UNIVERSIDADE FEDERAL DA FRONTEIRA SUL CÂMPUS ERECHIM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL
CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL
JULIANA WRUBLEWSKI
TOXICIDADE AGUDA E CRÔNICA DE AGROTÓXICOS EM GIRINOS DE Physalaemus cuvieri (Anura, Leptodactylidae)
ERECHIM 2016
JULIANA WRUBLEWSKI
TOXICIDADE AGUDA E CRÔNICA DE AGROTÓXICOS EM GIRINOS DE Physalaemus cuvieri (Anura, Leptodactylidae)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental da Universidade Federal da Fronteira Sul – UFFS como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia Ambiental sob a orientação da Profª Dra. Marília Teresinha Hartmann e do Profº D. Sc. Leandro Galon.
ERECHIM 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DA FRONTEIRA SUL CAMPUS ERECHIM ERS 135 – Km 72, nº 200 CEP: 99700-970 Caixa Postal 764 Erechim - RS Brasil
JULIANA WRUBLEWSKI
TOXICIDADE AGUDA E CRÔNICA DE AGROTÓXICOS EM GIRINOS DE Physalaemus cuvieri (Anura, Leptodactylidae)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental da Universidade Federal da Fronteira Sul – UFFS como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia Ambiental. Orientadores: Profª Dra. Marília Teresinha Hartmann e Prof. D. Sc. Leandro Galon.
Defendido em banca examinadora em 18/03/2016.
BANCA EXAMINADORA
________________________________ Profª Dra. Marília Teresinha Hartmann
Orientadora
_________________________________ Prof. D. Sc. Leandro Galon
Orientador
________________________________ Profª Dra. Vania Lucia Loro Universidade Federal de Santa Maria
____________________________________ Prof. Dr. Anderson Luis Nunes
Instituto Federal do Rio Grande do Sul–Campus Sertão
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Professora Dr. Marilia Hartmann pela oportunidade em compartilhar seu conhecimento, por acreditar e confiar no desenvolvimento desta pesquisa.
Ao meu orientador Professor D. Sc. Leandro Galon pelas sugestões e questionamentos que contribuíram para a concretização deste trabalho.
A banca examinadora, por ter aceitado o convite para avaliar esta pesquisa.
Agradeço imensamente a realização deste mestrado às pessoas que conseguiram entender minhas ausências, buscando fazer melhor aquilo a que me propus. Obrigada pela compreensão a minha Mãe Adelina, ao meu esposo Elton, meu irmão Cassiano e minha cunhada Queliane. Sem vocês eu nada seria, que nos gritos de socorros sempre estiveram ao meu lado.
Agradeço aos professores do Mestrado que contribuíram para que esta caminhada pudesse chegar ao final e, estarem sempre incentivando o grupo a pesquisar.
Agradeço em especial aos amigos mestrandos pelo apoio, atenção e contribuições para o desenvolvimento da pesquisa, em especial a Ângela Camila Deffaci, Flavia Bernardo Chagas, Guilherme Vanzetto e Paola Sturza.
Agradeço a todos os amigos que torceram para que tudo desse certo, e que compreenderam minha ausência nestes últimos dois anos.
Aos meus colegas da Secretaria Municipal de Educação que, me ajudaram e incentivaram neste período que me dediquei imensamente ao trabalho e ao mestrado. Muito obrigada a todos!!!
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Agrotóxicos utilizados no estudo com seus nomes técnicos e comerciais. UFFS, Câmpus Erechim, 2015.______________________________ 21 Tabela 2: Mortalidade de Physalaemus cuvieri expostos a concentrações agudas de atrazina, cipermetrina e tebuconazole em Physalaemus cuvieri. UFFS, Campus Erechim, 2015._____________________________________________ 29 Tabela 3: Mortalidade de girinos de Physalaemus cuvieri expostos a doses sub letais de atrazina, cipermetrina e tebuconazole em diferentes concentrações dos produtos e horas de exposição durante sete dias. UFFS, Campus Erechim, 2015______________________________________________________________ 33 Tabela 4: Atividade natatória diária dos girinos de Physalaemus cuvieri em concentrações sub letais de atrazina, cipermetrina e tebuconazole comparando
com o controle UFFS, Campus Erechim,
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Indivíduo adulto de Physalaemus cuvieri (A); Casal em amplexo (B); Desova coletada para desenvolvimento em laboratório e utilizada para os testes (C); Girinos utilizados nos testes (D)____________________________________ 21 Figura 2: Visão geral da área onde foram coletadas as desovas de Physalaemus
cuvieri, (Anura: Leptodactylidae), município de Erechim, RS (Setembro,
2014)_____________________________________________________________ 22 Figura 3: Girinos de Physalaemus cuvieri selecionados para os testes (A); Realização dos testes em triplicata (B). UFFS, Campus Erechim, 2015._____________________________________________________________ 25 Figura 4: Concentração letal (CL50 96h) (mg/L) de atrazina, cipermetrina e tebuconazole em girinos de Physalaemus cuvieri. UFFS, Campus Erechim, 2015._____________________________________________________________ 28 Figura 5: Taxa de mortalidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto a diferentes concentrações (mg/L) de tebuconazole (A), cipermetrina (B) e atrazina (C) no teste de exposição aguda. UFFS, Campus Erechim, 2015._____________________________________________________________ 30 Figura 6: Taxa de mortalidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto há diferentes tempos (h) aos agrotóxicos tebuconazole (A), cipermetrina (B) e atrazina (C) no teste de exposição aguda. UFFS, Campus Erechim, 2015._____________________________________________________________ 31 Figura 7: Sobrevivência de girinos de Physalaemus cuvieri após sete dias de exposição aos agrotóxicos: atrazina (barra branca), cipermetrina (barra gradiente) e tebuconazole (barra preta), no controle e nas concentrações 1/10, 1/50 e 1/100 da CL50. UFFS, Campus Erechim, 2015.___________________________________ __
32 Figura 8: Taxa mortalidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto a diferentes concentrações (mg/L) dos agrotóxicos atrazina (A), cipermetrina (B) e tebuconazole (C) na exposição crônica. UFFS, Campus Erechim, 2015._____________________________________________________________ 34 Figura 9: Taxa mortalidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto a diferentes tempos (h) aos agrotóxicos atrazina (A), cipermetrina (B) e tebuconazole (C) na exposição crônica. UFFS, Campus Erechim, 2015._________________________ 35 Figura 10: Atividade natatória dos girinos de Physalaemus cuvieri expostos aos agrotóxicos tebuconazole (linha sólida), atrazina (linha pontilhada) e cipermetrina (linha tracejada). As linhas mostram o padrão que mais se repetiu (moda) nas três concentrações de agrotóxicos testadas ao longo dos sete dias de teste. UFFS,
Campus Erechim, 2015._______________________________________________ 37 Figura 11: Taxa mobilidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto a diferentes concentrações (mg/L) dos agrotóxicos cipermetrina (A), atrazina (B) e tebuconazole (C) na exposição crônica. UFFS, Campus Erechim, 2015._____________________________________________________________ 38 Figura 12: Taxa de mobilidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto a diferentes tempos (h) aos agrotóxicos cipermetrina (A), atrazina (B) e tebuconazole (C) na exposição crônica. UFFS, Campus Erechim, 2015._________________________ 39
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL________________________________________ 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS______________________________ 12 TOXICIDADE AGUDA E CRÔNICA DE AGROTÓXICOS EM
GIRINOS DE Physalaemus cuvieri (Anura, Leptodactylidae)___________
14 RESUMO____________________________________________________ 14 ABSTRACT__________________________________________________ 15 1 INTRODUÇÃO_____________________________________________ 16 2 MATERIAL E MÉTODOS____________________________________ 20 2.1 Agrotóxicos____________________________________________ 20 2.2 Espécie teste____________________________________________ 21 2.3 Coleta e Manutenção das desovas e larvas para o experimento____ 22 2.4 Design experimental_____________________________________ 23 2.4.1 Teste Agudo_______________________________________ 24 2.4.2 Teste crônico_______________________________________ 26 2.5 Análises dos dados_______________________________________ 27 3 RESULTADOS______________________________________________ 27 3.1 Exposição aguda________________________________________ 27 3.2 Exposição crônica: mortalidade e sobrevivência________________ 32 3.2.1 Efeito das doses crônicas na atividade natatória____________ 36 4 DISCUSSÃO_______________________________________________ 40 5 CONCLUSÃO GERAL_______________________________________ 44 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS____________________________ 45
9 INTRODUÇÃO GERAL
O Brasil é o país com a maior diversidade de espécies de anfíbios do mundo, com 1026 já descritas, destas 988 são anuros (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HERPETOLOGIA, 2015). Estão na lista vermelha da International Union for Conservation of Nature (IUCN), 33 espécies distribuídas pelo país, sendo 17 vulneráveis, sete em perigo e nove criticamente ameaçadas (MIJARES, 2010; IUCN 2014).
