DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA ANÁLISES TOXICOLÓGICAS FORENSES NA DETERMINAÇÃO DE PRAGUICIDAS EM URINA HUMANA EMPREGANDO A TÉCNICA
DE EXTRAÇÃO EM PONTEIRAS DESCARTÁVEIS E GC-MS
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Química Analítica.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Carasek da Rocha
Florianópolis 2018
TOXICOLÓGICAS FORENSES NA DETERMINAÇÃO DE PRAGUICIDAS EM URINA HUMANA EMPREGANDO A TÉCNICA
DE EXTRAÇÃO EM PONTEIRAS DESCARTÁVEIS E GC-MS
Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de Mestre em Química Analítica e aprovada em sua forma final pelo
Programa de Pós-Graduação em Química. Florianópolis, 20 de fevereiro de 2018.
______________________________________________ Prof. Dr. Vanderlei Gageiro Machado
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Química Banca examinadora:
______________________________________________ Prof. Dr. Eduardo Carasek da Rocha
Orientador
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
______________________________________________ Prof. Dr. Luciano Vitali
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
______________________________________________ Profª. Drª. Alcíbia Helena de Azevedo Maia Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
______________________________________________ Prof. Dr. Luiz Augusto dos Santos Madureira Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
“A experiência nunca falha, apenas as nossas opiniões falham, ao esperar da experiência aquilo que ela não é capaz de oferecer.” Leonardo da Vinci
base de tudo. Obrigado mãe, te amo!
Ao meu professor orientador Eduardo Carasek, pela oportunidade de desenvolver esse trabalho de mestrado, pela confiança, pela orientação e principalmente pela transmissão de conhecimentos. Muito obrigado!
Ao Josias Merib, pela troca de conhecimentos e ensinamentos durante todo o período do mestrado. Meu muito obrigado, de verdade!
Aos meus amigos e colegas do laboratório CroMaas pelo companheirismo, conselhos e conversas descontraídos no laboratório, bares e festas. Vocês são demais!
Aos meus amigos Ana Paula, Fran, Bruna Reis, Laís, Nathália, Alana, Bruna Auras, Suélen, William, Lucas Verli, João, Nelson, Dani, Caroline, Helena, Janaína, Jéssica e Renata obrigado pelo apoio e por tantos momentos felizes juntos.
À minha família que sempre me deu total apoio na minha jornada acadêmica e que sempre entendeu minha ausência nos momentos familiares.
Às amizades que fiz durante meus estudos para os concursos públicos, especialmente a Leilane, Flávia, Felipe, Manuella, Gustavo, Amanda, Rebecca, Ana, Milena e Helena pela troca de conhecimentos e também por todos os momentos de sofrimento e angústia que passamos juntos durante os estudos e também esperando os resultados, que para a maioria de nós foram muito positivos. Obrigado a todos e que venha a tão sonhada nomeação dos futuros Peritos Criminais!
Aos meus amigos e outras pessoas que de alguma forma estiveram envolvidas nessa trajetória, meu muito obrigado!
À UFSC por conceder o espaço físico, materiais didáticos, ensino público e de qualidade para a conclusão dessa etapa.
Aos professores que compartilharam seus conhecimentos comigo durante o período do mestrado. Sem vocês, o país não avança! Obrigado!!!
ponteiras descartáveis (DPX) para a determinação de praguicidas em urina humana em casos de envenenamento. Os praguicidas eleitos como analitos para serem estudados nesse trabalho foram o oxamil, propoxur, carbofurano, 3-hidroxicarbofurano, carbaril, metiocarbe, terbufós, metilparation, malation, clorpirifós e o endosulfano. A ponteira que foi adquirida comercialmente e utilizada para as extrações desses compostos possui capacidade de 5 mL e contém no seu interior 20 mg de material sorvente constituído de estireno-divinilbenzeno, um material polimérico com características apolares, ideal para a extração dos praguicidas escolhidos. As otimizações dos principais parâmetros que afetam a eficiência de extração dessa técnica de preparo de amostra foram realizadas de forma univariada e multivariada, sendo as condições ótimas de extração constituídas de 5 ciclos de extração de 30 segundos e 5 ciclos de dessorção de 15 segundos com 250 µL de acetato de etila. A eluição do extrato foi realizada em um frasco contendo cerca de 100 mg de sulfato de sódio anidro na qual 1 µL foi injetado manualmente em um cromatógrafo gasoso acoplado a espectrometria de massas (GC-MS) para que os analitos fossem separados e identificados. O método desenvolvido passou por uma etapa de validação na qual apresentou coeficientes de determinação superiores a 0,9911 para todos os analitos estudados, os valores de limite de detecção (LOD) foram de 0,76 e 1,52 µg L-1 e de
quantificação (LOQ) foram de 2,5 e 5,0 µg L-1. Os ensaios de recuperação
apresentaram valores na faixa de 63 a 118%, a precisão intra-dia variou de 0,7 a 15,3% e a de inter-dia de 4,9 a 13,1%. O tempo total necessário para o procedimento de extração é de cerca de 4 min para cada amostra e a corrida cromatográfica é de 24 min, o que caracteriza um método rápido e eficiente para análises toxicológicas forenses em urina humana na identificação das causas de envenenamentos por praguicidas.
Palavras-chave: praguicidas, agrotóxicos, toxicologia forense, urina, DPX, GC-MS.
(DPX) for the determination of pesticides in human urine in poisoning cases was proposed. The pesticides chosen as analytes in this work were oxamyl, propoxur, carbofuran, 3-hydroxycarbofuran, carbaryl, methiocarb, terbufos, methylparation, malation, chlorpyrifos and endosulfan. The tip that was commercially acquired and used for extractions of these compounds has a capacity of 5 mL and contains 20 mg of sorbent material composed of styrene-divinylbenzene, a polymeric material with non-polar characteristics, ideal for the extraction of pesticides. The optimization of the main parameters that affect the extraction efficiency of this sample preparation technique was performed in a univariate and multivariate way. The optimal extraction conditions were 5 extraction cycles of 30 seconds and 5 desorption cycles of 15 seconds with 250 μL of ethyl acetate. Elution of the extract was performed in a vial containing about 100 mg of anhydrous sodium sulfate and 1 μl was manually injected into a gas chromatographer coupled to mass spectrometry (GC-MS) where the analytes were separated and identified. The method developed was validated and showed determination coefficients higher than 0.9911 for all analytes, the limits of detection (LOD) were 0.76 and 1.52 µg L-1 and the limits of quantification (LOQ)
were 2.5 and 5.0 µg L-1. The recoveries presented values ranging from 63
to 118%, intra-day precision ranged from 0.7 to 15.3% and inter-day from 4.9 to 13.1%. The total time required for the extraction procedure is about 4 min for each sample and the chromatographic run is 24 min, which characterizes a rapid method for forensic toxicological analyzes in human urine for identification of the causes of poisonings by pesticides.
