada, Professor Antonio!
A minha família “Sal e Luz”, por auxiliarem em um caminhar que agrade a Deus, acima de tudo. Pelos momentos de compartilhar à vida juntos e isto torná-la melhor vivida em tudo que possamos fazer ou ter. Por sermos felizes desde agora em saber que o nosso criador voltará. Vocês são aqueles bem chegados que geram riso no meu coração. Obrigada por estarem comigo!
Ao grupo, Clodine, Márcia (e sua trupe), Aline, Jaci, Priscila, Léia, Lailson, Sérgio, Sabrina, Paula, Sandro, D. Eliane, D. Socorro e Jully por fazerem da minha sexta-noite uma oportunidade a mais de celebrar o amor de Deus em nossas vidas. Vocês são bênçãos. Bateu valeu, galera!
Aos meus amigos do LEMTE, Ana Pavla, Conceição, Bárbara, Élyda, Rita, Nayara (Nanay), Cosme, Karin, Ana Jéssica, por serem pessoas compromissadas com aquilo que fazem, vivendo isso de forma rotineira no laboratório. E também por tornar o ambiente de trabalho um local prazeroso de permanecer. Obrigada a cada um (a)!
Aos amigos da linha de expressão heteróloga, Eliane (Eli-te), André (Doctor), Filipe (Filipe-te), Marcelo (Tchecha) e Luciana (Lu) por funcionarmos em grupo, com diferentes habilidades que foram compartilhadas e que ao final somaram-se. Pelos inúmeros momentos de risadas e alegria. Vocês tornaram esses anos bem especiais para mim. Obrigada-TE! (o TE é interno!!.rsrs).
meninas!
Ao professor Roberto Soares de Castro pela colaboração para a realização desse trabalho, sua orientação e confiança prestada. Isto foi essencial para a finalização da Tese. Obrigada, Professor!
Ao pessoal da Universidade Federal Rural, Ana Cláudia e Sérgio pelo curto tempo que trocamos experiência, mas de ótimo convívio. Em particular, à Ana pela sua excelente e essencial ajuda nos experimentos de ELISA. Muito obrigada, pessoal!
A Professora Inês Portela Lobato da UFMG pela colaboração e fornecimento dos soros suínos utilizados. Agradecida, Professora!
A professora Clara Nilce Barbosa pelo “ponta pé” inicial dos estudos com Circovírus no LEMTE-UFPE
A professora Suely Galdino (in memoriam) pelo seu exemplo de entusiasmo pela pesquisa e por seu notório interesse pelos objetivos comuns aos “PPGITeanos”. Seu exemplo não pode ser esquecido!
Aos Professores da pós-graduação que com suas experiências ajudaram à minha formação.
Ao secretário do PPGIT, Paulo, pelo auxílio de forma correta e exemplar para os PPGITeanos em geral. Obrigada, Paulo!
Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para todo o propósito debaixo do céu.
Há tempo de nascer e tempo de morrer; tempo de plantar e tempo de arrancar o que se plantou;
Tempo de matar e tempo de curar; tempo de derrubar e tempo de edificar;
Tempo de chorar e tempo de rir; tempo de prantear e tempo de dançar;
Tempo de espalhar pedras e tempo de ajuntar pedras; tempo de abraçar, e tempo de afastar-se de abraçar;
Tempo de buscar e tempo de perder; tempo de guardar e tempo de lançar fora;
Tempo de rasgar e tempo de coser; tempo de estar calado e tempo de falar;
Tempo de guerra e tempo de paz
.
O Circovírus Suíno (CVS) é um vírus de DNA fita simples, que pertence à família Circoviridae, com genoma de 1,7kilobases. Apresenta dois tipos principais, o CVS1 e o CVS2. O CVS1 não é patogênico, enquanto que o CVS2 está associado a um conjunto de doenças como a Síndrome Multissistêmica do Definhamento de Suínos (SMDS). Estes tipos virais possuem a proteína Rep, essencial para replicação e a proteína Cap, formadora do capsídeo. A pCap possui epítopos imunoreativos e imunodominantes e tem sido utilizada como um antígeno tanto para o diagnóstico, quanto para aplicação vacinal, contra infecções causadas pelo CVS2. Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica que utiliza metanol como única fonte de carbono e tem sido utilizada para expressar genes heterólogos por apresentar vantagens como, a realização de modificações pós-traducionais e sua fácil manipulação. Objetivou-se nesse estudo expressar o gene Cap códon-otimizado do CVS2 para expressar em
Pichia pastoris, visando a produção secretória da pCap e sua aplicação como antígeno
recombinante em imunoensaios. Para tanto, a construção pPICZαA/CVS2Capo obtida após clonagem gênica foi inserida no genoma da levedura por eletroporação e o sistema foi induzido com metanol, sob o controle do promotor AOX1, por 72h. Os clones expressos positivamente foram identificados em Colony blot e Dot blot, após a reação dos clones com anticorpo-antiHis. A rCap foi detectada com massa molecular de ~39 kDa em sobrenadante da P. pastoris por SDS-PAGE e Western blot. Neste último, a detecção foi feita pelo reconhecimento da rCap por anticorpos anti-CVS2 de soros de animais com histórico de SMDS. A rCap testada em ELISA indireto contra soros de animais sabidamente negativos e positivos, previamente determinados pela imunoperoxidase (IP), mostrou alta eficiência discriminatória com alta razão positivo/negativo de 597. Após análise preliminar de parâmetros concordantes e discordantes, entre o IP e ELISA, observou-se uma alta concordância entre eles. Os resultados representam a efetiva produção da rCap pela via secretória de P. pastoris, com sugestiva preservação dos epítopos imunoreativos na mesma. Isto demonstra a viabilidade do sistema eucarioto de expressão utilizado e o potencial uso da rCap para detecção de anticorpos anti-CVS2 como ferramenta auxiliar no diagnóstico de doenças causadas pelo CVS2 como a SMDS.
PALAVRAS-CHAVE: Circovírus Suíno 2. Pichia pastoris. proteína do capsísdeo. antígeno
The pig circovirus (CVS) is a single strand, which belongs to the family Circoviridae with 1.7 kilobase genome DNA viruses. It has two main types, the PCV1 and PCV2. The PCV1 is not pathogenic, whereas PCV2 is associated with a number of diseases such as Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome of Swine (SMDS). These viral types have the Rep protein essential for replication and Cap protein, forming the capsid. The pCap has immunodominant and immunoreactive epitopes and has been used as an antigen for both diagnosis and vaccinal application against infections caused by PCV2. Pichia pastoris is a methylotrophic yeast that uses methanol as sole carbon source has been used to express heterologous genes by its advantages as the realization of post-translational modifications and its easy handling. The objective of this study express the codon-optimized gene for PCV2 Cap the express in P.
pastoris, targeting secretory production of pCap and its application as a recombinant antigen
in immunoassays. For this, the construction (pPICZαA/CVS2Capo) obtained after cloning the gene was inserted into the genome of yeast by electroporation and the system was induced with methanol, under the control of AOX1 promoter, for 72h. The expressed clones were positively identified in Colony blot and Dot blot after reaction with antibody-antiHis clones. The rCAP was detected with a molecular mass of ~39 kDa in the supernatant of P. pastoris by SDS-PAGE and Western blot. In the latter, the detection was made by rCap recognition by anti-PCV2 antibodies in sera from animals with a history of PMWS. The rCap tested in ELISA against sera from known negative and positive animals, previously determined by immunoperoxidase (IP), showed high efficiency with high discriminatory reason positive/negative 597. Upon preliminary analysis of concordant and discordant parameters between the IP and ELISA, there was a high correlation between them. The results represent an effective production rCap the secretory pathway of P. pastoris with suggestive preservation of immunoreactive epitopes in the rCap. This demonstrates the viability of eukaryotic expression system used and the potential use of rCap for detection of anti-PCV2 antibodies and as an auxiliary tool for diagnosis of diseases caused by PCV2 like PMWS. .
