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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Alessandra Regina Dhom Pimentel de Moraes
“Avaliação da combinação da oxigenação hiperbárica com
óleos de Copaifera sp e Carapa guianensis
no tratamento da leishmaniose experimental”
CAMPINAS 2016
Alessandra Regina Dhom Pimentel de Moraes
“Avaliação da combinação da oxigenação hiperbárica com
óleos de Copaifera sp e Carapa guianensis
no tratamento da leishmaniose experimental”
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a
obtenção do título de Mestra em Biologia Animal na área de Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELA ALUNA
ALESSANDRA REGINA DHOM PIMENTEL DE MORAES E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SELMA GIORGIO
orientadora: SELMA GIORGIO
Campinas, 28 de julho de 2016.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Selma Giorgio (orientadora)
Profa. Dra. Regina Maura Bueno Franco
Prof. Dr. Carlos Emílio Levy
Profa. Dra. Eneida de Paula
Profa. Dra. Adriana Degrossoli
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Nós vemos o Sol que vem brilhando
Por traz da mais alta serrania
Mostrando a todos que já vem o dia
Os pássaros começam logo cantando
Nós vemos o mundo clareando
O Sol mostra sua fortaleza
A gente admirando a grandeza
Nós sentimos do Sol tanta quentura
A Lua com aquela frieza pura
Dedico este trabalho ao meu pai (in memoriam), minha mãe, e minha família que sempre me apoiaram.
AGRADECIMENTOS
A Deus, que me guia todos os dias. A FAPESP, CAPES e CNPq pelo apoio.
À profa. Dra. Selma Giorgio, que confiou em mim e no projeto desde o início, me ensinou e orientou transmitindo seu conhecimento com paciência, dedicação, firmeza, incentivo e coragem.
Ao meu pai, Dimas, que me fez acreditar em mim sempre, à minha mãe, Nanci, com seu carinho e apoio em todos os sentidos e minhas irmãs Dinan e Denise que sempre se mantiveram ao meu lado.
Ao meu marido Gilson, companheiro de cada minuto, dedicado e compreensivo, juntamente com nossos filhos doando bem mais que tempo.
Ao meu amigo Reinaldo, que me apresentou algumas qualidades dos produtos naturais que utilizei nesse trabalho, me incentivou a vir para a UNICAMP e realizar o mestrado.
Ao meu amigo Thiago e sua família, que me auxiliaram a adquirir os óleos naturais no Acre, me conduzindo aos locais necessários.
Aos amigos do Laboratório de Leishmaniose que me apoiaram, me ensinaram, me auxiliaram em tantos momentos, Solange, Myriam, Mariana, Bárbara, Luiz, Vanessa, Izadora, Daniel, Ana, Juliana, Ademar e aos que foram chegando e sendo amigos verdadeiros.
Aos funcionários do departamento de Biologia Animal João, Nilson, D. Tacilda, que estiveram, com amizade e prontidão, auxiliando no que foi possível, em especial à amiga Dra. Tatiana Steiner, que me auxiliou em diversos momentos com seus conselhos e amizade.
Ao Marco Antônio da Pós Graduação com toda sua dedicação e paciência comigo. Aos professores que me acolheram como aluna, e me ensinaram a base para que esse trabalho acontecesse, Arício, Urara, Eliana, Luiz Augusto, Marlene, Silmara, Danilo, e convidados de outros departamentos e de outras instituições.
À pesquisadora Dra. Sílvia Basso, da FUNTAC, Rio Branco, AC, pelas análises fisicoquímica e cromatográfica dos óleos de copaíba e de andiroba.
Às amigas e alunas de doutorado do departamento de Biomembranas, Vivane Guilherme e Lígia Nunes pelo apoio durante o desenvolvimento e caracterização das nanoemulsões.
Ao prof. Dr. Nelson Duran, pelo uso de equipamentos de seu laboratório para formulação e caracterização das nanoemulsões.
Ao prof. Dr. Guilherme Diniz Tavares, da UFMG, que me auxiliou na formulação das nanoemulsões.
Ao pesquisador Dr. Allan Radaic, que me auxiliou a realizar as fotomicrografias das nanoemulsões.
Às técnicas do laboratório de Microscopia Eletrônica, Ana Floriana Rodrigues e Stella Maris Fick de Ferraz que me auxiliaram nos procedimentos realizados em microscopia eletrônica.
Ao prof. Dr. Paulo Joazeiro que me forneceu o material usado para preparo dos promastigotas para realização da microscopia eletrônica de varredura.
Ao prof. João Eduardo Pires, coordenador da faculdade de Medicina Veterinária da ULBRA, Palmas TO, por ceder o laboratório da faculdade para leitura de lâminas. Aos professores Danilo, Regina Maura e Guilherme que aceitaram fazer parte de minha pré banca, mostrando pontos a serem melhorados.
A essa banca examinadora e suplentes.
RESUMO
A leishmaniose cutânea, causada pela espécie Leishmania amazonensis, é caracterizada mais comumente pela presença de lesões cutâneas locais, podendo evoluir para forma mucocutânea, mucosa ou disseminada. A leishmaniose causada pela espécie L. infantum caracteriza-se por lesões viscerais e pode ser fatal. Os cães são reservatórios domésticos e canídeos e marsupiais são os reservatórios silvestres da L. infantum. Tanto a leishmaniose cutânea como a visceral têm a quimioterapia como forma de controle, mas a toxicidade e as recidivas são constantemente reportadas, e ainda não foram desenvolvidas vacinas efetivas. Diante desse quadro, as pesquisas são intensas na busca por compostos sintéticos ou produtos naturais para tratamento dessa parasitose. Nesse trabalho de mestrado avaliamos o óleo extraído do tronco da árvore do gênero Copaifera, popularmente conhecido como óleo de copaíba, e o óleo de andiroba originado da castanha da árvore Carapa guianensis, ambos, provenientes do Acre, nos modelos in vitro e in vivo das leishmanioses cutânea e visceral. Nanoemulsões dos óleos de copaíba e de andiroba foram desenvolvidas e caracterizadas através da mensuração do tamanho das partículas, polidispersão, a tensão do potencial zeta e microscopia eletrônica de transmissão para obtenção das imagens. Os protocolos de tratamento com oxigenação hiperbárica, terapia baseada em contato com ambiente 100% oxigenado e pressão de 3 ATM, e com as nanoemulsões foram testados em camundogos BALB/c infectados por L. amazonensis ou L. infantum. O uso de nanoemulsões viabilizou a administração oral e a utilização dos óleos em experimentos in vitro. A nanoemulsão de andiroba reduziu a proliferação dos parasitos em 50% usando-se 5,9µL/mL de nanoandi3 para L. amazonensis e 3,63µL/mL de nanoandi3 para L. infantum. Nanocopa reduziu a proliferação dos parasitos em 50% em dosagens de 0,3 µL e 0,18 µL/mL para L.amazonensis e L.infantum, respectivamente, após 48hs. Os resultados indicaram que nanoemulsões de ambos os óleos, têm efeito tóxico em promastigotas e amastigotas intracelulares de L. amazonensis e L. infantum. As fotomicrografias eletrônicas de varredura de promastigotas de L. amazonensis e de L. infantum tratados com as nanoemulsões de copaíba ou andiroba mostraram presença de células de tamanho reduzido e com deformidades celulares. Os camundongos infectados com L. amazonensis ou L. infantum, e tratados por via oral com as nanoemulsões dos óleos de copaíba e de
andiroba, tiveram redução significativa da carga parasitária nas lesões e órgãos avaliados. A terapia com a câmara hiperbárica nos animais infectados com L. amazonensis e L. infantum reduziu a carga parasitária nas lesões e órgãos avaliados, quando em conjunto com a administração oral de nanoemulsões de copaíba. A análise histológica de vários órgãos coletados de camundongos tratados com as nanoemulsões de andiroba e copaíba indicou que essas não foram tóxicas para os animais nas dosagem utilizadas. Os resultados abrem perspectivas para mais pesquisas com essas nanoemulsões para o tratamento de LC e LV.
