Estudo do efeito do estresse por subjugação social sobre o comportamento nociceptivo de camundongos e mecanismos neurobiológicos associados

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

MARCO ORESTE FINOCCHIO PAGLIUSI JUNIOR

ESTUDO DO EFEITO DO ESTRESSE POR SUBJUGAÇÃO SOCIAL

SOBRE O COMPORTAMENTO NOCICEPTIVO DE CAMUNDONGOS

E MECANISMOS NEUROBIOLÓGICOS ASSOCIADOS

CAMPINAS 2016

MARCO ORESTE FINOCCHIO PAGLIUSI JUNIOR

ESTUDO DO EFEITO DO ESTRESSE POR SUBJUGAÇÃO SOCIAL

SOBRE O COMPORTAMENTO NOCICEPTIVO DE CAMUNDONGOS

E MECANISMOS NEUROBIOLÓGICOS ASSOCIADOS

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestre em Biologia Funcional e Molecular. Área de concentração: Fisiologia.

CAMPINAS 2016

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO

DEFENDIDA PELO ALUNO MARCO ORESTE FINOCCHIO PAGLIUSI JUNIOR, ORIENTADA

PELO PROFESSOR DOUTOR CARLOS

AMILCAR PARADA E CO-ORIENTADA PELO

PROFESSOR DOUTOR CESAR RENATO

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972

Pagliusi Junior, Marco Oreste Finocchio,

P148e PagEstudo do efeito do estresse por subjugação social sobre o comportamento nociceptivo de camundongos e mecanismos neurobiológicos associados / Marco Oreste Finocchio Pagliusi Junior. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.

PagOrientador: Carlos Amilcar Parada. PagCoorientador: Cesar Renato Sartori.

PagDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.

Pag1. Núcleo accumbens. 2. Área tegmentar ventral. 3. Estresse psicológico. 4. Dor. 5. Fator neurotrófico derivado do cérebro. I. Parada, Carlos

Amilcar,1960-. II. Sartori, Cesar Renato,1973-. III. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Study of social defeat stress effect on nociceptive behavior in mice

and neurobiological mechanisms associated

Palavras-chave em inglês:

Nucleus accumbens Ventral tegmental area Stress, Psychological Pain

Brain-derived neurotrofic factor

Área de concentração: Fisiologia

Titulação: Mestre em Biologia Funcional e Molecular Banca examinadora:

Carlos Amilcar Parada [Orientador] Silvana Chiavegatto

Maria Andréia Delbin

Data de defesa: 04-02-2016

Programa de Pós-Graduação: Biologia Funcional e Molecular

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Carlos Amilcar Parada

Profa. Dra. Silvana Chiavegatto

Profa. Dra. Maria Andréia Delbin

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

Agradecimentos

Agradecimentos

Agradecimentos

Agradecimentos

Aos meus pais, Marco e Edna, e a minha irmã e seu marido, Flávia e Francisco, que estiveram

incondicionalmente ao meu lado em todas as escolhas de minha vida.

Ao meu co-orientador e amigo, Prof. Cesar Renato Sartori, que esteve ao meu lado durante todos

os experimentos. Muito obrigado pelo apoio e pelo incentivo.

Ao meu orientador, Prof. Carlos Amilcar Parada, pela confiança, incentivo e disponibilidade.

Aos professores que fizeram parte da banca de qualificação, Prof. Leonardo dos Reis Silveira,

Profa. Maria Andréia Delbin e Prof. Alexandre Rezende pelas considerações e sugestões.

Aos professores componentes da banca de defesa, Profa. Silvana Chiavegatto e Profa. Maria

Andréia Delbin que prontamente se disponibilizaram para ajudar.

Ao Ivan Bonet pela amizade e disponibilidade em me ajudar em diversas etapas do meu projeto.

Aos companheiros de laboratório André, Maria, Juliana, Lilian, Gilson, Amanda, Filipe, Felipe,

Luiz, Elayne, Silviane, Wilian, Fernanda, Catarine, Luara e Jalile que também se

disponibilizaram em ajudar e estiveram sempre ao meu lado durante esses anos.

Aos meus amigos e familiares, que entenderam minhas ausências e sempre estiveram presentes.

Obrigado.

Agradecimento Institucional

Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP – pela concessão da bolsa de mestrado e pelo suporte financeiro para o desenvolvimento do meu trabalho (processo 2013/09749-4).

RESUMO

PAGLIUSI JR, MOF. Estudo do efeito do Estresse por Subjugação Social Repetida sobre o comportamento nociceptivo de camundongos e mecanismos neurobiológicos associados, 2016. Embora a dor não seja um dos sintomas para diagnóstico de depressão, estudos epidemiológicos indicam uma estreita associação entre transtorno depressivo e dor crônica. Isto é evidenciado por observações clínicas onde pacientes com depressão possuem altas taxas de prevalência de dor crônica e, ao mesmo tempo, pacientes que sofrem de dor crônica também são constantemente diagnosticados com transtornos depressivos. Diversas características clínicas e biológicas são compartilhadas entre dor e depressão, entre elas estão diversas estruturas neuroanatômicas, circuitos neurais e sistemas de neurotransmissores, os quais apresentam mudanças similares nestas duas condições. No modelo de estresse por subjugação social, desenvolvido recentemente, camundongos intrusos são expostos a camundongos reidentes (de uma linhagem mais robusta e agressiva), sofrendo breves períodos de agressão física seguidos por longos períodos de contato sensorial. O camundongo subjugado pode apresentar diversas características comportamentais e fisiológicas do tipo depressivas e, nesse caso, são considerados suscetíveis; por outro lado, alguns camundongos subjugados não apresentam estas alterações comportamentais e fisiológicas, sendo estes chamados de resilientes. Contudo, não há dados que considerem a sensibilidade a dor destes animais. Sendo assim, este estudo visa investigar a resposta comportamental destes animais par estimulação niciceptiva, através do teste de Von Frey e de capsaicina. Para isto, três grupos experimentais foram estabelecidos: grupo controle, onde o camundongo intruso foi pareado com outro camundongo da mesma linhagem; grupo suscetível e, finalmente, grupo resiliente. Nossos dados mostraram que camundongos suscetíveis apresentam maior sensibilidade a dor em ambos os testes quando comparados aos grupos controle e resiliente. Além disso, constatamos que o grupo resiliente possui um limiar de dor intermediário quando comparado aos outros dois grupos. O estresse por subjugação social aumentou a expressão de BDNF na VTA dos camundongos suscetíveis, mas não no grupo resiliente, em comparação ao controle. Os níveis protéicos das isoformas de BDNF foram avaliados no NAc; nossos resultados apresentaram uma diminuição da isoforma madura de BDNF nos grupos estressados em comparação ao controle, um aumento da isoforma truncada no grupo suscetível e nenhuma diferença nos níveis protéicos da isoforma precursora do BDNF. Estes resultados sugerem a existência de um processo comum de plasticidade neural entre dor crônica e transtornos depressivos induzidos por estresse. Nossos resultados experimentais corroboram com a co-morbidade entre dor e transtorno depressivo frequentemente observados na clínica.

Palavras-chave: Núcleo Accumbens, Área Tegmentar Ventral, Estresse por Derrota Social, Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro, Dor.

ABSTRACT

PAGLIUSI JR, MOF. Study of Social Defeat Stress effects on nociceptive behavior in mice and neurobiological mechanisms associated, 2016.