KEY WORDS: Porcine Circovirus 2. Pichia pastoris. capsid protein. recombinant antigen
Figura 1: Organização Genômica do Circovírus Suíno 2 22 Figura 2: Microscopia eletrônica dos vírions do CVS2 33 Figura 3: Estrutura secundária da proteína do Capsídeo 34 Figura 4: Mapa do vetor pPICZα (Invitrogen) 41 Figura 5. Estratégia da construção do gene Cap otimizado de CVS2 para
expressão em Pichia pastoris.
44
Figura 6: Comparação entre a utilização do codon usage de P. pastoris e os utilizados para a expressão do gene do capsídeo otimizado de CVS2
53
Figura 7: Comparação entre a utilização dos códons utilizados por P. pastoris e os utilizados para a expressão do gene do capsídeo selvagem de CVS2
54
Figura 8: Alinhamento das sequências nucleotídicas do genes cap selvagem e códon otimizado de CVS2.
56
Figura 9: Esquematização da obtenção do gene Capo e do vetor de expressão pPICZαA
56
Figura 10: Obtenção do gene Capo e do vetor de expressão pPICZαA. 57 Figura 11: Ilustração da clonagem do gene Capo no vetor pPICZαA 58 Figura 12: Confirmação da clonagem do gene Cap no vetor pPICZαA 58 Figura 13: Alinhamento da construção pPICZα/CVS2Cap com o gene Cap
códon otimizado de CVS2
59
Figura 14: Linearização da construção pPICZαA/CVS2Capo 60 Figura 15: Triagem dos recombinantes de Pichia pastoris em Colony blot 61 Figura 16: Screening dos recombinantes de Pichia pastoris em Dot blot 62 Figura 17: Proteína Recombinante (rCap) analisada por SDS-PAGE 63 Figura 18: Imunodetecção da Proteína recombinante do capsídeo de CVS2
(rCap) em Western Blot
64
Tabela 1: Principais componentes do vetor pPICZα (Invitrogen) e suas funções
Tabela 2. Volumes e concentrações dos reagentes utilizados na reação de digestão
41
46
Tabela 3: Diluições testadas do antígeno recombinante, do soro e da proteína-G na padronização do ELISA indireto
64
Tabela 4: Comparação dos resultados de soros de suínos testados pelo IP, teste de referência, com os resultados da DO450nm do ELISA
ABIPECS: Associação da indústria produtora e exportadora de carne suína
AOX1: Álcool oxidase 1
AOXp: Promotor AOX1
B
BMGY: Meio complexo tamponado com glicerol
C
CpG: citosina-guanina dinucleotídeos
CaCL2: Cloreto de Cálcio CVS: Circovírus Suíno
CpG: Cotosina-Granina - Olinonucelotídeo
D
D.O: densidade ótica
DNA: ácido desoxirribonucleico
DACVS: Doenças Associadas ao Circovírus Suíno
E
ELISA: Ensaio Imunoadsorvente ligado à enzima ELISA-r:
H
HS: hibridização “in situ” I
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IF: Imunofluorescência
IPMC: Imunoperoxidase em camada de Células
L
LB: Meio Luria Bertani LPD:Leite em pó desnatado
M
MSC: Múltiplo sítio de Clonagem
N
ng: nanogramas nt: nucleotídeo
P
PEG: Polietilenoglicol
pBSK: Vetor de clonagem pBluescriptSK pCap: proteína do capsídeo
PCRq: Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa PVDF: Fluoreto de polivinildileno
S
SEAB: Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento
T
TBS: Tris Buffered Saline TCA: Ácido tricloacético
V
VLPs: Partículas semelhantes a vírus
Y
1. INTRODUÇÃO 17
2. REVISÃO DE LITERATURA 19
2.1 Suinocultura 19
2.2. Circovírus 19
2.2.1 Organização Genômica e Replicação 21 2.3. Doenças associadas ao circovírus suíno 2 (DACVS2) 23 2.3.1 Síndrome Multissistêmica do Definhamento em Suínos (SMDS) 25 2.4. Diagnóstico para Doenças associadas ao circovírus suíno 2 26
2.4.1 Diagnóstico laboratorial 28
2.4.2 Diagnóstico sorológico 29
2.5. Transmissão e controle das DACVS2 31
2.6 Proteína do casídeo (pCap) de CVS2 33
2.6.1 Estrutura e Função 33
2.6.2 Produção da Proteína do Capsídeo (pCap) do CVS2 em sistemas
recombinantes de expressão 36
2.7 Sistema heterólogo de expressão em levedura 37 2.7.1 Pichia pastoris como sistema de expressão heteróloga 38
3. OBJETIVOS 43
3.1 Geral 43
3.2 Específico 43
4. METODOLOGIA 44
4.1. Obtenção do gene Cap de CVS2 códon-otimizado 44 4.2. Clonagem do gene Cap em vetor de expressão pPICzαA 44 4.2.1. Preparação de células competentes de E. coli via CaCl2 45 4.2.2. Transformação plasmidial em Escherichia coli 45 4.2.3 Extração plasmidial, digestão e ligação 46 4.2.4 Análise dos clones pPICZαA/CVS2Capo por digestão e
sequenciamento 46
pastoris 47
4.4. Imunoensaios para triagem dos clones recombinantes em Pichia pastoris 48
4.4.1 Colony Blotting 48
4.4.2 Dot Blotting 48
4.5 Indução dos recombinantes de Pichia pastoris com cultivos em frascos 49 4.6. Tratamento com os sobrenadantes com Polietilenoglicol (PEG) e Ácido
tricloroacético ( TCA) 49
4.7 Análise por SDS (dodecil-sulfato de sódio de poliacrilamida) e Western Blot 50
4.8. ELISA indireto 51
4.8.1 Padronização do ELISA indireto (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay) 51
5. RESULTADOS 52
5.1. Análise in silico do gene Cap de CVS2 códon otimizado Cap de CVS2 52 5.2. Clonagem do gene Cap otimizado (Capo) em vetor de expressão pPICZαA 56 5.3. Análise dos recombinantes de Pichia pastoris através do screening em
Colony blotting e Dot blotting 60
5.4. Detecção da proteína recombinante do capsídeo (rCap) de CVS2 por
SDS-PAGE e Western Blot 61
5.5. Padronização do ELISA indireto 63
6. DISCUSSÃO 65
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO 75
8. PERSPECTIVAS 76
1. INTRODUÇÃO
A suinocultura progrediu em muitos países como China, Estados Unidos e os países da União Européia, os quais representam 80% da produção mundial de carne suína. A representatividade do Brasil neste mercado mundial é de 3,1% (SEAB, 2013). O crescimento no comércio mundial de carne suína estimulou entre os produtores, um aprimoramento de técnicas de manejo, nutrição e reprodução dos suínos, assim como uma maior preocupação com a saúde dos animais nos plantéis. A intensificação do comércio de animais pode propiciar a multiplicação e disseminação de vários patógenos, principalmente vírus e bactérias, resultando na ocorrência de surtos de enfermidades que acarretam elevados prejuízos econômicos (BARCELLOS et al., 2008).
Circovírus Suíno (CVS) é um agente patogênico viral que é amplamente distribuído em suínos por todo o mundo e de grande importância para suinocultura mundial. São vírus pertencentes à família Circoviridae que inclui dois tipos: o CVS1, que não é patogênico e o CVS2. Ambos o tipos virais possuem duas principais ORFS (quadro aberto de leitura). A ORF1 codifica a proteína replicativa rep, e a ORF2, codifica a única proteína estrutural do capsídeo, cap. A proteína Cap possui sítios de reconhecimento para o receptor viral e forma o capsídeo viral e representa o antígeno imunodominante do vírus, responsável pela produção de anticorpos neutralizantes. Nela estão contidos epítopos imunoreativos e imunoconservados, reconhecedores de anticorpos anti-CVS2. Isto a torna eleita para ser utilizada como marcador sorológico da infecção com circovírus, ou para uma estratégia protetora, como as vacinas contra este patógeno (FENAUX et al., 2003; BUCAREY et al., 2009).