Os anfíbios possuem características, tais como um ciclo de vida bifásico, pele permeável, desenvolvimento indireto, com larvas aquáticas que os tornam particularmente sensíveis à exposição de poluentes aquáticos e, constituem importantes elos nas redes tróficas (BORGES-MARTINS et al., 2007). Devido a estas características, estes organismos têm sido propostos como bons indicadores de controle da qualidade ambiental (STEBBINS e COHEN, 1995). Atualmente a diminuição global da biodiversidade, incluindo os anfíbios tornou-se preocupação mundial (IUCN, 2014). São diversos os fatores que contribuem com o declínio da espécie, dentre eles a destruição de habitat, mudança climática, patógenos, introdução de espécies exóticas e contaminação ambiental (SPARLING et al., 2010).
Levando-se em conta a contaminação ambiental o uso de agrotóxicos tem sido um dos fatores considerados como responsáveis pela diminuição das populações de anfíbios (BLAUSTEIN et al., 2003; SPARLING et al., 2010). Desta forma, as atividades humanas, em especial a agricultura, que utilizam agrotóxicos podem ocasionar impactos negativos sobre os agroecossistemas, através da contaminação de
10 águas superficiais e subterrâneas, dos solos, do homem, dos alimentos através de resíduos e os animais (ANVISA, 2015).
Desse modo torna-se importante a realização de pesquisas que avaliem as alterações que os agrotóxicos podem ocasionar, por exemplo, o declínio de espécies, como é o caso dos anfíbios. Os tipos mais comuns de agrotóxicos utilizados são os inseticidas, herbicidas, fungicidas e rodenticidas, particularmente os efeitos adversos dos herbicidas estão recebendo maior atenção como um potente causador do declínio de anfíbios nos últimos anos (HAYES et al., 2002; DAVIDSON et al., 2002;. ROHR et al., 2005; JONES et al., 2009; HAYES et al., 2010; SPARLING et al., 2010).
As alterações detectadas nas funções biológicas de organismos vivos quando em contato com xenobióticos como os agrotóxicos, podem servir como bioindicadores de impacto ambiental (ARIAS et al., 2007). Xenobióticos são produtos químicos sem utilidade para o organismo que em contato excessivo pode ser danoso (SMITH et al., 2007). Segundo Magalhães e Ferrão Filho (2008) as análises químicas isoladas de amostras de água não revelam o impacto global causado pelo agente poluidor, pois não retratam as consequências sobre o ecossistema, sendo assim, os sistemas biológicos podem revelar os efeitos tóxicos de um determinado poluente, como um bioindicador de maior qualidade.
A avaliação ecotoxicológica constitui importante ferramenta para análise dos efeitos prejudiciais de agrotóxicos em espécies não alvo, principalmente as nativas (USEPA, 2002). A identificação do perigo e a análise da relação dose-resposta são etapas iniciais no processo de avaliação da toxicidade ou de risco ambiental desses compostos (USEPA, 2002).
Para uma avaliação mais precisa dos efeitos diretos e indiretos dos agrotóxicos sobre as espécies, se faz necessário à utilização de testes ecotoxicológicos, dentre os
11 mais utilizados está o de exposição aguda que tem como função avaliar os efeitos mais severos e rápidos do composto sobre os indivíduos expostos (ZAGATTO e BERTOLETTI, 2008). As variáveis respostas mais utilizadas são a mortalidade de peixes e anfíbios e, a imobilidade para invertebrados, prevendo assim como os invertebrados podem interferir na densidade das espécies (RELYEA e HOVERMAN, 2006).
As concentrações utilizadas em testes de exposição aguda são mais altas do que as encontradas no ambiente natural, com exceção de um cenário onde há uma alta concentração do agrotóxico, em função de uma aplicação direta, em ambientes aquáticos com baixo volume de água (ZAGATTO e BERTOLETTI, 2008). Considerando o estudo do efeito dos agrotóxicos em concentrações mais realistas, os testes de exposição crônica tornam-se mais expressivos, pois permitem avaliar os efeitos letais assim como os subletais dos compostos sobre as espécies e, por um período mais prolongado que pode variar de 7 a 21 dias ou até meses (MOUTINHO, 2013).
A hipótese da pesquisa é que os agrotóxicos atrazina, cipermetrina e tebuconazole afetam a mortalidade e/ou atividade natatória dos girinos de Physalaemus
cuvieri.
O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a toxicidade aguda e crônica dos agrotóxicos atrazina, cipermetrina e tebuconazole, que atingem direta e indiretamente o ecossistema onde estão inseridos os anfíbios, neste caso a espécie Physalaemus cuvieri.
12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANVISA - AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. 2015. Disponível em:http://portal.anvisa.gov.br/wps/content/Anvisa+Portal/Anvisa/Inicio/Agrotoxicos+e +Toxicologia/Assuntos+de+Interesse/Monografias+de+Agrotoxicos/Monografias Acesso: 30 janeiro de 2015.
ARIAS ARL, et al. 2007. Utilização de bioindicadores na avaliação de impacto e monitoramento da contaminação de rios e córregos por agroquímicos. Ciên Saúde Colet. 12: 61 - 72.
BLAUSTEIN AR, ROMANSIC JM, KIESECKER JM. AND HATCH, A.C. 2003. Ultraviolet radiation, toxic chemicals and amphibian population declines. Divers. Distrib. 9: 123 - 140.
BORGES-MARTINS M, BECKER FG, COLOMBO P, MELO MTQ, ZANK C. 2007.Anfíbios. In: BECKER FG, RA RAMOS e LA MOURA. Biodiversidade: Regiões da Lagoa do Casamento e dos Butiazais de Tapes, Planície Costeira do Rio Grande do Sul. Brasília. p. 276 - 291.
DAVIDSON C, SHAFFER HB, JENNINGS MR. 2002. Spatial tests of the pesticide drift, habitat destruction, UV-B, and climate-change hypothesis for California amphibian declines. Conserv. Biol. 16: 1588 - 1601.
HAYES TB, COLLINS A, LEE M, MENDOZA M, NORIEGA N, STUART AA, VONK A, 2002. Hermaphroditic, demasculinized frogs after exposure to the herbicide atrazine at low ecologically relevant doses. PNAS 99: 5476 - 5480.
HAYES T, KHOURY V, NARAYAN A, NAZIR M, PARK A, BROWN T, ADAME L, CHAN E, BUCHHOLZ D, STUEVE T, GALLIPEAU S. 2010. Atrazine induces complete feminization and chemical castration in male African Clawed frogs (Xenopus
laevis). PNAS 107: 4612 - 4617.
IUCN 2014. The IUCN Red List of Threatened Species. Version 2014.3. <http://www.iucnredlist.org>. Download ed on 17 November 2014.
JONES, D.K.; HAMMOND, J.I.; RELYEA, R.A. 2009. Very highly toxic effects of endosulfan across nine species of tadpoles: lag effects and family-level sensitivity. Environ Toxicol Chem 28: 1939 - 1945.
MAGALHÃES DP, FERRÃO FILHO AS. 2008. A ecotoxicologia como ferramenta no biomonitoramento de ecossistemas aquáticos. Oecol. Bras. 12: 355 - 381.
MIJARES A, RODRIGUES MT, BALDO D. 2010. Physalaemus cuvieri. The IUCN Red List of Threatened Species. Version 2015. Disponível em: www.iucnredlist.org . Acesso em: 20 agosto 2015.
MOUTINHO MF. 2013. Ecotoxicidade comparativa de herbicidas da cana-de-açúcar para larvas de anfíbios. Dissertação – Mestrado - Programa de Pós Graduação em
13 Ecologia. Área de concentração: Ecologia de ambientes aquáticos e Terrestres. Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. São Paulo.
RELYEA RA, HOVERMAN J. 2006. Assessing the ecology in ecotoxicology: a review and synthesis in freshwater systems. Ecol lett. 9: 1157 - 1171.
ROHR JR, CRUMRINE PW. 2005. Effects of an herbicide and an insecticide on pond community structure and processes. Ecol Appl 15: 1135 - 1147.
SMITH C. Bioquímica medica básica de MarKs. 2. ed. Porto Alegre, RS: Artmed, 2007.
SOCIEDADE BRASILEIRA DE HERPETOLOGIA, 2015. Disponível em: http://www.sbherpetologia.org.br/index.php/anfibios Acesso: 04 agosto 2015.
SPARLING DW, LINDER G, BISHOP CA, KREST SK. 2010. Ecotoxicology of Amphibians and Reptiles. CRC Press. SETAC Books. Second Edition. p. 916.
STEBBINS RC, COHEN NW. 1995. A Natural History of Amphibians. Princeton Univ. Press, Princeton, New Jersey. p. 368.