ABSTRACT
Cutaneous leishmaniasis, caused by Leishmania amazonensis species is most commonly characterized by the presence of local skin lesions, it may progress to mucocutaneous, mucous or disseminated leishmaniasis. Leishmaniasis caused by L. infantum species characterized by visceral lesions and can be fatal. Dogs are domestic reservoirs and canids and marsupials are the wild reservoirs of L. infantum. Both cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis have chemotherapy as a method of control, but the toxicity and recurrences are constantly reported, and have not yet developed effective vaccines. Given this situation, research is intense in the search for synthetic compounds or natural products for treatment of this disease. In this master's work we evaluated the oil extracted from the trunk of Copaifera tree, popularly known as copaiba oil and andiroba oil originated from the chestnut tree Carapa guianensis, both from Acre, in models in vitro and in vivo of cutaneous and visceral leishmaniasis. Nanoemulsions of copaíba oil or andiroba oil were developed and characterized by measuring the particle size, polydispersity, the tension of the zeta potential and transmission electron microscopy to obtain the images. Treatment protocols with hyperbaric oxygen therapy based contact 100% oxygenated environment and 3 atm pressure, and the nanoemulsions were tested in BALB / c mice infected with L. amazonensis and L. infantum. The use of nanoemulsions made possible the oral administration and the use of oils in vitro experiments. The nanoemulsion of andiroba nanoandi3 reduced the proliferation of parasites on 50% L. amazonensis and L. infantum. Nanocopa reduced the proliferation of parasites on 50% at dosages of 0.3 uL and 0.18 uL / mL for L.infantum and L.amazonensis, respectively, after 48 hours. The results indicated that nanoemulsions of both oils have a toxic effect on intracellular amastigotes and promastigotes of L. amazonensis and L. infantum. Electronic photomicrographs promastigotes scanning of L. amazonensis and L. infantum treated with nanoemulsions of copaíba or andiroba showed the presence of small sized cells and cell deformities. The mice infected with L. amazonensis or L. infantum and treated orally with the nanoemulsion of copaiba oil or nanoemulsion of andiroba oil, had a significant reduction in parasite load in the lesions and evaluated organs. Hyperbaric oxygen therapy in animals infected with L. amazonensis and L. infantum reduced the parasite load in the lesions and evaluated organs when in conjunction with oral
administration of nanoemulsions of copaiba. Histological analysis of various organs collected from mice treated with the nanoemulsion of andiroba oil or nanoemulsion of copaíba oil indicated that these were not toxic for the animals used in the dosage form. The results open perspectives for further research with these nanoemulsions for the treatment of LC and LV.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 1.1 Histórico... 1.2 O parasito... 1.3 Vetores... 1.4 Distribuição mundial das leishmanioses... 1.5 As Leishmanioses... 1.5.1 Leishmaniose tegumentar... 1.5.2 Leishmaniose visceral... 1.5.3 Leishmaniose visceral canina... 1.6 Prevenção e controle das leishmanioses... 1.7 Diagnóstico das leishmanioses... 1.8 Tratamento das leishmanioses em humanos... 1.9 Medicamentos usados na leishmaniose visceral canina (LVC) ...
1.10 Produtos naturais ... 1.10.1 Óleo de Copaifera...
1.10.2 Óleo de Carapa guianensis... 1.11 Tratamentos com a Câmara Hiperbárica (HBO) ... 1.12 Leishmaniose experimental ... 1.13 Emulsões e nanoemulsões... 1.13.1 Caracterização de sistemas nanoestruturados... 2. OBJETIVOS... 2.1 Objetivo geral... 2.2 Objetivos específicos... 3. MATERIAIS E MÉTODOS... 3.1 Parasitos... 3.2 Animais... 3.3 Fármacos... 3.4 Infecção dos animais com promastigotas de L.amazonensis e monitoramento.... 3.5 Infecção dos animais com promastigotas de L.infantum e monitoramento ... 3.6 Óleos de Copaifera (copaíba) e C. guianensis (andiroba)... 3.7 Protocolos de emulsões ... 3.8 Protocolos de nanoemulsões... 16 16 16 18 18 21 21 23 24 25 26 26 29 29 32 35 37 38 40 41 43 43 43 44 44 44 45 45 45 45 46 47
3.9 Caracterização das nanoemulsões por DLS... 3.10 Caracterização das nanoemulsões por NTA... 3.11 Microscopia eletrônica de transmissão (MET) das nanoemulsões... 3.12 Microscopia eletrônica de varredura de promastigotas ... 3.13 Ensaios de toxicidade em promastigotas... 3.14 Ensaios de toxicidade em macrófagos... 3.15 Ensaios de toxicidade em amastigotas intracelulares ... 3.16 Tratamentos dos camundongos com nanoemulsões... 3,17 Tratamentos dos camundongos com a câmara hiperbárica... 3.18 Histologia... 3.19 Análise dos resultados... 4- RESULTADOS... 4.1 Análise fisicoquímica dos óleos de Copaifera (copaíba) e C. guianensis
(andiroba) ... 4.2 Análise cromatográfica dos óleos... 4.2.1 Cromatograma do óleo de copaíba... 4.2.2 Cromatograma do óleo de andiroba... 4.3 Emulsões e nanoemulsões... 4.3.1 Emulsões de óleo de copaíba e de andiroba... 4.3.2 Nanoemulsões de óleo de copaíba e de andiroba ... 4.4 Caracterização das nanoemulsões ... 4.4.1 DLS... 4.4.2 NTA... 4.4.3 MET das nanoemulsões... 4.5 Toxicidade das emulsões em promastigotas... 4,6 Toxicidade das nanoemulsões em promastigotas... 4.7 MEV dos promastigotas... 4.8 Toxicidade das nanoemulsões em macrófagos... 4.9 Toxicidade das nanoemulsões em amastigotas intracelulares... 4.10 Testes in vivo ... 4.11 Histologia dos órgãos e lesões... 4.11.1 Análise histológica de camundongos infectados com L.amazonensis ... 4.11.2 Análise histológica de camundongos infectados com L.infantum...
48 48 49 49 50 50 51 51 52 53 54 54 . 54 54 54 55 56 56 57 58 58 64 66 67 68 72 74 76 81 86 86 87
5- DISCUSSÃO... 6- CONCLUSÕES... 7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 8- ANEXOS... 93 100 101 112
1 INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
A primeira observação do parasito Leishmania foi feita por Cunnignham em 1885. O parasito foi identificado no início do século XX, quando William Leishman encontrou o protozoário no baço de um soldado indiano e Donovan, em 1903, foi o responsável pela primeira publicação. Em 1903, Ross criou o gênero Leishmania e denominou Leishmania donovani o agente causador do calazar (do indostão, Kala-azar, onde kala significa negro, e azar, doença). Em 1904, Leonard Rogers conseguiu cultivá-lo e Patton observou diferentes formas morfológicas em 1907 (CABRERA, 1999). No Brasil, o primeiro a relatar a doença e a suspeitar do papel dos flebotomíneos como vetores foi Cerqueira em 1885, na Bahia (GONTIJO et al., 2003). A espécie foi descrita em 1908 por Charles Nicole como Leishmania infantum (NICOLE, 1908). Em 1937, Chagas e Cunha descreveram a espécie Leishmania chagasi como causadora da leishmaniose visceral na América (CUNHA e CHAGAS, 1937). Pesquisas moleculares comprovaram que se tratavam da mesma espécie, sendo então a L.chagasi considerada como sinônimo de L. infantum tendo prioridade a nomenclatura mais antiga (MAURICIO et al., 2000).
1.2 O parasito
Os protozoários digenéticos da família Trypanosomatidae, ordem Kinetoplastida, do gênero Leishmania são os parasitos responsáveis pelas leishmanioses. Os organismos da ordem Kinetoplastida apresentam uma mitocôndria única (denominada cinetoplasto) rica em DNA mitocondrial, o kDNA. Apresentam uma forma flagelada e extracelular, o promastigota, e uma forma imóvel e intracelular, o amastigota (Figura 1) (LAINSON, 2010).
Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de promastigota (A) e óptica das formas intracelulares no interior de macrófagos murinos (B) (amastigotas indicados na seta) (B) (fotos da autora).
