Nanodispersões de fase líquido-cristalina como carreadoras de siRNA no tratamento tópico da psoríase: Avaliação em modelos in vitro e in vivo

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(1)UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO. Nanodispersões de fase líquido-cristalina como carreadoras de siRNA no tratamento tópico da psoríase: Avaliação em modelos in vitro e in vivo. Lívia Vieira Depieri. Ribeirão Preto 2016.

(2) UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO. Nanodispersões de fase líquido-cristalina como carreadoras de siRNA no tratamento tópico da psoríase: Avaliação em modelos in vitro e in vivo. Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas para obtenção do Título de Doutor em Ciências Área de Concentração: Medicamentos e Cosméticos Orientada: Lívia Vieira Depieri Orientadora: Profa. Dra. Maria Vitória Lopes Badra Bentley. Ribeirão Preto 2016.

(3) AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.. Depieri, Lívia Vieira Nanodispersões de fase líquido-cristalina como carreadoras de siRNA no tratamento tópico da psoríase: Avaliação em modelos in vitro e in vivo. Ribeirão Preto, 2016. 126 p.; 30cm. Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Medicamentos e Cosméticos. Orientadora: Bentley, Maria Vitória Lopes Badra. 1. siRNA. 2. Nanodispersão líquido-cristalina. 3. Psoríase..

(4) FOLHA DE APROVAÇÃO Lívia Vieira Depieri Nanodispersões de fase líquido-cristalina como carreadoras de siRNA no tratamento tópico da psoríase: Avaliação em modelos in vitro e in vivo. Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas para obtenção do Título de Doutor em Ciências Área de Concentração: Medicamentos e Cosméticos Orientadora: Profa. Dra. Maria Vitória Lopes Badra Bentley. Aprovada em:. Banca Examinadora Prof. Dr. ____________________________________________________________ Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________. Prof. Dr. ____________________________________________________________ Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________. Prof. Dr. ____________________________________________________________ Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________. Prof. Dr. ____________________________________________________________ Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________. Prof. Dr. ____________________________________________________________ Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________.

(5) Dedicatória. Aos meus amados avós Darcy e Olindo, por todo amor e incentivo constante em todos os momentos.... À minha querida mãe Libânia, por todo amor e parceria, por acreditar nos meus sonhos e me ajudar a consquistá-los.... Ao meu amado companheiro Thiago, por ser tão especial em minha vida, por me apoiar e me ajudar a ser cada dia uma pessoa melhor... Te amo!. À toda minha Família e Amigos com quem pude compartilhar histórias e alegrias durante essa caminhada....

(6) Agradecimentos À Deus, por todas as experiências vividas, permitindo meu crescimento e amadurecimento emocional e espiritual. À minha orientadora Profa. Dra. Maria Vitória Lopes Badra Bentley pela oportunidade de desenvolver essa pesquisa, pelo aprendizado diário, pelo exemplo profissional e pessoal e pela confiança. Obrigada por esses 10 anos de amizade e parceria que tanto contribuíram e contribuem para minha formação acadêmica, profissional e pessoal. À Profa. Dra. Luciana Biagini Lopes pelas colaborações tão valiosas ao longo desse trabalho. Obrigada pela amizade, carinho e incentivo, por ser um grande exemplo profissional, meus sinceros agradecimentos e a mais profunda admiração. Ao Prof. Dr. Robert Langer e ao Prof. Dr. Daniel Griffith Anderson pela colaboração, pelo imenso aprendizado e importante contribuição científica durante a realização do estágio sanduíche. Foi uma imensa honra trabalhar com vocês! Ao Dr. Yizhou Dong, Dr. Gaurav Sahay e ao Dr. Roman Bogorad pela colaboração, dedicação, auxílio na execução dos experimentos e discussões enriquecedoras realizadas durante o estágio sanduíche. À Profa. Dra. Lúcia Helena Faccioli pela colaboração e ensinamentos durante a realização desta pesquisa. Ao Dr. Francisco Wanderley Garcia Paula e Silva pela dedicação, atenção, auxílio na execução dos experimentos, pelas trocas de experiência, ensinamentos, e, sobretudo, pela amizade. Muito obrigada por tudo Francisco! Às técnicas do Laboratório de Inflamação e Imunologia das Parasitoses, Alyne Fávero Galvão Meirelles e Caroline Fontanari pela amizade, dedicação e auxílios durante a realização desta pesquisa. À Profa. Dra. Maria José Vieira Fonseca pela colaboração e ensinamentos durante a realização desta pesquisa..

(7) À Profa. Dra. Soraia Katia Pereira Costa e seus alunos Tuanny Priscila Schmidt, Anderson Romerio e Leandro Rodrigues pela colaboração, ensinamentos e auxílio nos experimentos com o modelo in vivo de psoríase. Aos amigos e técnicos do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, Fabíola, Henrique e José Orestes, pela ajuda, apoio e companheirismo. A todos os amigos do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, pós-graduandos e estagiários, em especial à Larissa, Lívia, Marcelo, Margarete e Patrícia pelo apoio, incentivo, ensinamentos e amizade. E àqueles que também passaram pelo laboratório e participaram da minha caminhada científica. Em especial à Fábia, Fabiana, Marina e Samantha, obrigada pela conviência maravilhosa, pelos ensinamentos e pela amizade que permanece até hoje! À minha querida amiga Katia Kaori Otaguiri pela amizade sincera, carinho, pela colaboração para realização deste trabalho e por tantos momentos importantes compartilhados. Ao Laboratório de Citometria de Fluxo da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto – FMRP-USP, à Camila Cristina de Oliveira Menezes Bonaldo e à Daiane Fernanda dos Santos pela colaboração e auxílio nas análises de citometria de fluxo. Ao Laboratório de Imunofluorescência da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto – FMRP-USP, à Danielle Aparecida Rosa de Magalhães e à Joseane Serrano pela colaboração, ensinamentos e auxílio com o preparo das lâminas histológicas. Ao Laboratório de Microscopia Avançada da FCFRP-USP e ao Eduardo Tozzato pelas análises por microscopia confocal. Aos funcionários da seção de Pós-Graduação pelo excelente serviço prestado. À Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Ao Albany College of Pharmacy and Healthy Sciences. Ao Massachusetts Institute of Technology e ao Koch Institute for Integrative Cancer Research..

(8) À Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto – FMRP-USP. Ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pela bolsa de doutorado (processo n°. 141927/2012-7) e pela bolsa de doutorado sanduíche (processo n°. 210002/2013-1). À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de doutorado (processo n°. 2012/09125-8). À todos aqueles que, de alguma forma, participaram da execução deste trabalho, tornando possível sua realização, meus sinceros agradecimentos..

(9) Olhar para trás após uma longa caminhada pode fazer perder a noção da distância que percorremos, mas se nos detivermos em nossa imagem, quando a iniciamos e ao término, certamente nos lembraremos do quanto nos custou chegar até o ponto final, e hoje temos a impressão de que tudo começou ontem... João Guimarães Rosa.