intoxicação humana. ... 29 Figura 2 – Exemplos de cartuchos comerciais de SPE. ... 37
Figura 3 – Esquema da ponteira utilizada na técnica de DPX. ... 39
Figura 4 – Estrutura da fase extratora da ponteira do tipo DPX-RP composta do copolímero estireno-divinilbenzeno. ... 41 Figura 5 – Etapas do procedimento de extração utilizando a técnica de DPX. ... 43 Figura 6 – Procedimento do preparo da ponteira de DPX e acoplamento com a seringa. ... 51 Figura 7 – Cromatograma da separação cromatográfica no GC-MS no modo SCAN com a injeção de 1 µL da mistura de padrões com concentração de 5 e 10 mg L-1 no modo splitless. ... 60
Figura 8 – Gráfico da otimização do modo de ciclo de extração. ... 61
Figura 9 – Superfície resposta da otimização do(s) solvente(s) de dessorção líquida. ... 62 Figura 10 – Superfície resposta obtida para a otimização do número de ciclos e tempo de extração. ... 64 Figura 11 – Superfície resposta obtida para a otimização do número de ciclos e tempo de dessorção. ... 65 Figura 12 – Gráfico da otimização da etapa de limpeza e de condicionamento. ... 66 Figura 13 – Diagrama do procedimento de preparo de amostra otimizado do método desenvolvido nesse trabalho. ... 68
toxicidade segundo a OMS. ... 27 Tabela 2 – Número de casos, óbitos e porcentagem de letalidade por classe de agente tóxico reportados pelo CIATox/SC no período de 2008 a 2013. ... 28 Tabela 3 – Estrutura molecular, classe, pKa e toxicidade dos analitos estudados nesse trabalho. ... 32 Tabela 4 – Diferentes tipos de fase extratora comerciais com seus respectivos usos para a técnica de extração com DPX. ... 40 Tabela 5 – Trabalhos reportados da literatura e suas aplicações em análises utilizando a técnica de DPX no preparo de amostra. ... 47 Tabela 6 – Informações dos íons em relação às razões massa/carga dos analitos. ... 53 Tabela 7 – Planejamento da otimização do modo de ciclo de extração. ... 54 Tabela 8 – Planejamento de superfície triangular para a escolha do solvente ou mistura de solventes na etapa de dessorção líquida. ... 55 Tabela 9 – Planejamento Doehlert para a otimização do número de ciclos e tempo de extração. ... 56 Tabela 10 – Planejamento Doehlert para a otimização do número de ciclos e tempo de dessorção. ... 57 Tabela 11 – Tempos de retenção dos analitos obtidos na separação cromatográfica. ... 59 Tabela 12 – Equação da reta, faixa linear de trabalho, coeficiente de determinação, limite de detecção e de quantificação para os analitos. .. 69
Tabela 13 – Resultados obtidos através de ensaios de recuperação para a avaliação da exatidão e precisão do método desenvolvido. ... 71 Tabela 14 – Comparação do método desenvolvido com outros reportados na literatura. ... 73
Microextraction
CIATox/SC – Centro de Informação e Assistência Toxicológica de Santa Catarina
DL50 – Dose Letal Média
DPX – Extração em Ponteiras Descartáveis, do inglês Disposable Pipette Extraction
FAO – Organização para Agricultura e Alimentação das Nações Unidas GC – Cromatografia Gasosa, do inglês Gas Chromatography
GC/ECD/FPD – Cromatografia Gasosa com Detector de Captura de Elétrons e Detector Fotométrico de Chama, do inglês Gas Chromatography/Electron Capture Detector/Flame Photometric Detector
GC-IT-MS/MS – Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas com analisador do tipo Ion Trap, do inglês Gas Chromatography – Ion Trap – Mass Spectrometry/Mass Spectrometry
GC-MS – Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas, do inglês Gas Chromatography – Mass Spectrometry
GC-MS/MS – Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas, do inglês Gas Chromatography – Mass Spectrometry/Mass Spectrometry
GC-MS-µECD – Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas e ao Micro Detector de Captura de Elétrons, do inglês Gas Chromatography – Mass Spectrometry – Micro Electron Capture Detector
IGP-SC – Instituto Geral de Perícias de Santa Catarina Kow – Coeficiente de partição óleo/água
LC – Cromatografia Líquida, do inglês Liquid Chromatography
LC-ESI/MS/MS – Cromatografia Líquida com Ionização por Eletro Spray acoplado à Espectrometria de Massas, do inglês Liquid Chromatography – Electrospray Ionization/Mass Spectrometry/Mass Spectrometry
LC-MS/MS – Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas, do inglês Liquid Chromatography – Mass Spectrometry/Mass Spectrometry
LLE – Extração Líquido-Líquido, do inglês Liquid-Liquid Extraction LOD – Limite de Detecção, do inglês Limit of Detection
OMS – Organização Mundial da Saúde r² – Coeficiente de Determinação
RP – Fase Reversa, do inglês Reverse Phase
RSD – Desvio Padrão Relativo, do inglês Relative Standard Deviation SBSE – Extração Sortiva em Barra de Agitação, do inglês Stir Bar Sorptive Extraction
SIM – Monitoramento de Íon Selecionado, do inglês Selected Ion Monitoring
SPE – Extração em Fase Sólida, do inglês Solid Phase Extraction SPME – Microextração em Fase Sólida, do inglês Solid Phase Microextraction
UHPLC-QqQ-MS/MS – Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas com Triplo Quadrupolo, do inglês Ultra-High Performance Liquid Chromatography – Triple Quadrupolo - Mass Spectrometry/Mass Spectrometry
1 INTRODUÇÃO ... 21 2 REVISÃO DA LITERATURA ... 23 2.1 Toxicologia ... 23 2.1.1 Toxicologia Forense ... 24 2.2 Praguicidas ... 24 2.3 Analitos estudados ... 29 2.4 Preparo de amostra ... 35
2.4.1 Extração em ponteiras descartáveis ... 38
3 OBJETIVOS ... 49 3.1 Objetivo geral ... 49 3.2 Objetivos específicos ... 49 4 METODOLOGIA ... 50 4.1 Materiais e reagentes ... 50 4.2 Amostras de urina... 50
4.3 Preparo da ponteira descartável ... 50
4.4 Instrumentação e condições cromatográficas ... 51
4.5 Otimizações da técnica de extração em ponteiras descartáveis ... 53
4.5.1 Condições fixadas inicialmente ... 53
4.5.2 Otimização do modo de ciclo de extração... 54
4.5.3 Otimização do(s) solvente(s) da dessorção líquida... 54
4.5.5 Otimização do número de ciclos e tempo de dessorção ... 56
4.5.6 Otimização da etapa de limpeza e de condicionamento... 57
4.6 Validação da metodologia desenvolvida ... 57
4.7 Programas utilizados na análise dos dados ... 58
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 59
5.1 Otimização da separação cromatográfica ... 59
5.2 Otimizações da técnica de extração em ponteiras descartáveis ... 60
5.2.1 Otimização do modo de ciclo de extração ... 60
5.2.2 Otimização do(s) solvente(s) da dessorção ... 61
5.2.3 Otimização do número de ciclos e tempo de extração ... 63
5.2.4 Otimização do número de ciclos e tempo de dessorção ... 64
5.2.5 Otimização da etapa de limpeza e de condicionamento... 66
5.2.6 Estudo da adição de sal no frasco contendo o extrato... 67
5.3 Procedimento de preparo de amostra otimizado ... 67
5.4 Validação da metodologia desenvolvida ... 68
5.5 Comparação do método proposto com métodos descritos na literatura ... 72
7 PERSPECTIVAS ... 75
REFERÊNCIAS ... 76
1 INTRODUÇÃO
Desde que produtos destinados ao controle de pragas se tornaram comercialmente disponíveis em mercados e farmácias, eles têm sido utilizados de maneira irregular em todas as regiões do país e do mundo, o que aumentou os casos de intoxicação intencionais ou não por esses compostos. Casos de envenenamento reportados por diversos países mostram que há cerca de 250 mil a 370 mil mortes associadas a esse tipo de intoxicação a cada ano (KIR et al., 2013). A Organização Mundial de Saúde (OMS) relata que casos de morte por envenenamento devido ao contato com praguicidas é um dos métodos mais comuns de suicídio no mundo todo, sendo assim considerado um problema de saúde pública (WHO, 2018).
Dentre os compostos pertencentes à classe dos praguicidas, as substâncias presentes no grupo dos inseticidas são as mais frequentemente encontradas nas análises toxicológicas de material biológico como urina, sangue e conteúdo gástrico provenientes da autópsia de cadáveres que apresentam morte suspeita ou de maneira não natural, sendo pertinente uma análise toxicológica para consolidar as causas da morte desse indivíduo (YAYCI et al., 2004; LEVINE, 2005). A descoberta das causas dessas mortes é de extrema importância para a justiça, sendo assim, métodos de determinação de praguicidas em fluídos biológicos têm sido estudados ao longo dos anos (PARK et al., 2009).
Para a análise de matrizes biológicas é necessária uma etapa chamada de preparo de amostra que tem como objetivo separar o analito da matriz e também fazer a pré-concentração deles para serem posteriormente analisados pela técnica analítica mais adequada (QUEIROZ et al., 2001). Dentre as técnicas de preparo de amostra, a extração líquido-liquido e a extração em fase sólida têm recebido destaque, principalmente aquelas derivadas dessas duas, que são técnicas miniaturizadas e chamadas de técnicas de microextração (JAIN et al., 2016).