Despite the pain is not one of the symptoms for the depression diagnosis, epidemiological studies indicate a close association between depressive disorder and chronic pain. This is evidenced by the clinical observation that patients with depression have high prevalence of chronic pain and, at the same time, patients suffering from chronic pain are also often diagnosed with depressive disorders. Several clinical and biological characteristics are shared between pain and depression, and various neuroanatomical structures, neural circuits and neurotransmitter systems exhibit similar changes in those two conditions. In Social Defeat Stress animal model, recently developed, intruder mice are exposed to resident mice from a more aggressive and more physically robust strain, experiencing brief periods of physical aggression followed by longer periods of sensory contact. The defeated mice may display a number of physiological and behavioral depressive-like characteristics, and then they are considered susceptible; furthermore, some defeated mice may not display these characteristics, and then they are considered resilient. However, there is no data regarding the pain sensibility in such animals. Thus, this study aimed to investigate the behavioral response to nociceptive stimulation, through Von Frey and capsaicin test, in mice submitted to the Social Defeat Stress model. For this, three experimental groups were established: Control group, where the intruder mice were paired with mice of the same strain; susceptible group, and, finally, resilient group. Our data showed that susceptible mice exhibited greater pain intensity in both tests when compared to both control and resilient mice. Furthermore, we found that the resilient mice showed an intermediate nociceptive threshold compared to the other two groups (susceptible and control), presenting, therefore, resiliency also to the decreasing of the nociceptive threshold. In addition, the Social Defeat Stress increased BDNF expression in the VTA of susceptible group, but not in the resilient group, in comparison with de control group. The protein levels of BDNF isoforms were evaluated in the NAc; we found an decreased of the mature isoform of BDNF protein in the defeated groups in comparison with the control groups, an increase in the truncated isoform of BDNF in the susceptible group and no differences in the precursor isoform of BDNF. These results suggest the existence of a common process of neuronal plasticity underlying both chronic pain and stress-induced depressive disorder. Our experimental data corroborate the comorbidity between pain and depressive disorder frequently observed in the clinic.

Keywords: Nucleus Accumbens, Ventral Tegmental Area, Social Defeat Stress, Brain Derived Neurotrofic Factor, Pain.

Lista de Abreviaturas

AKT/PKB Proteína Quinase B

BDNF Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro

cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar

CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica

cm Centímetro

D1 Receptor de dopamina 1

D2 Receptor de dopamina 2

DSM Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais

EPM Erro Padrão da Média

ERK Quinase reguladora de sinal extracelular

g Grama

GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

GC Hormônios glicocorticóides

HPA Hipotálamo-pituitária-adrenal

IPC Índice de permanência nos corners

IS Índice de interação social

kDA Quilodaltons

mM Milimolar

mm Milímetro

mRNA Ácido ribonucléico mensageiro

NAc Núcleo Accumbens

ng Nanograma

PCR Reação em cadeia da polimerase

PGE2 Prostaglandina E2

RNA Ácido ribonucleico

SNC Sistema Nervoso Central

TRKB Quinase receptora de tropomiosina B

VTA Área Tegmentar Ventral

µg Micrograma

µL Microlitro

µm Micrômetro

o

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 12 2. OBJETIVOS ... 23 2.1 Objetivos Específicos ... 23 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 25 3.1 Grupos experimentais ... 25 3.2 Cronograma Comportamental ... 27

3.3 Estresse por Subjugação Social Repetida ... 27

3.4 Avaliação do Comportamento de Interação Social ... 28

3.5 Avaliação da Resposta Comportamental a Estímulos Nociceptivos ... 30

3.5.1 Teste da Capsaicina ... 30

3.5.2 Teste do Limiar Nociceptivo Mecânica (Von Frey Eletrônico) ... 30

3.6 Eutanásia dos Camundongos e Microdissecção ... 31

3.7 Análise da Expressão Gênica ... 33

3.8 Análise da Expressão Protéica ... 35

3.9 Análises Estatísticas ... 36

4. RESULTADOS ... 38

4.1 O Estresse por Subjugação Social Repetida induziu comportamento do tipo depressivo de esquiva social ... 39

4.2 O Estresse por Subjugação Social Repetida promoveu diminuição no limiar nociceptivo ... 40

4.3 O Estresse por Subjugação Social Repetida aumentou a expressão de BDNF na VTA dos animais suscetíveis ... 42

4.4 O Estresse por Subjugação Social Repetida levou a alterações significativas dos níveis protéicos de BDNF no Núcleo Accumbens ... 43

5. DISCUSSÃO ... 45

6. CONCLUSÃO... 55

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 57

1. Introdução

A dor pode ser definida como a percepção de uma sensação nociceptiva. É uma experiência complexa e subjetiva que inclui as dimensões afetivo-motivacional e cognitivo-avaliativa, além da dimensão sensorial-discriminativa (MELZAC e CASEY, 1968 apud TREEDE, 1999). Enquanto a dimensão sensorial-discriminativa define localização, intensidade e qualidade da dor, as dimensões afetiva e cognitiva estão relacionadas ao aspecto desagradável e subjetivo da dor e emoções dele decorrentes. Esse componente emocional depende de fatores como aprendizagem, memória e mecanismos de recompensa (CALVINO e GRILO, 2006). Em uma análise restrita, a dor envolve a ativação das vias nociceptivas, ou seja, vias sensoriais responsáveis pela detecção dos estímulos nociceptivos. Seu aspecto final, entretanto, é dependente de uma série de fatores integrados pelo Sistema Nervoso Central (SNC) que podem determinar e alterar a percepção do estímulo nociceptivo.

No que se refere à depressão, a Associação Americana de Psiquiatria publica periodicamente um Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (da sigla em inglês DSM - Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders), que já está em sua quinta edição. Este manual define um quadro de depressão quando o paciente apresenta pelo menos cinco de nove sintomas principais: estado deprimido, anedonia, perda de peso ou de apetite, distúrbios do sono, problemas psicomotores, fadiga ou perda de energia, sensação de inutilidade, dificuldade de concentração, ideias recorrentes de morte ou suicídio (DSM-V, 2013).

Entretanto, apesar da dor não figurar entre os sintomas da depressão (DSM-V, 2013), estudos epidemiológicos indicam uma estreita associação entre transtorno depressivo e dor crônica (ROBINSON et al., 2009; GOLDENBERG, 2010). Tal relação é

evidenciada por estudos que revelam que pacientes com depressão apresentam altas taxas de prevalência de dor crônica e, vice-versa, pacientes acometidos por dor crônica também são frequentemente diagnosticados com transtorno depressivo (BAIR et al., 2003). De fato, a co-morbidade entre depressão e dor parece ser mais a regra do que a exceção, com uma alta taxa de co-ocorrência (BAIR et al., 2008). Neste cenário, podemos destacar a fibromialgia, caracterizada por dor crônica difusa, persistente por pelo menos três meses e acompanhada por fadiga e distúrbios do sono (MALETIC e RAISON, 2009). As altas taxas de co-morbidade entre fibromialgia e depressão têm inclusive levantado um debate entre pesquisadores se estas são duas condições realmente distintas com alta co-morbidade ou sintomas diferentes de uma mesma condição (MALETIC e RAISON, 2009).

Diversas características clínicas e biológicas são compartilhadas entre dor e depressão; sendo que várias estruturas neuroanatômicas, circuitos neurais e sistemas de neurotransmissores apresentam alterações similares nestas duas condições (ROBINSON et al., 2009; GOLDENBERG, 2010). De forma interessante, as drogas mais eficazes para o tratamento da fibromialgia são os antidepressivos monoaminérgicos, que também são altamente eficazes no alívio de dores crônicas de um modo geral, revelando mais uma característica compartilhada entre dor crônica e depressão (JANN e SLADE, 2007; CLAUW, 2008; ROBINSON et al., 2009).

Em patologias crônicas, comumente se observa uma interação entre predisposição genética e eventos e circunstâncias ambientais determinando o seu desenvolvimento; dentre os eventos ambientais, o estresse crônico parece ser um fator crucial para o desenvolvimento da depressão. De fato, há evidências de que episódios de depressão ocorrem num contexto de alguma forma de estresse (NESTLER et al., 2002; CHARNEY

e MANJI, 2004). Anormalidades no sistema de resposta ao estresse, notadamente a hiperatividade do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), estão entre as alterações biológicas compartilhadas entre depressão e dor crônica (MALETIC e RAISON, 2009; GOLDENBERG, 2010).