O ciclo infectivo no hospedeiro vertebrado se inicia quando as formas promastigotas metacíclicas são inoculadas pela fêmea do inseto vetor, durante o repasto sanguíneo, no hospedeiro vertebrado. Essas formas são fagocitadas pelos macrófagos teciduais e pelos neutrófilos (PETERS et al., 2009). Nos macrófagos, promastigotas se transformam em amastigotas, e esses, não suportando a carga parasitária, rompem-se e as formas amastigotas livres, assim como neutrófilos infectados, são fagocitados por outros macrófagos (PETERS et al., 2009). As fêmeas dos flebotomíneos, ao exercerem a hematofagia, ingerem, junto com o sangue, os parasitos sob a forma amastigota, esses ainda no interior das células infectadas. No interior do inseto ocorre a transformação para a forma promastigota procíclica e posteriormente para a forma promastigota metacíclica, que se encaminha para a probóscide do inseto (CABRERA, 1999) Figura 2.
1.3 Vetores
No Novo Mundo o inseto vetor é um flebotomíneo do gênero Lutzomyia e no Velho Mundo do gênero Phlebotomus (OMS, 2014).
Os flebotomíneos são insetos dípteros, psicodídeos, de pequeno porte, corpo piloso, delgado e diferem-se dos demais dípteros por, principalmente, desenvolverem todo seu estádio larvar em matéria orgânica contida no solo e não em água. Quando adultos, apresentam dimorfismo sexual, alimentam-se de seiva para manter a homeostase, mas as fêmeas precisam de uma dieta sanguínea para maturação ovariana, e assim prosseguir com a oviposição e manutenção do ciclo vital (FORATTINI, 1960).
Os vetores Lutzomyia, antes encontrados apenas em ambientes silvestres, tiveram, mais recentemente, a adaptação aos ambientes urbanos, em periferias de grandes centros, principalmente na Região Sudeste (Brasil), podendo ser encontrados no peridomicílio, em galinheiros, chiqueiro, canil, paiol, entre outros ambientes e também no intradomicílio (SILVA et al., 2007). Em áreas tropicais, a densidade populacional de flebotomíneos aumenta durante ou após períodos chuvosos, pois a alta umidade resultante das primeiras chuvas proporciona a eclosão das pupas (SHIMABUKURO e GALATI, 2011).
1.4 Distribuição mundial das leishmanioses
Estima-se em torno de 2 milhões de novos casos anuais de leishmanioses por todo mundo, sendo que, entre 20 a 30 mil deles chegam a óbito. A leishmaniose tegumentar (LT) é a forma mais comum da doença, e a leishmaniose visceral (LV) é fatal se não tratada (OMS, 2015). Estima-se que 14 milhões de pessoas estejam infectadas com o parasito Leishmania (DESJEUX, 2004) e que ocorram entre 0,7 a 1,3 milhões de novos casos de LT, anuais, principalmente no Afeganistão, Argélia, Brasil, Colômbia, Irã e Síria (OMS, 2014) (Figura 3).
No Brasil, na década de 50, houve uma diminuição da LT, mas o número de casos vem crescendo progressivamente nos últimos 20 anos nas regiões Nordeste, Norte, Centro-Oeste, Sudeste e Sul (estado do Paraná). Os surtos são associados à derrubada de matas para construção de estradas e criação de povoados. Também ocorrem casos de leishmanioses em outras regiões do país em
áreas de colonização antiga, não associadas à derrubada de matas. Os cães, eqüinos e roedores têm papel importante como reservatórios do parasito (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).
Figura 3. Mapa de distribuição mundial de leishmaniose tegumentar (OMS, 2014). Estima-se que 200 mil a 400 mil novos casos anuais de LV ocorram em
todo o mundo, sendo que mais de 90% dos novos casos ocorrem em 6 países: Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Nepal e Sudão (OMS, 2015) (Figura 4). A LV é endêmica em 88 países, com um total de 350 milhões de pessoas com o risco de adquirir a doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Nas Américas, a LV abrange desde o sul da Argentina até o sul do Canadá (DANTAS-TORRES, 2006). Na região andina, entre os anos de 1996 e 1998, foram registrados mais de 14 mil casos de leishmanioses em média, com 6.155 ocorridos na Colômbia, 2.668 no Peru, 2.240 na Bolívia, 1.936 na Venezuela e 1.084 no Equador (DAVIES et al., 2000).
Dentro das Américas, o Brasil é o país com o maior índice de ocorrência da enfermidade (DANTAS-TORRES, 2006). A LV está sendo levada para os grandes centros urbanos por meio da migração populacional em busca de melhores condições socioeconômicas (DANTAS-TORRES, 2006).
Segundo o Ministério da Saúde do Brasil, de 1990 a 2014, das notificações de LV em humanos, 61,21% ocorreram na região Nordeste (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
Figura 4. Mapa de distribuição mundial da leishmaniose visceral (OMS, 2015). A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é hoje uma das mais importantes doenças de cães importados da Europa Central. As estimativas de soroprevalência da leishmaniose canina relatada para a região da Espanha, por exemplo, é de 3,7% para a província de Orense, no canto noroeste do país, e 34,6% para a província de Málaga, na costa sul (MIRÓ et al., 2013).
No Brasil a LVC foi notificada em 19 das 27 unidades da federação, com aproximadamente 1.600 municípios apresentando transmissão autóctone. Na América Latina, a LVC já foi descrita em 12 países, sendo que 90% dos casos ocorrem no Brasil. No país, há expansão e urbanização da leishmaniose visceral com grande número de cães positivos em várias cidades de grande e médio porte (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011).
Em inquéritos censitários em quatro localidades do Distrito Federal foi observada diferença de prevalência em relação a diversas localidades, assim como em relação à idade e à presença ou ausência de sinais clínicos, nesse trabalho nota-se que a LVC aprenota-senta como maiores fatores de risco, a localidade, a idade e a presença de alterações clínicas, sendo assim, o conhecimento obtido sobre a prevalência da leishmaniose em cães foi um dos parâmetros usados para estabelecer estratégias para ações de controle da doença (NASCIMENTO, 2011).
1.5 As Leishmanioses
1.5.1 Leishmaniose Tegumentar
Leishmaniose tegumentar (LT) é um conjunto de enfermidades causadas por várias espécies de Leishmania, que acometem a pele e/ou mucosas do ser humano, e de diferentes espécies de animais silvestres e domésticos das regiões tropicais e subtropicais do Velho e Novo Mundo (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).
A LT é classificada de acordo com sua distribuição geográfica em leishmaniose tegumentar do Velho Mundo e leishmaniose tegumentar do Novo Mundo (leishmaniose tegumentar americana - LTA). As espécies de Leishmania envolvidas na sua ocorrência são diferentes, assim como as espécies de hospedeiros que as abrigam e as de insetos vetores que as transmitem. A LT é a forma mais comum de leishmaniose e provoca lesões de pele, úlceras, principalmente sobre as partes expostas do corpo, deixando cicatrizes ao longo da vida e deficiência grave (OMS, 2014).
No Brasil, a LTA é uma afecção dermatológica que merece atenção, principalmente pelo risco de ocorrência de deformidades que pode produzir no ser humano, com envolvimento psicológico, com reflexos no campo social e econômico, uma vez que, pode ser considerada uma doença ocupacional. A doença manifesta-se de diferentes formas clínicas, mas normalmente inicia-manifesta-se na pele e, dependendo da resposta imune do hospedeiro e da espécie infectante, ela pode ficar limitada ao local da inoculação do parasito, ou atingir novos locais na pele e nas mucosas do nariz, orofaringe e laringe (MOURA, 2013).
A LTA pode se apresentar de forma cutânea, mucocutânea ou disseminada. A leishmaniose cutânea é a forma mais comum no Brasil e é caracterizada pela formação de uma ou mais lesões ulceradas, de bordas elevadas, de cor avermelhada, que podem ser recobertas por secreção serosa ou seropurulenta (graças à contaminação secundária por bactérias e leveduras), é comumente limitada a uma ou mais úlceras de pele frequentemente encontradas em membros, pavilhões auriculares e rosto. No local da inoculação, forma-se uma mácula, pápula ou nódulo que pode estar coberta por crosta, após a remoção da crosta expõe o aspecto ulcerado típico. Os pacientes raramente se queixam de dor (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010). A L. amazonensis produz lesões cutâneas únicas
ou em mais números. Não produz lesões mucosas, mas pode causar a leishmaniose cutânea difusa ou a forma disseminada da doença em indivíduos imunossuprimidos (FERREIRA, 2014).