USEPA. United States Environmental Protection Agency. Guidelines for the health: risk assessment guidance for superfund (RAGS). 2002. Disponível em: <www.epea.gov/superfund/programs/risk/rags/ch7> Acesso em: 25 jun 2015.
ZAGATTO PA, BERTOLETTI E. 2008. Ecotoxicologia Aquática: Princípios e Alterações. São Carlos. RiMa. 2ª ed. p. 486.
14 TOXICIDADE AGUDA E CRÔNICA DE AGROTÓXICOS EM GIRINOS DE
Physalaemus cuvieri (Anura, Leptodactylidae)
Resumo
O Brasil é o maior consumidor de agrotóxicos do mundo, entretanto são escassas as pesquisas de como esses afetam a fauna silvestre. Dentre os grupos de vertebrados, os anfíbios são de particular importância nas pesquisas sobre o impacto de agrotóxicos, devido a correlação entre estes produtos e o declínio de espécies. Este estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade aguda e crônica das formulações comerciais dos agrotóxicos: herbicida - atrazina, inseticida - cipermetrina e fungicida – tebuconazole, em girinos de Physalaemus cuvieri. Foram coletadas desovas da espécie na natureza e desenvolvidas em condições controladas em laboratório. Os testes de toxicidade foram realizados em condições padronizadas para determinar a concentração letal (CL50) a 96 horas de exposição e, o efeito das concentrações subletais dos agrotóxicos durante sete dias. Além disso, foram realizados testes de atividade natatória nos girinos expostos a concentrações subletais. A concentração letal (CL50) foi de 24,39 mg/L para atrazina, 1,4 mg/L para cipermetrina e de 1,13 mg/L para tebuconazole. O teste crônico foi realizado com concentrações 1/10, 1/50 e 1/100 da CL50, sendo expostos a 2,4; 0,48 e 0,24 mg/Lde atrazina; 0,14; 0,028; 0,014 mg/L de cipermetrina e, 0,11; 0,02; 0,01 mg/L de tebuconazole. No teste agudo, a atrazina apresentou baixa toxicidade enquanto que a cipermetrina e o tebuconazole demonstraram toxicidade média para P. cuvieri. A atividade natatória dos girinos foi afetada ao se aplicar as doses subletais de atrazina e cipermetrina, mas não na exposição à tebuconazole. O inseticida cipermetrina foi o que mais alterou a atividade natatória dos indivíduos testados.
15 ACUTE AND CHRONIC TOXICITY OF PESTICIDES ON TADPOLES
Physalaemus cuvieri (Anura, Leptodactylidae)
Abstract
Brazil is the largest consumer of pesticides in the world however the research of how these pesticides affect the wildlife is scarce. Among the vertebrates groups, amphibians are particularly important in research that verify the impact of pesticides, because the correlation between these products and the species decline. This study aimed to evaluate the acute and chronic toxicity of commercial formulations of pesticides: atrazine (herbicide), cypermethrin (insecticide) and tebuconazole (fungicide) in tadpoles
Physalaemus cuvieri. Species spawns were collected in nature and carried out under
controlled conditions in the laboratory. The toxicity tests were carried out under standard conditions to determine the lethal concentration (LC50) using 96 hours of exposure and also the effect of sub-lethal concentrations of pesticides for seven days. In addition, we made swimming activity tests on tadpoles exposed to sublethal concentrations. The lethal concentration (LC50) was 24.39 mg / L of atrazine, 1.4 mg / L for cypermethrin and 1.13 mg / L for tebuconazole. The test was performed with chronic concentrations 1/10, 1/50 and 1/100 LC50, being exposed to 2.4; 0.48 and 0.24 mg / L of atrazine; 0.14; 0.028; 0.014 mg / l Cypermethrin and 0.11; 0.02; 0.01 mg / L tebuconazole. In the acute test, atrazine showed lower toxicity while cypermethrin and tebuconazole demonstrated toxicity medium for P. cuvieri. Swimming activity of tadpoles was affected by applying sublethal doses of atrazine and cypermethrin, but not in exposure to tebuconazole. The cypermethrin was the insecticide that most altered the swimming activity of the individuals tested.
16 1 INTRODUÇÃO
Atualmente, o principal método de controle de doenças, insetos e plantas daninhas que infestam as lavouras, tem sido com o uso de agrotóxicos (JARDIM, 2012). Esses produtos são considerados perigosos para o ecossistema, para a saúde, além de persistirem no ambiente ou mesmo bioacumularem (EPA, 2015). Segundo a ANVISA (2015), o Brasil se consolida como um dos maiores consumidores de agrotóxicos em todo o mundo, fato que tem sido correlacionado com a contaminação da água, do solo, do homem e dos alimentos. As principais vias de contaminação do ambiente pelos agrotóxicos ocorreu em aplicações equivocadas, como problemas de deriva, ou mesmo aos processos de lixiviação do solo, onde esses podem atingir águas superficiais ou subterrâneas, dentre outros (HAYES et al., 2003).
Os agrotóxicos utilizados nas lavouras para o controle de doenças, plantas daninhas e insetos apresentam em suas formulações o ingrediente ativo e os inertes. Em muitos casos os inertes presentes em determinada formulação podem ser até mais prejudiciais que os ingredientes ativos, no entanto ambos os compostos podem ocasionar danos para organismos não alvo, ao serem expostos, continuamente aos produtos (CANDIOTI et al., 2010; VIEIRA et al., 2014). Neste sentido, diversos estudos vêm sendo realizados utilizando formulações comerciais de agrotóxicos e a influência desses sobre animais silvestres, como os anfíbios, tentando avaliar os efeitos da exposição ou contato (SILVA, 2013; VASCONCELOS, 2014), visto que os produtores aplicam formulações comerciais e não os ativos ou inertes isolados.
No Brasil os agrotóxicos que apresentam em sua formulação os ingredientes ativos atrazina, cipermetrina e tebuconazole estão sendo muito utilizados para o controle de pragas infestantes de lavouras (AGROFIT, 2016)). A atrazina é um herbicida, a
17 cipermetrina um inseticida e o tebuconazole, um fungida, sendo considerados tóxicos a alguns organismos não alvos (IBAMA, 2010). A atrazina é classificada como classe III - medianamente tóxico, cipermetrina classe II - altamente tóxico e tebuconazole na classe IV - pouco tóxico. No entanto como classificação ambiental, essa toxicidade muda, atrazina, cipermetrina e tebuconazole são enquadrados como classe II, muito perigosos para o ambiente (ANVISA, 2015).
O herbicida atrazina (6-chloro-N2-ethyl-N4-isopropyl-1,3,5-triazine-2,4-diamine), apresenta fórmula bruta C8H14CIN5, pertencente aos inibidores do fotossistema II e ao grupo das triazinas (SILVA et al., 2007). Está proibido na União Européia desde 2004 por ser considerado tóxico (SASS e COLANGELO, 2006), mas tem sido muito usado no Brasil para o controle de plantas daninhas infestantes das principais culturas de interesse agronômico (SILVA et al., 2007). Os herbicidas do grupo das triazinas tem amplo potencial de contaminação ambiental pela alta capacidade de lixiviação e escoamento, elevada persistência em solos, hidrólise lenta, baixa solubilidade em água e absorção moderada à matéria orgânica (GRIZOLIA, 2005; ANVISA, 2015).
A cipermetrina é um inseticida piretróide sintético de amplo espectro com sua fórmula bruta C22H19Cl2NO3, nome químico (RS) –α-cyano-3-phenoxybenzyl (1RS,3RS;1RS, 3SR) -3- (2,2-dichlorovinyl)-2-2- dimethylcyclopropane carboxylate, e aplicação foliar (MAPA, 2015). É altamente tóxica para animais aquáticos, induz a alteração nas glândulas pituitárias gonadotróficas, fígado, ovários, níveis plasmáticos e mortalidade em peixes (SAXENA e SETH, 2002; SINGH e SINGH 2008; ANVISA, 2015).
O fungicida tebuconazole do grupo químico dos triazóis recebe o nome químico de (RS)-1-p-chlorophenyl-4,4-dimethyl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl) pentan-3-ol,
18 sua fórmula bruta é C16H22CIN3O, utilizado na agricultura em lavouras de batata no controle da Pinta Preta, feijão para ferrugem, tomate para septoriose, ferrugem da soja, preservante de madeira, controle de fungos, entre outros (MAPA, 2015). Os fungicidas formulados a base de tebuconazole são persistentes no ambiente (MATTE, 2013), e podem causar efeitos adversos de longo prazo em organismos aquáticos, possuem ação sistêmica e persistência de 20 a 25 dias no ambiente (TONI, 2010).
