UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PATRÍCIA RIBEIRO
IMPORTÂNCIA RELATIVA DO RECEPTOR TIPO TOLL 4 NA
RESPOSTA À AXOTOMIA E REGENERAÇÃO NERVOSA
PERIFÉRICA
CAMPINAS 2017
PATRÍCIA RIBEIRO
IMPORTÂNCIA RELATIVA DO RECEPTOR TIPO TOLL 4 NA
RESPOSTA À AXOTOMIA E REGENERAÇÃO NERVOSA
PERIFÉRICA
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Celular e Estrutural na área de Anatomia.
Orientador: ALEXANDRE LEITE RODRIGUES DE OLIVEIRA
CAMPINAS 2017
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA PATRÍCIA RIBEIRO E ORIENTADA PELO PROFESSOR DOUTOR ALEXANDRE LEITE RODRIGUES DE OLIVEIRA.
Campinas, 06 de novembro de 2017.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira Prof. Dr. Fábio Rogério
Prof. Dr. Leonardo dos Reis Silveira
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
“Conheça todas as teorias domine todas as técnicas, mas ao tocar uma alma humana seja apenas outra alma humana.” Carl Jung
Agradecimentos
Agradeço a Deus pela vida, e por me guiar em todo os momentos.
Agradeço aos meus pais, pelo amor, pela compreensão e apoio, não apenas durante a realização deste trabalho, mas durante toda minha vida.
A toda minha família e amigos do Paraná.
Ao professor Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, pela orientação na realização desse projeto, por todas as oportunidades de crescimento profissional e pessoal, pela atenção, paciência e ensinamentos.
Aos amigos e colegas de laboratório, aprendi muito com cada um de vocês. A professora Taize, do laboratório de biologia molecular e cultura de células - departamento de morfologia e patologia básica –Faculdade de Medicina Jundiaí. Pela ajuda com a técnica de Western blotting e por todos os ensinamentos. Também ao seu aluno Victor por toda a ajuda.
À UNICAMP, por proporcionar o cenário e aos seus profissionais que contribuíram para meu aprendizado.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia, sua coordenação e à secretária Líliam.
Aos professores do programa, por todos os ensinamentos; Aos técnicos do departamento por todo o auxílio.
Resumo
Após axotomia periférica há retração seletiva de terminais sinápticos em contato com o corpo do neurônio lesado, com ênfase em aferências inibitórias. Tal processo, que também envolve células da glia, é influenciado pela expressão do complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I), afetando significativamente no processo regenerativo pós-lesão. Alguns receptores da imunidade inata como os tipos Toll (TLR), são responsáveis por iniciar uma resposta imune imediata, frente à detecção de determinados padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Em particular, TLR 2 e 4 que são expressos no sistema nervoso por astrócitos e microglia sugerindo um papel relevante dos TLRs na plasticidade sináptica. Adicionalmente, há possibilidade de haver interação entre estes receptores e a via do complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I). No entanto, nenhum estudo descreveu os mecanismos pelos quais os TLRs afetam a plasticidade sináptica, bem como a complementaridade destes com as alterações regidas pelo MHC I. Portanto, nesse trabalho verificamos a importância relativa da expressão de TLR 2 e 4 na plasticidade sináptica da medula espinal, após esmagamento do nervo isquiático em camundongos C57BL/6, TLR2 -/- e TLR4-/-.Para isso, os animais (n=18/ grupo) foram submetidos ao esmagamento unilateral do nervo isquiático, sendo a superexpressão de TLR4 induzida através da administração de lipopolissacarídeo (LPS). Uma semana após a lesão, os animais foram sacrificados e fixados em paraformaldeído 4%, sendo as medulas espinais dissecadas e processadas para imunomarcação anti-sinaptofisina, VGLUT1, GFAP e Iba-1. Para analisar a expressão de TLR4, medulas espinais foram dissecadas a fresco e congelas em nitrogênio líquido, sendo armazenadas na temperatura -80ºC. O mesmo procedimento foi feito com o material utilizado para os ensaios de qRT- PCR, onde se investigou a expressão gênica de microglobulina beta 2 (uma subunidade do MHC I), CGRP e GAP 43. Os resultados mostraram que a administração de LPS leva à diminuição do número de sinapses ativas no entorno dos corpos celulares dos motoneurônios espinais, indicando aumento da eliminação sináptica em resposta à axotomia. A exposição ao LPS também aumentou ainda mais astrogliose e reação microglial, em comparação com animais não tratados (PBS), especialmente ipsilateral à axotomia. Além disso, tratamento com LPS aumentou a expressão de B2M. Importantemente, a ausência de TLR favoreceu a regeneração axonal. Em conclusão, nossos resultados reforçam a influência da expressão de TLR2 e 4 durante o processo de resposta a uma lesão nervosa, atuando de forma complementar ao processo de remodelamento sináptico regido pelo MHC I. Tal fato aponta para os TLRs como potenciais alvos moleculares em futuras terapias visando o reparo do SNC e SNP.
Abstract
After peripheral axotomy, there is selective retraction of synaptic terminals in contact with the body of the injured neuron with emphasis on inhibitory afferents. This process, which also involves glial cells, is influenced by the expression of the Major Histocompatibility Complex Class I (MHC I), significantly affecting the post-injury regenerative process. Some receptors of innate immunity such as Toll-Like (TLR), are responsible for initiating an immediate immune response against the detection of certain Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs). In particular, TLR 2 and 4 are expressed in the nervous system by astrocytes and microglia suggesting a relevant role of TLRs in synaptic plasticity. In addition, there is a possibility of interaction between these receptors and the Major Histocompatibility Complex Class I pathway (MHC I). However, no study has described the mechanisms by which TLRs affect synaptic plasticity nor their complementarity with MHC I-regulated changes. Therefore, in this essay we have verified the relative importance and purpose of TLR 2 and 4 in the synaptic plasticity of the spinal cord after sciatic nerve crushing of mice (C57BL/6, TLR2-/- and TLR4-/-). For this experiment, the animals (n = 18 / group) were submitted to unilateral crushing of the sciatic nerve and TLR4 overexpression was induced through the administration of lipopolysaccharide (LPS). One week after the injury, the animals were sacrificed and put into 4% paraformaldehyde. The spinal cords were dissected and processed for anti-synaptophysin, VGLUT1, GFAP and Iba-1 immunostaining. To analyze TLR4 expression, the spinal cords were dissected fresh and frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. The same procedure was done with the material used for the qRT-PCR assays, where the gene expression of b2 microglobulin (a subunit of MHC I), CGRP and GAP 43 was investigated.The results showed that LPS administration leads to a decrease in the number of active synapses around the spinal motoneuron cell bodies, indicating increased synaptic elimination in response to axotomy. Exposure to LPS also increased even more astrogliosis and microglial reaction compared to untreated animals (PBS), especially ipsilateral to axotomy. In addition, treatment with LPS increased B2M expression. Importantly, the absence of TLR favored axonal regeneration.In conclusion, our results reinforced the influence of the expression of TLR2 and 4 during the process of response to a nerve injury, acting in a complementary way to the process of synaptic remodeling governed by MHC I. This fact points to TLRs as potential molecular targets in future therapies for CNS and SNP repair.