(10) i. RESUMO DEPIERI, L. V. Nanodispersões de fase líquido-cristalina como carreadoras de siRNA no tratamento tópico da psoríase: Avaliação em modelos in vitro e in vivo. 2016. 160 f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2016. A terapia gênica por interferência de RNA (RNAi) é um processo de silenciamento gênico pós-transcricional onde moléculas de small interfering RNA (siRNA) específicas são capazes de suprimir a expressão de um determinado gene. Atualmente, é uma abordagem terapêutica promissora para o tratamento de muitas doenças graves, incluindo doenças cutâneas. No entanto, dificuldades relacionadas à administração e à biodistribuição limitam a utilização clínica dos siRNAs. Neste contexto, foi proposto o uso de um nanocarreador a base de cristais líquidos para viabilizar a aplicação de siRNAs no tratamento tópico da psoríase. A nanodispersão líquido-cristalina (NLC) desenvolvida, composta por monoleína, ácido oleico, polietilenoimina e fase aquosa (8:2:1:89, p/p/p/p), foi capaz de superar as barreiras da via de administração tópica, bem como as limitações resultantes das características das moléculas de siRNA. A NLC foi capaz de complexar o siRNA, protege-lo por 24 h da degradação enzimática e liberá-lo de forma intacta. A NLC promoveu uma alta taxa de captação celular do siRNA em fibroblastos e macrófagos. Sua aplicação tópica pode ser considerada segura para a pele, pois manteve a viabilidade da epiderme humana reconstruída acima de 50% e a quantidade de IL-1α liberada foi inferior a 60 pg/mL. A NLC apresentou eficácia em promover a liberação funcional do siRNA nos modelos in vitro avaliados. No modelo de pele humana reconstruída psoriática, reduziu os níveis de IL-6 (~ 70%) após um único tratamento por 6 h e, os níveis do RNAm IL6 (~ 50%) após o tratamento por 3 dias consecutivos. Em macrófagos, reduziu os níveis do RNAm Tnf em 40% após o tratamento concomitante com LPS por 24 h e, em 60% após o tratamento por 24 h pós-estímulo prévio com LPS. A eficácia foi ainda maior com o pré-tratamento por 24 h seguido do estímulo com LPS, que normalizou os níveis do RNAm Tnf. O tratamento tópico com a NLC veiculando siRNA Tnf foi eficaz em reduzir significativamente os níveis do RNAm Tnf nos modelos in vivo de inflamação cutânea aguda induzida por TPA (~ 60%) e de psoríase induzida por imiquimode (~ 90%) avaliados. No modelo in vivo de psoríase, o tratamento tópico com a NLC veiculando siRNA Tnf também reduziu significativamente a atividade da mieloperoxidade (~ 65%) e a espessura da epiderme (~ 70%) em comparação aos grupos controle. Também foi eficaz na melhora fenotípica dos animais, reduzindo o rubor, descamação, acantose e o número de ataques de coceira, resultados da redução do processo inflamatório decorrente da ação efetiva das moléculas de siRNA Tnf. A NLC também promoveu a penetração cutânea das moléculas de siRNA nas camadas mais profundas da pele, in vivo. Face aos resultados obtidos, pode-se concluir que a NLC é uma estratégia relevante para a administração tópica de siRNAs, que mostrou potencial terapêutico para suprimir genes específicos relacionados a doenças de pele. Palavras-chave: siRNA, Nanodispersão líquido-cristalina, Psoríase, Terapia gênica. Depieri, L.V..

(11) ii. ABSTRACT DEPIERI, L. V. Liquid crystalline nanodispersions as a siRNA carrier in the topical treatment of psoriasis: Evaluation in in vitro and in vivo models. 2016. 160 f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2016. Gene therapy by RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing process in which specific small interfering RNA (siRNA) molecules can suppress the expression of a particular gene. Currently, is a promising therapeutic approach for the treatment of many severe disorders, including skin diseases. However, difficulties related to the administration and biodistribution limit the clinical use of siRNAs. In this context, a nanocarrier based in liquid crystal has been proposed to enable the application of siRNAs in the topical treatment of psoriasis. The liquid crystalline nanodispersion (LCN) developed, composed by monoolein, oleic acid, polyethylenimine and aqueous phase (8:2:1:89, w/w/w/w), was able to overcome the barriers of topical administration route, as well as limitations resulting from the characteristics of the siRNA molecules. The LCN was able to complex the siRNA, protect it for 24 h from enzymatic degradation and release it in an intact form. The LNC promoted a high cellular uptake of siRNA in fibroblasts and macrophages. Its topical application can be considered safe to the skin since viability of the reconstructed human epidermis remained above 50% and the amount of IL-1α released is less than 60 pg/mL. The LCN showed efficacy in promoting functional release of siRNA in in vitro models evaluated. In psoriatic reconstructed human skin model, it reduced the IL-6 levels (~ 70%) after a single treatment for 6 h and the mRNA IL6 levels (~ 50%) after treatment for 3 consecutive days. In macrophages, it reduced the mRNA Tnf levels in 40% after the concomitant treatment with LPS for 24 h and, in 60% with treatment for 24 h after prior stimulation with LPS. The efficiency was higher with the pretreatment for 24 h followed by stimulation with LPS, that normalized the RNAm Tnf levels. Topical treatment with NLC carrying siRNA Tnf was effective in reduce significantly the mRNA Tnf levels in in vivo models of skin acute inflammation induced by TPA (~ 60%) and of psoriasis induced by imiquimod (~ 90%) evaluated. In the in vivo model of psoriasis, topical treatment with the NLC carrying siRNA Tnf also significantly reduced activity of myeloperoxidase (~ 65%) and the epidermis thickness (~ 70%) compared to control groups. It has also been effective in animal phenotypic improvement, reducing redness, desquamation, acanthosis and the number of itch attacks, results of the reduction in inflammatory process obtained by the effective action of siRNA Tnf molecules. The LCN also promoted the penetration of siRNA molecules into the deeper layers of the skin in vivo. With the results obtained, we can conclude that the LCN is a relevant strategy for topical administration of siRNAs, which showed therapeutic potential to suppress specific genes related to skin diseases. Keywords: siRNA, Liquid crystalline nanodispersion, Psoriasis, Gene therapy. Depieri, L.V..

(12) iii. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Cronologia do desenvolvimento e aplicações da Interferência por RNA. ... 2 Figura 2 - Mecanismo de interferência por RNA. Adaptado de (HUANG; LIU, 2011). 4 Figura 3 - Estrutura da molécula de siRNA. Adaptado de (DE FOUGEROLLES et al., 2007). .......................................................................................................................... 5 Figura 4 - Estrutura molecular do polímero catiônico PEI (YIN et al., 2014). ............. 8 Figura 5 - Esquematização do mecanismo de escape endossomal de nanopartículas preparadas com PEI, conhecido como “efeito esponja de prótons”. Adaptado de (HUANG; LIU, 2011). .................................................................................................. 9 Figura 6 - Esquematização do mecanismo de escape endossomal de nanopartículas lipídicas por [A] desestabilização da membrana endossomal e por [B] formação de fase hexagonal. Adaptado de (HUANG; LIU, 2011). ................................................. 11 Figura 7 - Estrutura molecular da monoleína (PAN et al., 2013). ............................. 13 Figura 8 - Representação esquemática das diversas fases líquido-cristalinas formadas pela monoleína em presença de água. Adaptado de: (“Cubic Phase Particles in Drug Delivery”, 2012). ............................................................................. 14 Figura 9 - Diagrama esquemático do impacto da estrutura lipídica, aumento da concentração de água e estímulos externos sobre o fator de empacotamento e curvatura. Adaptado de (NGUYEN, 2008; CHANG et al., 2015). .............................. 16 Figura 10 - Esquema evolutivo do quadro imunoinflamatório característico na psoríase. Adaptado de (NESTLE; KAPLAN; BARKER, 2009). ................................. 20 Figura 11 - Método para obtenção das NLCs compostas por MO:FA (10:90, p/p) e MO:AO:FA (8:2:90, p/p) incorporadas com os adjuvantes catiônicos PEI ou OAM. O siRNA foi adicionado às NLCs após o processo de sonicação. ................................ 28 Figura 12 - Condicionamento dos tecidos EpiDerm™. (1) Material necessário para o condicionamento dos tecidos; (2) Remoção da placa contendo os tecidos em ambiente estéril da embalagem; (3) Abertura da placa contendo os tecidos em ambiente estéril para a remoção dos inserts da matriz de agarose; (4) Tecidos transferidos para placa de 6 poços contendo 900 µL de meio de cultura préaquecido. ................................................................................................................... 33 Figura 13 - Etapas do ensaio de irritação cutânea por MTT. (A) Aplicação das formulações nos inserts; (B) Tratamento dos tecidos com o reagente de MTT; (C) Extração. ................................................................................................................... 35 Depieri, L.V..