Diversos autores relacionam o declínio de anfíbios com a presença de agrotóxicos no ecossistema (BISHOP et al., 1999; ALLRAN e KASAROV, 2000; BOONE et al., 2001; SPARLING e FELLERS, 2009; SPARLING et al., 2010). A alta sensibilidade dos anfíbios a diferentes substâncias químicas encontradas no ecossistema aquático tem sido demonstrada, incluindo agrotóxicos, fertilizantes químicos, compostos organoclorados entre outros, mas poucos estudos retratam as concentrações que afetam a sobrevivência das espécies neste grupo de vertebrados (SILVANO e SEGALLA, 2005; SPARLING et al., 2010).
Os anfíbios são os vertebrados mais ameaçados do planeta, com cerca de 40% das espécies com algum grau de ameaça de extinção (BLAUSTEIN et al., 1994; YOUNG et al., 2001; STUART et al., 2004; MMA, 2008; IUCN, 2014). Os agrotóxicos podem causar a diminuição na taxa de crescimento e desenvolvimento, anormalidades e influência na reprodução e sobrevivência de anfíbios (BISHOP et al., 1999; SPARLING e FELLERS, 2009). Dessa forma o entendimento dos efeitos da contaminação química torna-se relevante diante do relato do declínio das espécies de anuros presentes no ecossistema (BLAUSTEIN et al., 1994; YOUNG et al., 2001; SPARLING et al., 2010).
Anfíbios anuros podem ser utilizados como modelos a serem estudados, pois apresentam diversas características que os tornam suscetíveis a contaminação por agrotóxicos (STUART et al., 2004). Além de possuírem alta permeabilidade da pele, a
19 maioria das espécies depende do ambiente aquático para reprodução e desenvolvimento larval, são mais sensíveis que outros vertebrados por apresentarem um ciclo de vida bifásico (MMA, 2008; LEITE, 2010). São considerados excelentes bioindicadores para monitoramento ambiental aquático, pois podem ser encontrados em ambientes como pequenas lagoas permanentes ou temporárias e/ou banhados, em que outros animais aquáticos, como peixes, não se encontram (SEMLITSCH et al., 2000; LEITE, 2010). Com isso, são considerados os organismos que podem maximizar o controle experimental e o realismo ecológico, tanto em trabalhos laboratoriais como no campo (BOONE e JAMES, 2005).
A espécie Physalaemus cuvieri (FITZINGER, 1826), da família Leptodactylidae, não está ameaçada globalmente, sendo considerada pela International Union for Conservation of Nature (IUCN) como estável na lista vermelha. No entanto, está ameaçada na Argentina, por ter seu habitat afetado pelos cultivos agrícolas, extração de madeira, poluição das águas causada pelo escoamento de agrotóxicos, dentre outros (MIJARES, 2010; IUCN, 2014). A reprodução acontece entre setembro e fevereiro, depois de chuvas, em lagoas dentro de áreas agrícolas, permanentes ou temporárias, em ambientes propícios a contaminação por agrotóxicos (BORGES-MARTINS et al., 2007), já que essa época é que se concentram as aplicações de agrotóxicos nas lavouras do Rio Grande do Sul.
Physalaemus cuvieri é uma espécie de pequeno porte, medindo até 3 cm quando
adulto; sua coloração dorsal é variável, de bege a castanho escuro, podendo ser acinzentada, com manchas em formato variado, com uma faixa escura e larga nas laterais, do focinho até a cintura, com ventre branco, manchado de escuro no peito e na garganta; o saco vocal dos machos é preto (BORGES-MARTINS et al., 2007). Esse anfíbio é encontrado em áreas abertas ou bordas de mata, sob troncos e pedras fora do
20 período de atividade. Suas desovas podem chegar de 400 a 700 ovos, organizadas em ninho de espuma, que flutua e ficam presos as margens da vegetação, após três dias se encontram em período larval e, demoram 45 dias, aproximadamente, para metamorfosear (KWET e DI-BERNARDO, 1999). Cardoso (1981) e Haddad e Sazima (1992) citam esta espécie como sendo tolerante a alterações ambientais, podendo ocupar vários tipos de ambientes antropizados.
Poucas são as informações no Brasil sobre os efeitos de agrotóxicos em espécies de anfíbios, embora esses produtos sejam utilizados há muito tempo nas lavouras (SVARTZ, 2012; SILVA et al., 2013). Apesar de alguns estudos terem explorado os efeitos ou mesmo a relação de diferentes produtos químicos nas espécies de anfíbios a nível mundial (TEJEDO, 2003; SILVA et al., 2013, MOUTINHO, 2013, VASCONCELOS, 2014; PÉREZ IGLESIAS, 2015), no Brasil pesquisas envolvendo a sensibilidade de girinos de P. cuvieri a diversas concentrações de atrazina, cipermetrina são escassas, principalmente utilizando o tebuconazole em anfíbios (MOUTINHO, 2013; PÉREZ IGLESIAS, 2015).
Este estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade aguda e crônica de atrazina, cipermetrina e tebuconazole em girinos de Physalaemus cuvieri.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Agrotóxicos
Os agrotóxicos estudados (Tabela 1) foram atrazina (herbicida produto comercial Atrazina Nortox 500 SC), cipermetrina (inseticida produto comercial
21 Cipermetrina Nortox 250 EC) e tebuconazole (fungicida produto comercial Rival 200 EC). Todos esses agrotóxicos estão registrados no Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA, 2015) para serem utilizados no manejo de plantas daninhas, insetos e doenças respectivamente.
Tabela 1: Agrotóxicos utilizados no estudo com seus nomes técnicos e comerciais. UFFS, Câmpus Erechim, 2015.
Nome
técnico Nome comercial
Concentração de ingrediente ativo (g/L) Concentração de ingrediente inerte (g/L)
Atrazina Atrazina Nortox 500 SC 500 572
Cipermetrina Cipermetrina Nortox 250 EC
250 120
Tebuconazole Rival 200 EC 200 800
2.2 Espécie teste
A espécie selecionada foi Physalaemus cuvieri, conhecida popularmente como rã cachorro com ampla distribuição geográfica, presente no Brasil, na Argentina e no Paraguai (HADDAD e SAZIMA, 1992) (Figura 1).
A B
C D
Figura 1: Indivíduo adulto de Physalaemus cuvieri (A); Casal em amplexo (B); Desova coletada para desenvolvimento em laboratório e utilizada para os testes (C); Girinos utilizados nos testes (D). Fonte: A (WOEHL, 2000); B (ANELISE, 2007).C e D, foto da autora.
22 2.3 Coleta e Manutenção das desovas e larvas para o experimento
Foram coletadas desovas de Physalaemus cuvieri, com no máximo 24 horas de oviposição, (até estágio 14, de acordo com a classificação de Gosner (1960), em um banhado (27º30’50” S; 52º16’21” O; Figura 2), município de Erechim/RS, entre os meses de novembro de 2014 a fevereiro de 2015.
Figura 2: Visão geral da área onde foram coletadas as desovas de Physalaemus cuvieri, (Anura: Leptodactylidae), município de Erechim, RS (Setembro, 2014).
As desovas foram transportadas até o Laboratório de Ecologia e Conservação da Universidade Federal da Fronteira Sul – Campus Erechim, e mantidas separadamente em aquários de aproximadamente 50 L com água de poço artesiano e, aclimatizadas a 25ºC até sua eclosão.
As larvas foram alimentadas a cada 24 horas com alimento completo para peixes em flocos (Alcon Basic). O teste agudo foi realizado com os animais em jejum, não sendo alimentados durante o teste. No experimento do teste crônico, a alimentação foi mantida diariamente após o início do mesmo, com um cálculo de 16% da massa média
23 dos indivíduos e posteriormente foram multiplicados pela quantidade de indivíduos presente no teste.
Os girinos não utilizados nos experimentos foram liberados no mesmo local em que a desova foi coletada. Este estudo tem licença do IBAMA (45786-1) e autorização do Comitê de Ética para Uso de Animais da Universidade Federal da Fronteira Sul.
2.4 Design experimental
Foram utilizados indivíduos provenientes de seis desovas da espécie P. cuvieri. Os indivíduos foram selecionados com a massa corporal de aproximadamente 0,0803 g e 0,1186 g e, entre os estágios 24 a 27 de desenvolvimento, de acordo com a classificação de Gosner (1960) com a finalidade de reduzir a variação dos parâmetros aferidos. Apenas organismos considerados saudáveis, com movimentos natatórios normais, capacidade de movimento ao longo do aquário, sem nenhuma deformidade ou lesão aparente foram utilizados nos experimentos.
Utilizou-se para os testes e o desenvolvimento das larvas água de poço artesiano. A água estava com a temperatura de 25ºC ( ±1ºC), pH 8,0 (± 1), oxigênio dissolvido 7,0 (± 0,3mg/L). No laboratório usou-se ar condicionado quente/frio.