Uma das técnicas que tem sido bastante empregada na análise de praguicidas é a extração em ponteiras descartáveis (DPX) que foi desenvolvida por William E. Brewer da Universidade da Carolina do Sul (BREWER, 2014). Essa técnica utiliza uma ponteira contendo um tipo de material sorvente no seu interior que é capaz de interagir com o analito, fazendo com que ele seja extraído da matriz e pré-concentrado para posterior análise em um instrumento analítico adequado (PINTO et al., 2015).
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Desta forma, o desenvolvimento de um método de preparo de amostra rápido e eficiente para a extração de um vasto número de compostos pertencentes à classe dos inseticidas requisitando um baixo volume de amostra de urina humana torna-se indispensável no esclarecimento das causas da morte em casos de envenenamento por praguicidas no âmbito forense, sendo este o objetivo principal desse trabalho.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Toxicologia
A Toxicologia é uma ciência multidisciplinar que estuda os efeitos adversos provenientes da interação de substâncias químicas com o organismo vivo (LEVINE, 2005). A história da Toxicologia é acompanhada pela história da nossa civilização, pois desde os primórdios o homem já tinha conhecimento sobre os efeitos tóxicos do veneno de um vasto número de plantas e de alguns animas presentes naquela época, na qual o veneno dessas espécies era geralmente utilizado na caça como uma arma contra o inimigo que era capaz de acelerar a morte através da paralisia do músculo cardíaco e da musculatura esquelética (OGA, 2014). O primeiro registro que se tem na história sobre substâncias tóxicas é datado de 1500 a.C. chamado de Papiro de Ebers, na qual lista cerca de 800 substâncias ativas, em que incluía metais como chumbo e cobre, venenos de animais e um vasto número de vegetais tóxicos. Ao longo dos anos essa lista foi crescendo com a contribuição da identificação de novos agentes tóxicos e terapêuticos por diferentes pesquisadores, onde a primeira classificação dessas substâncias em veneno de animais, vegetais e minerais foi realizada por Dioscórides (40-90 d.C.) (OGA, 2014).
A Toxicologia evoluiu pouco nos séculos XVII e XVIII com os métodos de estudos ainda muito empíricos, mas um personagem chamado de Philippus Aureolus Theophrastus Bombastus von Hohenheim-Paracelsus (1493-1541) merece destaque graças aos seus estudos revolucionários na época que envolviam as áreas de toxicologia, farmacologia e terapêutica. Philippus ficou muito conhecido com o seu postulado: “todas as substâncias são venenos, a dose correta é que diferencia o veneno do remédio” (OGA, 2014).
A partir dessa época, muito progresso foi feito na área da Toxicologia, desde estudos de venenos de serpentes, estudos dos efeitos provenientes da exposição em minas de mineração, introdução de conceitos de toxicidade em órgãos-alvo e a descrição de mecanismos de ação de vários agentes tóxicos e de fármacos. Sendo o auge desse progresso a introdução de técnicas analíticas para a identificação e quantificação desses agentes tóxicos em tecidos na tentativa de comprovar as causas dos envenenamentos, surgindo assim a Toxicologia Forense (PASSAGLI, 2009; OGA, 2014).
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2.1.1 Toxicologia Forense
A Toxicologia Forense é uma das áreas da Toxicologia com finalidade legal em favor da justiça, sendo sua maior aplicação a identificação de qualquer substância química que possa causar danos ou até mesmo a morte de um ser humano (PASSAGLI, 2009; KLAASSEN e WATKINS, 2012).
Essa ciência é conhecida por ser geralmente aplicada para identificar substâncias como álcool e/ou drogas em motoristas e testes em urina humana para revelar abuso de algum tipo de droga. Mas as análises realizadas pela Toxicologia Forense são muito mais abrangentes, uma vez que visa a identificação de qualquer tipo de substância química relacionada à investigação das causas que levaram algum indivíduo ao óbito (LEVINE, 2005).
Para o melhor entendimento sobre o papel das substâncias químicas na intoxicação de uma pessoa, a experiência prática do toxicologista forense aliado ao uso de técnicas analíticas modernas e análises sistemáticas se tornam extremamente importantes. O agente toxicante pode estar presente na forma livre na matriz ou estar ligado a proteínas e a outros possíveis constituintes celulares, sendo assim, é necessário um prévio tratamento da amostra com o objetivo de isolar a substância da matriz antes de ser analisada (KLAASSEN e WATKINS, 2012).
Geralmente qualquer morte suspeita e/ou não natural é sujeita a passar por uma investigação forense como por exemplo nos casos de mortes que envolvem trauma ou violência, mortes que são potencialmente suspeitas de suicídio ou resultados de atividades criminais. A análise inicia-se no momento da autópsia do corpo com a coleta de diversas amostras biológicas para serem posteriormente analisadas por um toxicologista forense tais como sangue, urina, humor vítreo, fígado e conteúdo gástrico. As principais classes de substâncias de interesse forense as drogas de abuso, medicamentos e outras substâncias como os praguicidas que geralmente são encontradas em casos de envenenamento (LEVINE, 2005).
2.2 Praguicidas
Os praguicidas, segundo a Organização para Agricultura e Alimentação das Nações Unidas (FAO), são substâncias ou misturas de substâncias introduzidas deliberadamente no ambiente visando a prevenção, destruição, repulsão ou amenização de pragas. Esse termo
também inclui as substâncias químicas destinadas a regularização do crescimento de plantas, desfolhamento, dessecamento, aos agentes para reduzir a densidade ou evitar a queda prematura dos frutos e também as substâncias que são aplicadas sobre as culturas antes e depois da colheita a fim de preservar o produto obtido no transporte e na armazenagem (OGA, 2014).
Na legislação brasileira (Lei nº 7.802/89), uma definição semelhante à da FAO é para agrotóxicos, que substitui o termo defensivo agrícola, com a intenção de denominar os venenos agrícolas e colocar em evidência a toxicidade que esses produtos apresentam tanto para o meio ambiente quanto para os seres humanos. É importante ressaltar que o termo “pesticidas” (tradução da palavra pesticides) é usada erroneamente na língua portuguesa como sinônimo da palavra praguicidas, já que peste não significa praga na nossa língua, ou seja, não se aplica nesse contexto (OGA, 2014).
Os praguicidas são classificados em diferentes classes que se baseiam nos padrões de uso e no tipo de praga que se deseja combater, sendo as principais: inseticidas (insetos), herbicidas (erva daninha), fungicidas (fungos e bolores), rodenticidas (roedores), acaricidas (ácaros), moluscicidas (caracóis e outros moluscos), larvicidas (larvas) e pediculicidas (piolho). Além dessas classificações, existe outra classificação mais ampla na qual inclui reguladores de crescimento de plantas, repelentes e atrativos (ferormônios) (KLAASSEN e WATKINS, 2012).
A exposição dos praguicidas pode ocorrer de diferentes maneiras sendo elas por via oral, dérmica ou por inalação. O contato por via oral pode acontecer através da ingestão de altas doses, o que leva a um estado de grave intoxicação com uma alta possibilidade da ocorrência de óbito, esse tipo de contato é geralmente advindo da ingestão intencional com o objetivo de causar suicídio ou ingestão acidental devido ao incorreto armazenamento desses compostos em embalagens inadequadas. Entretanto, pequenas doses desses compostos são ingeridas pela população mundial diariamente advindas do consumo de alimentos ou de água, ambos contendo resíduos desses contaminantes (KLAASSEN e WATKINS, 2012).
Os indivíduos que possuem maior risco de contato com os praguicidas são os trabalhadores envolvidos na produção, transporte, mistura e aplicação desses compostos, bem como, os trabalhadores que trabalham na colheita de lavouras que são pulverizadas com esses produtos. Nesses casos, acontece o contato por via dérmica, seja ele na
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aplicação e manuseio ou por derramamento acidental desses compostos. O contato dérmico ocorre principalmente em áreas do corpo não protegidas com vestes ou equipamentos de proteção, como por exemplo nas mãos e na face ou por inalação (KLAASSEN e WATKINS, 2012).