(13) iv. Figura 14 - Esquema do protocolo do ensaio imunoenzimático ELISA para quantificação de IL-1α humana (Invitrogen, Camarillo, CA, USA). ............................ 36 Figura 15 - Disposição dos inserts na placa de cultivo para a realização dos tratamentos. .............................................................................................................. 38 Figura 16 - Esquema do protocolo do ensaio imunoenzimático ELISA para quantificação de IL-6 humana (Invitrogen, Camarillo, CA, USA). .............................. 39 Figura 17 - Etapas para extração do RNA dos tecidos utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA). ............................................................................ 41 Figura 18 - Etapas para extração do RNA das células utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA). ............................................................................ 48 Figura 19 - Esquema do protocolo experimental para a determinação da eficácia in vivo da NLC (MO:AO:PEI:FA, 8:2:1:89, p/p/p/p) veiculando siRNA em modelo de inflamação aguda induzida com TPA. ....................................................................... 52 Figura 20 - Protocolo experimental de indução de psoríase com IMQ associado ao tratamento com a NLC isenta e veiculando siRNA controle ou siRNA Tnf. ............... 54 Figura 21 - Captação e a viabilidade celular do siRNA-FAM, complexos formados entre os adjuvantes catiônicos PEI e OAM com siRNA-FAM e as NLCs complexadas com siRNA-FAM determinado por citometria de fluxo. siRNA-FAM na concentração final de 20 nM/poço (20 pmol siRNA/6x105 células/mL de meio de cultura). Resultados representam a média de três experimentos independentes (n=3) ± desvio padrão. ........................................................................................................... 61 Figura 22 - Dot plot representativo do siRNA-FAM, complexos formados entre os adjuvantes catiônicos PEI e OAM com siRNA-FAM e as NLCs complexadas com siRNA-FAM determinado por citometria de fluxo. siRNA-FAM na concentração final de 20 nM/poço (20 pmol siRNA/6x105 células/mL de meio de cultura). .................... 62 Figura 23 - Ensaio de eletroforese em gel de agarose para avaliação da eficiência de complexação e integridade do siRNA na NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) por meio do ensaio de competição com poliânion. siRNA 10 μM (faixa 1), siRNA 10 μM + heparina (faixa 2), NLC (faixa 3), NLC + heparina (faixa 4), NLC + siRNA 10 μM (faixa 5) e NLC + siRNA 10 μM + heparina (faixa 6). ............... 65 Figura 24 - Ensaio de eletroforese em gel de agarose para avaliação da estabilidade do siRNA em presença de RNase: [A] siRNA livre (faixa 1) e em presença de RNase (2 μg) em função do tempo: 30 min (faixa 2), 1 h (faixa 3), 3 h (faixa 4), 6 h (faixa 5), 12 h (faixa 6), 18 h (faixa 7), 24 h (faixa 8); [B] Avaliação da habilidade da NLC Depieri, L.V..

(14) v. composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) em proteger o siRNA da degradação enzimática; siRNA 10 μM + heparina (faixa 1), siRNA 10 μM + RNase + heparina (faixa 2), RNase + NLC (faixa 3), RNase + NLC + heparina (faixa 4), siRNA 10 μM + RNase + NLC (faixa 5), siRNA 10 μM + RNase + NLC + heparina (faixa 6). .................................................................................................................................. 66 Figura 25 - [A] Viabilidade dos tecidos da epiderme humana reconstruída (EpiDerm™) e [B] níveis extracelulares de IL-1α após tratamento tópico da EpiDerm™ com a NLC composta por MO:OA:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) e controles: PBS e Triton X-100 por 2, 5 e 12 h. Os resultados representam a média de três determinações ± desvio padrão. A análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação aos tratamentos PBS e NLC. .......................................................................................................................... 68 Figura 26 - [A] Viabilidade dos tecidos da epiderme humana reconstruída (EpiDerm™) e [B] níveis extracelulares IL-1α após tratamento tópico da EpiDerm™ com a NLC composta por MO:OA:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) sem e com siRNA controle, solução de PEI:FA sem e com siRNA controle, PBS, siRNA controle e Triton X-100 por 3 dias (6 h de incubação com os tratamentos seguido da incubação por 18 h sem os tratamentos). siRNA controle na concentração final de 10 μM. Os resultados representam a média de três determinações ± desvio padrão. A análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido do pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao tratamento PBS. ................................................................... 70 Figura 27 - Níveis extracelulares de IL-6 quantificados por ELISA após o tratamento dos tecidos de pele psoriática por 6 h com a NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) contendo siRNA IL6 e os controles: PBS, siRNA IL6 em água livre de RNase, NLC isenta de siRNA IL6 e complexo PEI:FA (1:99, p/p) com siRNA IL6. siRNA IL6 na concentração final de 10 µM. Os resultados representam a média de 46 determinações ± desvio padrão. Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo PBS; &. p<0,05 em relação ao grupo siRNA IL6; $p<0,05 em relação ao grupo NLC; #p<0,05. em relação ao grupo PEI:FA + siRNA IL6. ................................................................ 73 Figura 28 - Níveis extracelulares de IL-6 quantificados por ELISA e níveis do RNAm IL6 quantificados por qRT-PCR após o tratamento dos tecidos de pele psoriática por 24 h (6 h incubação com as formulações e 18 h incubação sem as formulações) com a NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) contendo siRNA IL6 e os Depieri, L.V..

(15) vi. controles: PBS, siRNA IL6 em água livre de RNase e NLC isenta de siRNA IL6. siRNA IL6 na concentração final de 10 µM. Os resultados representam a média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo PBS; **p<0,05 em relação ao grupo siRNA IL6.................................................................. 75 Figura 29 - Níveis extracelulares de IL-6 quantificados por ELISA e níveis do RNAm IL6 quantificados por qRT-PCR após o tratamento dos tecidos de pele psoriática por 72 h (6 h incubação com as formulações e 18 h incubação sem as formulações por 3 dias consecutivos) com a NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) contendo siRNA IL6 e os controles: PBS, siRNA IL6 em água livre de RNase e NLC isenta de siRNA IL6. siRNA IL6 na concentração final de 10 µM. Os resultados representam a média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo PBS; #p<0,05 em relação ao grupo siRNA IL6; &p<0,05 em relação ao grupo NLC. .............................................................................................. 77 Figura 30 - [A] Captação e viabilidade celular; [B] Dot plot representativo do siRNAFAM, NLC (MO:AO:PEI:FA – 8:2:1:89, p/p/p/p) com siRNA-FAM e a Lipofectamina 2000 com siRNA-FAM determinado por citometria de fluxo. siRNA-FAM na concentração final de 45 nM/poço (dose de 7,5 pmol/poço/1x10 5 células). Resultados representam a média de três experimentos independentes (n=3) ± desvio padrão. ........................................................................................................... 79 Figura 31 - Imagens representativas obtidas por microscopia confocal de varredura a laser de macrófagos da linhagem J774 tratados por 24 h com a) PBS; b) solução de siRNA-FAM em água livre de RNase; c) Lipofectamina veiculando siRNA-FAM; d) NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) veiculando siRNA-FAM. siRNA-FAM na concentração final de 45 nM/poço (dose de 7,5 pmol/poço/1x105 células). As imagens representam a sobreposição máxima de secções ópticas xy em função da profundidade (z). As células fixadas foram coradas com DAPI e Faloidina/Texas-red para visualização do núcleo (azul) e F-actina (vermelho), respectivamente. Lasers: UV (405 nm), emissão: 420 – 516 nm (azul); Visível (488 nm), emissão: 494 – 599 nm (verde); Visível (552 nm), emissão: 593 – 698 nm (vermelho). Objetiva 63X, barra: 40 μm. ................................................................... 80 Figura 32 - Ensaio de eletroforese em gel de agarose para avaliação da eficiência de complexação de diferentes doses de siRNA Tnf pela NLC (MO:AO:PEI:FA Depieri, L.V..