24 2.4.1 Teste agudo
Os testes ecotoxicológicos laboratoriais de exposição aguda tiveram a duração de 96 horas. Todos os testes foram realizados em triplicata, inclusive o controle. A cada 24 horas foi realizada a avaliação da temperatura e oxigênio da água. Os indivíduos mortos foram computados e retirados a cada 12 horas até o final dos testes.
Foram utilizadas as concentrações de 0; 3; 12; 24; 35; 45 e 55 mg/L de atrazina, 0; 0,4; 1,5 e 6 mg/L de cipermetrina e 0; 0,4; 0,7; 1; 2 ; 3; 4 e 8 mg/L de tebuconazole nos testes. As concentrações aplicadas foram baseadas em referências bibliográficas levando em consideração as recomendações da bula para aplicações no campo. Para cipermetrina, foram usadas três concentrações, próximas a CL50 registrada para
Physalaemus biligonigerus (IZAGUIRRE et al., 2006) e foi suficiente para uma CL50 confiável (p<0,05). Para tebuconazole não foram encontrados trabalhos na bibliografia com espécies próximas a P. cuvieri. Desta maneira foram testadas várias concentrações para encontrar a CL50 baseando-se no trabalho de Toni (2011) o qual pesquisou o uso do tebuconazole em Cyprinus carpio. Para atrazina usou-se a referência de Moutinho (2013) para P. cuvieri.
Conforme a indicação nas bulas de cada agrotóxico para o controle de pragas usa-se : a) atrazina 3 a 8 L/ha do produto comercial Atrazina Nortox 500 SC, de acordo com as características do solo, se arenoso menor a dose, caso for argiloso e rico em matéria orgânica maior será a dose ou ainda, conforme a cultura a ser aplicada e a planta daninha presente na lavoura; b) A cipermetrina, produto comercial Cipermetrina Nortox 250 EC é indicada de 40 a 600 µL/ha, dependendo da cultura e do inseto que se quer controlar e, c) tebuconazole, marca comercial Rival 200 EC, aplica-se de 300 mL a 1 L/ha, dependendo da doença e da cultura presente na lavoura.
25 Primeiramente, os girinos foram dispostos aleatoriamente em um recipiente de vidro, em grupos de 10, para posteriormente serem inseridos nos testes (Figura 3 A). Para a classificação dos compostos segundo a toxicidade aguda (CL50) para organismos aquáticos, o presente trabalho utilizou a classificação do Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS Criteria, GHS, 2011). Portanto os compostos podem ser classificados em três categorias quando expostos a 96 horas de experimento: alta toxicidade (CL50 <1 mg/L), média toxicidade (CL50 entre 1 e 10 mg/L) e baixa toxicidade (CL50 >10 mg/L).
Os recipientes utilizados para os testes apresentavam capacidade para 10 L, contendo um girino por litro de água. O tamanho do recipiente simulou uma poça de água de aproximadamente 10 cm de profundidade (Figura 3 B), o que seria o mais próximo do hábitat onde foram coletadas as desovas.
A B
Figura 3: Girinos de Physalaemus cuvieri selecionados para os testes (A); Realização dos testes em triplicata (B). UFFS, Câmpus Erechim, 2014.
26 2.4.2 Teste crônico
O teste crônico foi realizado nas concentrações de 1/10, 1/50 e 1/100 da CL50 96h do teste agudo, teste estático, durante sete dias, com alimentação diária, seguindo o mesmo padrão da criação das larvas usadas no experimento anterior. Para atrazina as concentrações testadas foram 0; 2,4; 0,48 e 0,24 mg/L, para cipermetrina 0; 0,14; 0,028 e 0,014 mg/L e, para tebuconazole 0; 0,11; 0,02 e 0,01 mg/L. As condições laboratoriais e as avaliações da água foram as mesmas descritas para o teste agudo.
A cada 24 horas de experimento foram realizadas as contagens de mortalidade dos indivíduos além de, verificar o efeito da concentração crônica sobre os girinos sobreviventes através da atividade natatória.
Para testar a atividade natatória dos girinos durante o teste crônico, a cada 24 horas foram realizados movimentos na água do aquário, com auxílio de um bastão de vidro, três vezes em círculo. Essa movimentação foi curta para estimular a movimentação dos girinos no aquário, sem causar stress. Como forma de comparação, o padrão de atividade natatória estabelecido foi: (3) para movimentos natatórios iguais ao controle, ou seja, sem alterações na natação do girino, quando comparado ao controle; (2) para movimentos natatórios diferentes do controle, sendo esta em círculos ou metade do controle; (1) movimentos natatórios somente com estímulo de toque em alguma parte do corpo e (0) considerado estático, mas vivo. Neste último caso, os girinos não apresentaram nenhuma movimentação com o estímulo ou toque do bastão. Porém ao serem retirados dos testes com o auxílio de uma peneira, eles se debateram e foram devolvidos ao teste, e classificados como padrão zero (0).
27 2.5 Análises dos dados
Os cálculos da CL50 seguiram a metodologia proposta por Pacheco e Rebello (2013).
Para avaliar se os fatores tempo e concentração influenciaram significativamente as taxas de mortalidade e atividade natatória dos girinos, tanto para testes crônicos quanto agudos, utilizou-se análise de variância pelo teste F. Nesta análise o tempo e a concentração foram utilizados como fatores explanatórios e, a taxa de atividade natatória e mortalidade foram os fatores resposta. Para realização das análises foi utilizado o software R (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2012) com nível de significância de 95%.
3 RESULTADOS
3.1 Exposição aguda
As formulações comerciais testadas de tebuconazole e de cipermetrina foram as mais tóxicas do que a de atrazina sobre a mortalidade dos girinos de P. cuvieri. A CL50 do teste agudo (Figura 4), foi de 1,13 mg/L para tebuconazole; 1,40 mg/L para cipermetrina e 24,39 mg/L para atrazina. De fato, tebuconazole e cipermetrina possuem toxicidade média e atrazina baixa toxicidade para girinos de P. cuvieri, conforme GHS (2011).
28 Figura 4: Concentração letal (CL50 96h) (mg/L) de atrazina, cipermetrina e tebuconazole em girinos de Physalaemus cuvieri. UFFS, Câmpus Erechim, 2015.
O teste com atrazina apresentou mortalidade de 43,3% (13) a 56,6% (17) nas primeiras 24 horas de exposição, nas concentrações de 35, 45 e 55 mg/L, respectivamente (Tabela 2). Essas concentrações eliminaram todos os girinos nas 96 horas de teste. Nos testes realizados com cipermetrina não houve mortalidade nas primeiras 24 horas e, de 48 a 96 horas a mortalidade aumentou. No final do teste (96 horas) a mortalidade foi de 13 (43%) indivíduos na concentração em 6 mg/L, 12 (40%) indivíduos na concentração 1,5 mg/L, 9 (30%) indivíduos em 0,4 mg/L.
No teste com tebuconazole os resultados foram bem distintos nas primeiras 24 horas, nas concentrações de 1, 2, 3, 4 e 8 mg/L, respectivamente morreram 1 (3,33%), 6 (20%), 10 (33,3%), 7 (23,3%) e 30 (100%) dos indivíduos. Em 48 horas a mortalidade foi maior que 50% e em 96 horas a mortalidade foi de 100% nas concentrações de 2, 3, 4 e 8 mg/L. O controle não apresentou mortalidade em nenhum dos testes.
1,13
1,4
24,39
Tebuconazole Cipermetrina Atrazina
Co n ce n tr aç ão Let al (m g/ L) Agrotóxicos
29 Tabela 2 – Mortalidade de Physalaemus cuvieri expostos a concentrações agudas de atrazina, cipermetrina e tebuconazole em Physalaemus cuvieri. UFFS, Campus Erechim, 2015. Agrotóxico Concentração mg/L Mortalidade CL 50 (mg/L) 24 h 48 h 72 h 96 h Total Atrazina 0 0 0 0 0 0 24,39 -95% CL: 21,16 +95%CL: 27,63 R2=0,93 p=0,00 3 0 0 0 0 0 12 0 0 1 5 6 24 0 3 2 5 10 35 13 8 7 2 30 45 17 6 5 2 30 55 17 9 3 1 30 Cipermetrina 0 0 0 0 0 0 1,4 -95% CL: 1,25 +95%CL: 1,55 R2=0,99 p=0,00 0,4 0 6 3 9 18 1,5 0 4 7 12 23 6 0 9 4 13 26 Tebuconazole 0 0 0 0 0 0 1,13 -95% CL: 0,99 +95% CL: 1,27 R2= 0,95 p = 0,007 0,4 0 0 0 0 0 0,7 0 0 0 0 0 1 1 5 10 5 21 2 6 10 14 0 30 3 10 9 11 0 30 4 7 4 19 0 30 8 30 0 0 0 30
Em relação às concentrações dos agrotóxicos analisados sobre a taxa de mortalidade dos girinos observou-se influência significativa para tebuconazole, cipermetrina e atrazina (F7,21 = 13,66, p= 1,53( < 0,001); F3,9 = 4,29, p= 0.04 e F6,18 = 3,23, p= 0,02, respectivamente). Ou seja, ao se incrementar as doses dos agrotóxicos maior foi a taxa de mortalidade (Figura 5 A, 5 B e 5 C).