Um dos efeitos negativos do uso dos praguicidas é que nem sempre eles são seletivos para as espécies-alvo, sendo assim, efeitos adversos podem ser observados em outros organismos não alvo e até mesmo em seres humanos. Devido a estes efeitos adversos causados na população, como por exemplo a intoxicação, a Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda que os praguicidas sejam classificados com base no seu grau de toxicidade que é estabelecida nos resultados de testes de toxicidade oral e dérmica em ratos (KLAASSEN e WATKINS, 2012). A classificação dos praguicidas segundo o grau de toxicidade pela OMS está mostrado na Tabela 1.
Tabela 1 – Classificação dos praguicidas baseado no seu grau de toxicidade segundo a OMS.
Classe
DL50 em ratos (mg/kg peso corporal)
Oral Dérmica
Sólidos Líquidos Sólidos Líquidos Ia Extremamente tóxico 5 ou menos 20 ou menos 10 ou menos 40 ou menos Ib Altamente tóxico 5 – 50 20 – 200 10 – 100 40 – 400 II Moderadamente tóxico 50 – 500 200 – 2000 100 – 1000 400 – 4000 III Levemente tóxico Acima de 500 Acima de 2000 Acima de 1000 Acima de 4000 IV+ Pouco provável que apresente toxicidade em condições normais Acima de 2000 Acima de 3000 Acima de 4000 Acima de 6000
Fonte: Adaptado de KLAASSEN e WATKINS (2012).
No estado de Santa Catarina, através das informações publicadas pelo Centro de Informação e Assistência Toxicológica de Santa Catarina (CIATox/SC), ocorreram 2.780 casos de intoxicação por agrotóxicos entre 2008 e 2013, com 102 casos fatais, sendo a morte causada pela intoxicação por agrotóxicos a que causou o maior número de mortes em relação aos outros tipos de intoxicação envolvendo outros agentes, como mostrado na Tabela 2.
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Tabela 2 – Número de casos, óbitos e porcentagem de letalidade por classe de agente tóxico reportados pelo CIATox/SC no período de 2008 a 2013. Classe de agente Nº de casos Nº de óbitos Letalidade (%) Medicamentos 15.803 91 0,58 Animais peçonhentos 15.232 12 0,08 Diagnóstico diferencial 6.095 10 0,16
Animais não peçonhentos 4.068 - -
Produtos químicos domissanitários 3.808 6 0,16 Agrotóxicos 2.780 102 3,67 Produtos químicos industriais 2.595 5 0,19 Drogas de abuso 1.965 53 2,70 Raticidas 1.596 1 0,06
Agrotóxicos uso doméstico 1.234 2 0,16
Plantas 794 1 0,13 Cosméticos 464 - - Produtos veterinário 416 5 1,20 Metais 185 - - Alimentos 108 - - Outros 138 2 1,45 Total 57.281 290 0,51
Fonte: Adaptado de CIATox/SC (2018).
No último relatório publicado em 2015 pelo CIATox/SC, os agrotóxicos estiveram envolvidos em 668 casos de intoxicação, sendo estes casos ocorridos de maneira isolada ou em associação com outras classes de agentes, abrangendo cerca de 794 substâncias diferentes. A circunstância mais frequente envolvendo a intoxicação por agrotóxicos foi a tentativa de suicídio (42,9%), seguida pela exposição acidental (30,7%) e ocupacional (23,2%).
A Figura 1 mostra os agrotóxicos que são frequentemente mais encontrados nos casos de intoxicação por essa classe de agente. Dentre os 594 casos reportados nessa figura, 372 envolveram intoxicação pelo grupo dos inseticidas, o que corresponde a cerca de 63% dos casos e
demonstra que esse grupo de substâncias geralmente é o mais encontrado em casos de intoxicação (CIATox/SC, 2016).
Figura 1 – Agrotóxicos encontrados mais frequentemente nos casos de intoxicação humana.
Fonte: CIATox/SC (2016).
Os dados acima mostram que os casos de intoxicação intencional ou não intencional por praguicidas são um problema público de saúde no estado de Santa Catarina. Mas estudos mostram que esse problema assola também o mundo inteiro, em que todos os anos morrem cerca de 250 a 370 mil pessoas devido a ingestão desse tipo de substância química. A OMS reconhece os casos de envenenamento por praguicidas um dos principais meios de suicídio no mundo todo, sendo os inseticidas o grupo de compostos que causam a maior parte das mortes (WHO, 2018). 2.3 Analitos estudados
Nesse trabalho, os analitos estudados são todos pertencentes à classe dos inseticidas, já que são os maiores causadores das mortes por envenenamento. Essa classe pode ser dividida em quatro principais grupos: carbamatos, organofosforados, organoclorados e piretróides (KLAASSEN e WATKINS, 2012; OGA, 2014), onde nesse trabalho serão estudados apenas analitos pertencentes às três primeiras classes.
Os compostos pertencentes ao grupo dos carbamatos são formados por derivados do ácido N-metil-carbâmico e dos ácidos tiocarbamatos e ditiocarbamatos, cada derivado apresenta toxicidade
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diferente e consequentemente usos distintos. Os carbamatos apresentam baixa pressão de vapor e baixa solubilidade em água, sendo moderadamente solúveis em benzeno e tolueno e altamente solúveis em metanol e acetona (LARINI, 1999; OGA, 2014).
Já os compostos pertences ao grupo dos organofosforados são ésteres amido ou tiol-derivados dos ácidos fosfórico, fosfônico, fosforotióico e fosfonotióico. Possuem alta suscetibilidade de sofrer hidrólise e apresentam alta lipossolubilidade, ou seja, alto coeficiente de partição óleo/água (Kow) (LARINI, 1999; OGA, 2014).
Os carbamatos e os organofosforados são geralmente absorvidos pela pele, vias aéreas e pelo trato gastrointestinal e sua absorção pode ser muitas vezes acelerada pelos solventes que compõem a formulação do praguicida. Após absorvido, esses compostos são distribuídos para todos os tecidos onde sofrem a biotransformação, processo este que ocorre principalmente no fígado com a função de transformar os compostos em espécies que são mais facilmente excretadas pelo organismo. A eliminação destes compostos ocorre principalmente pela urina e fezes, na qual uma pequena parcela é eliminada sem modificação. O fígado é o principal órgão responsável pela realização de reações químicas de oxidação, redução, clivagem hidrolítica e conjugação na biotransformação dos inseticidas organofosforados para a excreção na urina. Já para os inseticidas do grupo dos carbamatos as reações de maior importância compreendem a hidrólise, hidroxilação do grupamento N-metil e hidroxilação do anel aromático. (LARINI, 1999; OGA, 2014).
Os compostos dos grupos dos carbamatos e dos organofosforados são inseticidas anticolinesterásicos, ou seja, seu mecanismo de ação tóxica no organismo deve-se à inibição enzimática da acetilcolinesterase neuronal, que é uma enzima com a função de degradar o neurotransmissor acetilcolina em colina e ácido acético na sinapse nervosa fazendo com que o neurônio retorne ao estado de relaxamento após a transmissão do impulso nervoso. Com a inibição dessa enzima pelo contato com esses compostos, ocorre o acúmulo de acetilcolina nas terminações nervosas, o que leva o organismo a uma síndrome colinérgica aguda surgindo alguns sinais e sintomas muscarínicos, nicotínicos e no sistema nervoso central, na qual essas manifestações são totalmente dependentes da dose, da via de exposição, taxa de absorção e da toxicidade envolvidas na ocorrência. Os principais sintomas em casos de intoxicação por esses compostos são a alternância de miose (diminuição da pupila) e midríase (dilatação da pupila), lacrimejamento, visão turva, salivação excessiva, bradicardia, hipotensão, taquipneia, insuficiência
respiratória, paralisia respiratória e morte (OGA, 2014; MOREAU et al., 2014)
Já os compostos pertencentes ao grupo dos organoclorados são cíclicos e com baixa volatilidade, sendo estimulantes do sistema nervoso central. São compostos que apresentam bioacumulação, biomagnificação e persistência por várias décadas o que traz sérios danos ao meio ambiente e aos seres vivos. São absorvidos pela pele e pelo trato digestivo e respiratório, apresentando alta lipossolubilidade o que facilita a sua distribuição e deposição no tecido adiposo. A eliminação é feita principalmente pela via biliar, onde a maioria dos compostos geram produtos de biotransformação na urina principalmente através de reações de oxidação (LARINI, 1999; OGA, 2014).