(16) vii. 8:2:1:89, p/p/p/p) diluída em PBS (1:100) utilizadas do experimento in vitro de silenciamento gênico. ................................................................................................ 82 Figura 33 - Efeito da NLC (MO:AO:PEI:FA - 8:2:1:89, p/p/p/p), sem ou com siRNA controle ou Tnf e da Lipofectamina sem ou com siRNA controle ou Tnf e em associação ao LPS (500 ng mL-1/poço) sobre a viabilidade celular dos macrófagos da linhagem J774. siRNA controle ou Tnf na dose final de 60 pmol/poço/1x105 células. Os resultados representam a média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey.................................................................................................................... 83 Figura 34 - Níveis do RNAm Tnf quantificados por qRT-PCR após o tratamento concomitante dos macrófagos da linhagem J774 por 6 h com LPS e a NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) ou Lipofectamina isentas de siRNA e contendo siRNA controle (60 pmol) ou diferentes doses de siRNA Tnf (7,5, 30 e 60 pmol). Os resultados representam a média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo PBS; **p<0,05 em relação ao grupo LPS; #. p<0,05 em relação ao grupo LPS + Lipofectamina; &p<0,05 em relação ao grupo. LPS + Lipofectamina + siRNA controle (60 pmol). .................................................... 84 Figura 35 - Níveis do RNAm Tnf quantificados por qRT-PCR após o tratamento concomitante dos macrófagos da linhagem J774 por 24 h com LPS e a NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) ou Lipofectamina isentas de siRNA e contendo siRNA controle (60 pmol) ou diferentes doses de siRNA Tnf (7,5, 30 e 60 pmol). Os resultados representam a média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo PBS; **p<0,05 em relação ao grupo LPS; #. p<0,05 em relação ao grupo LPS + NLC. ................................................................ 86. Figura 36 - Níveis do RNAm Tnf quantificados por qRT-PCR após o tratamento dos macrófagos da linhagem J774 por 2 h com LPS e 24 h com a NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) ou Lipofectamina isentas de siRNA e contendo siRNA controle (60 pmol) ou diferentes doses de siRNA Tnf (7,5, 30 e 60 pmol). Os resultados representam a média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo PBS; **p<0,05 em relação ao grupo LPS; #p<0,05 em relação ao grupo LPS + NLC + siRNA controle (60 pmol); $p<0,05 em relação ao Depieri, L.V..

(17) viii. grupo LPS + NLC; &p<0,05 em relação ao grupo LPS + Lipofectamina + siRNA controle (60 pmol). .................................................................................................... 88 Figura 37 - Níveis do RNAm Tnf quantificados por qRT-PCR após o tratamento dos macrófagos da linhagem J774 por 24 h com a NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) e Lipofectamina isentas de siRNA e contendo siRNA controle (60 pmol) ou diferentes doses de siRNA Tnf (7,5, 30 e 60 pmol) seguido do tratamento com LPS por 2 h. Os resultados representam a média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo PBS; **p<0,05 em relação ao grupo LPS; #p<0,05 em relação ao grupo NLC + LPS; $p<0,05 em relação ao grupo NLC + siRNA controle (60 pmol) + LPS. ................................................................... 90 Figura 38 - Efeito da NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) contendo siRNA Tnf na normalização do aumento nos níveis do RNAm Tnf no modelo in vivo de inflamação cutânea aguda induzido por TPA. siRNA na concentração final de 10 µM. Os resultados representam a média ± desvio padrão (n = 4/5 animais por grupo). Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo sem tratamento; **p<0,05 em relação ao grupo TPA; #p<0,05 em relação ao grupo TPA + NLC e, $p<0,05 em relação ao grupo TPA + NLC + siRNA controle. ....................................................... 93 Figura 39 - Efeito da NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) contendo siRNA Tnf na normalização do aumento nos níveis do RNAm Tnf induzido por imiquimode no modelo in vivo de psoríase. siRNA na concentração final de 10 μM. Os resultados representam a média ± desvio padrão (n = 4/5 animais por grupo). Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo Vaselina + NLC; **p<0,05 em relação ao grupo Imiquimode + NLC; ***p<0,05 em relação ao grupo Imiquimode + NLC + siRNA controle. ......................................................................................................... 95 Figura 40 - Medida da atividade da MPO para avaliação do efeito da NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) incorporada com siRNA Tnf na redução do processo inflamatório induzido por imiquimode no modelo in vivo de psoríase. siRNA na concentração final de 10 μM. Os resultados representam a média ± desvio padrão (n = 4/5 animais por grupo). Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo Vaselina. Depieri, L.V..

(18) ix. + NLC; **p<0,05 em relação ao grupo Imiquimode + NLC; ***p<0,05 em relação ao grupo Imiquimode + NLC + siRNA controle. ............................................................. 98 Figura 41 - Imagens representativas da pele de camundongos BALB/c tratadas diariamente com: A) Vaselina + NLC; B) Imiquimode + NLC; C) Imiquimode + NLC + siRNA controle; D) Imiquimode + NLC + siRNA Tnf após 5 dias de tratamento. Inflamação cutânea induzida pelo Imiquimode assemelha-se fenotipicamente à psoríase..................................................................................................................... 99 Figura 42 - Fotomicrografias representativas da pele dorsal de camundongos tratados 1x/dia com vaselina ou imiquimode e 2x/dia com a NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) isenta ou veiculando siRNA controle ou siRNA Tnf. siRNA na concentração final de 10 μM. Os cortes foram visualizados por microscopia de luz convencional utilizando a objetiva de 20X e 40X. ..................... 100 Figura 43 - Espessura da epiderme da pele dorsal de camundongos tratados 1x/dia com vaselina ou imiquimode e 2x/dia com a NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) isenta ou veiculando siRNA controle ou siRNA Tnf. siRNA na concentração final de 10 μM. Os resultados representam a média ± desvio padrão (n = 4/5 animais por grupo). Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo Vaselina + NLC; #. p<0,05 em relação ao grupo Imiquimode + NLC; $p<0,05 em relação ao grupo. Imiquimode + NLC + siRNA controle. ...................................................................... 101 Figura 44 - Evolução temporal da [A] descamação, [B] rubor e [C] espessura da orelha dos animais tratados com Vaselina + NLC, Imiquimode + NLC, Imiquimode + NLC + siRNA controle e Imiquimode + NLC + siRNA Tnf. siRNA na concentração final de 10 μM. Os símbolos indicam a pontuação média (0 – 4) ou média da espessura da orelha ± desvio padrão (n = 4/5 animais por grupo). Análise estatística realizada com os dados obtidos no último dia do experimento pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação aos grupos Vaselina + NLC, Imiquimode + NLC e Imiquimode + NLC + siRNA controle. ........................ 103 Figura 45 - Efeito da administração tópica (1x/dia) de vaselina ou imiquimode associado aos tratamentos (2x/dia) com a NLC isenta de siRNA e veiculando siRNA controle ou siRNA Tnf sobre os ataques de coceira espontânea em camundongos. siRNA na concentração final de 10 μM.. Os resultados representam a média ±. desvio padrão (n = 4/5 animais por grupo). Análise estatística realizada pelo teste ANOVA de uma via, seguido pelo pós-teste de Tukey, *p<0,05 em relação ao grupo Depieri, L.V..