30 A
B
C
Figura 5: Taxa de mortalidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto a diferentes concentrações (mg/L) de tebuconazole (A), cipermetrina (B) e atrazina (C) no teste de exposição aguda. UFFS, Campus Erechim, 2015
Em relação ao tempo de exposição ocorreu influência dos agrotóxicos tebuconazole e cipermetrina (Figura 6 A: F3,21 = 3,99, p= 0,02 e 6 B: F3,9 = 6,23, p=
Concentrações de tebuconazole ( mg/L) Ta x a de mortalida de ( % ) Concentrações de cipermetrina (mg/L) Ta x a de mortalida de ( % ) Concentrações de atrazina ( mg/L) Ta x a de mortalida de ( % )
31 0.01, respectivamente), ou seja, quanto maior o tempo de exposição dos organismos ampliou-se a taxa de mortalidade. Em contrapartida, o tempo de exposição não aumentou a taxa de mortalidade dos girinos para o agrotóxico atrazina (Figura 6 C: F3,18 = 1.88, p= 0,17).
A
B
C
Figura 6: Taxa de mortalidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto há diferentes tempos (h) aos agrotóxicos tebuconazole (A), cipermetrina (B) e atrazina (C) no teste de exposição aguda. UFFS, Campus Erechim, 2015
Tempo de exposição (h) Tempo de exposição (h) Tempo de exposição (h) Ta x a de mortalida de ( % ) Ta x a de mortalida de ( % ) Ta x a de mor ta lidad e ( % )
32 3.2 Exposição crônica: mortalidade e sobrevivência
O teste crônico apresentou mortalidade gradativa durante os sete dias de exposição aos três agrotóxicos avaliados. Ao final do teste crônico, a sobrevivência foi de 63 a 100% para atrazina e tebuconazole e entre 23 e 53% para cipermetrina (Figura 7).
Figura 7: Sobrevivência de girinos de Physalaemus cuvieri após sete dias de exposição aos agrotóxicos: atrazina (barra branca), cipermetrina (barra gradiente) e tebuconazole (barra preta), no controle e nas concentrações 1/10, 1/50 e 1/100 da CL50 . UFFS,
Campus Erechim, 2015
No teste crônico, a mortalidade iniciou na concentração 1/10 (0,11 mg/L) de tebuconazole nas primeiras 24 horas. Para cipermetrina e atrazina, a mortalidade iniciou nas 48 horas de teste; cipermetrina apresentou o maior número de mortes 22, 23 e 14, até o final o teste nas concentrações 0,14; 0,028 e 0,014 mg/L; a atrazina 11, 7 e 9 nas concentrações 2,4; 0,48 e 0,24 mg/L, respectivamente. O tebuconazole foi o que apresentou o menor número de girinos mortos até o encerramento do teste, 3 na concentração 0,11 e 2 em 0,02 mg/L (Tabela 3). 0 5 10 15 20 25 30 35 1 2 3 4 Controle 100% 63,3% 76,6% 70% 26,6% 23,3% 53% 100% 90% 93,3% 1/10 1/50 1/100
IN
D
IV
ÍD
U
O
S
33 Tabela 3: Mortalidade de girinos de Physalaemus cuvieri expostos a doses sub letais de atrazina, cipermetrina e tebuconazole em diferentes concentrações dos produtos e horas de exposição durante sete dias. UFFS, Campus Erechim, 2015
Agrotóxico Concentração mg/L Tempo/ Mortalidade (h) 24 48 72 96 120 144 168 Total Atrazina 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2,4 0 0 2 0 0 5 4 11 0,48 0 2 1 0 1 1 2 7 0,24 0 0 4 0 0 5 0 9 Cipermetrina 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,14 0 3 4 5 2 3 5 22 0,028 0 2 1 5 8 4 3 23 0,014 0 1 2 1 1 5 4 14 Tebuconazole 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,11 1 0 1 0 0 1 0 3 0,02 0 0 1 0 0 0 1 2 0,01 0 0 0 0 0 0 0 0
Em relação às concentrações apenas o agrotóxico cipermetrina influenciou na mortalidade dos girinos. A mortalidade aumentou conforme incrementou-se a concentração do mesmo (Figura 8 B: F3,18=5,49, p=0,007). As concentrações de atrazina e tebuconazole não influenciaram na taxa de mortalidade dos indivíduos analisados (Figura 8 A: F3,18=1,71, p=0,20; 8 C: F3,18=2,53, p=0,38, respectivamente).
34 A
B
C
Figura 8: Taxa mortalidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto a diferentes concentrações (mg/L) dos agrotóxicos atrazina (A), cipermetrina (B) e tebuconazole (C) na exposição crônica. UFFS, Campus Erechim, 2015
Concentrações de atrazina (mg/L) Ta x a de mortalida de ( % ) Concentrações de cipermetrina (mg/L) Ta x a de morta li da de ( % ) Concentrações de tebuconazole (mg/L) Ta x a de mortalida de ( % )
35 Não ocorreu influência quanto ao tempo de exposição dos girinos às concentrações dos agrotóxicos (Figuras 9 A, B e C). Ou seja, nenhum dos três demonstrou aumento na taxa de mortalidade com o aumento do tempo de exposição (atrazina: F6,18:2,32, p=0,07; cipermetrina: F6,18=1,67, p=0,18 e tebuconazole: F6,18=1,12, p=0,09).
A
B
C
Figura 9: Taxa mortalidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto a diferentes tempos (h) aos agrotóxicos atrazina (A), cipermetrina (B) e tebuconazole (C) na exposição crônica. 3.2.1 Efeitos das doses crônicas na atividade natatória. UFFS, Campus Erechim, 2015
Tempo de exposição (h) Tempo de exposição (h) Tempo de exposição (h) Tax a de m ort ali dade ( %) Ta x a de mortalida de ( % ) Ta x a de mortalida de ( % )
36 A atividade natatória dos girinos foi afetada pelas doses crônicas (subletais) de atrazina e cipermetrina, mas não de tebuconazole (Tabela 4, Figura 10). Na presença de atrazina na água, os girinos nadaram no padrão três, igual ao controle do primeiro ao quarto dia. No quinto, sexto e sétimo dias de testes a atividade natatória foi padrão dois (diferente do controle) nas três concentrações testadas de Atrazina (Tabela 4).
Tabela 4: Atividade natatória diária dos girinos de Physalaemus cuvieri em concentrações sub letais de atrazina, cipermetrina e tebuconazole comparando com o controle UFFS, Campus Erechim, 2015
Agrotóxico Concentração mg/L Atividade natatóriaa 24b 48 72 96 120 144 168 Total Atrazina 0 3 3 3 3 3 3 3 3 2,4 3 3 3 3 2 2 2 2 0,48 3 3 3 3 2 2 2 2 0,24 3 3 3 3 2 2 2 2 Cipermetrina 0 3 3 3 3 3 3 3 3 0,14 2 2 2 1 1 1 1 1 0,028 2 2 2 2 1 1 1 1 0,014 2 2 2 2 2 1 2 2 Tebuconazole 0 3 3 3 3 3 3 3 3 0,11 3 3 3 3 3 3 3 3 0,02 3 3 3 3 3 3 3 3 0,01 3 3 3 3 3 3 3 3
a Considerando (3) – para atividade natatória igual ao controle, ou seja, sem alterações na natação do girino, quando comparado ao controle (2) – para atividade natatória diferente do controle, sendo esta em círculos ou metade do controle, (1) – atividade natatória somente com estímulo de toque em alguma parte do corpo e (0) - considerado estático, mas vivo. b Analisado a cada 24 horas.
Com a exposição à cipermetrina os girinos demonstraram atividade natatória dois, diferente e menor do que o controle desde o primeiro dia, nas três concentrações testadas (Tabela 4). No terceiro dia de teste, observou-se que na concentração 0,14 mg/L alguns girinos estavam de cabeça para baixo antes da agitação no aquário. No quarto dia, na dose mais alta (0,14 mg/L), os girinos passaram a ter padrão um, enquanto nas doses de 0,028 e 0,014 mg/L permaneceram com padrão dois. Do quinto ao sétimo dia, o padrão foi um ao usar 0,14 mg/L, um com 0,028 e dois em 0,014 mg/L
37 (Figura 10, Tabela 4). Os girinos que permaneceram vivos até o final do teste, responderam com movimentos vagarosos para um único estímulo.