O CVS2 está associado a um conjunto de doenças como: doença reprodutiva de Suíno, doença respiratória de Suíno, doença entérica, dermatite e nefropatia Suína e a síndrome multissistêmica do definhamento de suínos (SMDS), que é a mais importante (BAEKBO, KRISTENSEN, LARSEN, 2012). As infecções com CVS2 promovem variados níveis de depleção linfocitária, e agressão à primeira linha de defesa da resposta imune celular, infectando macrófagos e células dendríticas (KIXMOLLER et al., 2008). Um quadro inflamatório também é comum nos órgãos afetados. A evolução das doenças causadas pelo CVS2 é influenciada pela presença de multifatores, como: predisposição do hospedeiro e o seu quadro imunológico, co-infecções virais ou bacterianas. Particularmente, a SMDS causa distúrbios em vários sistemas, o que dificulta o diagnóstico dessa doença (SEGALÉS, 2012).
Nas doenças causadas pelo CVS2, os animais podem ser diagnosticados, se apresentarem: sinais clínicos e lesões macroscópicas em órgãos específicos, lesões histopatológicas, em tecidos alvos e a presença do antígeno de CVS2.
O diagnóstico laboratorial das infecções pelo CVS2 pode ser feito através de isolamento viral, imunofluorescência (IF), imunoperoxidase (IP) (ALLAN E ELLIS, 2000), hibridização in situ (HS) (NAWAGITGUL et al., 2000) e PCR (Reação em cadeia da Polimerase) (CALSAMIGLIA et al., 2002). A HS e IHQ são mais comumente aplicadas para identificação do Circovírus Suíno 2, entretanto a literatura aponta que testes imunoenzimáticos, como o IP e ELISA, também tem sido bem escolhido. O ELISA por apresentar maior acurácia e praticidade é um teste bem sugerido e atualmente, um ELISA realizado com antígenos recombinantes tem sido muito atrativo (NAWAGAITGUL et al., 2000).
Antígenos recombinantes produzidos em diferentes sistemas de expressão heteróloga, têm sido aplicados no campo da pesquisa de doenças veterinárias (COUTINHO et al., 2012; GONÇALVEZ et al., 2010). Sistemas de expressão como Pichia pastoris, Escherichia coli,
Saccharomyces cerevisae e Baculovírus já têm sido testados para expressão do gene Cap de
CVS2 visando à produção de proteínas recombinantes de interesse para diagnósticos e ou vacinação (WU et al., 2008; KAMSTRUP et al., 2004; FENAUX et al., 2003).
Dentre estes sistemas, a levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido usada com grande sucesso (CREGG, CEREGHINO, HIGGINS, 2000), devido a apresentar características peculiares que exercem muitas vantagens sobre outros sistemas (MACAULEY-PATRICK et al., 2005), tais como: simplicidade das técnicas para a manipulação genética, capacidade de produzir proteínas heterólogas em altos níveis, habilidade de realizar modificações pós-traducionais, tipicamente associadas a eucariotos superiores, e de secretar proteínas solúveis para o meio (GELLISSEN, 2000). Além disso, esta levedura tem um padrão de glicosilação similar ao das células animais e não promove hiperglicosilação como Saccharomyces cerevisiae que pode afetar a função biológica da proteína produzida (CREGG, CEREGHINO, HIGGINS, 2000).
Neste trabalho o gene Cap do Circovírus Suíno 2 com o códon otmizado foi expresso em sistema eucarioto utilizando a levedura Pichia pastoris como hospedeira. A proteína recombinante do capsídeo (rCap) do CVS2 produzida por via secretória apresentou bioatividade contra soros de suínos positivos para CVS2 em imunoensaios. A rCap foi utilizada como antígeno em teste de ELISA indireto a fim de averiguar sua potencial imunoreatividade. Parâmetros intrínsecos ao teste, como sensibilidade e especificidade, foram
determinadas para fins comparativos entre o ensaio teste ELISA, e o teste de referência, Imunoperoxidase em Monocamada de Células (IPMC).
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Suinocultura
A produção mundial de carne suína possui grande representatividade. A China ocupa o primeiro lugar, seguida da união Européia e Estados Unidos. O Brasil atualmente ocupa a quarta posição, com representatividade de 3,1% da produção mundial (ABIPECS, 2013). A carne suína é a fonte de proteína animal mais consumida mundialmente, sendo praticamente o dobro da carne bovina. A Europa, América do Norte e Oceania, representam a ordem decrescente do consumo mundial. O consumo no Brasil ainda é superado pela carne Bovina (ABIPECS, 2013; SEAB, 2013).
O acentuado crescimento de consumo e vendas veio acompanhado da modernização mundial da indústria suinícola, nas últimas duas décadas, com melhorias dos sistemas produtivos, das tecnologias envolvidas na produção, bem como do manejo e padrões de abate (SEAB, 2013). O aumento no tamanho dos sistemas de produção (granjas ou complexos de granjas e núcleos) trouxe paralelamente um aumento na densidade animal incrementando a pressão de infecção. A intensificação do comércio de animais de uma região para outra, criou uma situação propícia para a multiplicação e disseminação de vários patógenos, principalmente vírus e bactérias (BARCELLOS et al., 2008). Em vista disso, a Suinocultura está sendo exposta a problemas técnicos e econômicos, com exigência de implantação de programas sanitários e de biossegurança mais refinados (BARCELLOS et al., 2008). Este contexto tornou evidente a necessidade de uma maior atenção à saúde dos plantéis.
2.2 Circovírus
A família Circoviridae compreende dois gêneros bem descritos: Circovírus e Gyrovírus. O primeiro, infecta suíno e aves (gansos, papagaios, patos, cisne, corvo, canários); o segundo infecta somente galinhas. Foi sugerido pertencer ao gênero Gyrovirus um tipo de vírus que pode infectar humano (SAUVAGE et al., 2011) e um Circovírus que infecta peixes (LORINCZ et al., 2011). Phan et al. (2012) sugeriram um novo gênero para a família, chamado de Cyclovírus, que consiste no tipo viral que infecta chimpanzés e humanos.
Circovírus são vírus não-envelopados, de simetria icosaédrica, com tamanho do genoma variando entre 1,7 a 2,3 kilobases, com DNA circular de fita simples (ss-DNA). São os menores vírus de mamíferos conhecidos e impressiona não somente por induzir uma patogênese complexa, mas também por possuir um reduzido material genético que responde todas as necessidades funcionais da maquinaria do vírus (FINSTERBUSCH e MANKERTZ, 2009).
O Circovírus Suíno foi descoberto através de análises de microscopia eletrônica, na forma de um contaminante persistente que infectava células de rim de suíno da linhagem PK-15, mas que não promovia efeito citopático (TISCHER et al., 1982). Nestas análises foi observada a presença de um DNA circular de fita simples, daí o nome dado à amostra viral recém-achada de Circovírus (vírus circular) (TISCHER et al., 1974). O vírus foi inicialmente chamado de CVSnp (Circovírus não patogênico) (HAMEL et al., 1998), e hoje é denominado de Circovirus Suíno tipo 1 (CVS1). Uma nova variante patogênica foi nomeada de Circovírus da síndrome do definhamento de suínos (CVSsmds) (ALLAN et al., 1998; ELLIS et al., 1998), e atualmente é denominado de Circovírus Suíno tipo 2 (CVS2). Assim, foram definidos dois tipos virais: um que não induz a doença (CVS1) e outro (CVS2) ao qual estão associadas todas as patologias causadas pelo circovírus suíno (SEGÁLES, 2012).
Baseado no nível de variação genética da ORF2 (fase aberta de leitura), cinco sub-tipos tem sido descritos: CVS2 (a, b, c, d, e) (TRIBLE & ROWLAND, 2012; BAEKBO, KRISTENSEN, LARSEN ET AL., 2012 et al., 2012). O CVS2 tem sido detectado em muitos lugares do mundo como: Europa, América, Austrália, China, Tailândia e Corea. O genótipo CVS2c foi detectado somente na Dinamarca e os genótipos CVS2d e CVS2e, somente na Ásia (DUPONT et al., 2008; JANTAFONG et al., 2011). Entretanto, a proposta dos novos genótipos CVS2d e CVS2e tem sido controversa (CORTEY et al., 2011).