(19) x. Vaselina + NLC; #p<0,05 em relação ao grupo Imiquimode + NLC;. &. p<0,05 em. relação ao grupo Imiquimode + NLC + siRNA controle. .......................................... 105 Figura 46 - Imagens representativas obtidas por microscopia confocal de varredura a laser de secções de pele tratadas com imiquimode 1x/dia associado com o tratamento com a NLC composta por MO:AO:PEI:FA (8:2:1:89, p/p/p/p) veiculando siRNA controle ou siRNA controle-Alexa 647. As imagens representam a sobreposição máxima de secções ópticas xy em função da profundidade (z). Os cortes foram corados com DAPI para visualização do núcleo (azul). Lasers: UV (405 nm), emissão: 420 – 516 nm (azul); Visível (638 nm), emissão: 647 – 743 nm (vermelho). Objetiva 63X, barra: 50 μm. ................................................................. 107. Depieri, L.V..

(20) xi. LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Tamanho de partícula, PdI e potencial zeta das NLCs preparadas com PEI ou OAM, sem e com siRNA 10 μM. .................................................................... 60. Depieri, L.V..

(21) xii. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Actb. Beta actina. Ago-2. Argonauta-2. AO. Ácido oleico. BSA. Albumina bovina sérica. cDNA. DNA complementar. Ct. Cycle threshold. d. Distâncias interplanares. D.O.. Densidade óptica. DAPI. 4'6'-diamidino-2-fenilindol. DEPC. Dietilpirocarbonato. DGCR8. DiGeorge Syndrome Critical Region 8 protein. DLS. Dynamic Light Scattering. DMEM. Dulbecco’s Modified Eagle Medium. DMSO. Dimetilsulfóxido. DNA. Ácido desoxiribonucléico. dNTP. Desoxiribonucleotídeo trifosfato. DOPE. 1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. DOTAP. 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano. DOTMA. 1,2-di-O-octadecil-3-trimetilamônio propano. DPBS. Dulbecco’s tampão fosfato salino. dsRNA. Double stand RNA. EC. Estrato córneo. ECVAM. Centro Europeu de Validação de Métodos Alternativos. ELISA. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay. FA. Fase aquosa. FAM. Carboxifluoresceína. FDA. Food and drug administration. FE. Fator de empacotamento. GAGs. Glicosaminoglicanas. GAPDH. Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. H2O2. Peróxido de hidrogênio. Depieri, L.V..

(22) xiii. H2SO4. Ácido sulfúrico. HTAB. Brometo de hexadeciltrimetilamônio. IL. Interleucina. IL-1α. Interleucina-1α. IL-6. Interleucina-6. IMQ. Imiquimode. IFN-γ. Interferon-gama. LPS. Lipopolissacarídeo. miRNA. microRNA. MO. Monoleína, monoleato de glicerila. MPO. Mieloperoxidase. MTT. [brometo de 3-(4,5-dimetiliazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]. Na2EDTA. Sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético. Na3PO4. Fosfato de sódio. NaCl. Cloreto de sódio. NLC. Nanodispersão líquido-cristalina. OAM. Oleilamina. PASI. Índice da Área e Severidade da Psoríase. PBS. Tampão fosfato salino. PC. Paquioníquia congênita. PdI. Índice de polidispersão. PEI. Polietilenoimina. Pré-miRNA microRNA precursor Pri-miRNA microRNA primário qRT-PCR. Transcrição reversa e reação da polimerase em cadeia em tempo real. RISC. RNA Induced Silencing Complex. RHE. Reconstructed Human Epidermis. RNA. Ácido ribonucléico. RNAi. Interferência por RNA. RNAm. RNA mensageiro. shRNA. short hairpin RNA. siRNA. small interfering RNA. TAE. Tris-acetato-EDTA. Depieri, L.V..

(23) xiv. Th1. Linfócito T helper, tipo 1. Th17. Linfócito T helper, tipo 17. TLR-4. Toll like-receptor 4. TMB. 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina. TNF. Fator de necrose tumoral. TPA. 12-O-tetradecanoil-forbol 13-acetato. UTRs. Untranslated regions. Depieri, L.V..

(24) SUMÁRIO. Resumo ....................................................................................................................... i Abstract ...................................................................................................................... ii Lista de figuras ......................................................................................................... iii Lista de tabelas ........................................................................................................ xi Lista de abreviaturas e siglas ................................................................................ xii. 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1 1.1. Terapia Gênica – Interferência por RNA (RNAi) ................................................... 1 1.2. Desafios e estratégias para veiculação de siRNAs .............................................. 5 1.3. Cristais líquidos .................................................................................................. 12 1.4. Psoríase ............................................................................................................. 18 1.5. Via de administração tópica para siRNAs .......................................................... 22. 2. OBJETIVO ............................................................................................................ 24 2.1 Objetivos específicos:.......................................................................................... 24. 3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 25 3.1. Material............................................................................................................... 25 3.1.1. Solventes, reagentes e matérias-primas: ........................................................ 25 3.1.2. Equipamentos e acessórios: ........................................................................... 26 3.2. Métodos.............................................................................................................. 27 3.2.1. Obtenção das nanodispersões líquido-cristalinas (NLCs) ............................... 27 3.2.2. Caracterização das NLCs................................................................................ 28 3.2.2.1. Análise do diâmetro médio e índice de polidispersão das partículas ........... 28 3.2.2.2. Medida da carga superficial das partículas .................................................. 29 3.2.3. Avaliação da captação celular do siRNA veiculado pelas NLCs em fibroblastos por citometria de fluxo ............................................................................................... 29 3.2.3.1. Linhagem e cultivo celular ............................................................................ 29.