Diferentemente dos demais agrotóxicos testados, quando se avaliou as doses subletais de tebuconazole, a atividade natatória permaneceu igual ao controle do primeiro ao sétimo dia (Figura 10, Tabela 4). Os girinos do controle não apresentaram alteração durante todo o período de teste para os três agrotóxicos.
Figura 10: Atividade natatória dos girinos de Physalaemus cuvieri expostos aos agrotóxicos tebuconazole (linha sólida), atrazina (linha pontilhada) e cipermetrina (linha tracejada). As linhas mostram o padrão que mais se repetiu (moda) nas três concentrações de agrotóxicos testadas ao longo dos sete dias de teste. UFFS, Campus Erechim, 2015
As concentrações dos agrotóxicos cipermetrina e atrazina influenciaram a atividade natatória dos girinos expostos, em relação aos girinos no controle (Figura 11 A: F3,18=30,93, p=2,57; 11 B: F3,18=4,5, p=0,16). Quanto maior a concentração dos agrotóxicos menor a atividade natatória dos organismos. Quanto ao fungicida tebuconazole os organismos não apresentaram alterações na atividade natatória em relação ao tratamento controle nas concentrações testadas (Figura 11 C: F3,18= 1, p=0,41). 0 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7
Tempo de teste crônico em dias
P ad rã o d e ativ id ad e n atató ria
38 A
B
C
Figura 11: Taxa mobilidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto a diferentes concentrações (mg/L) dos agrotóxicos cipermetrina (A), atrazina (B) e tebuconazole (C) na exposição crônica. UFFS, Campus Erechim, 2015
Em relação ao tempo de exposição dos organismos apenas cipermetrina e atrazina influenciaram (Figura 12 A e B). Em ambos os agrotóxicos pode-se observar que ocorreu uma diminuição nos movimentos natatórios com o passar do tempo
Concentrações de cipermetrina (mg/L) Concentrações de atrazina (mg/L) Concentrações de tebuconazole (mg/L) Ta x a de mobi li da de ( % ) Ta x a de mobi li da de (%) Ta x a de mobi li da de ( % )
39 (cipermetrina F6,18=3,21, p=0,02; atrazina: F6,18=9,0, p=0,0001). Quanto ao fungicida tebuconazole os organismos não apresentaram alterações na atividade natatória com o passar do tempo (Figura 12 C: F6,18=1, p=0,45).
A
B
C
Figura 12: Taxa de mobilidade (%) de Physalaemus cuvieri exposto a diferentes tempos (h) aos agrotóxicos cipermetrina (A), atrazina (B) e tebuconazole (C) na exposição crônica. UFFS, Campus Erechim, 2015
Tempo de exposição (h) Tempo de exposição (h) Tempo de exposição (h) Ta x a de mobi li da de ( % ) Ta x a de mobi li da de ( % ) Ta x a de mobi li da de ( % )
40 4 DISCUSSÃO
Este estudo demonstrou diferença da toxicidade dos três agrotóxicos avaliados em relação à toxicidade aguda, crônica e atividade natatória em P. cuvieri. A CL50 96h, de tebuconazole e de cipermetrina demonstrou maior toxicidade que a atrazina, conforme as categorias de GHS (2011). O tebuconazole e a cipermetrina apresentaram toxicidade média (muito próxima da alta), enquanto atrazina demonstrou baixa toxicidade, para o anfíbio testado.
A atrazina está sendo pesquisada sobre o potencial de agrotóxicos como desreguladores endócrinos em anfíbios, há evidências sugerindo que a atrazina pode afetar adversamente a capacidade reprodutiva de anuros (HAYES et al., 2002; TAVERA-MENDOZA et al., 2002 a, b) e como consequência, potencialmente contribuir para o declínio da população. Em pesquisa recente com a atrazina, utilizando-se as concentrações de 1,5; 3,0; 6,0; 12,5; 19,0 e 25,0 mg/L para Rhinella schneideri e
Physalaemus nattereri em 96 h de exposição o resultado da CL50 foi de 22,18 e 33,71 mg/L (PÉREZ IGLESIAS, 2015). O resultado para P. cuvieri testado no presente estudo está entre os valores encontrados para outros anfíbios, mas sendo menos resistente que
P. nattereri, outra espécie do mesmo gênero.
Anfíbios apresentam diferenças na sensibilidade a cipermetrina (BIGA e BLAUSTEIN, 2013), assim como deve ocorrer com outros agrotóxicos. Na comparação com outros estudos, P. cuvieri é mais resistente a cipermetrina em relação a outras espécies. Em Physalaemus biligonigerus a CL50 foi de 0,12 mg/L (IZAGUIRRE et al., 2000), e 0,11 mg/L em Rhinela arenarum (IZAGUIRRE et al., 2006). Durante exposição aguda em concentrações de 10 µg/L de cipermetrina (0,01 mg/L), Rana
41
arvalis apresentou 100% de mortalidade, mostrando novamente a sensibilidade de
anfíbios a este inseticida (GREULICH e PFLUGMACHER, 2003).
O fungicida tebuconazole tem elevada capacidade de se acumular em tecidos de anfíbios (SMALLING et al., 2015). Em peixes vários trabalhos detalham a concentração letal de tebuconazole, considerado aqui o grupo mais próximo para comparação. Para
Cyprinus carpio, a CL50 foi de 2,37 mg/L-1 (TONI, 2011) para Rhamdia quelen foi de 5,3 mg/L-1 (KREUTZ et al., 2008) e para Danio rerio foi de 19,6 mg/L (SANCHO et al., 2010) de tebuconazole. Esses resultados demonstraram que o tebuconazole foi mais tóxico para P. cuvieri do que para as espécies de peixes testadas em outras pesquisas.
No teste agudo, a concentração influenciou na mortalidade dos três agrotóxicos testados, entretanto, o tempo de exposição influenciou na aplicação das concentrações somente de cipermetrina e tebuconazole. Dessa forma, quanto maior o tempo de exposição a estes dois agrotóxicos maior a mortalidade de P. cuvieri. Segundo Magalhães e Ferrão Filho (2008) essa relação entre tempo de exposição e mortalidade pode ser explicada porque leva algum tempo para o agrotóxico se acumular nos tecidos do organismo até atingir uma concentração limiar, a partir da qual o efeito se apresenta. As primeiras 24 horas são importantes pois alguns organismos podem adquirir resistência após as primeiras horas de exposição (MAGALHÃES e FERRÃO FILHO, 2008), no entanto, não foi o que aconteceu neste estudo
Na análise crônica, tebuconazole foi o agrotóxico que apresentou menor mortalidade e menor efeito sobre a atividade natatória de P. cuvieri, que permaneceu igual ao controle após os estímulos. Sendo assim, na forma crônica, tebuconazole foi o menos tóxico, pois nem a concentração nem o tempo influenciaram a mortalidade e a atividade natatória. Cipermetrina foi considerada a mais tóxica, pois apresentou maior mortalidade e alteração significativa na atividade natatória.
42 Em ambiente natural, a mobilidade reduzida dos girinos significa menor capacidade de fuga, o que interfere na sobrevivência, pois se tornam mais suscetíveis a predação (AZEVEDO-RAMOS, et al., 1992). Desta maneira, girinos expostos a cipermetrina e a atrazina em seu ambiente natural, em maior ou menor grau poderão ter alterações na atividade natatória. As concentrações subletais dos agrotóxicos testados neste estudo considera-se as mais próximas das encontradas no ambiente, o que leva a uma real preocupação com a sobrevivência das populações de anuros, principalmente de
P. cuvieri.
Outros estudos realizados testando atividade natatória em girino mostraram que a atrazina modifica a natação em R. schneideri e P. nattereri (PÉREZ IGLESIAS, 2015) e estes resultados concordam com o encontrado em peixes (NIEVES-PUIGDOLLER et al., 2007). As alterações na atividade natatória encontradas no presente estudo podem ter significado ecológico, sendo que estes girinos tornam-se mais visíveis para os predadores, mais lentos, aumentando o risco de predação e tendo à estrutura física reduzida devido a uma escassa nutrição o que leva os mesmos à morte. Assim sendo, as alterações na natação devido aos efeitos subletais dos agrotóxicos podem causar interrupções nas interações entre espécies de anfíbios e no funcionamento das comunidades por afetar cadeias tróficas por ausência de predadores e presas (HOWE et al., 1998; PELTZER et al., 2013).
A cipermetrina, assim como os piretróides em geral, são altamente tóxicos para peixes e invertebrados aquáticos (MONTANHA, 2012). Segundo Begum (2005) o principal motivo é devido à metabolização e eliminação destes compostos serem significativamente mais lentos em peixes do que nos mamíferos e aves. Em carpa (Labeo rohita) expostas a concentrações subletais de cipermetrina produziram alterações bioquímicas, enzimáticas e nos parâmetros hematológicos (BASANTA e
43 SUBHAS, 2003). A cipermetrina categorizada como de uso restrito pela United States Environmental Protection Angency (USEPA) devido sua alta toxicidade aos peixes (SAHA e KAVIRAJ, 2009), é encontrada na superfície de águas, nos sistemas de escoamento, aquicultura e em aguas pluviais (JAENSSON et al., 2007).