A leishmaniose cutânea difusa (LCD) tem a L. amazonensis como a única espécie considerada responsável pela forma clínica no Brasil. A LCD se complica quando os pacientes não apresentam uma resposta satisfatória ao tratamento com antimoniais (LAINSON, 2010)
A leishmaniose mucocutânea é a complicação mais severa da LTA, afetando principalmente as mucosas da boca, nariz e faringe, sendo secundária a lesão cutânea. Acredita-se que a lesão mucosa ocorra por disseminação hematogênica ou linfática. Geralmente surge após a cura clínica da leishmaniose cutânea de evolução crônica e curada sem tratamento ou com tratamento inadequado (OMS, 2015).
A leishmaniose disseminada é uma forma emergente da leishmaniose. Tem sido descrita no Brasil, nas regiões Norte e Nordeste, e seu principal agente etiológico é a espécie L. braziliensis (SILVEIRA et al., 2005). Caracteriza-se pela presença de múltiplas lesões de pele, ulceradas ou não, encontradas simultaneamente em duas ou mais áreas do corpo do paciente. As lesões se distribuem, principalmente, na face e nos membros superiores. A doença ocorre em indivíduos sem distúrbio imunológico aparente; no entanto, a resposta imunitária específica parece estar retardada, pois cerca de 30% dos doentes apresenta teste Montenegro negativo, as lesões mucosas podem surgir junto com as lesões cutâneas meses ou vários anos depois de as lesões cutâneas já terem cicatrizado (CALVOPINA, 2004). É importante diferenciar a leishmaniose disseminada da forma cutânea difusa, caracterizada pela presença de várias lesões nodulares não ulceradas e por uma resposta imune celular muito pobre, geralmente associada a uma imunodepressão do hospedeiro ( MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).
No Brasil a L. braziliensis e a L. amazonensis são as espécies mais amplamente distribuídas (GRIMALDI JR., 1987).
1.5.2 Leishmaniose Visceral
A leishmaniose visceral é causada, nas Américas, pela espécie L. infantum e tem como característica, em humanos, lesões viscerais, causando principalmente esplenomegalia, hepatomegalia e afecções em medula óssea levando a distúrbios hematopoiéticos, chegando a ser fatal, principalmente em crianças e imunodeprimidos, se não tratados. É caracterizada por acessos irregulares de febre, perda de peso, aumento de volume do baço e fígado e anemia (MINISTERIO DA SAUDE, 2003). Suas características clínicas, histopatológicas e imunológicas dependem da virulência do protozoário infectante e da suscetibilidade do hospedeiro (QUEIROZ et al., 2004)). Caso não seja feito diagnóstico e tratamento adequado a doença evolui para desnutrição, pele seca e cabelos opacos e quebradiços, edema de membros, ascite, icterícia, hemorragias (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003). Na leishmaniose visceral, células fagocíticas se multiplicam e abrigam grandes quantidades de amastigotas, resultando em aumento de volume e disfunção dos órgãos. Ela é geralmente observada como uma doença debilitante e crônica, com linfoadenopatia e anemia. Há infiltrado de formas amastigotas em diferentes órgãos como fígado, baço, linfonodo, medula óssea, tendo sido encontradas inclusive no cérebro de hospedeiros (OLIVEIRA et al, 2012).
O desenvolvimento da leishmaniose está diretamente relacionado a competência imunológica do hospedeiro. Os linfócitos T desempenham papel importante na resistência ou persistência da Leishmania no hospedeiro e na progressão da infecção ou na cura clínica, pois essas células são capazes de mediar resposta celular e humoral, regulam a produção de citocinas e de anticorpos. De um modo geral, a população de linfócitos TCD4+ subdivide-se em duas populações: Th1, que secreta IL-2, IFN- e
TNF-mediada por células, contribuindo para resolução da infecção, e Th2, que secreta IL4, IL5 e IL10, relacionada à resposta mediada por anticorpos, não protetora no caso da leishmaniose, fazendo com que haja progressão da infecção (CORRÊA, 2011).
1.5.3 Leishmaniose Visceral Canina
A L. infantum tem, no Brasil, como reservatórios na área urbana, o cão e na região silvestre principalmente as raposas (Dusicyon vetulus e Cerdocyon thous) e os marsupiais (Didelphis albiventris) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011).
Nos países onde a LV é zoonótica, como é o caso do Brasil, os cães desempenham papel fundamental na epidemiologia, sendo considerados os principais reservatórios para a doença humana, principalmente devido à riqueza de formas amastigotas na pele do animal (ALVAR et al. 2004). A detecção precoce de cães infectados é fundamental para impedir a expansão da doença e é essencial para o seu controle (MAIA, 2008).
As lesões em cães podem ser classificadas em três formas: grave, oligossintomática e assintomática, sendo essa a forma de maior importância para a saúde pública devido a manter os parasitos ativos no ciclo da infecção humana (DANTAS-TORRES et al., 2006) . Os sintomas são variados, inespecíficos e incluem a linfadenopatia generalizada, perda de pêlos ao redor dos olhos, nariz, boca e orelhas, lesões de pele com ou sem descamações e às vezes úlceras, perda de apetite ocasionando depressão e emagrecimento, ornicogrifose dificultando a sua locomoção, febre, distúrbios de coagulação, lesões renais, hepáticas e lesões oculares (ALMEIDA et al., 2005).
A infecção no cão está associada a um aumento nos níveis de anticorpos específicos e ausência de resposta mediada por células. As alterações patológicas na leishmaniose visceral canina são causadas tanto pela ação direta do parasito nos tecidos, levando à formação de lesões inflamatórias não supurativas, quanto pela deposição de imunocomplexos em vários órgãos e tecidos, principalmente no fígado, baço e rins. Apesar da grande diversidade de manifestações clínicas, existem animais aparentemente saudáveis e aqueles que exibem sinais característicos de estágios finais da doença. Um fato importante é que a doença canina pode permanecer clinicamente inaparente por longos períodos (SILVA, 2009).
Inicialmente os parasitos estão presentes no local da picada infectiva, na pele, posteriormente ocorre a infecção das vísceras e novamente a distribuição na pele (MINISTERIO DA SAUDE, 2003). Em um trabalho visando estudar as alterações fibróticas causadas pela LVC foi observado através de análise histológica, deposição de fibras colágenas preferencialmente em fígado, pulmões, rins, em
linfonodos cervicais e baço, caracterizando um quadro de fibrose sistêmica associada ao parasitismo tecidual e a processos degenerativos e inflamatórios (SILVA, 2010).
1.6 Prevenção e controle das leishmanioses
Como medidas preventivas para o homem e a população canina, o Ministério da Saúde no Brasil recomenda o uso de medidas de proteção pessoal com uso de repelentes, saneamento ambiental, controle da população canina errante, uso de telas em canis individuais e coletivos, uso de coleiras impregnadas com deltametrina a 4% em cães (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011).
Devido às características epidemiológicas, as estratégias de controle da leishmaniose ainda são pouco efetivas e estão centradas no diagnóstico e tratamento precoce dos casos em humanos, redução da população de flebotomíneos, eliminação dos reservatórios e atividades de educação em saúde. Para controle do vetor o governo local pode recorrer ao controle químico, com borrifação de cipermetrina e deltametrina, sabendo, porém, que é dirigido apenas para o inseto adulto e tem como objetivo reduzir o contato entre o inseto transmissor e a população. A eutanásia de cães é recomendada a todos os animais sororeagentes e ou parasitológico positivo. As orientações de educação sanitária visam esclarecer a população sobre as ocorrências de casos no local, sinais clínicos, medidas de diagnóstico e tratamento e também capacitar equipe de profissionais da saúde (MINISTERIO DA SAUDE, 2014).
Não há vacinas para leishmanioses em humanos, mas atualmente, existem duas vacinas contra a leishmaniose visceral canina, registradas no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento e comercializadas no Brasil: a vacina Leish-tec® da marca Hertape Calier Saúde Animal S.A. e a vacina Leishmune® da marca Zoetis Indústria de Produtos Veterinários Ltda. ( BORJA-CABRERAA, 2008) que teve a licença suspensa temporariamente em 2014. O Ministério da Saúde preconiza a eutanásia de animais soro-reagentes, mesmo vacinados, que porventura sejam encontrados nas áreas de transmissão, em que os inquéritos caninos estejam em andamento (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
1.7 Diagnóstico das leishmanioses
O diagnóstico das leishmanioses é feito por exame clínico e laboratorial dos pacientes, tais como exame parasitológico direto, teste intradérmico, exames sorológicos (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA e Reação de Imuno Fluorescência Indireta, RIFI), imuno-histoquímica, reação em cadeia da polimerase (PCR), acompanhado por hemograma e bioquímica sérica para acompanhamento de reações inespecíficas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).