Lista de Figuras
Figura 1. Organização da substância cinzenta da medula espinal proposta por
Rexed. A imagem representa um corte transversal ao nível da intumescência lombar da medula (L5). Em vermelho observa-se o núcleo motor medial. Em tons de azul destacam-se os núcleos motores lateral e medial. O núcleo motor lateral (em azul escuro) foi a área considerada para esse estudo. Esta região apresenta os motoneurônios dorsais para inervação dos músculos distais do membro posterior. O núcleo motor medial (em azul claro) contém os motoneurônios que inervam os músculos proximais do membro posterior.
Figura 2. Ligantes específicos de cada TLR.
Figura 3. Procedimento cirúrgico para o esmagamento do nervo isquiático. Em (A), tricotomia da pele da região póstero-medial da coxa esquerda. Em (B),
afastamento musculatura, expondo o nervo isquiático.
Figura 4. Esquema de um motoneurônio alfa (lâmina IX) com terminais
pré-sinápticos (aferências) em aposição ao corpo celular. As linhas tracejadas representam áreas onde foi medida a densidade integrada de pixels.
Figura 5. Bandas de RNAr 28S e 18S. É possível observar que a banda 28S
é o dobro da 18S, indicando que o RNA tem boa integridade.
Figura 6. Western Blotting para a proteína TLR4. (D = não lesado,
contralateral; E = lesado, ipsilateral). (A) Note a intensificação das bandas do grupo tratado com LPS, em relação ao grupo controle tratado com PBS. (B) Gráfico da quantificação de pixels e comparação entre os grupos LPS e PBS
Figura 7. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lamina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-GFAP, 7 dias após esmagamento do nervo isquiático. (A) Imagens do grupo AX tratados com PBS e LPS, 7 dias após a lesão, ipsilateral e contralateral. (B) Gráfico indica a diferença da média da densidade integrada de pixels. (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.
Figura 8. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lamina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-GFAP, 7 dias após a lesão. (A) Imagens do grupo TLR4 -/- tratados com PBS e LPS, 7 dias após a lesão, ipsilateral e contralateral. (B) Gráfico indica a diferença da média da densidade integrada de pixels. (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.
Figura 9. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lamina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-GFAP, 7 dias após a lesão. (A) Imagens do grupo TLR4 -/- tratados com PBS e LPS, 7 dias após a lesão, ipsilateral e contralateral. (B) Gráfico indica a diferença da média dos dados brutos da densidade integrada de pixels. (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.
Figura 10. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lamina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-GFAP, 7 dias após a lesão. (A) Imagens dos grupos AX; TLR4 -/-; TLR2-/- ; tratados com PBS e LPS, 40 dias após a lesão, lados ipsilateral e contralateral. (B) Diferença da média da densidade integrada de pixels. (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.
Figura 11. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-IBA-1, 7 dias após a lesão. (A) Imagens do grupo AX tratados com PBS e LPS, lado ipsilateral e contralateral, 7 dias após a lesão, (B) Diferença da média da densidade integrada de pixels. (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.
Figura 12. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-IBA-1, sete dias após a lesão. (A) Imagens do grupo TLR4-/- tratados com PBS e LPS, lado ipsilateral e contralateral,7dias após a lesão, (B) Gráfico indica a diferença da média dos dados brutos da densidade integrada de pixels. (n= 5 para cada grupo). Barra de escala 100µm.
Figura 13. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-IBA-1, sete dias após a lesão. (A) Imagens do grupo TLR2-/- tratados com PBS e LPS, lado ipsilateral e contralateral, 7 dias após a lesão, (B) Gráfico indica a diferença da média dos dados brutos da densidade integrada de pixels. (n= 5para cada grupo). Barra de escala 100µm.
Figura 14. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lamina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-IBA-1, sete dias após a lesão. (A) Imagens dos grupos AX; TLR4 -/-; TLR2-/- ; tratados com PBS e LPS, 40 dias após a lesão, ipsilateral e contralateral. (B) Gráfico indica a diferença da média dos dados brutos da densidade integrada de pixels. (n=5 para cada grupo). Barra de escala 100µm.
Figura 15. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-sinaptofisina, sete dias após a lesão. (A) Imagens do grupo AX tratados com PBS e LPS, lado ipsi e contralateral, sete dias após a lesão, (B) Representação gráfica da quantificação da cobertura sináptica sete dias após lesão. Nota-se uma drástica eliminação sináptica. (n=5 para cada grupo). Barra de escala 50µm.
Figura 16. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-sinaptofisina, sete dias após a lesão. (A) Imagens do grupo TLR4-/-tratados com PBS e LPS, lado ipsi e contralateral. (B) Representação gráfica da quantificação da cobertura sináptica. Nota-se nos grupos TLR4-/-tratados com PBS e LPS, uma redução significativa na imunoreatividade anti-sinaptofisina, indicando uma pequena cobertura sináptica nesses neurônios. Entretanto, não se observam diferenças no padrão da marcação entre estes dois grupos. O que reafirma que os animais nocautes para TLR4 não respondem a LPS. (n= 5para cada grupo). Barra de escala 50µm
Figura 17. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-sinaptofisina, sete dias após a lesão. (A) Imagens do grupo TLR2-/-tratados com PBS e LPS, lado ipsi e contralateral. (B) Representação gráfica da quantificação da cobertura sináptica. Nota-se nos grupos TLR2-/-tratados com PBS e LPS, uma redução significativa na imunoreatividade anti-sinaptofisina, indicando uma pequena cobertura sináptica nesses neurônios. Entretanto, não se observam diferenças no padrão da marcação entre estes dois grupos. (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 50µm.