De acordo com isso, a maioria dos modelos experimentais indutores de comportamento depressivo em animais utiliza alguma forma de estresse (CRYAN et al., 2002); um destes modelos é o do estresse moderado crônico imprevisível. Nesse modelo, os roedores são expostos a uma série de estímulos estressantes, tais como privação periódica de água e/ou ração, exposição a temperaturas muito baixas, contenção física, inversão do ciclo claro/escuro, entre outros, apresentados randomicamente durante várias semanas. Como resultado, o animal passa a exibir um comportamento do tipo depressivo, que pode ser revertido com a administração de drogas antidepressivas. Entretanto, tem sido levantados questionamentos quanto à reprodutibilidade desses resultados comportamentais, devido à grande variabilidade de protocolos, o que diminuiu a confiança no modelo (POLLAK et al., 2010). Em outro modelo para indução de comportamento depressivo em roedores, conhecido como desamparo aprendido, os animais são submetidos a sessões de choques elétricos repetidos, altamente estressantes, que geram um déficit no comportamento de esquiva e/ou fuga ao estímulo aversivo, comportamento tipicamente considerado do tipo depressivo. A principal crítica a este modelo é que a maioria dos comportamentos relacionados à depressão não persistem após alguns dias da cessação dos estímulos elétricos (CRYAN et al., 2002).

Além disso, há muito são utilizados diversos modelos de estresse por subjugação social, os quais possuem o confronto social como uma ferramenta para a indução de comportamentos do tipo depressivo. Entretanto, recentemente foi realizada uma

padronização do protocolo de Estresse por Subjugação Social Repetida por Golden et al. (2011). Neste protocolo padronizado, camundongos são expostos em dias consecutivos a um camundongo agressor de linhagem fisicamente mais robusta, sofrendo breves períodos de agressão física seguidos de períodos mais longos de contato visual e olfativo. Desta forma fica caracterizada uma relação de submissão social, tipicamente observada nas relações humanas. Diante disso, os camundongos submissos desenvolvem uma série de alterações fisiológicas e comportamentais, dentre elas alterados níveis de corticosterona, hipertrofia cardíaca, distúrbios do ritmo circadiano, ansiedade, comportamento de desespero, anedonia e a esquiva social, com diminuição da interação social quando expostos a outros camundongos. O comportamento de esquiva social é utilizado como padrão na avaliação da efetividade do modelo (GOLDEN et al., 2011). De forma interessante, alguns camundongos, mesmo quando submetidos ao estresse por subjugação social repetida não apresentam um comportamento do tipo depressivo, sendo chamados então de resilientes; esses dados corroboram com o que ocorre em humanos, uma vez que nem todo indivíduo exposto a alguma forma de estresse crônico desenvolve psicopatologias (KRISHNAN et al., 2007). Em contrapartida, os camundongos submetidos ao estresse por subjugação social repetida que apresentam um comportamento do tipo depressivo são chamados de suscetíveis. Outra característica importante deste modelo, que o torna muito mais fidedigno do que os mais antigos modelos de indução e testes de avaliação do comportamento do tipo depressivo é o fato de ser responsivo apenas a tratamentos crônicos, e não agudos, com drogas antidepressivas; como também se observa em pacientes humanos (POLLAK et al., 2010). Trata-se, portanto, de um modelo robusto e que se aproxima bastante das características e sintomas da depressão humana (GOLDEN et al., 2011).

Sabe-se que numa condição de estresse severo e prolongado, com elevação sustentada dos níveis dos hormônios glicocorticóides (GC) devido à ativação do eixo HPA, ocorrem alterações neuroplásticas, dentre as quais figuram a retração e redução das ramificações dendríticas, diminuição da densidade de espinhas dendríticas, reduzidas taxas de neurogênese no giro denteado e, até mesmo morte de neurônios piramidais da formação hipocampal (GOULD et al., 1999; McEWEN, 2000, 2005; SAPOLSKY, 2000; PITTENGER e DUMAN, 2008). Além disso, o estresse crônico provoca diminuição dos níveis hipocampais do Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF), um dos mais prevalentes fatores neurotróficos do cérebro adulto e a principal neurotrofina da Formação Hipocampal, molécula que exerce uma potente regulação da plasticidade e sobrevivência de neurônios e glia no organismo adulto (NESTLER et al., 2002; RADECKI et al., 2005). Assim, a persistência e a intensidade dos estímulos estressantes podem acarretar disfunção hipocampal, determinando redução no controle inibitório que o hipocampo exerce sobre o eixo HPA. Consequentemente se estabeleceria a hiperatividade do eixo HPA, tipicamente observada em pacientes com depressão e, também, com dor crônica (NESTLER et al., 2002; MALETIC e RAISON, 2009; GOLDENBERG, 2010).

Outra estrutura particularmente suscetível a alterações neuroplásticas induzidas pelo estresse crônico é o chamado Sistema Dopaminérgico Mesolímbico do qual fazem parte a Área Tegmentar Ventral (VTA) e o Núcleo Accumbens (NAc), que recebe projeções dopaminérgicas da VTA, constituindo um dos mais importantes substratos neuroanatômicos para os mecanismos de recompensa natural e de resposta a drogas de abuso (NESTLER e CARLEZON, 2006). A fisiologia de tais estruturas encefálicas pode ser afetada em condições de estresse. Durante um evento de estresse agudo, por exemplo, um estímulo nociceptivo ou um confronto social, as projeções dopaminérgicas VTA –

NAc podem ser estimuladas, aumentando a motivação do organismo para lidar ativamente diante da ameaça e contribuindo para respostas homeostáticas e aprendizagens adaptativas relacionadas ao estresse (NESTLER e CARLEZON, 2006; PITTENGER e DUMAN, 2008). Por outro lado, o estresse crônico pode causar alterações plásticas duradouras na via mesolímbica que, por sua vez, podem contribuir para sua disfunção (NESTLER e CARLEZON, 2006).

Recentemente têm emergido evidências da participação do Sistema Dopaminérgico Mesolímbico na mediação de anormalidades comportamentais observadas na dor e na depressão. O NAc parece exercer um papel importante na modulação da dor fisiológica (MAGNUSSON e MARTIN, 2002; TAYLOR et al., 2003), tendo se mostrado uma importante estrutura modulatória da atividade tônica nos neurônios de projeção espino-supraespinal, induzindo uma antinocicepção heterosegmentar (GEAR et al., 1999; TAMBELI et al., 2002; TAMBELI et al., 2003). Além disso, vários trabalhos descrevem a relação dos mecanismos dopaminérgicos no efeito antinociceptivo do NAc durante a dor aguda (ALTIER e STEWART, 1999; GEAR et al., 1999; WOOD, 2004). Alguns estudos também mostram que o aumento da atividade dopaminérgica no sistema mesolímbico pode atenuar o comportamento nociceptivo agudo em animais (CHUDLER e DONG, 1995; ALTIER e STEWART, 1999; MAGNUSSON e FISHER, 2000; TAYLOR et al., 2003). Outros demonstram que a diminuição da liberação de dopamina no NAc induz aumento da sensação dolorosa aguda (SAADÉ et al., 1997; MAGNUSSON e MARTIN, 2002). Embora o NAc esteja associado com a antinocicepção induzida por estímulos mecânicos agudos, nosso grupo constatou recentemente que esse núcleo possui um papel facilitatório na manutenção da hiperalgesia persistente de origem inflamatória contribuindo para a cronificação da dor através de mecanismos de neuroplasticidade no sistema de neurotransmissão

dopaminérgica (DIAS et al., 2015). De acordo com isso, alguns trabalhos realizados em humanos utilizando métodos de neuroimagem com marcador de receptores de dopamina mostram que pode haver alterações no tônus dopaminérgico e na densidade desses receptores no estriado límbico nas condições de dor crônica (HAGELBERG et al., 2003) e fibromialgia (WOOD et al., 2007).