(25) 3.2.3.2. Tratamentos ................................................................................................. 30 3.2.3.3. Avaliação da captação celular do siRNA por citometria de fluxo .................. 30 3.2.4. Avaliação da estabilidade do complexo NLC/siRNA ....................................... 30 3.2.5. Avaliação da irritação cutânea da NLC em modelo de pele humana reconstruída por MTT e quantificação de IL-1α ......................................................... 31 3.2.5.1. Preparação dos tecidos ................................................................................ 32 3.2.5.2. Tratamentos ................................................................................................. 33 3.2.5.3. Avaliação da irritação cutânea por MTT ....................................................... 34 3.2.5.4. Avaliação da irritação cutânea por quantificação de IL-1α ........................... 35 3.2.6. Avaliação da eficácia do silenciamento da IL6 em modelo de pele humana psoriática após o tratamento com a NLC veiculando siRNA IL6 ............................... 36 3.2.6.1. Preparação dos tecidos ................................................................................ 37 3.2.6.2. Tratamentos ................................................................................................. 37 3.2.6.3. Quantificação dos níveis extracelulares de IL-6 por ELISA .......................... 38 3.2.6.4. Processamento dos tecidos para quantificação dos níveis do RNAm IL6 por qRT-PCR ................................................................................................................... 39 3.2.6.4.1. Isolamento do RNA ................................................................................... 39 3.2.6.4.2. Síntese do DNA complementar (cDNA) .................................................... 41 3.2.6.4.3. Transcrição reversa e reação da polimerase em cadeia em tempo real (qRT-PCR) ................................................................................................................ 42 3.2.7. Avaliação da captação celular do siRNA veiculado pela NLC em macrófagos por citometria de fluxo e por microscopia confocal de varredura a laser ................... 43 3.2.7.1. Linhagem e cultivo celular ............................................................................ 43 3.2.7.2. Tratamentos ................................................................................................. 43 3.2.7.3. Avaliação da captação celular do siRNA por citometria de fluxo .................. 43 3.2.7.4. Avaliação da captação celular do siRNA por microscopia confocal de varredura a laser ....................................................................................................... 44 3.2.8. Desenvolvimento de modelo in vitro de inflamação para avaliação da eficácia do tratamento com a NLC veiculando siRNA Tnf ...................................................... 45.

(26) 3.2.8.1. Avaliação da eficiência de complexação do siRNA Tnf em diferentes doses pela NLC ................................................................................................................... 45 3.2.8.2. Linhagem celular e cultivo ............................................................................ 45 3.2.8.3. Viabilidade celular ........................................................................................ 45 3.2.8.4. Indução in vitro da produção de TNF-α ........................................................ 46 3.2.8.5. Tratamentos ................................................................................................. 47 3.2.8.6. Avaliação da eficácia do siRNA Tnf veiculado pela NLC por meio da quantificação dos níveis do RNAm Tnf por qRT-PCR ............................................... 47 3.2.8.6.1. Isolamento do RNA ................................................................................... 47 3.2.8.6.2. Síntese do cDNA ....................................................................................... 48 3.2.8.6.3. Transcrição reversa e reação da polimerase em cadeia em tempo real (qRT-PCR) ................................................................................................................ 49 3.2.9. Avaliação da eficácia do silenciamento do Tnf em modelo in vivo de inflamação aguda após o tratamento com a NLC veiculando siRNA Tnf .................. 50 3.2.9.1. Animais......................................................................................................... 50 3.2.9.2. Indução da inflamação cutânea aguda e esquema terapêutico ................... 50 3.2.9.3. Avaliação da eficácia do siRNA Tnf veiculado pela NLC por meio da quantificação dos níveis do RNAm Tnf por qRT-PCR ............................................... 52 3.2.10. Avaliação da eficácia do silenciamento do Tnf em modelo in vivo de psoríase após o tratamento com a NLC veiculando siRNA Tnf ............................................... 53 3.2.10.1. Animais....................................................................................................... 53 3.2.10.2. Indução da psoríase e esquema terapêutico .............................................. 53 3.2.10.3. Avaliação da eficácia do siRNA Tnf veiculado pela NLC por meio da quantificação dos níveis do RNAm Tnf por qRT-PCR ............................................... 54 3.2.10.4. Avaliação da eficácia anti-inflamatória do siRNA Tnf veiculado pela NLC pela medida da atividade da mieloperoxidade (MPO) ............................................... 55 3.2.10.5. Análises histológicas .................................................................................. 55 3.2.10.6. Avaliação do efeito do siRNA Tnf veiculado pela NLC no índice da área e severidade da psoríase (PASI).................................................................................. 56.

(27) 3.2.10.7. Avaliação do efeito do siRNA Tnf veiculado sobre o comportamento de prurido espontâneo ................................................................................................... 56 3.2.11. Avaliação da penetração cutânea do siRNA veiculado pela NLC por microscopia confocal de varreadura a laser .............................................................. 57 3.2.12. Análise estatística ......................................................................................... 57. 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES .......................................................................... 58 4.1. Obtenção e caracterização das NLCs ................................................................ 59 4.2. Avaliação da captação celular do siRNA veiculado pelas NLCs em fibroblastos por citometria de fluxo ............................................................................................... 60 4.3. Avaliação da estabilidade do complexo NLC/siRNA .......................................... 64 4.4. Avaliação da irritação cutânea da NLC em modelo de pele humana reconstruída por MTT e quantificação de IL-1α por ELISA ............................................................ 66 4.5. Avaliação da eficácia do silenciamento da IL6 em modelo de pele humana psoriática após o tratamento com a NLC veiculando siRNA IL6 ............................... 72 4.6. Avaliação da captação celular do siRNA veiculado pela NLC em macrófagos por citometria de fluxo e por microscopia confocal de varredura a laser ......................... 79 4.7. Desenvolvimento de modelo in vitro de inflamação para avaliação da eficácia do tratamento com a NLC veiculando siRNA Tnf ........................................................... 81 4.7.1. Avaliação da eficiência de complexação de diferentes doses de siRNA Tnf pela NLC ................................................................................................................... 82 4.7.2. Avaliação da citotoxicidade ............................................................................. 82 4.7.3. Avaliação da eficácia do siRNA Tnf veiculado pela NLC por meio da quantificação dos níveis do RNAm Tnf por qRT-PCR ............................................... 83 4.8. Avaliação da eficácia do silenciamento do Tnf em modelo in vivo de inflamação aguda após o tratamento com a NLC veiculando siRNA Tnf .................................... 92 4.9. Avaliação da eficácia do silenciamento do Tnf em modelo in vivo de psoríase após o tratamento com a NLC veiculando siRNA Tnf ............................................... 94 4.9.1. Avaliação da eficácia do siRNA Tnf veiculado pela NLC por meio da quantificação dos níveis do RNAm Tnf por qRT-PCR ............................................... 94.

(28) 4.9.2. Avaliação da eficácia anti-inflamatória do siRNA Tnf veiculado pela NLC pela medida da atividade da mieloperoxidade (MPO)....................................................... 97 4.9.3. Análises histológicas ....................................................................................... 99 4.9.4. Avaliação do efeito do siRNA Tnf veiculado pela NLC no PASI .................... 101 4.9.5. Avaliação do efeito do siRNA Tnf veiculado sobre o comportamento de prurido espontâneo.............................................................................................................. 104 4.10. Avaliação da penetração cutânea do siRNA veiculado pela NLC em modelo in vivo de psoríase por microscopia confocal de varreadura a laser ........................... 106. 5. CONCLUSÕES ................................................................................................... 109. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 111.

(29) Introdução Depieri, L.V..