Figura 18. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-sinaptofisina, quarenta dias após a lesão. (n=5 para cada grupo). Barra de escala 50µm
Figura 19. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-VGLUT-1, sete dias após a lesão. (A) Imagens do grupo AX tratados com PBS e LPS, lado ipsi e contralateral. (B) (n= 5para cada grupo). Barra de escala 50µm.
Figura 20. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
Imagens do grupo TLR4-/-tratados com PBS e LPS, lado ipsi e contralateral. (B). n= 5para cada grupo. Barra de escala 50µm.
Figura 21. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-VGLUT-1, sete dias após a lesão. (A) Imagens do grupo TLR2-/-tratados com PBS e LPS, lado ipsi e contralateral. (B) .(n= 5para cada grupo). Barra de escala 50µm.
Figura 22. Gel de agarose 1% representativo com amostras de RNA da medula
espinal de animais de todos os grupos utilizados para a técnica qRT- PCR.
Figura 23. Expressão relativa do gene CGRP, sete dias após a axotomia do
nervo isquiático.
Figura 24. Expressão relativa do gene GAP43, sete dias após a axotomia do
nervo isquiático. Não foram observadas diferenças estatística entre os grupos experimentais no tempo investigado.
Figura 25. Expressão relativa do gene b2M, sete dias após a axotomia do nervo
isquiático.
Figura 26. Analise da função motora dos animai quanto ao índice funcional do
isquiático (IFI) nos diferentes grupos até quarenta dias após a leão. Observa-se a queda no primeiro dia de avaliação após a cirurgia, e a recuperação gradativa de todos os grupos (n= 5 para cada grupo). (A) AX PBS; (B) AX LPS; (C) TLR4 -/-PBS; (D) TLR4 -/- LPS (E) TLR2 -/- PBS; (F) TLR2 -/- LPS.G gráfico construído com os valores do 40º dia de todos os grupos, onde podemos observar uma diferença estatística, entre os grupos TLR2-/- PBS e LPS. Em relação aos outros grupos, mostrando que no último dia, o desempenho desses animais, na avaliação funcional, demonstrou uma queda.
Lista de Tabelas
Tabela 1. Primers utilizados no RT-PCR para a genotipar animais nocautes
para TLR4.
Tabela 2. Técnicas utilizadas nesse trabalho, bem como os grupos
experimentais e tempos de sobrevida após esmagamento unilateral do nervo isquiático.
Tabela 3. Lista de anticorpos primários utilizados nos insaios de
imunofluorescência.
Tabela 4. Ensaios Taqman utilizados no RT-qPCR.
Tabela 5. Condições de termociclagem das reações de RT-qPCR.
Tabela 6. Imunorreatividade relativa à proteína ácida fibrilar glial (GFAP) obtida
pela medição da densidade integrada de pixels no núcleo motor lateral da coluna anterior (lâmina IX) da medula espinal, 7 dias após esmagamento do nervo isquiático. Dados apresentados como média dos dados brutos ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels e erro padrão da média.
Tabela 7. Imunorreatividade relativa à proteína ácida fibrilar glial (GFAP) obtida
pela medição da densidade integrada de pixels no núcleo motor lateral da coluna anterior (lâmina IX) da medula espinal, 40 dias após esmagamento do nervo isquiático. Dados apresentados como média dos dados brutos ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels e erro padrão da média.
Tabela 8. Imunorreatividade relativa à molécula adaptadora ligante de cálcio
ionizado-1 (Iba1) obtida pela medição da densidade integrada de pixels no núcleo motor lateral da coluna anterior (lâmina IX) da medula espinal, 7 dias após esmagamento do nervo isquiático. Dados apresentados como média dos dados brutos ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels e erro padrão da média.
Tabela 9. Imunorreatividade relativa à molécula adaptadora ligante de cálcio
ionizado-1 (Iba1) obtida pela medição da densidade integrada de pixels no núcleo motor lateral da coluna anterior (lâmina IX) da medula espinal, 40 dias após esmagamento do nervo isquiático. Dados apresentados como média dos dados brutos ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels e erro padrão da média.
Tabela 10. Imunorreatividade relativa à proteína sinaptofisina obtida pela
(lâmina IX) da medula espinal, 7 dias após esmagamento do nervo isquiático. Dados apresentados como média das razões ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels e erro padrão da média.
Tabela 11. Imunorreatividade relativa à proteína sinaptofisina obtida pela
medição da densidade integrada de pixels no núcleo motor lateral da coluna anterior (lâmina IX) da medula espinal, 40 dias após esmagamento do nervo isquiático. Dados apresentados como média das razões ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels e erro padrão da média.
Tabela 12. Imunorreatividade relativa às vesículas contendo o transportador
vesicular de glutamato tipo 1 (VGLUT1) obtida pela medição da densidade integrada de pixels no núcleo motor lateral da coluna anterior (lâmina IX) da medula espinal, 40 dias após esmagamento do nervo isquiático. Dados apresentados como média das razões ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels e erro padrão da média.
Tabela 13. Leitura das amostras de RNA (razões 260/280 e 260/230) em
nanofotômetro
Tabela 14. Média ± EP da quantidade de transcritos para CGRP. Tabela 15. Média ± EP da quantidade de transcritos para GAP43. Tabela 16. Média ± EP da quantidade de transcritos para b2M.
Tabela 17. Valores referentes ao índice funcional do isquiático (IFI) obtida através do sistema “walking track test” (CatWalk), em diferentes tempos experimentais. Média ± Erro Padrão da Média.