O Circovírus Suíno tipo 2 é reconhecido por ter a maior taxa de mutação dentre os vírus de DNA, quando comparada à razão de mutação de um vírus de RNA (PÉREZ et al., 2011). Vírus quiméricos contendo a ORF1 do subgrupo 2a e ORF2 do subgrupo 2b têm sido encontrado no mesmo hospedeiro, implicando que eventos de recombinação são frequentes no gênero Circovírus (KIM et al., 2009). Ademais, a literatura relata que outros vírus podem infectar células já infectadas pelo CVS2, favorecendo a recombinação gênica e uma maior diferenciação antigênica dentro do grupo (LEFEBVRE et al., 2009).
Ambos os tipos virais, CVS1 e CVS2, possuem um total de onze ORFs (fase aberta de leitura), das quais três (ORF1, ORF2 e ORF3) são as mais conhecidas. Em ambos os tipos virais a ORF1 codifica a proteína Rep e a ORF2 codifica a proteína Cap. A primeira (Rep) é uma proteína essencial para replicação do vírus e a segunda (Cap) é a única proteína estrutural formadora do capsídeo (cap) (FENAUX et al., 2003). A ORF3 codifica uma proteína que induz a apoptose (LIU et al., 2006). Acerca das demais, ainda não se conhece as funções das proteínas que codificam (HAMEL et al., 1998). O estudo de Hamel et al. (1998) somente descreveram os produtos protéicos das ORFs 4, 5, 6, 7 e 8 em relação às sequências numéricas dos aminoácidos e sobre a identificação de sítios de glicosilação. Sobre os aminoácidos, estas ORFs codificam pequenas proteínas com até 115 aminoácidos, e quanto aos sítios de glicosilação partilhados foram descritos nas ORFs 1, 2, 4, 5 e 6. Tais sítios na ORF4 foram descritos em ambos os tipos virais, enquanto que nas ORFs 5 e 6 foi apenas revelado no CVS1 (HAMEL et al., 1998).
O tamanho do genoma para CVS1, CVS2a e CVS2b é 1759, 1768 e 1767 pb, respectivamente. Os dois subtipos CVS1 e CVS2 apresentam uma organização genômica com aproximadamente 80% de similaridade. Entre os sub-tipos de CVS2 a identidade na sequência de nucleotídeos é de 95%. Os genes rep de CVS1 e CVS2 possuem 83% de identidade na sequência nucleotídica e 86% na sequência de aminoácidos, enquanto que o gene cap de ambos apresenta alta divergência antigênica, com identidade de 67% na sequência nucleotídica e 65% na sequência de aminoácidos (GILLESPIE et al., 2009). Acredita-se que isto contribua para a diferença da patogenia do vírus entre CVS1 e CVS2 (MANKERTZ et al., 2004).
A duas maiores ORFs, ORF1 e ORF2, do Circovírus têm uma orientação contrária no genoma (orientação ambisense). O gene cap apresenta uma orientação anti-horária (3’-5’), diferente do gene rep. Tal conformação cria duas regiões intergênicas: uma curta e uma maior que compreende a origem de replicação (ORI), localizada entre os terminais 5’ (FISNTERBURG e MANKERTZ, 2009). A origem de replicação apresenta uma estrutura haste-volta; adjacente a esta estrutura existem motivos conservados (Hexâmeros 1-4) que são sítios de ligação da replicase. A haste (stem) é formada por uma sequência de onze pares de bases repetidas e invertidas formando um palíndromo, enquanto que a volta (loop) contém entre 10 e 12 nucleotídeos (12 no CVS1 e 10 no CVS2), onde está um motivo de octâmeros conservados (AXTAXT * ACC), onde * indica o sítio de clivagem (CHEUNG, 2012), como mostra a figura 1. A ORF3 está localizada na fita viral negativa e tem tamanhos diferentes nas variantes de CVS (CVS1 = 621 nd e CVS2= 315 nd) (LIU et al., 2006).
Figura 1: Organização Genômica do Circovírus Suíno 2. Genoma circular mostrando as principais ORFs (Fase aberta de leitura). Em preto a ORF1, codificadora da protéina de replicação (Rep); Em cinza, a ORF2, codificadora da proteína do capsídeo (Cap); Região intergênica com a formação da estrutura stem-loop (haste-alça); Origem da replicação (Ori); H: hexâmero. Fonte: Finsterbusch e Mankertz (2009), com algumas modificações.
O gene rep sofre splicing e forma duas proteínas rep e rep’ que são essenciais para a replicação, a qual somente ocorre se ambas forem expressas simultaneamente (MANKERTZ e HILLENBRAND, 2001). A proteína Rep’ regula negativamente o promotor que controla a transcrição do gene rep (MARKERTZ e HILLENBRAND, 2003). A replicação do Circovírus é via círculo rolante, um mecanismo que é largamente usado em plasmídeos de bactérias, fagos e plantas (CHEUNG, 2012). O processo de replicação, que converte o DNA fita simples, em um DNA fita dupla é realizado por enzimas expressas na fase S do ciclo celular do hospedeiro (FINSTERBUSCH e MANKERTZ, 2009).
A preferência do tipo de células para replicação do vírus ainda não é consensual. O CVS2 já foi encontrado em linhagens de monócitos, macrófagos e células dendríticas (ALAN et al., 1994), mas estes tipos de células não são alvos eficientes para replicação do vírus (GILPIN et al., 2003). Outras evidências indicam que o vírus pode ser encontrado em linfócitos (DARWICH e MATEU, 2012), e que o CVS2 se replica em linfoblastóides provocando lise celular (RODRÍGUES-CARIÑO et al., 2011). Recentemente, grandes
quantidades de vírus foram encontradas em células mononucleares e endoteliais de vasos sanguíneos em pulmões de suínos jovens (CINO-OZUNA et al., 2011).
Quando alcança o sucesso da replicação, o CVS2 de modo geral causa variados níveis de depleção linfocitária e imunosupressão (OPRIESSNING, MENG, HALBUR, 2007), caracterizando à ação viral na modulação da resposta imune do hospedeiro. Estudos tem demonstrado que esta capacidade está associada à multifatores, como: predisposição do hospedeiro, pois dependendo da linhagem do suíno os sinais clínicos da doença são mais severos, e à presença de co-infecções virais e bacterianas (BEACH e MENG, 2012).
2.3 Doenças Associadas ao Circovírus Suíno 2 (DACVS2)
Atualmente, o Circovírus Suíno 2 é um dos mais importantes patógenos virais sob o ponto de vista econômico para suinocultura (MENG, 2012). Desde a sua primeira descrição, a abrangência clínica e patológica tem diversificado bastante, ao ponto que hoje se reconhece um conjunto de doenças oriundas da infecção por este patógeno. Este conjunto de doença é denominado de Doenças Associadas ao Circovírus Suíno, conhecido mundialmente como PCVAD-Porcine circovirus-associated disease. Nesse conjunto de doenças se inclui: Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS), Síndrome da Nefropatia e Dermatite Suína, Doença respiratória de Suíno, Síndrome reprodutiva de Suíno (BAEKBO, KRISTENSEN, LARSEN et al., 2012), tremor congênito (STEVENSON et al., 2001; FRANÇA et al., 2005) e Doença entérica (SEGÁLES, 2012). Vale ressaltar que após o estudo de Kennedy et al. (2003) o tremor congênito A2 não tem sido mais associado ao CVS2.
Além de infecções clínicas associadas a este vírus, ocorrem hoje as infecções subclínicas. Estudos baseados em sorologia demonstraram que o CVS2 é ubíquo, enquanto que a prevalência das doenças clínicas é baixa. Estudos sugerem a hipótese que estas infecções subclínicas podem ser provenientes da ineficiente resposta protetora de algumas vacinas atuais utilizadas contra as circoviroses (SEGALÉS, 2012).