A atuação dos inseticidas organoclorados no organismo se dá principalmente na alteração das propriedades eletrofisiológicas presentes na membrana dos neurônios e das enzimas relacionadas como a Na+
-ATPase e K+-ATPase, modificando a cinética do fluxo dos íons sódio e
potássio, o que resulta na alteração da transmissão de impulso nervoso, levando a disparos repetitivos do estímulo nervoso. As manifestações clínicas causadas pela intoxicação com organoclorados também são dependentes do organismo envolvido, da via de exposição e do veículo utilizado como diluente, sendo os principais sintomas as náuseas, vômitos, desconforto abdominal, diarreia, cefaleia, tremores, convulsões e a morte (PASSAGLI, 2009; OGA, 2014).
Em casos de intoxicações graves, principalmente naqueles que levam o indivíduo a óbito, os praguicidas podem ser encontrados na urina na forma não metabolizada, pois o intervalo entre a ingestão e a morte é insuficiente para ocorrer a biotransformação do agente tóxico (STACEY e WINTER, 2004; VALENTE, 2012). Devido a esse fato, na literatura são reportados diferentes métodos de análises de praguicidas na sua forma não metabolizada em urina humana (JIA et al., 2008; CAZORLA-REYES et al., 2011; LÓPEZ et al., 2011).
A escolha dos analitos a serem estudados nesse trabalho deu-se a partir de informações cedidas pelo Instituto Geral de Perícias de Santa Catarina (IGP-SC), na qual o órgão relatou os principais praguicidas que são encontrados em análises toxicológicas forenses em casos de envenenamento. Dentre os analitos escolhidos, os compostos oxamil, propoxur, carbofurano, 3-hidroxicarbofurano, carbaril e metiocarbe pertencem ao grupo dos carbamatos; o terbufós, metilparation, malation e o clorpirifós são organofosforados e o endosulfano é um organoclorado.
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As estruturas moleculares, a classe, o valor de pKa e o grau de toxicidade destes compostos estão apresentados na Tabela 3.
Tabela 3 – Estrutura molecular, classe, pKa e toxicidade dos analitos estudados nesse trabalho.
Analito Estrutura molecular pKa a
Toxicidade - LD50 (mg/kg) b Carbamatos Oxamil 2,11 30 Propoxur - 51,2 Carbofurano - 10,2 3- hidroxicarbofu-rano 3,6 7
Carbaril 10,4 150 Metiocarbe - 16 Organofosforados Terbufós - 3,5 Metilparation - 57 Malation - 53
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Clorpirifós - 60
Organoclorado
Endosulfano - 26
a PPDB, 2018.
b LUZARDO et al., 2015; TOXNET, 2018.
2.4 Preparo de amostra
No universo da química analítica lida-se diariamente com a determinação de analitos presentes muitas vezes em baixas concentrações em matrizes complexas e cada etapa do processo analítico é extremamente relevante. Desde a coleta da amostra até o momento de processamento dos dados obtidos se está sujeito à introdução de pequenos erros que podem comprometer a qualidade final do resultado da análise (FUMES et al., 2015).
Devido a necessidade de assegurar a qualidade, a reprodutibilidade e a integridade dos dados, especialmente em algumas áreas como análises farmacêuticas, alimentares e forenses, algumas agências regulamentadoras requerem alguns procedimentos que incluem a validação do método e o tratamento estatístico dos dados a fim de se obter resultados confiáveis (FUMES et al., 2015).
Apesar dos avanços na instrumentação analítica nas últimas décadas, especialmente na área da cromatografia e da espectrometria de massas, ainda não é possível obter resultados desejados de análises de amostras complexas com a injeção direta da amostra no instrumento analítico sem uma etapa de pré-tratamento chamada de preparo de amostra (FUMES et al., 2015).
A etapa de preparo de amostra possui importância fundamental para o sucesso de qualquer método analítico, sendo essa etapa muitas vezes dependente tanto das características da matriz e de seus constituintes quanto dos analitos, o que requer a realização de otimizações apropriadas dos diferentes parâmetros de influência, principalmente no desenvolvimento de novos métodos analíticos. Há alguns anos atrás, essa etapa não recebia a devida atenção, mas com os avanços da instrumentação analítica, esforços têm sido feitos na intenção de melhorar e desenvolver novas e diferentes técnicas de preparo de amostra (ASENSIO-RAMOS et al., 2011).
Na etapa de preparo de amostra, visam-se algumas características importantes, tais como a rapidez, a simplicidade, o aumento da seletividade e da especificidade, o baixo custo, o potencial de automação ou a utilização de métodos on-line. Outra característica importante é o uso de pequenas quantidades ou nenhuma de solventes orgânicos visando assim uma menor agressão ao meio ambiente e a redução do desperdício gerado nos laboratórios de análises (SAITO et al., 2003; SMITH et al., 2003).
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A etapa de preparo de amostra tem como principal objetivo separar os analitos da matriz da amostra e/ou concentrá-los para análises em nível traço. Tendo em vista os problemas que podem surgir da introdução direta desse tipo de amostra no instrumento analítico, analistas comumente utilizam essa etapa para evitar possíveis danos ao aparelho (ROCHA et al., 2013).
Ao passar dos anos foram desenvolvidas técnicas de preparo de amostras que hoje em dia são consideradas técnicas tradicionais, tais como a extração sólido-líquido, conhecido como Soxhlet, a extração líquido-líquido (LLE, do inglês Liquid-Liquid Extraction) e a extração em fase sólida (SPE, do inglês Solid Phase Extraction) (BOYACI et al., 2015).
As técnicas Soxhlet e LLE são muito lentas e trabalhosas, requisitando grandes volumes de solventes orgânicos nas extrações e subsequentemente necessidade de um procedimento de evaporação para se obter uma concentração do analito significativa para análises em nível traço. Além disso, a evaporação dos solventes no ambiente do laboratório pode causar prejuízos à saúde do analista (BIDARI et al., 2011). Já a SPE traz algumas vantagens em relação às outras duas técnicas pois menores volumes de solventes orgânicos são utilizados nas extrações que ocorrem no interior de cartuchos comerciais utilizados apenas uma única vez, mas traz como desvantagem a grande quantidade de resíduos gerada (RODRIGUES et al., 2010). A Figura 2 mostra exemplos de cartuchos comerciais de SPE.
Figura 2 – Exemplos de cartuchos comerciais de SPE.
Fonte: SIGMA-ALDRICH (2018).
Os cartuchos convencionais de SPE são geralmente feitos com uma seringa de polipropileno com capacidade de 3 ou 5 mL contendo um material sorvente no seu interior com massa de 500 mg. Entretanto, com o passar dos anos, novos formatos e tamanhos foram desenvolvidos, utilizando menores massas de fase extratora e menores volumes, como por exemplo 100 mg de material contidos em uma seringa de 1 mL de capacidade. Alguns fabricantes também introduziram no mercado cartuchos ainda menores, contendo 10, 25 e 50 mg de sorvente (MAJORS, 2001).
Com o aumento da sensibilidade dos instrumentos analíticos ocorreu um avanço nas técnicas de preparo de amostra, em que se permite o uso de menores quantidades de amostra e consequentemente a necessidade de uso de menores massas de fase extratoras, na qual o volume de solvente e o tempo de análise também são reduzidos (FUMES et al., 2015).
Algumas técnicas que trazem esses avanços são as técnicas miniaturizadas de preparo de amostra, tais como a Microextração em Fase Sólida (SPME, do inglês Solid Phase Microextraction), a Extração Sortiva em Barra de Agitação (SBSE, do inglês Stir Bar Sorptive Extraction), a Microextração em Barra Adsortiva (BAµE, do inglês Bar Adsorptive Microextraction) e a Extração em Ponteiras Descartáveis (DPX, do inglês Disposable Pipette Extraction) (ARTHUR et al., 1990; BALTUSSEN et al., 1999; NOGUEIRA, 2013; BREWER et al., 2014).