No contexto da depressão, há um robusto corpo de evidências apontando para o envolvimento do Sistema Dopaminérgico Mesolímbico. Em humanos com depressão resistente ao tratamento medicamentoso, a estimulação cerebral profunda em estruturas do Sistema Dopaminérgico Mesolímbico tem resultado em importantes efeitos antidepressivos (SCHLAEPFER et al., 2008; BEWERNICK, et al., 2010). Em um estudo que utilizou o modelo de Estresse por Subjugação Social Repetida, foi constatado o aumento dos níveis de BDNF no NAc dos camundongos submissos e, por outro lado, um efeito antidepressivo promovido pela deleção local do gene do BDNF restrita à VTA dos camundongos (BERTON et al., 2006). Uma vez que, como mencionado acima, uma parcela dos camundongos submetidos à subjugação social não exibe o comportamento de esquiva social, Krishnan et al. (2007) segregaram os animais em suscetíveis e resilientes. Então, observaram que apenas os camundongos suscetíveis apresentavam aumentos nos níveis de BDNF no NAc, além da ativação de proteínas pertencentes às vias de sinalização intracelular do TrkB, como Akt e ERK, em decorrência ao estresse crônico por exposição a repetidos episódios de submissão social. Além disso, infusão bilateral intra-NAc de BDNF em camundongos resilientes aumentou a sua suscetibilidade em resposta à exposição submáxima à submissão social (KRISHNAN et al., 2007). Embora tenham observado aumento dos níveis da proteína do BDNF em função do estresse social crônico, não foi constatado aumento do seu RNA mensageiro no NAc; e a deleção local do gene do BDNF no NAc não evitou o estabelecimento da esquiva social após a

exposição à subjugação social (KRISHNAN et al., 2007). Assim, os autores postulam que a fonte do BDNF que age no NAc é a VTA, onde, de fato, a deleção local do gene preveniu a esquiva social induzida por subjugação, aumentando a proporção de camundongos resilientes além de reduzir os níveis da proteína do BDNF no NAc (BERTRON et al., 2006; KRISHNAN et al., 2007). De forma interessante, tais níveis de proteína estão aumentados no NAc de humanos com depressão analisados post-mortem (KRISHNAN et al., 2007). Importante mencionar aqui que todos estes estudos abordando o BDNF não avaliaram as possíveis distinções funcionais das diferentes isoformas da proteína.

O BDNF é sintetizado na forma de uma molécula precursora denominada pró-BDNF (32 kDa) que é posteriormente clivada para gerar a forma madura da proteína (14kDa) (MOWLA et al., 2001). O BDNF maduro se liga preferencialmente com o receptor de membrana tirosina-quinase B (TrkB), ativando uma cascata de sinalização intracelular que promove sobrevivência celular e plasticidade neuronal. Por sua vez, o pró-BDNF tem alta afinidade para o receptor de neurotrofina p75, desencadeando efeitos pró-apoptóticos e anti-plasticidade (LU et al., 2005). Alternativamente, a clivagem do pró-BDNF pode gerar uma isoforma truncada (28 kDa) cuja função não é ainda bem conhecida (MOWLA et al., 2001). Assim, diante desta função antagônica das diferentes isoformas do BDNF, é importante o refinamento dos estudos abordando essa questão.

É interessante notar também que o BDNF potencializa a liberação de dopamina no NAc (GOGGI et al., 2003). Cerca de 95% dos neurônios que compõem o NAc são os chamados neurônios espinhais médios que são divididos em duas subpopulações, neurônios que expressam receptores dopaminérgicos do tipo D1 e aqueles que expressam receptores do tipo D2 (LOBO et al., 2010), sendo que há fortes evidências da participação

dos receptores do tipo D2 na resposta antidepressiva. Enquanto o bloqueio farmacológico de receptores do tipo D2 suprime o efeito antidepressivo de diversas drogas em diferentes modelos animais, bem como em humanos, drogas agonistas de receptores do tipo D2 exercem efeito antidepressivo; além disso, drogas antidepressivas aumentam os níveis de RNA mensageiro do receptor do tipo D2 no NAc (GERSHON et al., 2007). De acordo com isso, o BDNF, sinalizando via TrkB, diminui a excitabilidade de neurônios espinhais médios do NAc que expressam receptores D2, que são muito enriquecidos em TrkB comparados aos neurônios que expressam receptores D1 (LOBO et al., 2010). A sinalização do BDNF na via VTA – NAc é crucial para associações de estímulos emocionais e o estabelecimento de memórias referentes a circunstâncias ameaçadoras ou recompensadoras. Mas, a ativação prolongada deste sistema pode ser mal-adaptativa e, sob condições patológicas, esta sinalização pode estabelecer associações anormais e gerar inflexibilidade cognitiva e generalizações que transformariam eventos inócuos em aversivos e levariam a determinados sintomas de dor crônica e/ou depressão (NESTLER e CARLEZON, 2006; KRISHNAN et al., 2007).

Diante dos dados até aqui expostos, parece bastante provável que as condições de dor crônica e depressão podem compartilhar mecanismos de neuroplasticidade em determinadas estruturas neurais, sobretudo no Sistema Mesolímbico, envolvendo o Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro e a neurotransmissão dopaminérgica. Tendo em vista as diversas e complexas relações entre a depressão e a dor de um modo geral, há grande interesse científico em aprofundar os estudos que visam compreender tais relações, uma vez que estes são escassos. Além disso, de acordo com a literatura, é plausível a hipótese de que a depressão, induzida através do modelo de Estresse por Subjugação Social Repetida, pode gerar um quadro de maior sensibilidade a dor, o que já é observado na clínica, além de produzir alterações neuroplásticas no Sistema Mesolímbico

Dopaminérgico. Sendo assim, com o presente estudo pretende-se investigar se camundongos expostos a estresse por subjugação social, que comprovadamente apresentam alterações comportamentais do tipo depressivo, também apresentam alterações nos comportamentos de resposta a estímulos nociceptivos químicos, através do teste da Capsaicina, e mecânicos, através do teste do Von Frey Eletrônico.

2. Objetivo Geral

O presente trabalho tem como objetivo geral investigar o comportamento de resposta a estímulos nociceptivos de camundongos submetidos ao modelo de Estresse por Subjugação Social Repetida, bem como analisar possíveis alterações neuroplásticas ao nível molecular no Núcleo Accumbens e Área Tegmentar Ventral destes animais.

2.1. Objetivos Específicos

1. Investigar a resposta comportamental a estímulos nociceptivos mecânicos e químicos de camundongos submetidos ao modelo de Estresse por Subjugação Social Repetida.

2. Verificar a expressão gênica de BDNF na Área Tegmentar Ventral de camundongos submetidos ao modelo de Estresse por Subjugação Social Repetida.

3. Verificar a expressão protéica do Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF), analisando suas diferentes isoformas, no Núcleo Accumbens de camundongos submetidos ao modelo de Estresse por Subjugação Social Repetida.

3. Materiais e Métodos

Foram utilizados camundongos machos C57BL/6JUNIB com oito semanas de idade, 20 - 25g de peso corporal, fornecidos pelo Centro de Bioterismo da UNICAMP (CEMIB) e também camundongos machos da lihagem Swiss, fornecidos pelo Laboratório Nacional Agropecuário de Campinas (Lanagro/SP) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa). Durante todo o período experimental os animais foram mantidos em condições controladas de luz (ciclo 12:12 horas de claro-escuro) e temperatura (21ºC), recebendo água e ração ad libitum..Aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UNICAMP (CEUA/UNICAMP), protocolo número 3849-1.