Uma marca das infecções causadas por este tipo viral é o quadro de inflamação e depleção linfocitária. Nas infecções subclínicas e na síndrome Nefropatia e Dermatite Suína, o nível de depleção varia de baixa a moderada, com inflamação granulomatosa dos tecidos linfóides. Na doença reprodutiva do suíno não ocorre lesão em tecidos linfóides, e na entérica a depleção e a inflamação ocorrem nas placas de Peyer (SEGÁLES, 2012). Na SMDS ocorre a forma mais severa de depleção linfocitária, afetando as células B, T e células NK (TRIBLE et al., 2012), provocando grave queda dos anticorpos anti-CVS2 (CHAE , 2004).
Muito embora a causa da depleção ainda não seja completamente compreendida, ela parece ser originada pela infecção do CVS2 nos precursores dos linfócitos na medula óssea ou no timo. O CVS2 já foi encontrado infectando o timo, e as lesões tímicas têm ocorrido simultaneamente com a depleção de linfócitos de outros tecidos (MAGAR et al., 2000, DARWICH e MATEU, 2012). Na medula óssea não é encontrada esta relação, embora este órgão também possa ser infectado (OPRIESSING et al., 2009). Shibahara et al. (2000) têm proposto que a apoptose de linfócitos B pode contribuir para esta depleção. Chang et al. (2007) têm reforçado a idéia de ativação de apoptose via infecção do CVS2, pela consequente ativação de NF-kB e o ligante Fas/Fas. Muito embora, Krakowka et al. (2004) afirmem que a apoptose não está diretamente relacionada com a severa depleção linfóide de SMDS.
Ocorre um quadro inflamatório crônico nos animais infectados com CVS2 (SEGÁLES, 2012) coerente com a ineficiente resposta imune inata devido às alterações no padrão de citocinas dos tecidos linfóides. Esta modificação é refletida pelo aumento da IL-12, IL-10, IL-1 e IL-8 e pela indução de vírions completos e VLP (virus like-particles). (DORTER et al., 2010). As citocinas secretadas pelas células T são diminuídas, por consequência da depleção linfocitária nestas células (DARWICH e MATEU, 2012).
O DNA de CVS2 induz supressão de IFN-α e reduz a capacidade de destruição dos macrófagos, além de interferir na apresentação de antígeno das células dendríticas mielóides. Respostas a padrões moleculares associados a patógenos, como os motivos CpG, interferem na capacidade de resposta endocítica das células dendríticas plasmocitóides e mielóides, devido à presença da dupla fita (ds) de DNA do vírus (CHANG et al., 2006). Esta mudança no padrão da resposta imune inata, pela infecção por CVS2, oferece aos microrganismos oportunistas a chance de induzirem infecções, fazendo com que o suíno infectado adquira deficiência nas respostas imunes. Sendo assim, a Síndrome multissistêmica pode ser considerada uma doença semelhante à imunodeficiência secundária (DARWICH et al., 2004; DARWICH e MATEU, 2012).
Contudo, Darwich e Mateu (2012) relataram que em casos naturais de infecção com CVS2 a remoção do vírus parece ser mediada por anticorpos neutralizantes e resposta mediada por células.
2.3.1 Síndrome Multissistêmica do Definhamento de Suínos - SMDS
Dentre estas manifestações clínicas associadas ao CVS2, a primeira descrita foi a SMDS (OPRIESSING, MENG, HALBUR, 2007; BAEKBO, KRISTENSEN, LARSEN et al.,
2012). Atualmente é uma das doenças emergentes em suínos causadas pelo CVS2, que tem recebido mais atenção dos pesquisadores e dos suinocultores (MENG, 2012), sendo a mais importante sob o ponto de vista econômico e patogênico.
Sobre sua descrição, esta síndrome foi inicialmente observada em Suínos como uma doença esporádica e caracterizada por definhamento e palidez, em 1991, no Canadá (HARDING, 1997; SEGÁLES, 2012). No Brasil, a SDMS foi diagnosticada em 2000, na Região Sul (CIACCI-ZANELLA e MORÉS, 2003). Logo depois a presença de antígenos virais de CVS2 associada a esta síndrome, foi observada no Rio de Janeiro (FRANÇA, 2004), São Paulo (CASTRO et al., 2003) e Minas Gerais (BARBOSA et al., 2011).
A SMDS tem sido diagnosticada em todos os continentes, incluindo Oceania (GRAU-ROMA et al., 2011). Muitos países Europeus enfrentaram uma epidemia com alta perda de suínos pós-desmamados (BAEKBO, KRISTENSEN, LARSEN et al., 2012). No decorrer desse período foram observados que os sinais clássicos da síndrome acometendo suínos em fase de crescimento, com alta mortalidade, mudou para uma forma mais severa, acometendo animais de mais idade. A alta mortalidade pós-desmame tem provocado trágico efeito nos rebanhos afetados, devido à acentuada perda de peso frequente dos animais (BAEKBO, KRISTENSEN, LARSEN et al., 2012). Na América do Norte, o que predomina é o acometimento da síndrome em suínos em crescimento, de até seis semanas de idade (BAEKBO, KRISTENSEN, LARSEN et al., 2012). A diferença na idade em que os suínos são acometidos parece estar associada a diferentes técnicas de manejo e esquema de vacinação (SHULZE et al., 2003).
A alta mortalidade em conjunto com o uso de antibióticos repercute os custos provocados pela doença, estimados em 600 milhões de Euros por ano na União Européia (SEGALÉS, GORDON, DOMINGO, 2005).
2.4 Transmissão e Controle das Doenças Associadas ao CVS2
A transmissão da doença é decorrente de duas hipóteses: a da transmissão vertical ou da horizontal. A detecção da carga viral de CVS2 já foi descrita em amostras de sêmen (MADSON et al., 2009), colostro, soro, fluidos oral e nasal e excreção fecal (PATTERSON et al., 2011). O contato com suínos infectados, instalações, equipamentos e fômites são fatores prováveis na transmissão horizontal do vírus; fatores de risco causadores de estresse, como densidade elevada, baixa qualidade do ar, água e ração, mistura de lotes com procedência e
idades diferentes, e a presença de enfermidades concomitantes podem intensificar as manifestações clínicas e favorecer o desenvolvimento da doença (FRANÇA et al., 2005).
Uma das formas de controle da doença é através de técnicas de manejo e alojamento
dos animais, como agrupar um número menor que 400 animais por rebanho, técnicas de higiene, uso de antibióticos para controle e eliminação de infecções secundárias, diminuição de fatores que provocam estresse, boa nutrição, e também, a forma atual mais eficiente que é a vacinação (PEJSAK et al., 2010). As co-infecções possuem um importante papel para as doenças associadas ao vírus, e o controle dessas infecções, com auxílio do diagnóstico dos agentes causadores, diminuem a severidade da doença. A maioria das co-infecções é devido à presença de bactérias e vírus, principalmente Mycoplasma hypneumoniae e o vírus da síndrome respiratória e reprodutiva do suíno (OPRIESSNING, MENG, HALBUR, 2007).
Existem quatro vacinas comerciais: Porcillis® PCV (Merck), Circumvent PCV (Intervet, Merck), Ingelvac CircoFLEX (Boehringer), Circovac® (Merial) e a vacina Fostera™ PCV2 (Pfizer), recentemente introduzida, mas que consiste na reformulação e substituição da Suvaxin® PCV2 (Fort Dodge Animal Health) (BEACH e MENG, 2012). A Circovac® (Merial) foi a primeira licenciada na Europa e a primeira que chegou no Brasil. De forma geral, a literatura tem mostrado uma boa avaliação das vacinas atuais no controle das circoviroses suínas, devido à indução das respostas imunes, humoral e celular, observadas em condições experimentais em camundongos e suínos (KIXMOLLER et al., 2008). Dentre as vacinas atuais, as mais bem sucedidas foram baseadas na indução da resposta imune contra a proteína do capsídeo de CVS2 (FACHINGER et al., 2008). As avaliações em animais vacinados mostraram boa eficácia em estudos experimentais e de campo, com o aumento no número de anticorpos e diminuição da mortalidade (OPRIESSNING, MENG, HALBUR, 2007). Em outras avaliações foi notada redução na carga viral em tecidos linfóides e nas lesões (BEACH e MENG, 2012). Estes modelos experimentais tem sido estabelecidos com o CVS2 e outros patógenos (ALLAN et al., 2000).