Em cães, são empregados o exame parasitológico direto e as técnicas sorológicas. Os testes de RIFI e ELISA são os ensaios sorológicos recomendados pelo Ministério da Saúde para estudos de soroprevalência em inquéritos caninos amostrais e censitários. Para áreas não endêmicas, o Ministério da Saúde indica o exame parasitológico direto como método confirmatório para cães com sorologia positiva em virtude de sua elevada especificidade (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). O diagnóstico da leishmaniose visceral canina ainda enfrenta sérios desafios. O diagnóstico clínico da LVC é precário e complexo, pois os sinais clínicos da doença são variáveis e inespecíficos, comuns a outras enfermidades que acometem o cão, a imunossupressão causada pela Leishmania pode gerar infecções oportunistas, dificultando do mesmo modo o diagnóstico dessa parasitose, por esse motivo foi mostrada a vantagem do uso da PCR como método diagnóstico na leishmaniose visceral canina, porém a PCR ainda não é comumente utilizada como medida diagnóstica pelo Ministério da Saúde (COSTA et al., 2015).
1.8 Tratamento das leishmanioses em humanos
O tratamento da leishmaniose foi introduzido pelo médico brasileiro Gaspar Vianna, em 1912, com o uso do tártaro emético, antimonial trivalente; atualmente o antimonial pentavalente é o fármaco de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses no Brasil (LIMA et al., 2007). O Glucantime® (antimoniato de N-metil glucamina) possui algumas desvantagens como alto custo, difícil administração e alta toxicidade, podendo desencadear vários efeitos colaterais como artralgia, mialgia, cefaléias, distúrbios gastrointestinais, alterações eletrocardiográficas, renais, hepáticas, erupção cutânea, entre outros. Além dos efeitos adversos, tem se observado com frequência um aumento na incidência de
insucesso, recidiva e resistência ao tratamento (AMATO, 2006). Os antimoniais pentavalentes parecem atuar no mecanismo bioenergético das formas amastigotas da Leishmania, por meio de glicólise e beta-oxidação, que ocorrem nas organelas denominadas glicossomas. Outro mecanismo proposto é o de ligação do composto com sítios sulfidrílicos, levando a morte destes protozoários (BERMAN, 1997). A estrutura molecular dos antimoniais, seu metabolismo e mecanismo de ação ainda estão sendo investigados. Há estudos do desenvolvimento de formulações à base de lipossomas e formulações à base de ciclodextrina para promover a distribuição oral de antimónio (FRÉZARD et al., 2009).
Outros medicamentos como a anfotericina B, paromomicina, isotionato de pentamidina e a miltefosina, têm sido utilizados sozinhos ou combinados, como opções de tratamento das diversas formas de leishmanioses em humanos (OMS, 2014).
A anfotericina B é uma opção no tratamento de leishmaniose em gestantes e em pacientes que manifestem toxicidade ou refratariedade relacionada ao uso dos antimoniais pentavalentes. É a droga leishmanicida mais potente disponível comercialmente, com ação nas formas promastigotas e amastigotas. Atualmente, duas apresentações de anfotericina B são disponibilizadas pelo Ministério da Saúde: o desoxicolato de anfotericina B e a anfotericina B lipossomal, com eficácias comparáveis, sendo que esta última apresentou menor toxicidade (MINISTERIO DA SAUDE, 2010). O mecanismo de ação da anfotericina B está baseado na ligação do fármaco ao ergosterol da membrana celular da Leishmania. A ligação ao ergosterol provoca uma desorganização estrutural na membrana, formando poros que alteram sua permeabilidade ao potássio intracelular, acarretando em morte do parasito por lise osmótica. Nos mamíferos, a anfotericina B se liga ao colesterol da membrana celular, o que parece estar relacionado aos efeitos adversos do fármaco (BANETH, 2002).
A paramomicina ou aminosidina é um antibiótico aminoglicosídeo, possui um amplo espectro de ação incluindo atividade contra protozoários, bactérias (SUNDAR et al., 2007) e cestódios (WITTNER M et al., 1971). A aplicação de uma formulação tópica de baixa toxicidade surge como uma possibilidade para auxiliar contra a leishmaniose cutânea. No entanto, apesar desta opção ter sido avaliada há
muitos anos, seu uso clínico ainda não foi consagrado, devido aos resultados variáveis (CARNEIRO, 2007).
O isotionato de pentamidina é um derivado sintético da amidina e é efetivo contra aguns protozoários patogênicos. O seu mecanismo de ação se dá por inibição de diferentes processos celulares ainda não elucidados inteiramente. Em estudo realizado em 2011 para avaliar a eficácia e segurança dos esquemas de tratamento na leishmaniose tegumentar ocasionada por L. guyanensis, foi visto que a pentamidina possui eficácia similar ao antimonial pentavalente tendo como principais efeitos colaterais dor ou enduração (OURIVES-NEVES et al., 2011).
A miltefosina é uma alquilfosfocolina, originalmente desenvolvida para o tratamento de metástases cutâneas em carcinomas mamários; posteriormente, foi testada no tratamento da LV através de uma iniciativa da Organização Mundial da Saúde (OMS, 2010). Foi o primeiro fármaco de uso oral utilizado no tratamento da LV. Os mecanismos de ação ainda não estão bem esclarecidos, mas sabe-se, que é capaz de bloquear a síntese e alterar a composição da membrana plamática do parasito (AMATO, 2006). Apresenta efeitos adversos ligados ao trato gastrointestinal como vômitos e diarréia além de teratogenicidade e potencial para desenvolver resistência (SEN & CHATTERJEE, 2011). Em 2008, Campos et al. testaram a ação leishmanicida e sua eficácia no tratamento oral da leishmaniose cutânea experimental, mostrando ação similar a do antimonial pentavalente (CAMPOS et al., 2008).
Outros fármacos têm sido utilizados no tratamento das leishmanioses, incluindo antifúngicos como os imidazóis, purinas (alopurinol) (CROFT, 2006), o imiquimod (agente imunomodulador), sitamaquine, o medicamento anticancerígeno tamoxifeno entre outros (MIGUEL, 2008) . Mas as avaliações do sucesso terapêutico indicam respostas variadas conforme o local de incidência e espécies de Leishmania envolvidas, sendo assim, se torna emergente o uso de terapias combinadas na busca de novas alternativas de tratamento contra leishmaniose (MIGUEL, 2010).
1.9 Medicamentos usados na leishmaniose visceral canina (LVC)
Os principais fármacos utilizados no tratamento da LVC nos locais onde é permitido o tratamento de cães são os antimoniais, o desoxicolato de anfotericina B
convencional ou encapsulada em lipossomas, aminosidina, alopurinol, pentamidina e, recentemente, miltefosina, porém os cães mostram efeito variável às terapias (SILVA, 2009).
Cães tratados com antimoniato apenas, ou em combinação com alopurinol, tiveram em um estudo recente, melhora no quadro clínico e redução dos parasitos da pele, diminuindo a infectividade aos flebotomíneos e, como consequência, a transmissão do parasito (MIRÓ et al,2005). Verificou-se que em cães infectados naturalmente e tratados exclusivamente com alopurinol, apesar da melhora clínica, apresentaram recidiva da doença, mas nenhuma evidência de disseminação do parasito na pele. Esta descoberta tem importantes implicações epidemiológicas, pois indica que o alopurinol apesar de não ser um tratamento eficaz, pode ser usado como tratamento de manutenção por tempo prolongado (6-12 meses), evitando a disseminação da leishmaniose a flebotomíneos (MIRÓ et al., 2011).