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2.4.1 Extração em ponteiras descartáveis
Uma das técnicas baseada na extração em fase sólida e que foi empregada nesse trabalho é a DPX que foi desenvolvida pelo Dr. William E. Brewer, da Universidade da Carolina do Sul, no ano de 2003 através da patente de número US6566145 B2 (BREWER, 2014). Essa técnica traz uma modificação da convencional técnica de SPE com o principal objetivo de diminuir além da quantidade de material sorvente empregado como fase extratora, o tempo de extração e também a quantidade de solventes utilizados nas extrações (PINTO et al., 2015; BORDIN et al., 2016).
A modificação inédita trazida pela técnica de DPX é a utilização de uma ponteira convencional de laboratório com capacidade de 1 ou 5 mL, na qual no seu interior está contido uma certa quantidade de material sorvente acondicionado livremente entre dois filtros, sendo um deles colocado na extremidade inferior e outro na extremidade superior da ponteira, como mostrado na Figura 3. A função do primeiro filtro, que pode ser uma tampa de vidro sinterizado, de lã de vidro, de polímero poroso ou de metal, é proporcionar uma espécie de barreira permeável que permite a passagem livre dos fluídos em qualquer direção, seja na aspiração ou na dispersão, ao mesmo tempo em que retém a fase extratora contida no interior da ponteira. Já o segundo filtro, localizado na extremidade superior, tem a função de impedir a passagem de qualquer material sólido ou líquido para o interior do pipetador ou da seringa, o que assegura a não contaminação dos mesmos e consequentemente a retenção do material sorvente no interior da ponteira (PINTO et al., 2015).
Figura 3 – Esquema da ponteira utilizada na técnica de DPX.
Fonte: Adaptado de BORDIN et al. (2016).
A primeira ponteira de DPX que foi comercialmente disponível foi baseada na cromatografia clássica com a utilização de partículas C18 incorporadas com polímeros como fase extratora (CHAVES et al., 2015). A partir daí, como ocorreu com os cartuchos de SPE tradicionais, novos materiais sorventes foram introduzidos no mercado com diferentes mecanismos de extração específicos para cada grupo de analitos, conforme mostrado na Tabela 4.
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Tabela 4 – Diferentes tipos de fase extratora comerciais com seus respectivos usos para a técnica de extração com DPX.
Tipo de ponteira Composição da fase extratora Uso DPX-RP Estireno-divinilbenzeno Extração de compostos apolares e pouco polares.
Ex: praguicidas
DPX-CX Grupos ácido sulfônico
Extração de compostos básicos. Ex: drogas de caráter
básico
DPX-WAX Grupo poliamino
Extração de compostos ácidos.
Ex: drogas e metabólitos
DPX-WCX Grupos policarboxilato
Extração de compostos básicos.
Ex: especialmente amino glicosídeos
DPX-Si Sílica gel Limpeza (cleanup) de
amostras ambientais
DPX-C18 C18 (20% de sílica gel)
Remoção de interferentes presentes
na matriz DPX-SC Vazio ou com areia
(lavada com ácido)
Coleta de amostras sólidas
DPX-Blank Vazio
Desenvolvimento de métodos com novas
fases extratoras Fonte: Adaptado de PINTO et al. (2015).
Nesse trabalho foi utilizada a ponteira do tipo DPX-RP, na qual a fase extratora contida no interior da ponteira é constituída de estireno-divinilbenzeno, um copolímero com características hidrofóbicas
semelhante à fase estacionária utilizada em cromatografia líquida no modo de fase reversa, por isso a sigla RP, do inglês reverse phase (GUAN et al., 2010). Na Figura 4 está ilustrado a estrutura do copolímero estireno-divinilbenzeno.
Figura 4 – Estrutura da fase extratora da ponteira do tipo DPX-RP composta do copolímero estireno-divinilbenzeno.
Fonte: SIGMA-ALDRICH (2018).
O mecanismo de retenção dos analitos pela fase extratora contendo o estireno-divinilbenzeno da ponteira do tipo DPX-RP é baseado em interações hidrofóbicas e interações π-π com o anel aromático presente nessa estrutura. A combinação desses dois mecanismos fornece um elevado potencial para uma extração seletiva da maioria dos compostos utilizados como praguicidas. Devido à natureza hidrofóbica, o sorvente interage com os analitos através de forças de Van der Waals e a presença do anel aromático na maioria dos praguicidas melhora a retenção dos analitos pela interação π-π com o material sorvente (GUAN et al., 2010).
Recentemente, trabalhos da literatura têm demonstrado a eficiência de extração de novas fases extratoras não comerciais para a técnica de DPX. Em um dos trabalhos, a utilização de uma fase extratora de um copolímero de compósitos de polianilina e estireno-divinilbenzeno foi utilizado na determinação simultânea de fluoxetina e norfluoxetina em amostras de plasma sanguíneo (CHAVES et al., 2015). Em um outro trabalho, utilizou-se uma mistura de partículas de
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C18 com albumina de soro bovino como fase extratora na determinação de drogas em plasma sanguíneo de pacientes esquizofrênicos para o monitoramento terapêutico de drogas (PINTO et al., 2017). Já em outro estudo, a utilização de um material híbrido inorgânico (Si3Py+Cl−) como material sorvente na determinação de diferentes
desreguladores endócrinos fenólicos em amostras de água mostrou-se bastante eficaz, apresentando maior eficiência de extração quando comparado com uma ponteira contendo material sorvente comercial (CORAZZA et al., 2017). Esses estudos demonstram uma elevada tendência na pesquisa acadêmica focada no desenvolvimento de novos materiais sorventes para serem utilizados como fase extratoras na técnica de DPX, levando em consideração os analitos e a matriz pode-se depode-senvolver materiais com alta eficiência de extração e com alta seletividade almejando os objetivos da análise.
Como a técnica de DPX é uma variante da técnica de SPE, ela apresenta os mesmos princípios e etapas similares de extração baseados na afinidade do analito com o material sorvente contido no interior da ponteira (KOLE et al., 2011). As etapas do procedimento de extração utilizando a técnica de DPX está demonstrada na Figura 5.
Figura 5 – Etapas do procedimento de extração utilizando a técnica de DPX.
Fonte: Adaptado de PINTO et al. (2015).
Primeiramente, o material sorvente passa por uma etapa chamada de condicionamento com o objetivo de ativar os sítios ativos desse material, deixando-os livres para que ocorra a interação com os analitos da amostra. Essa etapa ocorre com a aspiração de um solvente apropriado para a ativação desses sítios seguido da aspiração de ar para aumentar a área de contato do material com o solvente e finalizado com a eluição do solvente da ponteira. A segunda etapa do procedimento de extração utilizando a técnica de DPX é a aspiração da amostra seguida de aspiração de ar para que ocorra o equilíbrio de sorção dos analitos da amostra com o sorvente contido na ponteira. Em seguida, a amostra é descartada do interior da ponteira e uma etapa opcional pode ser realizada, que é chamada de lavagem (cleanup), a fim de remover possíveis interferentes presentes na amostra com a passagem de um solvente ou mistura de solventes apropriado. Por fim, a última etapa é chamada de eluição, na qual um solvente ou mistura de solventes é utilizado a fim de eluir os analitos ligados ao material sorvente para dentro de um frasco, da qual o extrato pode ser injetado diretamente no
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instrumento analítico ou evaporado e reconstituído para posterior análise em uma técnica analítica adequada, visando a maior detectabilidade analítica (PINTO et al., 2015; BORDIN et al., 2016).