O largo interesse em vacinar animais infectados com CVS2, com ou sem sinais clínicos aparentes, parece ter diminuído o interesse em diagnosticar, devido a grande dificuldade em estabelecer um diagnóstico padrão aceito pelas agências internacionais (SEGALÉS, 2012) e também, devido à presença de diferentes antígenos virais, provenientes de novas variantes do vírus, como o CVS2b que tem sido prevalente em muitas populações de suínos provocando alta severidade da circovorisose (BEACH e MENG, 2012).
Até o momento, as estratégias vacinais foram baseadas no genótipo de CVS2a (FORT et al., 2009), assim como, todas as reproduções experimentais da SMDS (FORT et al., 2008).
Tem sido demonstrado que o uso dessas vacinas e a boas práticas de manejo diminuem a severidade das circoviroses, mas estas recentes diferenças na virulência podem remeter a questionamentos na eficácia das vacinas já desenvolvidas. Trible e Rowland (2012) demonstraram que a presença simultânea dos dois genótipos, CVS2a e CVS2b, ou somente o CVS2b ou CVS2a, define uma doença clínica ou subclínica, respectivamente. Enquanto que Cortey et al. (2011) observaram o aparecimento simultâneo da SMDS e a mudança de genótipo de CVS2a para CVS2b. Diferenças na virulência possuem importante implicação no entendimento das diferentes manifestações clínicas, podendo influenciar no desenvolvimento de futuras vacinas (OPRIESSNING, MENG, HALBUR, 2007). Entretanto, vale ressaltar que mesmo após 20 anos da descrição do CVS2, o mecanismo preciso das infecções ainda deve ser bem elucidado (SEGALÉS, 2012).
Logo, chama-se à atenção para considerar que as vacinas para CVS2 podem não responder como se espera ou fracassar, devido a novas variantes do vírus (BEACH e MENG, 2012), e assim, um diagnóstico sorológico, diferenciando animais vacinados, de animais com infecção natural, tem sido proposto devido à prática em massa da vacinação (BEACH E MENG, 2012). Neste sentido, novos contextos de interesse no diagnóstico têm surgido, como: 1) confirmação do diagnóstico nos animais, com sinais semelhantes aos das doenças associadas ao vírus, mesmo tendo sido vacinados; 2) nas fazendas em que os resultados da vacinação foram ou estão abaixo das expectativas. Cino-Ozuna et al. (2011) investigaram rebanhos vacinados contra circovirose, e obervaram que nos animais em idade jovem, com decaimento de anticorpos maternos, apresentavam edema pulmonar, e que a variante presente foi o CVS2b. O edema pulmonar é observado no estágio final da doença, devido às infecções secundárias, mas neste trabalho o achado macroscópico, foi estritamente vinculada somente à presença do CVS2, diferentemente das outras doenças associadas ao vírus (CINO-OZUNA et al., 2011).
Nenhuma proposta de diagnóstico tem sido procurada tanto quanto para SMDS, comparada às outras doenças associadas ao vírus (SEGALÉS, 2012). Assim, o interesse pelo diagnóstico ainda existe e esta demanda pode ser realizada através de monitoramento sorológico, somado a um completo estudo diagnóstico, incluindo sinais clínicos e lesões em órgãos e tecidos (SEGALÉS, 2012).
Existe uma extensa lista de sinais clínicos para diagnosticar cada doença clínica associada ao CVS, porém muitos desses sinais se repetem entre as infecções, principalmente na SMDS, que a infecção viral afeta mais de um órgão (SEGÁLES, 2012). Isto é bem exemplificado pelo fato de que em todas as doenças associadas ao vírus, com exceção da entérica e reprodutiva, o DNA e o antígeno viral é encontrado nos tecidos linfóides que são mais afetados na SMDS (SEGALÉS, 2012).
O CVS2 sendo ubíquo, o diagnóstico deve ser bem rigoroso, não podendo se restringir à detecção do vírus, ou à presença de anticorpos contra ele (OPRIESSNIG, MENG, HALBUR, 2007). Barbosa e Freitas (2011), avaliando rebanhos brasileiros concluíram que achados macroscópicos não são suficientemente conclusivos de que o animal está com SMDS (BARBOSA e FREITAS, 2011). Desse modo, sinais clínicos, macroscópicos e microscópicos, lesões histopatológicas e a presença do antígeno, devem ser considerados em conjunto para o diagnóstico das doenças associadas ao CVS2 (SEGALÉS, 2012). Mas isto tem sido bem desafiador para os veterinários de campo, de forma mais particular, referente à SMDS, pois a presença de antígenos virais já foi observada em animais sem a doença e em diversos tecidos e órgãos (BARBOSA et al., 2011; SEGALÉS, 2012).
Segundo Segáles (2012), aspectos macroscópicos e microscópicos sugerem que tipo de infecção clínica o animal possui. Entretanto, em todas as doenças é indispensável à detecção do antígeno de CVS2. Assim, a classificação da manifestação clínica está associada à abundância do antígeno nas lesões e em determinados órgãos, como descrito a seguir: Respiratória do Suíno (com lesões nos pulmões) ou Nefropatia e Dermatite Suína, se houverem lesões na pele e rins, ou Síndrome reprodutiva do Suíno, se presente lesões nos tecidos cardíacos de fetos, ou Doenças entéricas, com um quadro clínico severo de diarreia (SEGÁLES, 2012). Se a presença do antígeno estiver associada a lesões em mais de um tecido linfóide; ou em um tecido linfóide e pelo menos um órgão como: pulmão, fígado, rins, intestino, baço; ou em dois desses órgãos, a doença sugerida é a SMDS (OPRIESSNING, MENG, HALBUR, 2007).
Uma proposta tem sido formalizada para se estabelecer um diagnóstico, ao nível de rebanho, com dois principais elementos para SMDS: 1) aumento significante de mortalidade pós-desmame, com a presença de sinais compatíveis com a síndrome; 2) um diagnóstico individual compatível com a doença, de pelo menos um animal, a cada três necropsiados (SEGALÉS, 2012). Individualmente, o animal deve apresentar três critérios: 1) presença de sinais clínicos; 2) lesões macroscópicas e microscópicas, moderadas a severa, em tecidos
linfóides e 3) alta quantidade de CVS2 nas lesões típicas (FINSTERBUSCH e MANKERTZ, 2009).
Referente aos aspectos macroscópicos, o animal doente apresenta: alta perda de peso, definhamento grave, palidez (figura 2). Pulmões não colapsados e o aumento de 3 a 4 vezes no tamanho dos linfonodos (SEGALÉS, GORDON, DOMINGO, 2005; BAEKBO, KRISTENSEN, LARSEN et al., 2012). Estes sinais devem ser simultâneos a achados histológicos no tecido linfático, como: depleção linfática, infiltração histiocítica, corpos de inclusão e células gigantes (SEGALÉS, GORDON, DOMINGO, 2005). Adicionalmente, o antígeno do CVS2 deve estar presente especificamente nos tecidos linfóides com lesões típicas (SEGALÉS, 2012).
É válido descrever que para SMDS a inoculação isolada de CVS2 até promove alterações microscópicas, mas não produz os sinais clínicos correspondentes à SMDS (ROVIRA et al., 2002; FRANÇA et al., 2005). Isto demonstra que a infecção com CVS2 é necessária, mas não suficiente para o desenvolvimento clínico da síndrome (FINSTERBUSCH e MANKERTZ, 2009; SEGALÉS, 2012). A não ser quando reproduzida experimentalmente com outros agentes infecciosos como bacterianos e virais (Allan et al., 2004).