3.1. Grupos Experimentais.

Os camundongos foram aleatoriamente divididos em dois grupos experimentais: Grupo Estressado, composto por animais submetidos ao Estresse por Subjugação Social Repetida e Grupo Controle, composto por animais não estressados. Os camundongos do grupo Estressado foram submetidos a sessões diárias de estresse por subjugação social por 10 dias consecutivos. Após esse período, os camundongos de ambos os grupos experimentais passaram por testes comportamentais, descritos a seguir, para a avaliação do comportamento do tipo depressivo e de resposta a estímulos nociceptivos. Sendo assim, após a avaliação do comportamento do tipo depressivo dos animais estressados, houve a separação do grupo Estressado em dois subgrupos: Estressados Suscetíveis e Estressados Resilientes, de acordo com critérios descritos abaixo (item 3.4). Encerrada a avaliação comportamental, todos os camundongos foram eutanasiados e seus encéfalos retirados para posterior microdissecção do Núcleo Accumbens (NAc) e Área Tegmentar Ventral (VTA, na sigla em inglês - Ventral Tegmental Area) para análises moleculares.

3.2. Cronograma de experimentos comportamentais

O cronograma experimental para os testes comportamentais deste projeto está apresentado na Tabela 1, desde o dia 0 (zero) no qual foi realizado o teste de resposta nociceptiva a estímulos mecânicos (Von Frey basal), até o dia 14, no qual foi realizada a eutanásia por decaptação e a retirada dos encéfalos. Foram realizados três séries experimentais distintas utilizando o mesmo cronograma comportamental.

Tabela 1. Cronograma comportamental

3.3. Estresse por Subjugação Social Repetida

Inicialmente foi realizada a seleção dos camundongos Swiss agressores como descrito por Golden et al. (2011). Nesta seleção, os camundongos Swiss obtidos do laboratório LANAGRO são expostos a um camundongo C57BL/6JUNIB por três minutos durante três dias consecutivos, sendo que em cada dia foi utilizado um camundongo C57BL/6JUNIB distinto. Durante cada uma destas sessões de três minutos, foi analisada a latência de ataque do camundongo Swiss (tempo decorrido até o primeiro ataque físico propriamente dito). O camundongo Swiss que apresentou uma latência menor ou igual a um minuto em pelo menos dois dias consecutivos (dos três dias de seleção) foi selecionado como camundongo agressor no experimento.

Para a indução do comportamento do tipo depressivo, os camundongos foram submetidos ao protocolo de Estresse por Subjugação Social também previamente descrito por Golden et al. (2011). Nesse protocolo, os camundongos experimentais

(C57BL/6JUNIB) são introduzidos diariamente, por um período de 10 dias consecutivos, em gaiolas de camundongos residentes da linhagem

pelo comportamento agressivo) duração de 10 minutos. Após permanecem por 24 horas

duas metades por uma divisória de acrílico perfurada

apenas o contato sensorial, sobretudo visual e olfatório, entre os animais. A cada sessão/dia de submissão os camundongos estressados (C57BL/6J)

novo camundongo Swiss residente. Os camundongos do grupo Controle

pares, ambos da linhagem C57BL/6J, em gaiolas também divididas em duas metades pe divisória acrílica; sendo manipulados igualmente

período de 10 dias do protocolo.

Figura 1. Gaiola especialmente projetad

Note a divisória de acrílico perfurada, permitindo o contato sensorial, e não físico

3.4. Avaliação do Comportamento de Interação Social

Para a avaliação da indução de comportamento do tipo depressivo social, os camundongos foram

após o término do procedimento de estresse por

al., 2006; GOLDEN et al., 2011). Para este procedimento

introduzidos diariamente, por um período de 10 dias consecutivos, em gaiolas de camundongos residentes da linhagem Swiss (previamente selecionad pelo comportamento agressivo) para a sessão de submissão social; cada sessão

o de 10 minutos. Após este período de contato físico-corporal, por 24 horas dividindo a mesma gaiola, sendo esta, porém,

duas metades por uma divisória de acrílico perfurada (Figura 1); tal divisória permite ontato sensorial, sobretudo visual e olfatório, entre os animais. A cada sessão/dia de submissão os camundongos estressados (C57BL/6J) são

residente. Os camundongos do grupo Controle

pares, ambos da linhagem C57BL/6J, em gaiolas também divididas em duas metades pe manipulados igualmente aos do grupo controle

do protocolo.

Gaiola especialmente projetada para a realização do protocolo de indução de estresse por s Note a divisória de acrílico perfurada, permitindo o contato sensorial, e não físico-corporal, entre os animais.

. Avaliação do Comportamento de Interação Social.

Para a avaliação da indução de comportamento do tipo depressivo

foram avaliados no teste de interação social vinte e quatro horas após o término do procedimento de estresse por subjugação social repetida (BERTON et 006; GOLDEN et al., 2011). Para este procedimento foi utilizada uma arena de introduzidos diariamente, por um período de 10 dias consecutivos, previamente selecionados ada sessão possui os camundongos , porém, separada em ; tal divisória permite ontato sensorial, sobretudo visual e olfatório, entre os animais. A cada nova são expostos a um residente. Os camundongos do grupo Controle são mantidos em pares, ambos da linhagem C57BL/6J, em gaiolas também divididas em duas metades pela controle ao longo do

subjugação social repetida. , entre os animais.

Para a avaliação da indução de comportamento do tipo depressivo de esquiva avaliados no teste de interação social vinte e quatro horas social repetida (BERTON et utilizada uma arena de

campo aberto de material plástico medindo 42x42cm (Figura 2a), tendo em um dos lados um pequeno compartimento (10x6,5cm) constituído de acrílico transparente com pequenas perfurações (Figura 2b). Os camundongos foram introduzidos na arena de campo aberto por duas sessões consecutivas, com duração de dois minutos e meio, separadas por um minuto entre si. Na primeira sessão (chamada de no-target) o compartimento de acrílico transparente permaneceu vazio; enquanto que na segunda sessão (target), havia no compartimento um camundongo Swiss não familiar, ou seja, que não tenha participado das sessões de subjugação social. As duas sessões foram registradas em vídeo para análises posteriores. Tais análises foram realizadas avaliando o tempo de permanência dos camundongos na chamada “zona de interação” da arena (região da arena com área retangular de 14x24cm, formando uma faixa de 8cm ao redor do compartimento de acrílico).

Figura 2. (a) Vista de cima da arena de campo aberto, delimitada com as zonas e suas respectivas dimensões, utilizada no teste de interação social. (b) Imagem da estrutura acrílica transparente com pequenas perfurações, utilizada para enclausurar o camundongo Swiss não familiar durante a sessão target do teste de interação social (c) Imagem da estrutura acrílica transparente com pequenas perfurações dentro da zona de interação na arena de campo aberto.

Com base nisso, um “Índice de Interação Social” (IS) foi então estabelecido pela razão entre o tempo que o camundongo permanecia na zona de interação na sessão target (Tzist) dividido pelo tempo de permanência na zona de interação na sessão no-target (Tzisnt), como mostrado na Equação 1. Camundongos com IS abaixo de 1 foram considerados Suscetíveis, ou seja, apresentam comportamento social do tipo depressivo;

camundongos com IS acima de 1 foram classificados como Resilientes ou resistentes ao estresse, sem apresentar comportamento do tipo depressivo de esquiva social (BERTON et al., 2006; GOLDEN et al., 2011).