No desenvolvimento de metodologias analíticas utilizando a técnica de extração com DPX é importante verificar alguns parâmetros que podem influenciar na eficiência de extração dos analitos. Após escolhido o tipo de fase extratora baseado em algumas características presentes nos analitos como a polaridade, acidez, basicidade e grau de ionização para possível extração por troca iônica e também escolhida a massa de material sorvente contida na ponteira (ou realizar uma otimização para a escolha da massa), outros parâmetros que podem influenciar a eficiência de extração utilizando a técnica de DPX podem ser otimizados, tais como:
- Solvente de condicionamento da fase extratora: antes da primeira utilização da ponteira de DPX em extrações é aconselhável que se realize uma etapa chamada de condicionamento do material sorvente presente no interior da ponteira, mas em alguns casos essa etapa não se faz necessária. A principal função dessa etapa é a ativação dos sítios ativos presentes no material para que sua eficiência de extração seja a máxima possível, sendo assim, é necessário verificar qual o solvente ou a mistura de solventes que desempenham melhor essa ativação dos sítios ativos com uma otimização (KOLE et al., 2011; PINTO et al., 2015; BORDIN et al., 2016).
- Número de ciclos e tempo de equilíbrio de extração: o tempo de contato da amostra contendo os analitos com o material sorvente é chamado de tempo de extração, que pode ser otimizado a fim de obter uma maior eficiência de extração, visto que ela está baseada no equilíbrio de sorção do analito com a fase extratora, portanto, essa etapa requer otimização. Nessa otimização, pode-se avaliar a quantidade de ciclos de extração, que é quantidade de vezes que a mesma amostra ou alíquotas da amostra passam pelo processo de extração (PINTO et al., 2015).
- Solvente de cleanup: a etapa de limpeza tem como principal objetivo realizar uma limpeza para a remoção de possíveis interferentes presentes na amostra que ficaram aderidos na superfície do material sorvente. A escolha do solvente utilizado nessa etapa é baseada nas características do material sorvente, dos analitos e dos possíveis
interferentes da matriz. Em alguns casos, essa etapa não se faz necessária (KOLE et al., 2011; PINTO et al., 2015).
- Número de ciclos e tempo de equilíbrio de dessorção líquida: a fim de assegurar a completa dessorção dos analitos sorvidos na fase extratora, a etapa de dessorção líquida é de extrema importância e requer uma otimização adequada. Como na otimização do número de ciclos e tempo de equilíbrio de extração, o tempo de contato da fase extratora com o solvente de dessorção deve ser otimizado a fim de obter uma maior eficiência de dessorção, visto que ela está baseada no equilíbrio de dessorção do analito da fase extratora para o solvente. Nessa otimização, pode-se avaliar a quantidade de ciclos de dessorção, que é quantidade de vezes que o mesmo volume do solvente de dessorção é aspirado para o interior da ponteira de DPX (PINTO et al., 2015). - Solvente ou mistura de solventes de dessorção líquida: na etapa de dessorção líquida é importante utilizar um solvente de dessorção apropriado para atingir elevada dessorção dos analitos do material sorvente para o solvente que será injetado posteriormente em um instrumento analítico para ser analisado, portanto, a escolha desse solvente requer otimização (KOLE et al., 2011; PINTO et al., 2015). - Efeito da adição de sal: estudos mostram que a adição de sal na amostra melhora a eficiência de extração de compostos, principalmente daqueles com características polares, pois o sal interage com as moléculas de água que circundam as moléculas de analito em amostras aquosas, deixando assim o analito mais livre e suscetível a ser extraído da matriz, melhorando a eficiência de extração do mesmo. Geralmente utiliza-se como sal o cloreto de sódio, pois é um dos sais mais econômicos (ZHAO et al., 2002; PSILLAKIS et al., 2003).
- Efeito do pH da amostra: o pH da amostra é um parâmetro bastante importante nas extrações, pois dependendo da técnica de extração utilizada, é desejável que os analitos presentes na amostra estejam na forma ionizada ou na forma molecular. Baseado no valor do pKa do analito é possível saber em qual pH da amostra em que está contido faz com que ele esteja na sua maior proporção na forma molecular ou na forma ionizada. Sendo assim, se o interesse é extrair um vasto número de analitos com diferentes valores de pKa, é necessária uma otimização para verificar o pH na qual obtém-se uma eficiência de extração
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satisfatória para todos os analitos (BEDENDO et al., 2012; CARASEK et al., 2015).
As análises dos extratos provenientes da extração pela técnica de DPX podem ser realizadas através de diferentes técnicas, sendo a cromatografia líquida e a cromatografia gasosa as mais utilizadas (PINTO et al., 2015). A técnica de DPX aliada a técnicas cromatográficas tem sido muito aplicada em análises forenses, ambientais e alimentares em um vasto número de matrizes diferentes como mostrado na Tabela 5.
Tabela 5 – Trabalhos reportados da literatura e suas aplicações em análises utilizando a técnica de DPX no preparo de amostra.
Analito Matriz Técnica
analítica Tipo de material sorvente Referência Anfetaminas, cocaína, antidepressivos tricíclicos, meperidina, metadona e fenciclidina Urina GC-MS DPX-CX ELLISON et al., 2009 Praguicidas organoclorados e organofosforados Alimentos GC-MS DPX-WAX GUAN et al., 2009 Metanfetaminas e anfetamina Sangue GC-MS DPX-C18 HASEGAWA et al., 2007 Cocaína e nicotina Mecônio GC-MS DPX-CX MOZANER et
al., 2014 Opiáceos Humor vítreo GC-MS DPX-CX HASEGAWA et al., 2011 Explosivos Água LC-UV/vis DPX-RP GUAN et al., 2014 Canabinoides e
seus metabólitos Urina
LC-MS/MS DPX-WAX ANDERSSON et al., 2016 Praguicidas organoclorados, organofosforados e fungicidas Frutas e vegetais GC-MS DPX-RP GUAN et al., 2010 Antibióticos aminoglicosídeos Tecidos LC-MS/MS DPX-CX LEHOTAY et al., 2013 Fonte: Autoria própria (2018).
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De um modo geral, a técnica de extração de DPX apresenta diversas vantagens, tais como o uso de pipetadores multicanais para aumentar a frequência analítica, o fluxo do líquido pode ser bidirecional, contaminação é menos recorrente pois as ponteiras são descartáveis. Como são utilizadas menores massas de material sorvente, pequenas quantidades de amostra e de solvente orgânico são requeridas na etapa de extração, além de que o sistema de extração pode ser automatizado para atender grandes demandas de análises como em grandes laboratórios, o que permite também análises mais precisas e exatas (GUAN et al., 2009).
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
O principal objetivo do trabalho consiste no desenvolvimento de um procedimento eficiente de preparo de amostra para a extração de praguicidas em amostras de urina humana utilizando a extração em ponteiras descartáveis (DPX) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) como técnica de separação e detecção dos compostos de interesse.
3.2 Objetivos específicos
- Otimizar a separação e detecção dos analitos no GC-MS variando as temperaturas do injetor, da coluna, da rampa de aquecimento, da fonte de íons e da interface;
- Otimizar os parâmetros da técnica de DPX para a extração dos analitos em amostras de urina humana como o modo de ciclo de extração, tempo e número de ciclos de extração, tempo e número de ciclos de dessorção, solvente ou mistura de solventes para a dessorção líquida e limpeza e condicionamento entre as extrações;
- Determinar os parâmetros de validação da metodologia desenvolvida tais como a faixa linear de trabalho, coeficiente de determinação, limite de detecção, limite de quantificação, exatidão, precisão intra-dia e precisão inter-dia.
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4 METODOLOGIA
4.1 Materiais e reagentes
Uma mistura de padrões analíticos dos analitos pertencentes ao grupo dos carbamatos foi adquirida da Sigma-Aldrich com concentração de 100 mg L-1 em metanol. Os outros padrões dos analitos
foram adquiridos também da Sigma-Aldrich e com estes foram preparadas soluções estoque padrão individuais de cada analito com concentração de 100 mg L-1 em metanol. A partir dessas soluções, foi
preparada uma solução de trabalho em metanol contendo a mistura de padrões de todos os analitos com concentração de 5 mg L-1 dos analitos
pertencentes ao grupo dos carbamatos e de 10 mg L-1 dos outros
analitos. O metanol padrão HPLC foi adquirido na J.T. Baker, o acetato de etila padrão HPLC/GC na Sigma-Aldrich e a acetonitrila padrão HPLC na Merck. O sulfato de sódio anidro utilizado no interior do frasco de eluição da amostra foi adquirido da Vetec. As ponteiras descartáveis de 1 mL do tipo DPX-RP 20 mg e as ponteiras descartáveis de 5 mL sem material sorvente foram adquiridas da DPX Labs, todas elas já contendo os filtros superiores e inferiores. A microseringa de 10 µL foi adquirida da Hamilton. A seringa descartável com capacidade de 5 mL foi adquirida da Bd Solomed. A água ultrapura utilizada nos experimentos foi purificada por um aparelho Mega purity (Billerica, EUA).