(30) Introdução. 1. 1. Introdução 1.1. Terapia Gênica – Interferência por RNA (RNAi) Terapia gênica trata-se de um procedimento que envolve a introdução de material genético dentro da célula de um organismo, com o objetivo de manipular, substituir, suprimir ou introduzir genes para o tratamento de doenças. Os genes são responsáveis por uma grande parte das doenças humanas, seja pela ausência da codificação ou codificação em excesso de determinadas proteínas, codificação de proteínas anormais, ou ainda por deixar o organismo suscetível a agentes ambientais, o que os tornam alvos extremamente importantes para o tratamento das doenças. Desse modo, a terapia gênica surge como uma ferramenta promissora no desenvolvimento de novas terapias (VERMA; WEITZMAN, 2005; MARTIMPREY et al., 2009). Neste contexto, destaca-se o mecanismo de interferência por RNA (RNAi), processo de silenciamento gênico pós-transcricional, descrito pela primeira vez no início da década de 90 pelos pesquisadores Richard Jorgenses e Joseph Mols, que tentavam intensificar a coloração púrpura de petúnias por meio da introdução de transgenes responsáveis pela pigmentação (NAPOLI; LEMIEUX; JORGENSEN, 1990; VAN DER KROL et al., 1990). Entretanto, os resultados obtidos foram flores totalmente brancas ou irregularmente coloridas em decorrência do silenciamento, tanto do transgene, quanto do gene endógeno responsável pela pigmentação. Esse fenômeno foi denominado “co-supressão”. Mais tarde, um efeito semelhante foi encontrado no fungo Neurospora crassa e denominado ''supressão'' (“quelling”) (NAPOLI; LEMIEUX; JORGENSEN, 1990; VAN DER KROL et al., 1990; FRANÇA et al., 2010; SIFUENTES-ROMERO; MILTON; GARCÍA-GASCA, 2011). No mesmo período, Guo e Kemphues estudavam a função do gene par-1 no nemátodo Caenorhabditis elegans utilizando fitas de RNA antisense e RNA sense (controle negativo) e observaram a inibição da produção da proteína par-1 com a utilização de ambas as fitas (GUO; KEMPHUES, 1995). Enquanto isso, Andrew Fire e Craig Mello obtiveram resultados similares aos de Guo e Kemphues com a injeção, separadamente, das fitas de RNA sense e antisense em nemátodos. Porém, observaram que a injeção de moléculas de RNA fita dupla (dsRNA, do inglês double strand RNA), resultava em efeitos mais pronunciados que cada fita individualmente na supressão da expressão de um determinado gene com sequência similar àquele dsRNA. Este processo no qual uma dupla fita de RNA era capaz de inibir a Depieri, L.V..

(31) Introdução. 2. expressão de um gene ficou conhecido como Interferência por RNA (RNAi) e laureou Andrew Fire e Craig Mello com o Prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina em 2006 (FIRE et al., 1998; SIFUENTES-ROMERO; MILTON; GARCÍA-GASCA, 2011). A descoberta da RNAi em nemátodos possibilitou relacionar os fenômenos descritos como “co-supressão”, em plantas, e “supressão”, em fungos, ao processo de silenciamento desencadeado por dsRNA. A descoberta da RNAi em C. elegans, em 1998, juntamente com a descrição dos resultados das pesquisas de Tuschl e colaboradores, em 2001, no qual duplas fitas de 21 nucleotídeos de RNA sintéticas foram capazes de promover o silenciamento gênico em células de mamíferos (ELBASHIR et al., 2001), desencadearam uma revolução biotecnológica. A Figura 1 ilustra o cronograma do desenvolvimento e aplicações da RNAi.. Figura 1 - Cronologia do desenvolvimento e aplicações da Interferência por RNA. A RNAi ganhou grande atenção e tornou-se um procedimento bastante utilizado para estudar a função dos genes e identificar potenciais genes alvos causadores de doenças. Além de ser uma importante ferramenta de pesquisa, a RNAi é uma grande promessa na terapia gênica para o silenciamento de genes causadores de doenças, aplicando-se, particularmente, para as doenças em que a redução ou supressão do produto de um gene alvo específico possa trazer benefícios terapêuticos (GUO et al., 2010b). O mecanismo de interferência por RNA pode ser dividido em duas fases distintas: a fase de iniciação, na qual ocorre a geração das moléculas efetoras, as quais podem ser classificadas em relação a sua origem e função em ao menos três categorias: siRNA (small interferig RNA), miRNA (microRNA) e shRNA (short hairpin Depieri, L.V..

(32) Introdução. 3. RNA); e a fase de execução, na qual ocorre a incorporação das moléculas efetoras em complexos proteicos e a promoção do silenciamento gênico (GELEY; MÜLLER, 2004; DE PAULA; BENTLEY; MAHATO, 2007). Os siRNAs são produtos de RNA dupla fita, com sequência totalmente complementar ao RNA mensageiro (RNAm) alvo e exógenos. Os miRNAs são produtos endógenos produzidos por meio de um processo envolvendo enzimas, proteínas. nucleares. e. citoplasmáticas. e. apresentam. característica. de. complementariedade parcial ao RNAm alvo. A produção dos miRNAs ocorre por meio da transcrição de genes pela RNA polimerase II em um microRNA primário (primiRNA) que então é clivado por um complexo proteico formado pela Drosha (enzima membro da família RNase III) e pela proteína DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Region. 8. protein). resultando. no. micro-RNA. precursor. (pré-miRNA),. de. aproximadamente 70 pares de bases, contendo uma região dupla fita e uma alça fita simples, formando uma estrutura denominada hairpin. O pré-miRNA é exportado para o citoplasma celular pela exportin-5. No citoplasma, é clivado pela enzima Dicer gerando um miRNA com cerca de 22 nucleotídeos. Os shRNA são moléculas de RNA dupla fita com estrutura semelhante à do miRNA. Podem ser sintéticos ou transcritos dentro da célula a partir de vetores que codificam o shRNA junto a um promotor da RNA polimerase III. Neste caso, o transcrito é processado pela Dicer igual os miRNAs (GELEY; MÜLLER, 2004; NOVINA; SHARP, 2004; DE PAULA; BENTLEY; MAHATO, 2007; FRANÇA et al., 2010; HUANG; LIU, 2011). Após a geração das moléculas efetoras, estas são incorporadas a proteínas celulares formando um complexo multimérico chamado RISC (RNA Induced Silencing Complex), do qual a proteína Argonauta 2 (Ago 2) participa. Essa proteína é responsável pela seleção da fita do siRNA ou miRNA que será incorporada ao complexo RISC e apresenta atividade de endonuclease dirigida contra a fita de RNAm alvo. A fita sense é eliminada e a fita antisense guia o complexo até o RNAm alvo. Como a sequência de bases nas moléculas de siRNA é perfeitamente complementar à sequência de bases do RNAm alvo, o complexo RISC cliva o referido RNAm, degradando-o. Por outro lado, dependendo da complementaridade das bases entre o miRNA e o RNAm, este pode ser degradado ou ter sua tradução bloqueada (Figura 2) (NOVINA; SHARP, 2004; DE PAULA; BENTLEY; MAHATO, 2007; WHITEHEAD; LANGER; ANDERSON, 2009; HUANG; LIU, 2011).. Depieri, L.V..

(33) Introdução. 4. Figura 2 - Mecanismo de interferência por RNA. Adaptado de (HUANG; LIU, 2011). O silenciamento gênico com a utilização de siRNAs criou um novo paradigma no desenvolvimento e descoberta de novos fármacos em relação à terapêutica tradicional com o uso de pequenas moléculas e anticorpos monoclonais. Para projetar uma terapêutica com o uso de siRNA requere-se apenas o conhecimento da sequência do gene alvo de interesse. Além disto, pelo fato do mecanismo de RNAi mediado por siRNA ocorrer no citoplasma, temos uma potencial vantagem em relação a outros mecanismos de regulação gênica que necessitam da entrada da molécula efetora no núcleo celular (GUO et al., 2010b). Além disso, diferentemente dos fármacos convencionais, o siRNA é específico, ou seja, ocorre somente o bloqueio na produção da proteína de interesse, não afetando a produção de proteínas de estruturas moleculares semelhantes, o que reduz possíveis efeitos adversos. Seu uso também é mais efetivo, pois uma única molécula de siRNA pode silenciar várias cópias de RNAm, responsável pela produção de várias moléculas da proteína (DAKA; PEER, 2012). Diversos estudos clínicos para terapias à base de siRNAs estão sendo conduzidos e os resultados mostram-se promissores, reforçando a grande viabilidade dessa nova modalidade terapêutica (OZCAN et al., 2015). Dentre os Depieri, L.V..