A meia vida da atrazina é influenciada pelas condições específicas do local, tais como a temperatura, luz solar, microrganismos, concentração do produto, características físico-químicas do solo e do próprio herbicida, dentre outras (SILVA et al., 2007). A literatura estima a meia vida de atrazina entre 16 a 100 dias, com uma média de 60 dias, enquanto, que em rios a meia-vida é de 1,5 a 13,3 dias, considerado relativamente curto (CHUNG e GU, 2003). Contudo, há relatos que em lagos a meia-vida pode ficar entre 124 a 365 dias, esse comportamento pode ser atribuído ao fluxo da água, à adsorção em sedimentos em suspensão e a fotólise em água superficial (SCHOTTLER e EISENREICH, 1997). A fotólise degrada rapidamente a atrazina e o tempo de meia-vida pode ficar entre 1,6 a 13,3 dias a partir de estudos em laboratório (CHUNG e GU, 2003).
O tebuconazole apresenta seu coeficiente de adsorção em 2.500 mL/g, a meia vida do produto de 403 dias no solo, apresenta potencial de ser transportado em água como associado ao sedimento, por apresentar alta afinidade com a matéria orgânica, desta forma, o fungicida apresenta uma maior mobilidade no ambiente (FERRACINI et al., 2001).
Essas características dos agrotóxicos testados demonstram sua permanência no ambiente e a possibilidade de contato com espécies não-alvo, neste caso anfíbios. Em maior ou menor grau, a formulação comercial de atrazina, cipermetrina e tebuconazole foram tóxicos para Physalaemus cuvieri, demonstrando que mesmo doses baixas podem afetar a mortalidade e/ou atividade natatória.
44 5 CONCLUSÃO GERAL
A toxicidade aguda de atrazina considerada baixa influenciou na mortalidade dos girinos, da mesma forma para as concentrações de cipermetrina e de tebuconazole, sendo avaliadas como toxicidade média. Assim, quanto maior a concentração de agrotóxico aplicado, o índice de mortalidade aumenta. O tempo de exposição aguda para atrazina não foi o fator relevante como para cipermetrina e tebuconazole.
As doses subletais de cipermetrina aplicadas resultou no maior número de mortalidade, no entanto o tempo de exposição não influenciou. A atrazina e o tebuconazole apresentaram mortalidade menor quando comparada a cipermetrina. No entanto, nem o tempo nem a concentração influenciaram no resultado. Nas doses subletais a sobrevivência dos girinos é afetada para os três agrotóxicos.
O tempo de exposição nas doses subletais de atrazina e cipermetrina prejudicaram os movimentos natatórios de P. cuvieri. Para cipermetrina verificou-se adversidade nos movimentos desde as 24 h de teste, no entanto para atrazina somente a partir das 120 h. Para o tebuconazole, as doses subletais testadas não influenciaram os movimentos natatórios.
45 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGROFIT. 2016. Disponível em: http://www.agrofit.com.br Acesso em: 17 de janeiro de 2016.
ANVISA - AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. 2015. Disponível em:http://portal.anvisa.gov.br/wps/content/Anvisa+Portal/Anvisa/Inicio/Agrotoxicos+e +Toxicologia/Assuntos+de+Interesse/Monografias+de+Agrotoxicos/Monografias Acesso: 30 jan de 2015.
ALLRAN JW, KARASOV WH. 2000. Effects of atrazine and nitrate on northern Leopard frog (Rana pipiens) larvae exposed in the laboratory from posthatch through metamorphosis. Environ Toxicol Chem 19: 2850 - 2855.
ANELISE, Imagem Physalaemus cuvieri, casal em amplexo. Disponível em : http://anneeliseblog.blogspot.com.br/2007/12/physalaemus-cuvieri-r-foi-gol-no-foi.html . Acesso em: 25 jan 2015.
AZEVEDO-RAMOS C, SLUYS MV, HERO IM, MAGNUSSON W. 1992. Influence of tadpole movement on predation by odonate naiads. J Herpetol 26: 335 - 338.
BASANTA KD, SUBHAS, CM. 2003. Toxicity of cypermethrin in Labeo rohita fingerlings: biochemical, enzymatic and haematological consequences. Elsevier. Comp. Biochem. Physiol. 134: 109 - 121.
BEGUM G. 2005. In vivo biochemical changes in liver and gill of Clarias batrachus during cypermethrin exposure and following cessation of exposure. Pestic Biochem Phys 82: 185 - 196.
BIGA LM. E BLAUSTEIN AR. 2013. Variations in lethal and sublethal effects of cypermethrin among aquatic stages and species of anuran amphibians. Environ Toxicol Chem 32: 2855 - 2860.
BISHOP CA, MAHONY NA, STRUGER J, NG P, PETTIT KE. 1999. Anuran development, density and diversity in relation of agricultural activity in the Holland river watershed, Ontario, Canada (1990-1992). Environ Monit Assess 57: 21 - 43. BLAUSTEIN AR, WAKE DB, SOUSA WP. 1994. Amphibian declines: judging stability, persistence, and susceptibility of populations to local and global extinctions. Conserv Biol 8: 60 - 71.
BOONE MD, BRIDGES CM, ROTHERMEL BB. 2001.Growth and development os larval green frogs (Rana clamitans) exposed to multiple doses of an insecticide. Oecologia 129: 518 - 524.
BOONE MD e JAMES SM. 2005. Aquatic sans terrestrial mesocosms in amphibian ecotoxicology. Appl herpetol 2: 231 - 257.
46 BORGES-MARTINS M, BECKER FG, COLOMBO P, MELO MTQ, ZANK C. 2007. Anfíbios. In: BECKER FG, RA RAMOS e LA MOURA. Biodiversidade: Regiões da Lagoa do Casamento e dos Butiazais de Tapes, Planície Costeira do Rio Grande do Sul. Brasília. p. 276 - 291.
CARDOSO AJ. 1981. Biologia e sobrevivência de Physalaemus cuvieri (Fitzinger,1826) (Amphibia, Anura), na natureza. Cien. Cult. 33: 1224 - 1228.
CANDIOTI JV, NATALE GS., SOLONESKIA S, RONCO A E. LARRAMENDY M L. 2010. Sublethal and lethal effects on Rhinella Arenarum (Anura, Bufonidae) tadpoles exerted by the pirimicarb-containing technical formulation insecticide Aficida®. Chemosphere 78: 249 - 255.
CHUNG SW, GU RR. 2003. Estimating time-variable transformation rate of atrazine in a reservoir. Adv Environ Res 7: 933 - 947.
EPA. United States Environmental Protection Agency. Disponível em: http://www.epa.gov/pesticides. Acesso em: 20 out 2015.
FERRACINI VI, PESSOA MCYP, SILVA AD, SPADOTTO CA. 2001. Análise de risco de contaminação das águas subterrâneas e superficiais da região de Petrolina (PE) e Juazeiro (BA). r. ecotoxicol. e meio ambiente 11: 1 - 16.
GHS, Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals. 2011. Fourth Edition. United Nations, New York and Geneva. p. 561.
GOSNER K. 1960. A simplified table for staging Anuran Embryos and larvae with notes on identification. Herpetologica 16: 183 - 189.
GREULICH K e PFLUGMACHER S. 2003. Differences in susceptibility of various life stages of amphibians to pesticide exposure. Aquat Toxicol 65: 329 - 336.
GRIZOLIA CK. 2005. Agrotóxicos mutações, câncer e reprodução. Brasília: Editora UNB. p. 392.
HADDAD CFB E SAZIMA I. 1992. Anfíbios anuros da Serra do Japi. In: Morellato, L.P.C. Org. História natural da Serra do Japi: ecologia e preservação de uma área florestal no Sudeste do Brasil. Campinas: UNICAMP/FAPESP p.188 - 211.
HAYES TB, COLLINS A, LEE M, MENDOZA M, NORIEGA N, STUART AA, VONK A, 2002. Hermaphroditic, demasculinized frogs after exposure to the herbicide atrazine at low ecologically relevant doses. PNAS 99: 5476 - 5480.
HAYES T, HASTON K, TSUI M, HOANG A, HAEFFELE C, VONK A, 2003. Atrazine-induced hermaphroditism at 0.1 ppb in American leopard frogs (Rana
pipiens): laboratory and field evidence. Environ Health Perspect 111: 568 - 575.
HOWE GE, GILLIS R, MOWBRAY RC. 1998. Effect of chemical synergy and larval stage on the toxicity of atrazina and alachlor to amphibian larvae. Environmental Toxicology and Chemestry 17: 519 - 525.