No Brasil, o Ministério da Saúde ainda não reconhece essas e outras formas de tratamento propostas até o momento como seguras, já que ainda é preciso se certificar de que esses animais tratados não se tornem portadores sãos, causando a disseminação da leishmaniose em humanos, após a supensão do tratamento. É necessária a pesquisa de novas fontes de tratamento seguro aos cães para que possam ser aprovadas para uso clínico. O uso de farmácos para tratamento da leishmaniose humana, segundo recomendações do Ministério da Saúde, está proibido para cães no Brasil. O objetivo é também evitar resistência do parasito (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
1.10 Produtos Naturais
Muitas das substâncias produzidas pelo metabolismo secundário das plantas possuem propriedades biológicas importantes diretamente envolvidas nos mecanismos de adaptação da planta ao seu meio, tais como defesa contra herbívoros e microrganismos, proteção contra raios UV, atração de polinizadores ou animais dispersores de sementes (FUMAGALI et al., 2008). Muitas vezes, os mesmos metabólitos secundários, tais como alcalóides, terpenóides e flavonóides que podem destruir agentes invasores nas plantas podem oferecer alternativas de tratamento contra doenças em animais e humanos, tais como a leishmaniose. Os
estudos químicos e imunofarmacológicos têm sido realizados com o intuito de encontrar novos compostos menos tóxicos, economicamente mais viáveis, de efeito específico e que reverta a resistência do parasito às drogas (BEZERRA, 2006).
Aproximadamente 25% dos medicamentos prescritos nas farmácias americanas possuem extratos vegetais em sua composição, no Brasil esse segmento corresponde a 7% do mercado terapêutico. Consequentemente, o consumo mundial de plantas medicinais e seus produtos têm gerado interesses em estudos científicos que confirmem suas propriedades farmacológicas (SIMÕES, 2001). A associação entre conhecimento popular de plantas com potencial farmacológico e a busca de compostos bioativos para a produção de novos fitoterápicos é importante para a descoberta de medicamentos mais efetivos no tratamento de diversas patologias, além de fornecer subsídios para a implantação de políticas públicas de conservação da biodiversidade de alguns gêneros botânicos do país. O interesse internacional nas plantas medicinais do Brasil é grande devido à vasta biodiversidade e a intensidade do uso popular de plantas (BRANDÃO et al., 2006).
As espécies vegetais são a melhor e maior fonte de fármacos para a humanidade (BEZERRA et al., 2006). Plantas usadas tradicionalmente pelas populações de locais endêmicos no tratamento de doenças parasitárias têm sido pesquisadas com o objetivo de se avaliar as atividades dos extratos e derivados. O primeiro critério para se avaliar novas alternativas para o tratamento da leishmaniose ou outras parasitoses é a obtenção de melhor eficácia com menor efeito colateral, quando comparadas aos tratamentos usados na clínica (VILA-NOVA, 2008). Com esse objetivo têm sido pesquisadas plantas e seus derivados, contendo especialmente em seus princípios ativos, chalconas, flavonóides, saponinas, quinonas, lignanos, tanino, alcalóides, terpenóides e oxilipinos (CHOUDHURY et al., 2011). Sucessos obtidos nessas pesquisas têm como exemplo, desde o início do século XVII, o tratamento da malária com quinina e da amebíase com emetina obtidas da Cinchona e Cephalis, respectivamente, e mais recentemente a artemisina, obtida da Artemisia, contra o Schistosoma mansoni (CORREA, 2015) .
As propriedades leishmanicidas de plantas do Cerrado brasileiro foram avaliadas por Lima et al., realizando-se ,primeiramente, um levantamento etnobotânico na região e sete espécies vegetais com as indicações terapêuticas
para antibiótico, antiinflamatório, analgésico, antiofídico e cicatrizante foram encontradas, sendo feitos extratos hidroalcoólicos das plantas e em seguida foram testadas quanto a sua atividade anti-promastigotas de L. amazonensis. Os vegetais estudados foram: Terminalia fagifoli (Cachaporra do Gentio), Vellozia squanata (Canela de Ema), Vochysia haenkeana (Pau Amarelo), Siparuna guianensis (Erva de Rato), Lafoensia pacari (Dedaleiro), Galactia glauscecens (Favinha do campo) e Plathymenia reticulata (Candeia). A IC 50 foi calculada em relação às culturas não tratadas. Verificou-se a presença de flavonóides, triterpenoides, esteróides e taninos que, são responsáveis pela atividade leishmanicida (LIMA et al., 2015).
Em outro estudo, foi demonstrada a atividade leishmanicida de extratos de macroalgas sobre o crescimento de promastigotas de L. amazonensis. Dez extratos diferentes foram testados e todos eles inibiram o crescimento dos parasitos e apresentaram baixa toxicidade para células de mamíferos, inibindo também o desenvolvimento das formas amastigotas no interior de macrófagos (ALIANÇA, 2012).
Em nosso laboratório Ayres et al. testaram algumas variedades de própolis brasileiras na leishmaniose experimental cutânea e no parasito L. amazonensis e a eficácia da terapia da oxigenação hiperbárica (HBO), aplicada em combinação ou não com o tratamento com glucantime, durante a infecção com Leishmania amazonensis. A linhagem murina susceptível, BALB/c, infectada no dorso com L. amazonensis, tratada com glucantime e exposta a HBO, mostrou durante o curso da doença, fases em que as lesões eram menores do que a de camundongos apenas tratados com glucantime; observou-se revascularização da pele da lesão e baixa produção de interferon-gama em células de linfonodos desses animais. O tratamento com propaina gerou lesões menos exsudativas em animais tratados com propaina ou propaina combinada ao tratamento com glucantime. Os resultados demonstram que tanto HBO como a própolis vermelha em combinação com glucantime, são promissoras no tratamento da leishmaniose cutânea (AYRES et al., 2011).
Em trabalho de revisão realizado por Gil et. al. foram relacionadas algumas plantas, suas famílias, distribuição geográfica, parte utilizada, tipos de extratos mostrando serem opções terapêuticas tradicionais e atuais, cuja atividade leishmanicida pode conduzir ao desenvolvimento de novos fármacos. Dos
compostos isolados observou-se um predomínio de alcalóides, triterpenos, sesquiterpenos, lactonas, quinóides, flavonóides, dentre outros. Através desta revisão bibliográfica verificou-se a necessidade de medicamentos mais eficazes para tratamento de leishmaniose além de outras patologias, o que se agrava ainda mais com os mecanismos de resistência aos fármacos em uso, assim sendo, o uso de extratos de plantas e de produtos naturais leishmanicidas, além de compostos purificados de plantas, representa uma excelente estratégia para busca de novas drogas para tratamento de leishmaniose. A exploração sustentável de nossa biodiversidade, com base na etnofarmacologia e medicina popular é um campo ainda vasto e muito promissor (GIL et al., 2009).
1.10.1 Óleo de Copaifera
As árvores de copaíba (Figura 5) são comuns na América Latina e África Ocidental, sendo encontradas no Brasil, nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e Amazônica. Elas chegam a viver 400 anos e têm como característica sua casca aromática, folhagem densa, flores pequenas e frutos secos, do tipo vagem com sementes pretas e ovóides ricas em lipídeos (PIERI et al., 2009)). Do tronco da árvore é extraído um óleo-resina através de perfuração (Figura 5 B). O óleo tem a cor que pode variar de amarelo a marrom, dependendo da espécie (Figura 6). O óleo de copaíba é uma resina líquida rica em sesquiterpenos e diterpenos. Sua fração volátil é composta por sesquiterpenos, enquanto a fração resinosa é composta por diterpenos (CASCON & GILBERT, 2000).
A B C D Figura 5. A) semente de copaíba com broto, B) detalhe circundado em vermelho de orifício que é usado para a coleta do óleo de copaíba (com tampão), C) árvore de copaíba na floresta e D) copa da árvore de copaíba com flores (fotos da autora).
Figura 6. Aspecto macroscópico do óleo de copaíba (foto da autora).
O óleo de copaíba em temperatura ambiente tem consistência líquida, com aroma forte e sabor amargo (VEIGA JR. e PINTO, 2002). Ele apresenta uma grande variabilidade em sua composição química, tendo sido identificados 72 sesquiterpenos e 27 diterpenos; o ácido copálico é o único diterpeno encontrado em todos os óleos analisados, razão pela qual é sugerida sua utilização como marcador biológico de óleos de copaíba (RIGAMONTE-AZEVEDO et al., 2004).