Lista de Abreviaturas e Siglas
AX - Grupo controle
B2M - Beta- 2 microglobulina
CEUA - Comissão de ética no uso de animais
CEMIB - Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica
CGRP - Calcitonin Gene-Related Protein (proteína relacionada ao gene de
calcitonina)
DAMPS - Padrões Moleculares Associados a Danos CS - Célula de Schwann
GABA - ácido gama-amino-butírico
GAP43 - Growth Associated Protein 43 (proteína 43 associada ao crescimento) GFAP - Proteína fibrilar ácida glial
IBA-1 - Proteína adaptadora de ligacao de cálcio ionizado IFI - Índice funcional do isquiático
IL-1 - Interleucina 1 IL-8 - Interleucina-8 LPS - Lipopolissacarideo
MHC I - Complexo principal de histocompatibilidade de classe I PAMPs -Padrões moleculares relacionados a patógeno
PBS - Tampão fosfato salino
PCR - Reação em cadeia da polimerase SN - Sistema nervoso
SNC - Sistema nervoso central SNP - Sistema nervoso periférico TLRs - Toll like recepor
TBS-T - Tris-Buffered Saline Tween-20 (tampão Tris-Tween20) VGLUT1 - Transportador vesicular de glutamato-1
Sumário
RESUMO... 7 ABSTRACT ... 8 LISTA DE FIGURAS ... 9 LISTA DE TABELAS ... 13 LISTA DE ABREVIATURAS ... 15 1. INTRODUÇÃO ... 181.1ORGANIZAÇÃO GERAL DO SISTEMA NERVOSO ... 18
1.2CÉLULAS DA GLIA ... 21
1.3LESÕES DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL E PERIFÉRICO ... 22
1.4PLASTICIDADE SINÁPTICA ... 23
1.5TOLL LIKE RECEPTOR NO SNC ... 24
2. JUSTIFICATIVA ... 29
3. OBJETIVOS ... 30
3.1OBJETIVOS GERAIS ... 30
3.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 30
4. METODOLOGIA ... 31
4.1ANIMAIS E GRUPOS EXPERIMENTAIS ... 31
4.2PREPARO E INOCULAÇÃO DE LPS ... 33
4.3PROCEDIMENTO CIRÚRGICO PARA ESMAGAMENTO DO NERVO ISQUIÁTICO ... 33
4.4SACRIFÍCIO E PREPARAÇÃO DO TECIDO ... 34
4.5IMUNOFLUORESCÊNCIA ... 34
4.6AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO MOTORA ... 35
4.7WESTERN BLOTTING ... 36
4.8ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA PELA TÉCNICA QRT–PCR ... 37
4.8.1 Validação da quantidade e qualidade e integridade do RNA ... 38
4.8.2 Síntese do DNA complementar (cDNA) ... 39
4.8.3 Reação da Polimerase em Cadeia em Tempo Real ... 39
4.9ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 41
5. RESULTADOS ... 42
5.1WESTERN BLOTTING ... 42
5.2IMUNOFLUORESCÊNCIA ... 43
5.2.1 Aumento da reatividade dos astrócitos após administração de LPS ... 43
5.2.2 Aumento da reatividade da micróglia após administração de LPS ... 49
5.2.3 Redução da imunoreatividade para sinaptofisina após axotomia e administração de LPS ... 54
5.2.4 Redução da imunoreatividade das sinapses excitatórias -Terminações nervosas glutamatérgicas ... 60
5.3 QRT-PCR(PCR-REAL TIME) ... 65
5.3.1 CGRP: indicador de resposta a axotomia ... 67
5.3.2 GAP43: indicador de regeneração axonal ... 67
5.3.3 Microglobulina beta – 2 sub componente do MHCI ... 68
5.4AVALIAÇÃO MOTORA DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL ... 69
6. DISCUSSÃO ... 72
7. CONCLUSÕES ... 77
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 78
1. Introdução
1.1 Organização Geral do Sistema Nervoso
O sistema nervoso (SN) é responsável pela manutenção da homeostasia, além de nos permitir interagir com o meio externo. É anatomicamente dividido em sistema nervoso central (SNC), constituído pelo encéfalo e medula espinal, e pelo sistema nervoso periférico (SNP), constituído de nervos (feixes de axônios sensitivos e motores), gânglios e terminações nervosas (Machado 2014) (Kandel, 2000) (Dangelo and Fattini, 2011).
A medula espinal apresenta forma aproximadamente cilíndrica, sendo ligeiramente achatada no sentido anteroposterior. Seu calibre não é uniforme, pois apresenta duas dilatações denominadas intumescência cervical e intumescência lombar. Estas intumescências correspondem aos segmentos medulares cujas raízes dorsais e ventrais convergem para formar os plexos braquial e lombossacral, destinados à inervação dos membros superiores e inferiores, respectivamente. A formação destas intumescências se deve à maior quantidade de neurônios, em especial de motoneurônios e, portanto, de fibras nervosas que entram ou saem destas áreas emergem desses segmentos medulares visando a inervação dos membros. A medula é constituída por duas porções principais, que se estendem por todo o seu comprimento, uma camada interna, denominada substância cinzenta, e uma camada externa, denominada substância branca (Gray and Goss, 1988).
A substância cinzenta é composta predominantemente por corpos neuronais e nela distinguem-se em cada antímero, três colunas, visíveis em cortes transversais. São os denominados cornos ou colunas anterior, posterior e lateral. Já a substância branca é formada por fibras nervosas, em sua maior parte mielínicas, que percorrem toda a extensão da medula e podem ser agrupadas de cada lado em três funículos ou cordões, constituindo tractos ascendentes e descendentes.
Os neurônios medulares não se distribuem de maneira uniforme na substância cinzenta, mas se agrupam em núcleos ora mais ora menos definidos. Estes núcleos são usualmente observados em cortes histológicos, no entanto, deve-se ter em mente que eles de fato formam pilares longitudinais dentro das três colunas da medula. Alguns núcleos, entretanto, não se estendem ao longo de toda a medula (Machado and Haertel, 2014).
A substância cinzenta da medula foi objeto de detalhados estudos de citoarquitetura realizados por (Rexed, 1952) cujos resultados mudaram as concepções existentes sobre a distribuição dos neurônios medulares. Verificou-se que os neurônios medulares se distribuem em extratos ou lâminas bastante regulares, numeradas de I a X, no sentido dorsoventral (figura 1). A lâmina IX contém os neurônios motores que correspondem aos núcleos da coluna anterior). Esses vários núcleos podem ser organizados em dois grupos: medial e lateral. Os núcleos do grupo medial existem em toda a extensão da medula e os neurônios motores nele localizados inervam a musculatura relacionada com o esqueleto axial. Já os núcleos do grupo lateral dão origem a fibras que inervam a musculatura apendicular, ou seja, dos membros superior e inferior. Em função disso, tais núcleos aparecem apenas nas regiões das intumescências. No grupo lateral, os neurônios motores situados mais medialmente inervam a musculatura distal dos membros, ou seja, os músculos intrínsecos e extrínsecos da mão e do pé.