ܫܵ =

்௭௜௦௧

்௭௜௦௡௧

(1)

Desta forma, ao final deste procedimento, são configurados três grupos experimentais: Controle, Estressado Suscetível e Estressado Resiliente. Adicionalmente, também foi avaliado o índice de permanência nos corners (IPC) pela razão entre o tempo que o camundongo permaneceu em tal região na sessão target (Tcst) pelo tempo de permanência nessa mesma região na sessão no-target (Tcsnt), como mostrado na Equação 2.

ܫܲܥ =

்௖௦௧

்௖௦௡௧

(

2)

3.5. Avaliação da Resposta Comportamental a Estímulos Nociceptivos.

Após a avaliação do comportamento do tipo depressivo, os camundongos foram submetidos a testes de respostas comportamentais a estímulos nociceptivos, com a finalidade de avaliar a sua sensibilidade à dor.

3.5.1. Teste da Capsaicina.

O teste da capsaicina foi utilizado para avaliar a nocicepção mediada pelas fibras sensoriais do tipo C, sendo realizado 24 horas após a avaliação da interação social. Para a

realização desta análise comportamental, uma caixa de observação medindo 30x30x30cm com base e três laterais espelhadas e frente de vidro foi utilizada. Cada camundongo foi inicialmente colocado e mantido na caixa por 20 minutos para habituar-se ao ambiente de experimentação e minimizar o estresse. Após o período de habituação, capsaicina foi administrada no tecido subcutâneo da pata traseira (0,1µg/15µl/pata). A resposta nociceptiva foi então caracterizada pelo ato de levantar a pata reflexamente (flinch) e quantificada durante 5 minutos.

3.5.2. Teste do Limiar Nociceptivo Mecânico (Von Frey eletrônico)

Neste teste, o limiar nociceptivo mecânico foi avaliado por um analgesímetro eletrônico, no chamado teste de Von Frey eletrônico. Este aparelho consiste em um transdutor de força conectado a um contador digital que expressa a força em gramas (g). O contato do transdutor de força com a pata é realizado através de uma ponteira descartável de polipropileno com 0,5 mm de diâmetro adaptada ao transdutor. Os camundongos foram colocados em caixas de acrílico, medindo 12x20x17cm cujo assoalho consiste de uma rede de malha igual a 5mm2, constituída de arame não maleável de 1mm de espessura. Os camundongos permaneceram nas caixas durante 20 minutos antes do experimento para habituação ao ambiente de teste, onde espelhos foram posicionados 25 cm abaixo das caixas de experimentação para facilitar a visualização das plantas das patas dos animais. O experimentador foi treinado a aplicar, por entre as malhas da rede, uma pressão na superfície plantar da pata dos ratos com um aumento constante até que o animal emita um reflexo de retirada da pata seguido de uma resposta caracterizada como tremor (flinch) da pata estimulada. Os estímulos foram repetidos por até seis vezes, em geral, até que o animal apresentasse três medidas consecutivas similares, ou seja, com uma diferença de força inferior ou igual a 10%. A intensidade de

hiperalgesia foi quantificada pela variação do limiar de nocicepção em gramas (grama-força) obtida subtraindo-se a média de três valores observados antes do Estresse por Submissão Social (valor basal) da média de três valores obtidos após o término do procedimento de Estresse por Subjugação Social (∆ limiar nociceptivo mecânico em gramas). Além disso, pensando em deixar nossos resultados mais robustos, reavaliamos o limiar nociceptivo dos animais três horas após a aplicação de Prostaglandina E2 (PGE2)

(dia 12), utilizando também como medida basal aquela aferida no dia 0 (zero).

3.6. Eutanásia dos Camundongos e Microdissecção

Encerrados todos os procedimentos de testes comportamentais descritos acima, os camundongos foram eutanasiados por decapitação, sendo seus cérebros rapidamente removidos do crânio e congelados em gelo seco e armazenados a -80ºC. Posteriormente, os cérebros previamente coletados foram processados em um criostato (Leica), sendo produzidos 24 cortes histológicos de 60µm de espessura por animal. Os cortes foram posicionados em lâminas de microscopia comuns previamente recobertas com Parafilm® (Figura 3) e, logo em seguida, realizou-se a desidratação com a série alcoólica crescente e a coloração com Cresyl Violeta na sequência abaixo descrita:

• 2 minutos em álcool 70% (4OC)

• 1,5 minutos em Cresyl Violeta 1% (diluído em álcool 50%) (4OC); • Rápida passada em álcool 70% (4OC);

• 2 minutos em álcool 100% (4OC);

• 2 minutos em álcool 100% (temperatura ambiente); • Deixar secando no fluxo por 15 minutos.

Figura 3. Detalhe da lâmina de microscopia padrão (1) recoberta com um pequeno pedaço de Parafilm®(2).

Em seguida, foi realizada a microdissecção manual do NAc e VTA em cada um dos cortes, sendo as lâminas posicionadas sob microscópio cirúrgico e utilizando-se bisturi nº 11; o material microdissecado foi colocado em um tubo de microcentrífuga (1,5µl) para as análises moleculares subsequentes. Para a identificação e delimitação do NAc e da VTA foi utilizado o atlas em coordenadas estereotáxicas do Franklin e Paxinos (1996), a Figura 4 mostra diferentes distâncias do NAc em relação ao bregma e, a Figura 5, as diferentes distâncias da VTA em relação ao bregma; tais figuras também serviram de referência para que os cortes pudessem ser realizados.

Figura 4. Diferentes cortes coronais do cérebro de um camundongo mostrando, à esquerda, o tecido corado através da Coloração de Nissl e, à direita, a representação das estruturas cerebrais; note que o NAc (ou simplesmente ACB) está em destaque e foi contornado em preto. Região mais anterior do NAc, Bregma

A B

1,96mm (A). Região mediana do NAc, Bregma 1,42mm (B). Região mais posterior do NAc, Bregma 0,62mm (C).

Figura 5. Diferentes cortes coronais do cérebro de um camundongo mostrando, à esquerda, o tecido corado através da Coloração de Nissl e, à direita, a representação das estruturas cerebrais; note que VTA (apontada pelas setas) está em destaque e foi contornada em preto. Região mais anterior da VTA, Bregma -2,92mm (A). Região mediana da VTA, Bregma -3,40mm (B). Região mais posterior da VTA, Bregma -3,88mm (C).

3.7. Análise da Expressão Gênica

Para a análise da expressão gênica, as amostras de VTA previamente dissecadas foram utilizadas para a realização de PCR em tempo real. Para este procedimento as amostras foram submetidas à extração de RNA utilizando-se o reagente Trizol (Invitrogen - EUA), seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante. A quantificação das amostras foi feita por espectrofotometria, utilizando-se o aparelho NanoDrop® ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware, USA), com coeficiente de extinção 40ng-cm/μL e comprimento da trajetória da luz OD260 0,1cm, seguindo a equação de Beer-Lambert: Concentração de RNA [ng/μL] = (OD260 x 40ng-cm/μL)/0.1cm. A síntese de cDNA foi realizada a partir de 2µg de RNA total, utilizando-se o kit High Capacity (Applied - EUA) com hexâmeros aleatórios, seguindo o

A B

protocolo sugerido pelo fabricante. O cDNA obtido foi diluído 10 vezes em água deionizada e armazenado a -80ºC.

O nível de expressão gênica do BDNF foi determinado através de PCR em tempo real realizado em um sistema StepOnePlus® Applied (Applied Biosystems – EUA) utilizando o reagente SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems – EUA). Como controle endógeno foi utilizado o gene GAPDH. As seqüências dos mRNAs do GAPDH e BDNF foram obtidas no banco público de dados da NCBI e os respectivos

primers foram desenhados utilizando o software Beacon DesignerTM v8.14 (Premier

Biosoft International) e analisados pelo Primer-blast

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast), garantindo que os primers tenham %GC perto de 50%, temperatura de melting e de anelamento adequadas, sejam extremamente específicos para a sequência analisada e não formem estruturas secundárias ou dímeros; também que o amplicon esteja perto da porção 3’ do mRNA em questão, tenha tamanho entre 75 e 150bp e este não possua estruturas secundárias nem SNPs (single nucleotide polymorphisms) nas regiões de ligação dos primers (Tabela 2)

Tabela 2. Sequência forward e reverse dos primers utilizados no presente estudo.