2.5.1 Diagnóstico laboratorial
Muitos métodos laboratoriais podem ser utilizados para completar o diagnóstico das doenças causadas pelo CVS2 (FRANÇA et al., 2005). Tais métodos são: isolamento viral (TISCHER et al., 1982), imunohistoquímica (IHQ) (ELLIS et al., 1998), hibridização “in
situ” (HS) (NAWAGTIGUL et al., 2000), imunofluorescência (IF) (ALLAN e ELLIS, 2000),
teste de reação em cadeia da polimerase - PCR e suas variantes como: PCR nested de tubo único (PONTES et al., 2012) e PCR em tempo real (GRAU-ROMA et al., 2008). Outros métodos como a imunoperoxidase (IP) (BARBOSA et al., 2011) e ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) têm sido utilizados (OPRIESSING, MENG, HALBUR, 2007). Sorden (2000) descreveu que a IHQ e HS são os métodos de escolha. Entretanto, quando ambas foram comparadas, a HS foi mais sensível (KIM e CHAE, 2004).
A técnica de isolamento viral pode ser utilizada, muito embora não seja comumente realizado pelo tempo consumido, pela necessidade de muitas passagens de cultivo, que podem induzir mutações no vírus (RACINE et al., 2004). Devido ao CVS2 tipicamente não induzir
efeito citopático, para o uso dessa técnica é necessário que a observação seja através de imunofluorescência ou imunoperoxidase (RACINE et al., 2004).
A técnica de imunohistoquímica consiste em um método que detecta antígenos virais em tecidos. Para uso dessa técnica, as amostras de tecidos devem ser coletadas na fase S mitótica (ou replicativa) do vírus, pelo fato de haver mais antígenos virais para serem marcados e melhor visualizados pela IQH (SEGÁLES et al., 2005). O baixo nível replicativo inerente ao CVS2 pode representar uma limitação para IHQ. Para detecção do DNA viral do CVS2 na amostra tecidual, o DNA tem que ser quantificado em torno de 500ng e com uma carga viral mínima de 108, por uma técnica complementar (BRUNBORG, MOLDAL, JONASSEN et al., 2004). Em animais com SMDS o vírus foi detectado em órgãos não linfóides (BARBOSA e FREITAS, 2011), este fato pode requerer uma análise de diversos e variados tecidos, caso esta técnica seja escolhida para o uso.
A existência da forte relação entre a presença de antígeno, ou DNA, e a severidade de lesões histológicas, tem sido sugerida para detecção do DNA viral (SEGALÉS, 2012) pela técnica de PCR em tempo real. A sensibilidade dessa técnica apesar de conhecida, não a torna o método substituto da histopatologia das doenças associadas ao vírus (GRAU-ROMA et al., 2008). Entretanto, quando comparadas às técnicas de IQH e HS, a PCR em tempo real foi mais precisa que as duas (KIM e CHAE, 2004), mas a HS foi mais específica que a IQH. A PCRq tem sido utilizada para diagnóstico da SMDS na quantificação em casos subclínicos, mas para as demais doenças é de pouquíssimo uso (GRAU-ROMA et al., 2008).
2.5.2 Diagnóstico Sorológico
Ensaios sorológicos são ferramentas que podem ser empregadas com a finalidade de monitorar rebanhos, para fins diagnóstico ou epidemiológico. Uma caracterização sorológica pode fornecer informações essenciais para programas de vacinação e medidas individuais de controle para diferentes rebanhos (FAUSTO, 2010). Além de promover um conhecimento tanto atual, quanto retrospectivo da população infectada (MAGAR et al., 2000). Para as doenças associadas ao CVS2, a sorologia pode fazer parte do conjunto necessário para diagnosticá-las.
Através de estudos sorológicos foi constatado que a infecção pelo vírus é de alta prevalência 95% a 100%, contrariamente à ocorrência da doença clínica com 5 a 15% (RODRÍGUEZ-ARRIOJA et al., 2000). Rodriguez-Arrioja et al. (2000) detectaram a presença de anticorpos anti-CVS2 antes de serem associados aos sinais clínicos da SMDS,
corroborando aos achados de estudos retrospectivos de Mesu et al. (2000) e Magar et al. (2000) que detectaram o antígeno viral em animais sem sinais clínicos. O desenvolvimento da síndrome em rebanhos infectados com CVS2, com e sem sinais clínicos da SMDS já foi registrado por Blanchard et al. (2003).
O método de IF e IP são empregados para localização de antígenos em células ou tecidos. Para IF utiliza-se um anticorpo conjugado a fluorocromo. O complexo formado é visualizado através de microscópio de fluorescência, e o anticorpo + flurocromo a cada experimento tem que ser mudado (FERREIRA e ÁVILA, 1996). Este método tem sido descrito para CVS2, na detecção do CVS2 inteiro e também de antígenos codificados pela ORF2 do vírus. Para IP emprega-se uma enzima conjugada ao anticorpo. A enzima possui maior capacidade de amplificação comparada ao flurocromo, e age convertendo um cromógeno em um produto solúvel, tal qual pode ser visualizada em microscópio óptico comum (FERREIRA e ÁVILA, 1996). Este último teste é usado largamente para CVS2 (BARBOSA et al., 2011; BLANCHARD et al., 2003; OPRIESSNING, MENG, HALBUR, 2007).
O ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) tem por princípio básico a imobilização do imunobiológico em uma fase sólida, enquanto o anticorpo pode ser ligado a uma enzima. O substrato (cromógeno) origina produtos solúveis coloridos, através da degradação enzimática. O teste é capaz de detectar quantidades extremamente pequenas de antígenos e anticorpos, e devido a esta alta sensibilidade pode ser executada em microescala, o que o torna bastante econômico dada à reduzida quantidade dos reagentes utilizados (GIL, GIL, KUBOTA, YAMAMOTO, 1999). Logo, caracteriza-se pela elevada sensibilidade, especificidade, bem como rapidez, baixo custo, simplicidade técnica, versatilidade, objetividade de leitura e possibilidade de automação (FERREIRA e ÁVILA, 1996).
Os testes de IF, IP e ELISA são tradicionalmente realizados com antígenos obtidos através de propagação in vitro do vírus (WALKER et al., 2000). Particularmente, para propagação do CVS2 isso é uma aparente desvantagem devido à dificuldade de reproduzi-lo experimentalmente, haja vista à natureza replicativa do vírus (ALLAN e ELLIS, 2000). Contrapondo as características do ELISA, os métodos de imunofluorescência e IPMC são imunoensaios que apresentam a limitação de não serem automatizados e com leituras consideradas subjetivas (OPRIESSING, MENG, HALBUR, 2007).
Os três ensaios podem ter sua sensibilidade e especificidade alteradas dependendo do antígeno utilizado (WALKER et al., 2000; GE et al., 2012). Se baseados em antígeno propagado em cultura celular, a sensibilidade pode ser prejudicada porque a taxa replicativa
do CVS2 é baixa, e pode ter alteração na especificidade devido à possibilidade de haver reações cruzadas entre diferentes sequências antigênicas trocadas entre agentes infecciosos, ou com outras proteínas do vírus (MAGAR et al., 2000). Na tentativa de evitar estes vieses vem sendo utilizados anticorpos monoclonais (MCNEILLY et al., 2001) e antígenos recombinantes (TRUONG et al., 2001).
2.6 Potencial diagnóstico e vacinal da proteína do Capsídeo (pCap) do CVS2
É única proteína estrutural de 233 aminoácidos, de massa molecular de 30kDa, codificada pela ORF2 (gene Cap), cuja função é formar o capsídeo icosaédrico do circovírus. Nawagitgul et al. (2000) observaram que a proteína recombinante da ORF2 foi capaz de se auto-encapsidar, fomando partículas semelhantes ao capsídeo, reforçando sua função estrutural. Esta capacidade que a pCap possui de se formar espontaneamente em Virus like
particles (VLPs) tem direcionado o seu uso para fins vacinais (ZHOU et al., 2005) ( Figura
2). A proteína do capsídeo (pCap) também contribui para o sucesso da replicação viral ao participar do reconhecimento de receptores glicanos para a fixação e entrada do vírus ao interior do núcleo (TRIBLE et al., 2012).