Figura 1. Organização da substância cinzenta da medula espinal, em lâminas,
proposta por Rexed. A imagem representa um corte transversal ao nível da intumescência lombar da medula (L5). Na lâmina IX, podemos observar o núcleo motor medial, o núcleo motor lateral, com componentes ventral e dorsal. O núcleo motor dorsolateral, foi a área considerada para esse estudo. Esta região apresenta os motoneurônios para inervação dos músculos distais do membro posterior, constituindo o nervo isquiático (L4, L5 e L6). Fonte: Paxinos, 2007.
Os nervos periféricos apresentam axônios mielínicos e amielínicos, dependendo de suas relações com as células de Schwann (CS). Um axônio mielínico, em geral possui diâmetro maior que 1µm e apresenta células de Schwann dispostas sequencialmente, formando ao redor do axônio uma estrutura em camadas concêntricas denominada bainha de mielina. As CS vizinhas estão separadas umas das outras por intervalos destituídos de mielina e parcialmente cobertos por digitações laterais do seu citoplasma. Estes espaços são denominados nodos de Ranvier. Entretanto, nos axônios amielínicos, uma CS, através de projeções citoplasmáticas, envolve total ou parcialmente entre 5 a 25 axônios, não havendo a formação da bainha de mielina. Dessa forma, os axônios amielínicos encontram-se individualmente alocados no interior de sulcos ou canais formados pelas expansões do citoplasma das CS (Peters A., 1976).
Um importante nervo espinal é o nervo isquiático, que no rato é formado pelos segmentos medulares L4, L5 e L6. Esses segmentos também contribuem para formação de outros nervos do plexo lombosacral. No nível do trocânter maior do fêmur este se apresenta unifascicular e, de 5 a 7 milímetros distalmente, o nervo isquiático
se divide em dois ramos (porção tibial e porção fibular) e mais distalmente, em quatro. A porção tibial dá origem ao nervo tibial e ao nervo sural, enquanto a porção fibular dá origem ao nervo fibular e ao ramo cutâneo. Em seu trajeto descendente, perfura os músculos isquiotibiais, localizando-se lateralmente na face posterior da coxa, e os dois maiores nervos, tibial e fibular, inervam as regiões posterior da coxa, dorsal e ventral da perna e pé (Schmalbruch, 1986).
1.2 Células da Glia
No microambiente medular os motoneurônios apresentam contato com a glia, dendritos e terminais sinápticos, sendo que aproximadamente metade de toda a extensão da membrana de seu corpo celular apresenta-se coberta por projeções gliais, destacando-se os contatos com os astrócitos.
No sistema nervoso central, a glia compreende: astrócitos, oligodendrócitos, microgliócitos e um tipo de glia com disposição epitelial, as células ependimárias. Os astrócitos e oligodendrócitos são coletivamente denominados como macróglia, e os microgliócitos constituem a micróglia. A macróglia e a micróglia colocam-se entre os neurônios e possuem massa citoplasmática distribuída sobretudo em prolongamentos (Machado and Haertel, 2014).
Os astrócitos são abundantes e caracterizados por inúmeros prolongamentos, restando pequena massa citoplasmática ao redor do núcleo. Reconhecem-se dois tipos: astrócitos protoplasmáticos, localizados na substância cinzenta, e astrócitos fibrosos, encontrados na substância branca. Ambos os tipos de astrócitos apoiam-se em capilares sanguíneos por meio de expansões conhecidas como pés vasculares. Têm, portanto, funções de sustentação e isolamento de neurônios, sendo elemento fundamental da barreira hemato-encefálica. Nos casos de lesão do tecido, os astrócitos ativados passam a proliferar e ocupam áreas lesadas, formando uma “cicatriz”, rica em elementos inibitórios do crescimento axonal. Os astrócitos também secretam fatores neurotróficos essenciais para a sobrevivência e manutenção neuronal, tais como BDNF (Boyd and Gordon, 2003), e GDNF (Naveilhan et al., 1997).
Microgliócitos (micróglia) são encontrados tanto na substância branca como cinzenta e apresentam funções fagocíticas. Evidencias indicam que os microgliócitos se originam de monócitos de origem mesodérmica, equivalendo, no sistema nervoso central, a um tipo de macrófago com funções de remoção, por fagocitose, de células
mortas, dendritos e mesmo microrganismos. Os microgliócitos se proliferam em caso de injúria e inflamação, sobretudo por novo aporte de monócitos vindos pela corrente sanguínea. Além disso, os microgliócitos apresentam várias características de monócitos e macrófagos. Eles reagem a mudanças em seu microambiente, passando para o estado ativado. Uma vez ativados eles podem migrar para locais de lesão e se proliferar, apresentando antígenos que têm papel central na resposta imune no sistema nervoso central. Interagem com leucócitos que, em condições de quebra de barreira hematoencefálica, invadem o tecido nervoso (Machado and Haertel, 2014).
1.3 Lesões do Sistema Nervoso Central e Periférico
O sistema nervoso apresenta-se suscetível a diversas formas de lesão, tanto por traumas mecânicos quanto por doenças degenerativas. Em se tratando de nervos periféricos, as injúrias são classificadas em três grupos: neuropraxia, axotomia e
neurotomia (Seddon, 1943). A neuropraxia é caracterizada, pelo dano local da bainha
de mielina, usualmente secundário à compressão, no qual a continuidade do axônio é preservada e o segmento distal não sofre degeneração. A axotomia gera perda da continuidade axonal, com variável preservação do tecido conectivo do nervo (Seddon, 1943), desencadeando diferentes processos no coto proximal e no fragmento distal ao local da lesão (Lee and Wolfe, 2000). A neurotomia, por sua vez, é o tipo de injúria mais severa, e trata-se da secção completa do nervo. Alguns anos depois, (Sunderland, 1951) expandiu a classificação de Seddon para cinco graus de lesão do nervo periférico: Neupropraxia grau I ,onde ocorre desmielinização segmentar.
Axotomia grau II, quando o axonio é danificado e o endoneuro contínua intacto. Axotomia grau III, nesse caso o axônio e endoneuro são danificados e o perineuro
continua intacto. Axotomia grau IV, onde o axônio, endoneuro e perineuro são danificados e o epineuro fica intacto. E a neurotomia grau V, é quando ocorre a transecção completa do nervo.