(34) Introdução. 5. estudos clínicos com o uso de siRNAs, pode-se destacar um relacionado à patologia cutânea paquioníquia congênita (PC), doença genética dominante negativa causada por mutação em genes que codificam a queratina (Clinical Trials.gov, 2016). Este é o primeiro estudo que utiliza uma molécula de siRNA em pele humana. Esta pesquisa clínica teve como objetivos avaliar a segurança e tolerabilidade de injeções intralesionais nos calos de pacientes portadores de PC conjuntamente à eficácia no tratamento com siRNA por meio de exames clínicos e relatos de pacientes (LEACHMAN et al., 2010).. 1.2. Desafios e estratégias para veiculação de siRNAs A eficácia do tratamento utilizando as moléculas de siRNA é considerada diretamente dependente da capacidade de transpor as barreiras que impedem sua absorção, distribuiçao e tráfego intracelular (KAPOOR; BURGESS; PATIL, 2012). siRNAs são moléculas de RNA dupla fita estruturalmente bem definida. Possuem geralmente 19-21 pares de bases, sendo a extremidade 5’ fosforilada e a extremidade 3’ hidroxilada e com 2 nucleotídos desemparelhados em cada ponta (Figura 3). São macromoléculas hidrofílicas com elevado peso molecular (~ 13 kDa) e carregadas negativamente. Estas propriedades físico-químicas impedem sua difusão passiva através das membranas celulares que apresentam um residual de carga negativa (KESHARWANI; GAJBHIYE; JAIN, 2012; DENG et al., 2014; MARTÍNEZ; JIMÉNEZ; PAÑEDA, 2015).. Figura 3 - Estrutura da molécula de siRNA. Adaptado de (DE FOUGEROLLES et al., 2007). Outro obstáculo da terapêutica com siRNA está relacionado à estabilidade dessas moléculas em fluidos biológicos (KANASTY et al., 2012; GAO; HUANG, 2013; JOO et al., 2014; MARTÍNEZ; JIMÉNEZ; PAÑEDA, 2015). Quando veiculadas na forma livre, são quase instantaneamente degradadas pela ação de RNase A, que Depieri, L.V..

(35) Introdução. 6. resulta em uma curta meia-vida, de cerca de 30 min (KREBS; ALSBERG, 2011; ALIABADI et al., 2012). As estratégias utilizadas para melhorar a estabilidade do siRNA in vivo são: (i) modificações químicas nos grupamentos fosfodiéster, nos açucares ou no anel de ribose das bases nitrogenadas, que reduzem a especificidade da nuclease e, (ii) proteção física por meio de sistemas de liberação, que impedem o acesso da nuclease ao siRNA (ALIABADI et al., 2012; MARTÍNEZ; JIMÉNEZ; PAÑEDA, 2015). As moléculas de siRNA também podem estimular uma resposta do sistema imunológico inato. Várias características podem influenciar a natureza e o grau de imunoestimulação e estas incluem a sequência do siRNA, sua estrutura, modificações químicas e os materiais utilizados na contrução dos sistemas de liberação (KANASTY et al., 2012). Os siRNAs também podem apresentar efeito fora do alvo e afetar a expressão de outros genes. O silenciamento fora do alvo ou silenciamento não específico pode dificultar a interpretação de resultados experimentais e causar efeitos tóxicos. Dentre as. possíveis. causas. do. silenciamento. não. específico,. podemos. citar. o. reconhecimento de regiões não traduzidas (UTRs – do inglês untranslated regions) do RNAm pela fita guia de RNA e a seleção incorreta da fita de RNA pelo RISC. As sequências UTRs são compartilhadas por muitos RNAms e, devido a uma hibridação incompleta, moléculas de miRNA podem regular a expressão de vários genes. Como os siRNAs e miRNAs compartilham a mesma maquinaria celular, eventos de silenciamento gênico não específicos ocorridos pelo uso de siRNAs podem ser resultados da sua ação inespecífica pelo reconhecimento destas UTRs. Embora a homologia parcial com alguns UTRs seja inevitável, o uso de algoritmos de design para construção das moléculas de siRNA são utilizados para tentar selecionar sequências. com. o. mínimo. de. complementaridade. para. estas. regiões.. Alternativamente, modificações químicas na estrutura do siRNA também são realizadas e objetivam desestabilizar a hibridação entre a sequência do siRNA com as regiões UTRs (KANASTY et al., 2012; DENG et al., 2014). Considerando os obstáculos para utilização clínica do siRNA, além dos esforços para a produção de moléculas de siRNA mais estáveis, específicas e não imunogênicas, o desenvolvimento de sistemas de liberação é apontado como fator chave para sua utilização terapêutica (WHITEHEAD; LANGER; ANDERSON, 2009; KREBS; ALSBERG, 2011). Depieri, L.V..

(36) Introdução. 7. Um sistema carreador ideal para veiculação de siRNA deve ser capaz de: i) ultrapassar as barreiras inerentes de cada via de administração como, por exemplo, o estrato córneo (EC) da pele, principal barreira para penetração de fármacos aplicados topicamente (CEVC; VIERL, 2010); ii) ligar-se às moléculas de siRNA promovendo proteção contra degradação enzimática; iii) facilitar a captação celular, uma vez que as moléculas de siRNA são incapazes de se difundirem passivamente pelas membranas celulares devido a repulsão eletrostática ocasionada pelo residual de carga negativa do siRNA e da bicamada lipídica; iv) promover o escape endossomal liberando o conteúdo do endossomo no citoplasma celular antes que ocorra a metabolização do siRNA pela ação dos lisossomos; v) ser inerte e não estimular uma resposta imunológica no organismo; e vi) liberar as moléculas de siRNA intactas no citoplasma para um eficiente silenciamento gênico (REISCHL; ZIMMER, 2009; PECOT et al., 2011; ZHANG; MCINTOSH; GRINSTAFF, 2012; FOLDVARI et al., 2015). Os sistemas carreadores podem ser classificados em virais ou não-virais e são selecionados de acordo com sua segurança e biocompatibilidade para se obter uma elevada eficiência de transfecção gênica (REISCHL; ZIMMER, 2009). Os vetores virais são conhecidos pela alta eficiência de transfecção de genes. São desenvolvidos por meio da modificação de vírus a fim de torná-los incapazes de se autorreplicar e de causar alguma doença, mas conservando sua capacidade inata de transferir o material genético para as células-alvo. Exemplos de vírus utilizados como carreadores incluem os lentivírus, adenovírus, herpes vírus, retrovírus e os vírus adeno-associados. Porém, devido a algumas características que incluem carcinogênese, imunogenicidade, limitada capacidade de carreamento gênico e dificuldade de produção em larga escala, atualmente, sua utilização é limitada (KAPOOR; BURGESS; PATIL, 2012; DENG et al., 2014; YIN et al., 2014). Os carreadores não-virais foram desenvolvidos para oferecer alternativas aos vetores virais para veiculação de genes e são cuidadosamente formulados para evitar a estimulação do sistema imunológico, como também para ultrapassar as barreiras da absorção, distribuição e tráfego intracelular. Estes tipos de carreadores mostram-se bastante promissores devido sua segurança, possibilidade de direcionamento para diferentes alvos celulares por meio de modificações estruturais pela incorporação de ligantes e fácil síntese (WHITEHEAD; LANGER; ANDERSON, 2009; GAO; HUANG, 2013; YIN et al., 2014; FOLDVARI et al., 2015). Depieri, L.V..