Gene Sequência forward Sequência reverse

GAPDH AAGATTGTCAGCAATGCATCC ACTGTGGTCATGAGCCCTTC

BDNF ACCATAAGGACGCGGACTTGTACA AGACATGTTTGCGGCATCCAG

As condições para os ciclos de PCR serão: 10min a 95ºC, seguidos de 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto. As amostras serão processadas em duplicata e uma análise de melting será realizada em cada amostra. A determinação da expressão gênica relativa será realizada através do método 2-ΔΔCt. O valor de Ct (o ciclo limiar no

qual a fluorescência medida é 10 vezes maior que o desvio padrão da fluorescência de fundo) será determinado para o gene alvo e o controle endógeno em cada amostra. A diferença entre os valores de Ct do gene alvo e do controle endógeno será determinada para cada amostra (ΔCt). O valor de ΔCt de uma amostra calibradora, composta de um pool de cDNA de diferentes amostras, será subtraído do ΔCt de cada amostra (ΔΔCt). A mudança relativa da expressão gênica (fold change) será calculada como 2-ΔΔCt.

3.8. Análise da Expressão Protéica

Para análise da expressão protéica, o tecido dissecado foi homogeneizado em uma solução de Uréia 8M a 4ºC utilizando um homogeneizador ultrassônico (BransonSonifier, modelo 185; Danbury, CT, USA) operado em pulsos de 5 segundos. Após uma incubação por 20 minutos, as amostras foram centrifugadas a 12000g por 5 minutos a 4oC e o sobrenadante resultante transferido a um novo tubo. Através do método de Bradford (BRADFORD, 1976), a concentração de proteínas foi determinada e um total de 70ug para cada amostra separada e adicionada ao tampão Laemmli contendo 100 mM de DTT e aquecidas a 65ºC por 5 min. Em seguida, as amostras foram pipetadas em gel de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE) para separação por peso molecular e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Esta membrana foi então corada com Ponceau S e fotografada para análise de controle de proteínas totais através de densitometria óptica por absorbância (Romero-Calvo et al., 2010). A ligação não específica de proteínas foi reduzida pela pré-incubação da membrana em um bloqueador contendo leite desnatado a 5% em tampão PBS contendo 0,1% de tween-20. Em seguida a membrana foi incubada a 4ºC, por uma noite, com o anticorpo primário anti-BDNF (rabbit, polyclonal, 1:1000; [N-20] sc-546, Santa Cruz Biotechnology, USA) que é capaz de detectar as isoformas precursora (pró-BDNF [32 kDa]), truncada (BDNF truncado [28 kDa]) e madura (mad-BDNF [14 kDa]) do (mad-BDNF, permitindo, dessa forma, analisar as diferentes isoformas do

BDNF na mesma corrida, uma vez que possuem pesos moleculares distintos. Na manhã seguinte, as membranas foram lavadas em tampão de lavagem (50 mM Na2PO4, 150

mMNaCl e 0,05% de Tween 20) e em seguida incubadas à temperatura ambiente, com anticorpo secundário conjugado HRP (Zymed, 1:10000). Para detectar as bandas imunorreativas, a membrana foi exposta à solução de quimioluminescência (Lumi Glochemiluninescensesubstrate, Kirkegardand Perry Gaithersubrg, MD. USA) e analisadas em fotodocumentador. Os resultados foram expressos por uma média entre a densidade das bandas referentes a cada isoforma da proteína investigada (BDNF) pela densidade das bandas marcadas com Ponceau S e, em seguida, foi calculada a razão entre as diferentes isoformas, separadamente, e o BDNF total (soma de todas as isoformas).

3.9. Análises Estatísticas

Os dados foram analisados através de ANOVA de uma via, seguido do teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas para p<0,05.

4. Resultados

4.1. O Estresse por Subjugação Social Repetida induziu comportamento do tipo

depressivo de esquiva social.

Analisando a Figura 6, podemos constatar através do IS (equação 1) que, após o estresse por subjugação social, conseguimos identificar os três grupos experimentais descritos por Berton (2006) e Golden (2011). São eles: Controle, Estressado Suscetível, camundongos que possuem IS abaixo de 1 e, portanto, apresentam comportamento social do tipo depressivo e Estressado Resiliente, camundongos com IS acima de 1, os quais são resistentes ao estresse, não apresentando o comportamento do tipo depressivo de esquiva social. Menores índices de interação social foram apresentados pelos camundongos suscetíveis em comparação aos demais grupos, revelando comportamento do tipo depressivo. Camundongos resilientes apresentaram maiores índices de interação social comparados aos suscetíveis e menores comparados aos controles (controles: 2,016±0,110; resiliente: 1,519±0,160; suscetíveis: 0,606±0,032).

O índice de permanência nos corners (IPC), calculado através da equação 2 descrita anteriormente, pode ser analisado na Figura 7; podemos observar que os animais suscetíveis tiveram um IPC mais elevado do que os animais controles e resilientes, os quais não tiveram diferenças estatísticas entre si (controles: 0,797±0,079;; resilientes: 0,723±0,095; suscetíveis: 2,123±0,219).

Analisando os números amostrais dos grupos experimentais, onde o grupo controle possui 28 indivíduos, o grupo resiliente 7 indivíduos e o grupo suscetível 21 indivíduos, podemos notar que um terço dos animais que passaram pelo protocolo de Subjugação Social Repetida não desenvolveram comportamento do tipo depressivo e são os chamados resilientes.

Figura 6. Índice de Interação Social - Zona de interação (IS) - razão entre o tempo na zona de interação na sessão target dividido pelo tempo na zona de interação na sessão no-target, como mostra a Equação 1. * p<0,05; *** p<0,001. ANOVA de uma via, seguido do teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas para p<0,05. Ncontrole = 28; Nresiliente = 7; Nsuscetível = 21.

Figura 7. Índice de permanência nos corners - razão entre o tempo nos corners na sessão target dividido pelo tempo nos corners na sessão no-target; *** p<0,001 diferente dos demais grupos. ANOVA de uma via, seguido do teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas para p<0,05. Ncontrole =

28; Nresiliente = 7; Nsuscetível = 21.

4.2. O Estresse por Subjugação Social Repetida promoveu diminuição no limiar

nociceptivo.

Após a avaliação do comportamento do tipo depressivo, os camundongos foram submetidos a testes de resposta comportamental a estímulo nociceptivos, com a finalidade de avaliar a sua sensibilidade à dor. No dia 12 do experimento, quando foi realizado o teste do limiar nociceptivo mecânico (Von Frey eletrônico), é possível notar na Figura 8A que os

Controle Resiliente Susce tível

0 1 2 3

*

***

***

Controle Re siliente Suscetíve l

0 1 2 3

***

camundongos suscetíveis e resilientes não diferiram entre no que se refere à variação do limiar nociceptivo, embora ambos tenham apresentado maior variação do limiar quando comparados aos camundongos do grupo controle, ou seja, estavam mais sensíveis a dor do que os animais controle (controles: -0,018±0,229; resilientes: 3,271±0,576; suscetíveis: 3,967±0,311). O mesmo padrão de resposta comportamental foi observado através dos dados obtidos pelo teste realizado 3 horas após a sensibilização com a administração de PGE2. Como demonstrado na Figura 8B, os camundongos resilientes e suscetíveis

apresentaram novamente maiores valores de hiperalgesia comparados com os camundongos do grupo controle, sem, no entanto, diferirem entre si (controles: 4,079±0,155; resilientes: 5,200±0,289; suscetíveis: 4,929±262).