4.2 Amostras de urina
Inicialmente, os ensaios de otimização foram realizados em amostras de água ultrapura e os analitos foram adicionados a essas amostras. Posteriormente, com todos os parâmetros já otimizados, o método foi validado em amostras de urina de integrantes do grupo de pesquisa que foram coletadas em frascos de vidro de 40 mL e estocadas sob refrigeração a 4 ºC até o momento da utilização. A amostra foi utilizada sem tratamento prévio e na temperatura ambiente, na qual os analitos também foram adicionados a essas amostras.
Para o desenvolvimento da metodologia foi utilizado uma ponteira descartável de 5 mL de capacidade contendo nenhum tipo de material sorvente no seu interior, na qual foi primeiramente retirado o filtro superior dessa ponteira e em seguida foi transferido os 20 mg de material sorvente proveniente da ponteira descartável de 1 mL de capacidade do tipo DPX-RP conforme mostrado na Figura 6. Após a transferência do material sorvente, o filtro foi colocado novamente na posição superior da ponteira descartável de 5 mL de capacidade. Posteriormente, a ponteira foi acoplada a uma seringa descartável de 5 mL de capacidade para ser utilizada nas extrações.
Figura 6 – Procedimento do preparo da ponteira de DPX e acoplamento com a seringa.
Fonte: Autoria própria (2018).
4.4 Instrumentação e condições cromatográficas
As análises cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo gasoso acoplado a espectrometria de massas da Shimadzu
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e modelo GC-MS-QP 2010 Plus. A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna da Restek e modelo Rtx®-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm de espessura do filme). O gás de arraste foi composto de hélio ultrapuro em fluxo constante de 1 mL/min. A temperatura do injetor foi 250 ºC e a temperatura inicial da coluna foi 50 ºC mantida por 1 min, depois a temperatura foi aumentada até 200 °C na taxa de 10 ºC/min e após atingida essa temperatura foi aumentada novamente até 255 ºC na taxa de 7 ºC/min, totalizando 24 min de corrida cromatográfica. O volume de injeção foi de 1 µL no modo splitless realizada manualmente. O espectrômetro de massas foi operado no modo de ionização por impacto de elétrons em 70 eV. A temperatura da fonte de íons foi fixada em 230 ºC e da interface em 280 ºC, sendo o tempo de corte do solvente de 2,5 min. A identificação dos analitos foi confirmada com a injeção dos padrões analíticos e com a presença dos íons majoritários (pico base) nos espectros de massa. A quantificação dos analitos foi realizada no modo SIM utilizando o íon de maior intensidade. As informações dos íons monitorados para a identificação e quantificação dos analitos estão mostradas na Tabela 6.
Tabela 6 – Informações dos íons em relação às razões massa/carga dos analitos. Analito Íons majoritários para a identificação (m/z) Íon usado na quantificação(m/z) Oxamil 42, 69, 72 72 Propoxur 27, 110, 152 110 Carbofurano 122, 149, 164 164 3-hidroxicarbofurano 137, 147, 180 147 Carbaril 115, 116, 144 144 Metiocarbe 109, 153, 168 168 Terbufós 57, 97, 231 97 Metilparation 109, 125, 263 109 Malation 125, 127, 173 173 Clorpirifós 97, 197, 199 97 Endosulfano 195, 197, 241 241
Fonte: Autoria própria (2018).
4.5 Otimizações da técnica de extração em ponteiras descartáveis
4.5.1 Condições fixadas inicialmente
O propósito do trabalho foi desenvolver uma metodologia para ser utilizada em laboratórios forenses, em que o fator tempo é de extrema importância. Sendo assim, nesse trabalho optou-se por utilizar ponteiras de DPX comerciais, sem a necessidade de preparação da ponteira com algum tipo de material sorvente não comercial antes das análises, o que levaria mais tempo e também possíveis erros na pesagem do material, já que a massa é em torno de poucos miligramas. Portanto, a ponteira comercial escolhida foi a DPX-RP de 5 mL com 20 mg de fase extratora, ideal para a extração de compostos com características apolares, como os praguicidas.
Visando limites de quantificação baixos, o volume de dessorção foi fixado em 250 µL, quantidade mínima suficiente para cobrir a massa de material sorvente de 20 mg na etapa de dessorção líquida, pois quanto menor o volume de solvente de dessorção, maior a concentração do analito no extrato e consequentemente menores limites são atingidos. O volume da amostra também foi fixado inicialmente em 5 mL, mas na etapa da obtenção das curvas de calibração para cada analito o volume de amostra de urina utilizado foi apenas de 100 µL.
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4.5.2 Otimização do modo de ciclo de extração
O modo de ciclo de extração é um fator importante que visa a máxima eficiência de extração dos analitos, para isso, é necessária uma otimização para saber qual modo é mais eficiente para alcançar o objetivo da análise. Para a técnica de extração utilizada nesse trabalho, existe na literatura dois modos de ciclo de extração, o primeiro e mais comum é quando uma alíquota de certo volume da amostra é aspirada para dentro da ponteira e depois é descartada seguindo para a aspiração de uma nova alíquota da mesma amostra, e o segundo modo, menos comum, é a aspiração de todo o volume da amostra para dentro da ponteira e depois é descartada de volta no mesmo frasco da amostra que segue para novas aspirações por vários ciclos conforme o trabalho de Konatu et al. (2017). Portanto, nesse estudo foi feito um planejamento de seis experimentos abrangendo os modos de ciclo de extração. Estes ensaios foram realizados em triplicata conforme a Tabela 7.
Tabela 7 – Planejamento da otimização do modo de ciclo de extração.
Método Modo de ciclo Tempo de
equilíbrio (s)
A 5 ciclos com 1 mL 60
B 5 ciclos com 1 mL 30
C 5 ciclos com 1 mL 0
D Todo volume de 5 mL por 10
vezes 0
E Todo volume de 5 mL por 20
vezes 0
F Todo volume de 5 mL por 30
vezes 0
Fonte: Autoria própria (2018).
4.5.3 Otimização do(s) solvente(s) da dessorção líquida
Para se obter uma boa eficiência de dessorção dos analitos foi realizada uma otimização do(s) solvente(s) empregado(s) na etapa de dessorção líquida, na qual utilizou-se o planejamento de superfície triangular. A extração foi realizada com 5 ciclos de 1 mL por 30 segundos de equilíbrio e dessorção líquida constituída de 1 ciclo com 250 µL do solvente por 30 segundos. Sendo assim, os solventes testados foram acetonitrila, metanol e acetato de etila em razões distintas
conforme mostrado na Tabela 8. O experimento 10 foi realizado em triplicata.
Tabela 8 – Planejamento de superfície triangular para a escolha do solvente ou mistura de solventes na etapa de dessorção líquida.
Experimento Metanol (%) Acetato de etila (%) Acetonitrila (%)
1 100 0 0 2 0 100 0 3 0 0 100 4 50 50 0 5 50 0 50 6 0 50 50 7 66,66 16,67 16,67 8 16,67 66,66 16,67 9 16,67 16,67 66,66 10 (ponto central) 33,33 33,33 33,33
Fonte: Autoria própria (2018).
4.5.4 Otimização do número de ciclos e tempo de extração
Para essa otimização foram realizados nove experimentos com o planejamento Doehlert, na qual o número de ciclos de extração foi variado na faixa de 3 a 7 ciclos e o tempo de equilíbrio foi variado de 0 a 60 segundos conforme mostrado na Tabela 9. A dessorção líquida foi constituída de 1 ciclo com 250 µL de acetato de etila por 30 segundos de equilíbrio.