Após lesão do nervo periférico, que gere ruptura dos axônios, no fragmento distal ao local da injúria, inicia-se um processo denominado degeneração Walleriana, que tem como evento chave a degeneração dos fragmentos dos axônios lesados (A, 1850; Waller, 1850) (Stoll et al., 2002; Wu et al., 2013). Concomitantemente, a bainha de mielina se fragmenta, as células de Schwann recuperam mobilidade, proliferam e secretam citocinas e fatores tróficos, além de participarem da fagocitose dos restos
de mielina e de axônios degenerados. Já na porção proximal à lesão, o corpo celular apresenta uma série de alterações, em conjunto, denominadas “reações do corpo celular à injúria - cromatólise”. Assim, o soma torna-se intumescido, o núcleo se move para a periferia e o retículo endoplasmático rugoso (corpúsculo/substância de Nissl) se torna fragmentado, não mais sendo visível como substância tigróide ou de Nissl (Kandel, 2000).
A axotomia periférica provoca resposta tissular complexa no sistema nervoso central (SNC), afetando, além do corpo celular, o microambiente circunjacente ao neurônio axotomizado. Observa-se um importante rearranjo dos circuitos medulares, com retração dos terminais sinápticos em contato com o corpo dos neurônios lesados, sendo que o grau de retração varia de acordo com o tipo de botão sináptico (Lindå et al., 2000);(Oliveira et al., 2004). Essas alterações, observadas no neurônio comprometido, levam a uma mudança no seu estado funcional, que passa de um estado de transmissão sináptica para um estado de regeneração (Lindå et al., 2000). Juntamente, estão as alterações que ocorrem nas células gliais. Entre as principais, estão as que ocorrem no metabolismo dos astrócitos próximos aos neurônios axotomizados, que formam os processos perisinápticos (Derouiche and Frotscher, 2001), responsáveis por inibir a transmissão sináptica.
1.4 Plasticidade Sináptica
Os neurônios, através de suas terminações axônicas, entram em contato com outros neurônios, passando-lhes informações. Os locais de tais contatos são denominados sinapses ou, mais precisamente, sinapses interneurais. Quanto a morfologia e ao modo de funcionamento, existem dois tipos de sinapses: sinapses elétricas e sinapses químicas (Machado and Haertel, 2014).Caracterizadas tanto pelo fluxo de correntes elétricas, quanto pela liberação de mediadores químicos, denominados neurotransmissores (Kandel, 2000).
Umas das características do sistema nervoso é a sua plasticidade, que é sua capacidade de modificação na eficiência da transmissão sináptica (aumento ou diminuição da resposta pós-sináptica) gerada por um estímulo químico, físico ou elétrico (Rafael N. Ruggiero, 2011).
Diversas proteínas que foram identificadas primeiramente no sistema imunológico, também são expressas no sistema nervoso em desenvolvimento e
adulto. Estudos demostraram que várias dessas proteínas, além de suas funções imunológicas, participam do processo de manutenção e modificação de conexões sinápticas (Boulanger, 2009).
Já se sabe que os neurônios expressam moléculas que antes eram conhecidas apenas por suas funções no sistema imunológico. Um exemplo, é o complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I) (Boulanger et al., 2001).
As moléculas de MHC I são moléculas transmembranas compostas por duas cadeias polipeptídicas ligadas de forma não covalente, por uma cadeia alfa (ou cadeia pesada) de 44 a 47 KD e uma subunidade chamada microglobulina B2. Cada cadeia alfa está orientada de modo que cerca de três quartos do polipeptídio é extracelular, um curto segmento hidrofóbico atravessa a membrana plasmática e os resíduos carboxiterminais ficam localizados no citoplasma. A moléculas de MHC I montadas completamente correspondem a um trímero, constituído por uma cadeia alfa e uma microglobulina B2 e um peptídeo ligado, e a expressão estável das moléculas de classe I nas superfícies celulares requer a presença dos três componentes do complexo trimérico (Abbas et al., 2015).
Pesquisas mostraram que as moléculas de MHC I estão envolvidas no processo de plasticidade sináptica, uma vez que a sua ausência levou ao aumento da perda de sinapses após a lesão, principalmente nas sinapses inibitórias (Oliveira et al., 2004). No mesmo contexto (Zanon et al., 2010) induziram o aumento da expressão de MHC I através de interferon beta no microambiente medular, associado à axotomia periférica e demostraram que, com uma maior expressão de MHC I, há maior perda sináptica inibitória, porém se preservando a seletividade. Além disso, observaram uma grande quantidade de MHC I na micróglia, e que os astrócitos tem seu nível de reatividade comprometido pela modulação do MHC I, o que altera o processo de plasticidade sináptica.
Acreditamos que outras moléculas no sistema imune possam estar presentes nesse processo de plasticidade sináptica, como por exemplo os receptores do tipo Toll.
1.5 Toll like receptor no SNC
Os receptores do tipo Toll (TLRs) são uma família conservada evolutivamente de receptores de reconhecimento de padrões moleculares. Estão presentes em
muitos tipos celulares que reconhecem produtos de uma grande variedade de microorganismos, assim como moléculas expressas ou liberadas por células estressadas ou em processo de morte (Abbas et al., 2015; Hoshino et al., 1999).
Os TLRs são glicoproteínas integrais de membrana, de tipo I, que contêm repetições ricas em leucina flanqueadas por locais ricos em cisteína em regiões extracelulares. Estão envolvidas na ligação ao ligante, e um domínio de homologia do receptor Toll/ IL-1 (TIR) em suas caudas citoplasmáticas, é essencial para a sinalização. Os domínios TIR também são encontrados nas caudas citoplasmáticas dos receptores para as citocinas IL-1 e IL-8, e vias de sinalização similares são disparadas pelos TLRs, IL-1 e IL-8 (O'Neill et al., 2013).
Esses receptores de mamíferos estão envolvidos em resposta a uma grande variedade de moléculas que são expressas pelos microorganismos, mas não por células saudáveis de mamíferos. Os ligantes que os diferentes TLRs reconhecem são estruturalmente diversos e incluem produtos de todas as classes de microorganismos (Akira and Takeda, 2004). (Figura 2). Os TLRs também estão envolvidos na resposta a moléculas endógenas, cuja a expressão ou localização indicam dano celular.