Controle Resiliente Suscetível -1 0 1 2 3 4 5 6

***

***

Controle Resiliente Suscetível 0 2 4 6

_*

*

Figura 8. Teste do limiar nociceptivo mecânico; o gráfico mostra a variação do limiar nociceptivo mecânico dos grupos experimentais avaliado 48 horas após a última sessão de subjugação social (A) e 3h após a aplicação de PGE2 (B - 3h Pós- PGE2). (* p<0,05, diferente dos demais grupos. *** p<0,001, diferente dos

demais grupos). Ncontrole = 28; Nresiliente = 7; Nsuscetível = 21.

A Figura 9 mostra graficamente a diferença de sensibilidade nociceptiva no teste da capsaicina entre os grupos experimentais. A Figura 9 demonstra que os camundongos do grupo Estressado Suscetível apresentaram maior número de flinchs quando comparados a ambos os outros grupos experimentais, com maior nível de significância com relação aos camundongos do grupo Controle. É possível constatar também que os camundongos do grupo Resiliente, embora tenham apresentado maior número de flinchs comparados aos

animais Controle, revelaram menor número de flinchs comparados aos camundongos suscetíveis (controles: 55,14±1,267; resilientes: 66,00±5,173; suscetíveis: 77,57±2,035).

Figura 9. Teste da capsaicina. O gráfico mostra o número de flinchs (ato de levantar a pata reflexamente) dados por cada grupo experimental (* p<0,05, ** p<0,1, *** p<0,001). Ncontrole = 28; Nresiliente

= 7; Nsuscetível = 21

4.3. O Estresse por Subjugação Social Repetida aumentou a expressão de BDNF

na VTA dos animais suscetíveis.

Após a microdissecção da Área Tegmentar Ventral (VTA) foi realizada, através de PCR em tempo real, a avaliação da expressão gênica de BDNF, utilizando GAPDH como gene de referência; Como mostra a figura 10, os camundongos do grupo Estressado Suscetível apresentaram maior expressão gênica do BDNF quando comparados tanto aos camundongos do grupo Controle quanto aos camundongos do grupo Estressado Resiliente. Além disso, não foram observadas diferenças entre os grupos Controle e Estressado Resiliente. (fold change Controle: 1,0018±0,0704; fold change Estressado Suscetível: 1,5586 ±0,1006; fold change Estressado Resiliente: 1,0832 ±0,0689).

Controle Resiliente Suscetível 0 20 40 60 80 100

**

***

*

F

li

n

c

h

Figura 10. Expressão do mRNA de BDNF na Área Tegmentar Ventral (VTA). O gráfico mostra o fold change de cada um dos grupos experimentais, tendo o grupo Controle como referência (*** p<0,001, diferente dos demais grupos). N=4 para todos os grupos.

4.4. O Estresse por Subjugação Social Repetida levou a alterações significativas

dos níveis protéicos de BDNF no Núcleo Accumbens.

Após a microdissecção Núcleo Accumbens (NAc), nessa região foi realizado através de

Western Blot a avaliação da expressão protéica das diferentes isoformas de BDNF; os resultados são

apresentados pela razão de cada uma das isoformas com o BDNF total.Como podemos observar na Figura 11, o grupo Controle apresentou maior nível protéico de BDNF maduro (14kDa) no NAc em comparação aos grupos Estressados, tanto Resilientes quanto Suscetíveis (p<0,01). Por outro lado, observando a Figura 12 podemos constatar que o grupo Controle apresentou menores níveis protéicos de BDNF truncado (28kDa) no NAc em comparação com o grupo Estressado Suscetível (p<0,05), não havendo diferenças estatísticas entre o grupo Estressado Resiliente e os demais. O resultado referente à molécula precursora de BDNF (pró-BDNF, 32kDa) está apresentado na Figura 13 e mostra que não houve diferenças estatísticas entre os todos grupos experimentais.

Controle Resiliente Suscetvel 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

***

Figura 11. Razão da quantificação protéica de BDNF maduro pelo BDNF total no NAc dos camundongos Controle, Resiliente e Suscetível

Figura 12. Razão da quantificação protéica de BDNF truncado pelo BDNF total no NAc dos camundongos Controle, Resiliente e Suscetível

Figura 13. Razão da quantificação protéica de BDNF precursor (pró camundongos Controle, Resiliente e Suscetível

grupos. Controle Re siliente 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35

_{* *}

Controle Re silie nte 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 B D N F t ru n c a d o / B D N F t o ta l (D e n s id a d e Ó p ti c a ) Controle Resiliente 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 B D N F p re c u rs o r / B D N F t o ta l (D e n s id a d e Ó p ti c a )

uantificação protéica de BDNF maduro pelo BDNF total no NAc dos camundongos Controle, Resiliente e Suscetível (** p<0,01, diferente dos demais grupos). N=4 para todos os grupos.

uantificação protéica de BDNF truncado pelo BDNF total no NAc dos camundongos Controle, Resiliente e Suscetível (* p<0,05). N=4 para todos os grupos.

uantificação protéica de BDNF precursor (pró-BDNF) pelo BDNF total no NAc dos undongos Controle, Resiliente e Suscetível (não houve diferenças estatísticas). N=4 para todos os

Re siliente Suscetível

Re silie nte Suscetível

*

Resiliente Suscetível

uantificação protéica de BDNF maduro pelo BDNF total no NAc dos camundongos N=4 para todos os grupos.

uantificação protéica de BDNF truncado pelo BDNF total no NAc dos camundongos

BDNF) pelo BDNF total no NAc dos (não houve diferenças estatísticas). N=4 para todos os

5. Discussão

Como descrito anteriormente por Golden et al. (2011), o protocolo de estresse social utilizado no presente estudo, chamado de Estresse por Subjugação Social Repetida, é capaz de gerar alterações comportamentais do tipo depressivo de esquiva social em aproximadamente dois terços dos camundongos submetidos ao protocolo, que são, portanto, considerados suscetíveis à indução de comportamento do tipo depressivo induzido por estresse social repetido. Os demais camundongos, cerca de um terço, que não apresentam alterações comportamentais são considerados resilientes (GOLDEN et al., 2011). Com isso, o modelo animal de Estresse por Subjugação Social Repetida mimetiza com grande fidelidade a condição humana, uma vez que nem todos os indivíduos que passam por uma situação estressante irão desenvolver distúrbios como a depressão. No presente estudo foram estabelecidos dois grupos distintos de camundongos estressados: suscetíveis e resilientes, em proporções semelhantes aquelas descritas na literatura (GOLDEN et al., 2011). Portanto, conseguimos reproduzir em nosso laboratório o modelo de Estresse por Subjugação Social Repetida de modo altamente fidedigno.

Além disso, nossos dados demonstraram que a submissão ao estresse social provocou uma diminuição no limiar nociceptivo dos camundongos diante de estímulos mecânicos e químicos. Já está bem estabelecido que algumas formas de estresse, sobretudo estresse agudo, são capazes de induzir analgesia, como relatado em estudos com modelos animais (AKIL et al, 1976; LEWIS et al, 1980; RIVAT et al, 2007). Por outro lado, tem sido relatado na literatura que diferentes formas de estresse crônico são capazes de provocar quadros de hiperalgesia. Satoh et al (1992), por exemplo, induziram estresse por frio repetido em ratos e observaram que esses animais apresentaram um quadro hiperalgésico, medido por estímulo mecânico através de um analgesímetro, que se mantinha por até três dias. Além disso, já foi constatado que ratos expostos à restrição física por um período de 1h por dia, durante 40 dias consecutivos, apresentaram maior sensibilidade à dor medidaatravés de estímulos térmicos no teste de retirada da cauda (da SILVA TORRES et al, 2003; GAMEIRO et al,