Na região do Acre, são encontradas principalmente as espécies de copaíba C. paupera e C. reticulata (MARTINS-DA-SILVA et al., 2008). O óleo de C. reticulata apresenta aspecto líquido, fino, odor fraco e de coloração amarelo-dourada com viscosidade muito variável (18 a 187 Pa-s) e densidade média de 0,975±0,049 g/ cm3 (SILVA et al., 2012).
No ano de 1972, o Food and Drug Administration, órgão norte-americano regulamentador de drogas, aprovou o óleo de copaíba, após ser submetido a testes (VEIGA JUNIOR E PINTO, 2012).
A principal propriedade terapêutica entre as citadas na literatura é a atividade antiinflamatória, com principais componentes responsáveis os hidrocarbonetos, sesquiterpênicos, especialmente o -bisaboleno e -cariophileno. A utilização do óleo de copaíba sobre as bactérias formadoras de placa dental foi comprovada recentemente em estudo realizado em cães, tendo sido obtido ao final do período experimental, redução significativa da formação da placa dental nos animais com a utilização de solução a base do fitofármaco e a ação antimicrobiana do óleo de copaíba, sobre a bactéria Streptococcus pyogenes, causadora de inflamações de garganta, obtendo resultados positivos na inibição do crescimento deste microrganismo (PIERI et al., 2009).
O ácido caurenóico, um diterpeno caurânico isolado do óleo de copaíba, mostrou-se ativo in vitro contra formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi. Uma ação lítica sobre os eritrócitos foi uma das limitações encontradas para esta atividade (VIEIRA, 002).
Recentemente foi demonstrado efeito leishmanicida do óleo resina de C. reticulata, semelhante ao da anfotericina B, em L. infantum (RONDON et al., 2012). Em análise de frações do óleo de copaíba (ácidos diterpênicos) todas as frações avaliadas tiveram atividade contra amastigotas e promastigotas de L. amazonensis, sendo mais efetivas em amastigotas (SANTOS et al., 2013).
Vale ressaltar que nos trabalhos acima citados usando óleo de copaíba em Leishmania, foram utilizados métodos de emulsificação contendo etanol ou dimetil sufoxido (DMSO) ou os óleos não foram emulsificados, ficando em suspensão nos meios de cultura.
1.10.2 Óleo de Carapa guianensis
A árvore Carapa guianensis (Figura 7) conhecida popularmente como andiroba, andiroba-saruba, iandiroba, carapa e nandiroba pertence à família Meliaceae. O termo andiroba é derivado da língua indígena onde iand significa óleo e rob amargo (Silva,2011).
A B C D E
Figura 7. A) semente e broto da árvore de andiroba;, B) árvore jovem de andiroba na floresta amazônica (5 anos) seta; C) castanha; D e E) castanha com semente de andiroba ( fotos da autora, Rio Branco, AC).
O gênero Carapa tem duas espécies, C. procera e C. guianensis. A C. guianensis ocorre em toda a região Amazônica, em várzeas secas e alagadiças, beiras de rios e igarapés do Pará até a Bahia (LORENZI, 2002). A madeira é moderadamente pesada, dura e pouco resistente às tempestades, porém é inatacável por insetos, sendo bem utilizada na construção civil (EMBRAPA, 2002). A árvore floresce duas vezes ao ano, agosto e setembro, janeiro e fevereiro, já os frutos amadurecem em junho e julho, fevereiro e março. Possui sementes vermelhas, coriáceas, convexas, angulosas e achatadas lateralmente (Figura 7 E). Além de não ser destrutiva, como no caso da indústria madeireira, a coleta das sementes demanda um pequeno investimento e os subprodutos provenientes do óleo, como sabonetes e velas, são revendidos em feiras livres do norte do país, tendo um grande impacto na economia de alguns estados da região. O óleo é comercializado para diversas regiões do país e exportado principalmente para
indústria de cosméticos na França, Alemanha e Estados Unidos (GONÇALVES, 2001).
A produção de uma árvore de andiroba pode variar de 50 a 200 Kg de semente por ano. As sementes quando acondicionadas em sacos plásticos permanecem viáveis por um longo período, até sete meses, desde que mantidas em câmara úmida (14ºC e 80% de Umidade Relativa - UR) ou câmara seca (12ºC e 30% de UR) (MIRANDA JÚNIOR, 2010).
O óleo de andiroba (Figura 8) pode ser extraído de duas maneiras, uma artesanal e outra industrial e a composição química varia conforme o método de extração. A extração de óleo de andiroba feita por método manual é utilizada pelas comunidades indígenas e caboclas da Região Norte, este processo depende da fermentação da semente cozida, seu descascamento e do lento escorrimento de óleo da massa obtida (EMBRAPA, 2002).
Figura 8. Aspecto do óleo de andiroba com diferença de cor devido a formas de extração diferentes e no fundo do frasco (seta) depósito da fração insaponificável (foto da autora, amostras na FUNTAC).
O óleo é constituído principalmente de ácido palmítico, oléico (cerca de 50%) e linoleico, além de uma fração insaponificável (Figura 8) (2 a 5%) constituída principalmente de substâncias amargas, chamadas meliacinas ou limonóides, que provavelmente são responsáveis pela atividade biológica do óleo (SILVA, 2011). Os limonóides gedunina, andirobina e epoxiazadiradiona isolados desta espécie apresentam importantes atividades biológicas: antiinflamatória (FERRARI, 1998), repelente de insetos (MENDONZA et al., 2007) e anti-tumor (CHICARO, 2009). O óleo de andiroba é utilizado popularmente para o tratamento de doenças febris,
malária (PEREIRA et al., 2014), como repelente para insetos, coceiras, cicatrizantes, antiinflamatório e traumatismos (MENDONZA e FERRAZ, 2007). Ferrari et al.(2007) investigaram uma suposta atividade fotoprotetora de emulsão do óleo de andiroba, fundamentados nos conhecimentos populares. O óleo de andiroba e uma fração purificada rica em limonóides são tóxicos para o Plasmodium falciparum, uma das espécies causadoras da malária (MIRANDA JUNIOR, 2010). Baldissera et al. demonstraram que o óleo de andiroba, copaíba e aroeira são tóxicos para Trypanosoma evansi (BALDISSERA et al., 2014). Não há relatos, até o presente, dos efeitos do óleo de andiroba em Leishmania.
1.11 Tratamentos com a Câmara Hiperbárica (HBO)
A Câmara Hiperbárica é um equipamento utilizado para terapia que permite manter a pressão interna constante ou controlada. Trata-se de um compartimento selado, para onde é bombeado oxigênio, ar comprimido ou mistura respiratória, por meio decompressores. Medicina Hiperbárica é o ramo da medicina responsável pelo estudo e implantação das normas técnicas e de segurança em ambientes pressurizados. É também responsável pelo estudo e estabelecimento de protocolos de tratamento para todas as patologias para as quais o oxigênio sob pressão tem a função de auxiliar no tratamento (FERNANDES, 2009). A primeira câmara hiperbárica foi construída na Europa em 1662 pelo padre inglês Henshaw. O destaque ao oxigênio (O2), se deu em 1774, pelo cientista inglês Joseph Priestley (MARCONDES e LIMA, 2003).
Atualmente a oxigenioterapia hiperbárica é um método terapêutico adjuvante empregado em patologias infecciosas inflamatórias e isquêmicas (LEWIS,1999). O O2 hiperbárico é bactericida quando usado isoladamente. Entretanto, essa função requer a exposição bastante prolongada a esse gás e sob pressões bastante elevadas, o que é viável nos laboratórios, mas ainda não no tratamento clínico dos seres humanos (WILLERS, 2015). Meltzer comprovou o aumento da angiogênese, com melhora da cicatrização tecidual quando ratos eram submetidos ao hiperbarismo (MELTZER, 1986).
O nosso grupo de pesquisa demonstrou que lesões cutâneas murinas causadas por L. amazonensis são hipóxicas, provavelmente devido ao prejuízo da microcirculação no tecido, demanda metabólica, proliferação dos parasitos e
infecção bacteriana secundária (VIEIRA, 2012). Em trabalho também realizado em nosso laboratório, foi demonstrado que a HBO (Figura 9) tem efeito tóxico e irreversível em amastigotas e promastigotas e reduz a infecção em culturas de macrófagos (ARRAIS-SILVA et al., 2005).