As bases estruturais das especificidades dos TLRs residem nos múltiplos módulos extracelulares ricos em leucina destes receptores, que se ligam diretamente aos PAMPs ou a moléculas adaptadoras que se ligam aos PAMPs. Existem entre 16 e 28 repetições ricas em leucina nos TLRs, e cada um destes módulos é composto de 20 a 30 aminoácidos que incluem motivos conservados LxxLxLxxN (onde L é leucina, x é qualquer aminoácido e N é a asparagina) e resíduos de aminoácidos que variam entre diferentes TLRs. Os resíduos variáveis de ligação dos módulos são a superfície convexa formada pelas alfa hélice e alças B. Essas repetições contribuem para a habilidade de alguns TLRs de se ligar a moléculas hidrofóbicas, tais como LPS bacteriano. A ligação do ligante aos domínios ricos em leucina causa interações físicas entre as moléculas do TLR e a formação de dímeros de TLR. O repertório de especificidades do sistema TLR é estendido pela habilidade dos TLRs de heterodimerizar um com o outro. Por exemplo, dímeros de TLR2 e TLR6 são necessários para respostas ao peptidoglicano (Abbas et al., 2015).
Especificidades dos TLRs também são influenciadas por várias moléculas não TLR acessórias. Isso é mais bem definido para a resposta do TLR4 ao LPS(Lehnardt et al., 2002). O LPS primeiro se liga à proteína solúvel de ligação do LPS no sangue
ou fluido extracelular. Este complexo serve para facilitar distribuição do LPS para a superfície da célula respondedora. Uma proteína extracelular denominada MD2 (myeloid differentiation protein 2) se liga ao componente lipídio A do LPS, formando um complexo que, então, interage com o TLR4 e inicia a sinalização. Outra proteína denominada CD14 também é necessária para a sinalização eficiente induzida pelo LPS. O CD14 é expresso pela maioria das células (exceto células endoteliais) como uma proteína solúvel ou uma proteína de membrana ligada glicofosfatidilinositol. Ambos CD14 e MD2 também podem se associar a outros TLRs (Rajaiah et al., 2015). Assim, combinações diferentes de moléculas acessórias nos complexos TLRs podem servir para ampliar a quantidade de produtos microbianos que podem induzir respostas imunes inatas. Os TLRs são encontrados na superfície celular e nas membranas intracelulares e são, então, capazes de reconhecer microorganismos em diferentes localizações celulares. Os TLRs 1,2,4,5 e 6 são expressos na membrana plasmática, onde eles reconhecem vários PAMPs no meio ambiente extracelular. Alguns dos estímulos microbianos mais potentes para as respostas imunes inatas se ligam a esses TLRs da membrana plasmática, tais como LPS bacteriano e ácido lipoteitóico, que são reconhecidos pelos TLRs 4 e 2, respectivamente (Abbas et al., 2015).
Os neurônios podem reconhecer ligantes endógenos, bem como patógenos invasores e participam tanto no desenvolvimento quanto nas respostas associadas à lesão do SNC. Os TLRs foram implicados tanto na patologia infecciosa do SNC quanto na não infecciosa e parecem desempenhar papéis importantes tanto na topografia e reparação do tecido, como também foram considerados como alvos terapêuticos na inflamação e infecção do SNC (Kielian, 2009).
Figura 2. Ligantes específicos de cada TLR. Observe que o receptor TLR4 reconhece
LPS e o receptor TLR2 reconhece peptidoglicano bacteriano. Fonte: Abbas, A.K., Lichtman, A.H., and Pillai, S. (2015). Imunologia Celular e Molecular
Tendo em vista as profundas mudanças em circuitos na medula espinal que ocorrem após uma lesão periférica, é possível que os TLRs estejam envolvidos em vias de sinalização que também envolvem a glia e neurônios.
Nesta linha, (Freria et al., 2012) observaram que após transecção do nervo isquiático, os receptores TLR4 e TLR2, reagem de forma oposta em relação a estabilidade dos terminais pré sinápticos, uma vez que a presença de TLR4 gerou uma regulação positiva do fator neurotrófico derivado das células gliais e uma maior regulação de interleucina-6, mas não foram observadas diferenças morfológicas na reatividade glial. Em contrapartida, a expressão de TLR2 levou a uma maior perda sináptica, relacionada com o aumento da astrogliose e de interleucinas pró– inflamatórias. Além disso, a ausência de TLR2 resultou na regulação positiva de fatores neurotróficos e expressão aumentada de MHC I.
Posteriormente (Freria et al., 2016) utilizou animais mutantes para TLR4 e nocautes de TLR2, sendo que os animais tiveram o nervo isquiático esmagado, onde foi demonstrado que os animais mutantes para TLR4 tiveram uma maior recuperação funcional, e também apresentaram expressão de proteína P75 e neurofilamento aumentadas, quando comparados com animais selvagens. Além disso, a recuperação
funcional foi relacionada com um maior número de brotamento de terminais nervosos. Já os animais nocautes para TLR2 mostraram um número de axônios degenerados 30% maior no coto distal no nervo isquiático axotomizado, e uma maior diminuição da expressão das proteínas p75 e neurofilamento em relação aos animais controle. Entretanto, a ausência do receptor TLR2 não influenciou na recuperação funcional.
Em contrapartida (Boivin et al., 2007a) demonstrou que na ausência do receptor TLR2, TLR4 e MyD88 ocorre um menor recrutamento de macrófagos no coto distal do nervo axotomizado. Além disso, tais autores observaram que microinjeções com os ligantes de TLR2 e TLR4 no local da lesão no nervo isquiático resultam na depuração mais rápida da mielina degenerada e recuperação motora acelerada.
Estes fatos sugerem um papel dos TLRs na plasticidade sináptica e que possa haver interação entre estes receptores e a via do MHC I. No entanto, nenhum estudo descreveu os mecanismos pelos quais os TLRs afetam a plasticidade sináptica, bem como a relação destes com o MHC I.