Figura 2: Microscopia eletrônica dos vírions do CVS2. Virus particle (partícula viral); outer capsid (capsídeo externo). Fonte: “The Control of Porcine Circovirus Diseases (PCVDs)”, disponível em http://www.pcvd.net.
Dentre os 233 aminoácidos, os 47 primeiros constituem um domínio de sinalização nuclear da proteína (NLS). Este domínio está localizado na região N-terminal, e é rico em resíduos de arginina (TRUNDOVA e CELER, 2007) com a presença de importantes epítopos
funcionais (figura 3a). A região C-terminal também possui epítopos funcionais importantes para reconhecimento de anticorpos (figura 3).
Figura 3: Estrutura secundária da proteína do Capsídeo. Em A: Extremidades arredondadas, azul e vermelha, indicam o N e o C terminal da proteína. As letras (B,C, D,G, H, I, F) indicam resíduos de reconhecimento para anticorpos. Em B: Estrutura secundária da VLP completa. Fonte: Khayat et al., (2011).
A pCap é considerada a mais imunogênica do vírus (FENAUX et al., 2003). Uma proteína é reconhecida por ter propriedade imunogênica quando induz resposta imunológica com produção de anticorpos ou contém sítios de reconhecimento para ligação de anticorpo (GIL, KUBOTA, YAMAMOTO, 1999). Epítopos conformacionais neutralizantes tem sido identificados nesta proteína (BLANCHARD et al., 2003; LEKCHAROENSUK et al., 2004; SHANG et al., 2009). Mahé et al. (2000) sugerem a relação da imunoreatividade da pCap com a patogenicidade do vírus. Reação cruzada de soros dos dois subtipos virais com a ORF1 foi observada, enquanto que o antígeno de CVS2-ORF2 reagiu apenas com o soro de CVS2, demonstrando um reconhecimento específico da ORF2 somente com o subtipo viral CVS2 (MAHÉ et al., 2000).
Os epítopos específicos incluindo os resíduos 69-83 e 117-131 são importantes para reconhecimento de anticorpos no soro de animais infectados com CVS2 (MAHÉ et al., 2000). Devido a anticorpos terem sido gerados contra o epítopo 117-131, em todos os animais experimentalmente infectados por CVS2, esta região foi considerada como um marcador sorológico (TRUONG et al., 2001). Outros resíduos diferentes, como: 136-146 e 101-150 (WU et al., 2008) tem sido propostos como marcadores sorológicos, devido a conservação deste epítopo em diferentes isolados do CVS2, e também, pela especificidade de detecção de isolados do CVS2, comparada à ausência de detecção do CVS1 e de outros vírus suínos.
Lekcharoensuk et al. (2004) observaram regiões imunoreativas nos resíduos 47-85, 165-200 e 200-233, assim como domínios chaves de reconhecimento de anticorpos conservados entre os genótipos do vírus. Estes pontos chaves foram observados nas seguintes posições e aminoácidos: 70-Asp, 71-Met, 77-Asn, 78-Asp, 113-Glu, 115-Asp, 127-Asp e 203-Glu. Os resíduos 201-Ile e 201-Tyr foram considerados essenciais para o reconhecimento de anticorpos (KHAYAT et al., 2011).
Trible et al. (2012) relataram que ocorre diferença qualitativa nas respostas imunológicas, dependendo de quais resíduos são reconhecidos primeiro. Animais vacinados, animais infectados experimentalmente e clinicamente doentes foram analisados, com constatação de que no primeiro grupo a primeira ligação anticorpo-epítopo (Ac-Ep) foi direcionada para o resíduo 43-233, a qual gerou uma forte reação neutralizante contra o vírus. No último grupo, também ocorreu reconhecimento do pequeno epítopo 169-180, que é altamente conservado entre os isolados de CVS2. Contudo este não produz resposta protetora aos animais, o que parece ser um mecanismo de defesa do CVS2 para se replicar. Este grupo de pesquisadores relatou que os resíduos 173-Tyr, 174-Phe e 175-Glu também são chaves para ligação de anticorpos, sendo o primeiro resíduo localizado visivelmente na superfície de uma VLP. A remoção ou ausência de um desses três resíduos é suficiente para inibição do reconhecimento do anticorpo (TRIBLE et al., 2012).
Mutações de substituição na sequência de aminoácidos (na posição 110, com a troca de prolina por alanina; e na posição 191, na troca de arginina por serina), resultou em uma menor viremia, na diminuição de sinais histológicos e no quadro patológico geral dos animais infectados, implicando na participação da pCap na virulência do CVS2 (FENAUX et al., 2004; TRIBLE e ROWLAND, 2012).
Estas considerações apontam a importância da pCap não somente na modulação da resposta imunológica no hospedeiro, favorecendo à patogênese viral, mas sobretudo aponta que a presença de epítopos imunoconservados e imunoreativos são importantes para desencadear resposta imunológica protetora. Logo, estudos tem sido realizados com objetivo de averiguar o potencial uso da proteína do capsídeo em vacinas, bem como, objetivando o diagnóstico para circovirose suína 2 (WU et al., 2012).
2.7 Produção da Proteína do Capsídeo (pCap) do CVS2 em sistemas recombinantes de expressão
Muitas construções recombinantes baseadas na sequência da proteína do Capsídeo de CVS2 são descritas na literatura, fazendo uso de sistemas eucariotos e procariotos de expressão, para diferentes finalidades.
Para finalidade vacinal, a pCap já foi produzida em sistema de expressão de baculovírus e pelo seu potencial imunogênico observado, hoje são empregadas como vacinas comerciais (FORT et al., 2008). Este sistema eucarioto também tem sido o escolhido por outros autores (ZHOU et al., 2005; KIXMOLLER et al., 2008). Diferentemente dos anteriores, mas ainda tratando-se de um sistema eucarioto, Fan et al. (2007) utilizaram um “falso” baculovírus, que infecta células de mamíferos. Em todos os trabalhos, nos animais inoculados com baculovírus recombinante foi observada eficácia na indução da resposta imune contra a proteína do capsídeo de CVS2. Neste sistema foi possível observar a formação de VLPs da proteína recombinante produzida (FAN et al., 2007).
O sistema de expressão utilizando células das leveduras Pichia pastoris (TU et al., 2012) e S. cerevisiae (BUCAREY et al., 2009) também já foram utilizadas. Neste último, a administração oral da pCap produzida induziu anticorpos anti-CVS2 em camudongos (BUCAREY et al., 2009).
Vacinas de DNA com o gene Cap também já foram descritas por Kamstrup et al. (2004) e Fenaux et al. (2003). Após a inserção do plasmídeo recombinante, via “gene gun” em camundongos, verificaram o produção de altos títulos gerados de anticorpos anti-CVS2. Blanchard et al. (2003) compararam a eficácia de vacinas de DNA e de subunidade, e observaram maior eficiência da vacina de subunidade através da neutralização viral nos animais infectados. Outro plasmídeo recombinante, contendo o gene Cap expresso em células de mamíferos foi observado indutor de respostas humoral e celular, quando testados em camundongos BalBc (JÚNIOR et al., 2009), reforçando a eficácia dos sistemas de expressão para obtenção da pCap.
Em sistema procarioto de expressão a pCap já foi produzida em diferentes estratégias. Trundova e Celer (2007) ao expressarem o gene Cap inteiro em E. coli, reportaram que o excesso de arginina na porção N-terminal acarreta um efeito prejudicial que provoca terminação prematura da cadeia polipeptídica. Quando o gene Cap é expresso parcialmente truncado neste microrganismo, altas concentrações da proteína recombinante são alcançadas. Porém, a proteína com este domínio deletado pode reter a sua propriedade antigênica (TRUNDOVA e CELER, 2007). A pCap foi também produzida no procarioto Lactococcus