Figura 9. Câmera hiperbárica modular para uso em pequenos animais. Laboratório de Leishmaniose, Depto. de Biologia Animal, IB, Unicamp. (foto da autora).
1.12 Leishmaniose experimental
Os modelos murinos têm sido amplamente utilizados para entender melhor o ciclo de vida do parasito, o processo de infecção e a relação parasito-hospedeiro. Diferentes linhagens de camundongos inoculados com L. donovani e L. infantum apresentam cargas parasitárias variadas. Camundongos BALB/c são suscetíveis e apresentam visceralizacão pricipalmente em baço e fígado havendo diferença entre as cargas parasitárias encontradas nos dois órgãos, sendo maior em fígado na fase inicial da infecção (30 dias) e havendo controle da infecção neste órgão após o período de 60 dias e há aumento da carga parasitária em baço comparado com fígado após os 60 dias (CORRÊA, 2011).
Em relação aos modelos experimentais para a L. amazonensis existem duas linhagens murinas muito estudadas, camundongos C57BL/6, que controlam a infecção e os BALB/c, suscetíveis ao parasito. Na grande maioria dos trabalhos inocula-se L. amazonensis pela via subcutânea, no coxim plantar de uma das patas traseiras e os animais são acompanhados semanalmente através de medição das patas e na conclusão do experimento os animais são sacrificados e a carga parasitária contada através de câmara de Neubauer (ARRAIS-SILVA et al., 2006).
Os sistemas in vitro são úteis na avaliação de compostos com atividade biológica que determine citotoxicidade e atividade leishmanicida. O macrófago é a célula mais diferenciada do sistema mononuclear fagocitário (VAN FURTH et al.,
1972) e extremamente efetivo na primeira linha de defesa imunológica e homeostasia do organismo. Esta célula é ativada após contato com patógenos ou moléculas provenientes desses, assim como citocinas e quimiocinas (GORDON, 2003). A grande maioria dos experimentos in vitro com leishmania é realizada com macrófagos peritoneias e de medula óssea de camundongos e macrófagos de linhagens tais como DH82 (MORAES et al, 2014), J774 (DEGROSSOLI et al., 2007). Em um estudo, utilizando-se os óleos de copaíba e andiroba, visando suas atividades antinflamatórias, foi verificada ação antineoplásica em células de linhagem originadas de carcinoma de orofaringe denominadas FaDu (ADCC) cultivadas in vitro , causando redução na proliferação dessas células porém não indução de apoptose (CHICARO, 2009), sendo assim, não consideramos viável o uso de células de linhagem para os testes das nanoemulsões de copaíba e andiroba em amastigotas intracelulares nesse trabalho de mestrado.
Na análise histopatológica, na LV, verifica-se principalmente a multiplicação de amastigotas em células mononucleares fagocíticas dos órgãos internos tais como o baço, fígado e medula óssea (OLIVEIRA et al., 1993), ocorrendo hiperplasia e hipertrofia das células. Outros órgãos como pulmões e rins também são afetados durante a progressão da infecção. Na LV experimental, causada pela L. donovani, L. infantum, a infecção hepática é geralmente autolimitante com resposta inflamatória granulomatosa, envolvendo células de Kupffer, monócitos e células TCD4+ e TCD8+ com eficiente formação de granuloma hepático, esses granulomas são importantes na eliminação de Leishmania spp. (MURRAY, 2001). O estudo da formação do granuloma hepático de cães com LVC mostrou granulomas de tamanhos variados, constituídos por macrófagos, parasitados ou não por formas amastigotas de L. infantum, algumas células epitelióides, poucos linfócitos e plasmócitos e raros neutrófilos. Cães assintomáticos apresentaram número maior de granulomas que oligossintomáticos e sintomáticos.
et al., 2007). Por outro lado, no estudo do baço de cães infectados naturalmente por L. infantum, observou-se frequência alta de periesplenites, granuloma, desorganização estrutural e atrofia de folículos linfóides e da zona marginal (SANTANA et al., 2008).
1.13 Emulsões e nanoemulsões
As emulsões são dispersões de dois ou mais líquidos imiscíveis, completamente difuso um no outro, termodinamicamente instáveis, e estabilizados cineticamente (ANSEL et al., 2000), e são compostas de água, óleo e tensoativo. A estrutura consiste em gotícula da fase dispersa envolta pela fase contínua e classificadas de: água em óleo (A/O) ou óleo em água (O/A). Um dos métodos para obtenção de emulsões é o da emulsificação direta, a fase dispersa é adicionada à fase contínua sob intensa agitação ou por um processo denominado de inversão de fases, onde se adiciona a fase que pretende ser a contínua à fase dispersa, até que a inversão ocorra e o tipo de emulsão desejada se forme (emulsão de baixo gasto de energia) (ANDRADE, 2008).
A nanoemulsão é um sistema heterogêneo composto por óleo em água ou água em dispersão de óleo com agente tensoativo, com gotículas que variam de tamanho de 20-600 nm (SOLANS, 2003). As nanoemulsões não se formam espontaneamente, sendo necessário fornecimento de energia ao sistema, podendo ser energia mecânica ou uso de propriedades fisicoquímicas do sistema (CAMARGO, 2008).
As nanoemulsões apresentam um novo e promissor sistema de veiculação para a tecnologia farmacêutica e cosmética evitando a ação da força da gravidade (instabilidades como sedimentação e cremação). Diferentes das microemulsões, que requerem uso de concentração de tensoativo superior a 20%, as nanoemulsões são obtidas usando-se concentrações bem menores de tensoativos, de 3 a 10% (OLIVEIRA, 2008).
As nanoemulsões são sitemas metaestáveis, ou seja, estáveis por um longo período de tempo, sendo esta estabilidade diretamente relacionada ao pequeno tamanho dos glóbulos, cujo movimento browniano diminui a ação da força da gravidade causando flutuação das partículas e reduzindo a instabilidade, permitindo que seja disperso em água. As dimensões das nanoemulsões permitem a maior penetração em tecidos e a esterilização é realizada utilizando-se filtros de membranas com diâmetros menores que os das bactérias (FERNANDEZ et al., 2004).
A nanotecnologia tem contribuído para o aperfeiçoamento de propriedades farmacológicas de fármacos convencionais, produzindo maior biodisponibilidade, aumentando a solubilidade de substâncias pouco solúveis, favorecendo a liberação controlada de substâncias, sendo assim, um dos materiais mais promissores da atualidade são as nanodispersões, que possuem grande potencial de aplicação em diversas áreas da indústria, incluindo a de produtos farmacêuticos (WANG et al., 2009).
As nanodispersões são formadas por sistemas micelares que por sua vez, são um conjunto de moléculas de tensoativos que se agrupam de forma espontânea gerando agregados coloidais nanoestruturados em meio aquoso com tamanho de partícula usualmente compreendido entre 30-300nm, quando utilizado como transportador de fármacos aumenta a capacidade de permanecer em circulação sistêmica por maior período de tempo, proporcionando acúmulo gradual do fármaco na área requerida e acumulação do fármaco em regiões com vascularização reduzida devido às dimensões reduzidas das partículas. A partícula em forma micelar, ainda possui a capacidade de proteger o fármaco contra possível inativação sob o efeito de um ambiente biológico, reduzindo efeitos colaterais indesejáveis, com consequente aumento da biodisponibilidade. As nanopartículas possuem a capacidade de aumentar significativamente a biodisponibilidade de substâncias lipofílicas encapsuladas dentro de suas partículas (ESDRAS, 2016).
A redução do tamanho das partículas para valores inferiores a 500nm, pode produzir uma maior absorção da substância ativa e maior captação de partículas pelo organismo, sugerindo que a absorção da nanopartículas é um fator importante na melhoria da biodisponibilidade (ACOSTA, 2009).
1.13.1 Caracterização de Sistemas Nanoestruturados
Após a obtenção de sitemas nanoestruturados, estes são submetidos a caracterização sendo investigadas as propriedades dos materiais como tamanho e distribuição de partículas, área superficial e porosidade, morfologia, estabilidade física, química e físico-química, propriedades térmicas, propriedades de superfície (carga superficial, quimica de superficie), propriedades estruturais, dentre outras, analisados quanto a propriedades físicoquímicas e de imagem (RADAIC, 2013).