2. Justificativa
Sabe-se que LPS aumenta a expressão de TLR-4, sendo este um reconhecido modelo experimental para elevar a expressão deste receptor permitindo, portanto, estudos de plasticidade sináptica após lesão nervosa, em comparação com animais knockout para TLR-4. Faz-se interessante conhecer o papel deste receptor na plasticidade sináptica após lesão axonal periférica, bem como sua relação com MHC I. Acreditamos que os resultados do presente estudo possibilitem melhor conhecimento molecular dos mecanismos envolvidos nas modificações dos circuitos medulares após lesão nervosa. Tendo em vista que a resposta inflamatória, no nervo periférico lesado, contribui para o sucesso ou eventual falha no processo regenerativo, o conhecimento aprofundado da sobreposição dos processos neurais e imunes certamente contribuirá para o desenvolvimento de estratégias regenerativas mais eficientes.
3. Objetivos
3.1 Objetivos geraisVerificar a importância da expressão do receptor tipo Toll 4 (TLR4) na plasticidade sináptica da medula espinal e sua relação com a expressão de receptores MHC I, bem como com a gliose reativa, após o esmagamento do nervo isquiático em camundongos C57BL/6 selvagens e TLR2 e 4 KO.
3.2. Objetivos específicos
• Caracterizara estimativa da densidade de terminações sinápticas pela expressão de sinaptofisina na coluna anterior da medula lombar.
• Detectar e quantificar terminações pré-sinápticas glutamatérgicas VGLUT-1 positivas, em aposição ao corpo celular dos motoneurônios, com e sem estimulação com LPS; • Analisar a distribuição dos genes, B2M beta- 2 microglobulina,
CGPR- Calcitonin Gene-Related Protein (proteína relacionada ao gene de calcitonina) e GAP 43 - Growth Associated Protein 43 (proteína 43 associada ao crescimento) na medula espinal após axotomia, nos diferentes grupos experimentais, através de RT-qPCR, empregando-se o método Taqman.
• Analisar a recuperação funcional dos animais dos grupos experimentais através do Walking Track Test (CatWalk), após esmagamento do nervo isquiático, até a recuperação completa da marcha.
4. Metodologia
4.1 Animais e Grupos experimentais
Foram utilizados camundongos machos imunocompetentes da linhagem C57BL/6J (Wt, selvagem) e sua versão deficiente (knockout) para os receptores TLR 2 e 4 (C57BL/6J /TLR4-KO, (Hoshino et al., 1999), (C57BL/6J /TLR2-KO (Takeuchi et al., 1999) entre 8 e 12 semanas de idade e peso corporal de aproximadamente 25g. Os animais foram obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas. Os experimentos foram conduzidos seguindo-se as normas de ética na experimentação animal e foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-Unicamp – protocolo CEUA; nº 3637-1). Os animais foram mantidos no biotério do Laboratório de Regeneração Nervosa do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional (IB-Unicamp) em minisoladores, livre acesso à agua e comida, em ambiente com temperatura controlada (23°C) e ciclo de claro/escuro de 12h. As linhagens transgênicas foram cedidas pelo professor José Maria Alvarez Mosig (ICB/USP). Os animais nocautes de TLR4 foram genotipados pela técnica de PCR a partir do DNA obtido da cauda do animal. Os primers utilizados para genotipagem estão descritos na tabela 1.
Todos os animais tiveram o nervo isquiático esquerdo esmagado e a medula analisada aos 7 dias pós trauma (imunofluorescência e qRT-PCR). A técnica de Western blotting foi realizada com 24 horas pós lesão e as avaliações funcional e de imunofluorescencia, com 40 dias após a cirurgia. Esse tempo de análise foi estabelecido por ser o tempo que os animais do grupo controle chegam à recuperação completa da função motora. Os animais das três linhagens foram divididos nos seguintes grupos:
1. C57BL/6J + Esmagamento + PBS
2. C57BL/6J (AX) + Esmagamento + LPS
3. TLR4 -/- + Esmagamento + PBS (veículo)
5. TLR2 -/- + Esmagamento + PBS
6. TLR2 -/- +Esmagamento + LPS
Tabela 1. Primers utilizados na técnica de PCR para a genotipar animais
nocautes para TLR4.
FW: 5'- CAC CAC CTC TCA AAC TTG- 3' TM= 50,5 C
RV: 5'- TCC CAA GAT CAA CCG ATG- 3' TM= 51,8 C
As técnicas utilizadas nesse trabalho, bem como os grupos experimentais e tempos de sobrevida após a lesão são indicados na tabela 2.
Tabela 2. Grupos experimentais e técnicas empregadas no estudo.
Grupo Técnicas ➔ (tempo de sobrevida) RT – PCR 7 dias Imunofluorescência 7 dias Imunofluorescência Catwalk 40 dias WB 24 horas C57BL/6J + PBS n=5 n=5 n=5 n=3 C57BL/6J + LPS n=5 n=5 n=5 n=3 TLR4 -/- + PBS n=5 n=5 n=5 n=3 TLR4-/- + LPS n=5 n=5 n=5 n=3 TLR2 -/- + PBS n=5 n=5 n=5 n=3 TLR2 -/- + LPS n=5 n=5 n=5 n=3
4.2 Preparo e inoculação de LPS
O LPS (L2880, Sigma Aldrich®) foi diluído em PBS na concentração de 0,5 mg/Kg e administrado, por via intraperitoneal, 48 e 24 horas antes da lesão. Essa concentração foi estabelecida a partir de testes nos animais das três diferentes linhagens, uma vez que, com a dose descrita na literatura, a mortalidade se mostrou alta e recorrente.
4.3 Procedimento cirúrgico para esmagamento do nervo isquiático
Os camundongos foram anestesiados com cloridrato de cetamina (100mg/Kg) (DOPALEN®) e de xilasina (10mg/Kg; ANASEDAN®) por injeção via intraperitoneal. Após tricotomia, foi feita incisão da pele na região média da coxa esquerda, sendo a musculatura da coxa cuidadosamente afastada, expondo-se o nervo isquiático para realização do esmagamento (Figura 3). O esmagamento foi realizado com uma pinça hemostática pressionando o nervo isquiático em seu terço proximal, próximo à incisura isquiática maior, por dez segundos. A musculatura foi então reposicionada e a pele suturada.
Figura 3. Procedimento cirúrgico para o esmagamento do nervo isquiático. Em (A), a
tricotomia da pele da região póstero-medial da coxa esquerda. Em (B), o afastamento musculatura expondo o nervo isquiático antes do esmagamento. Em (C) encontra-se o nervo isquiático após o esmagamento. Em (D), sutura da pele após procedimento cirúrgico.
Os animais ficaram sob fonte de luz para evitar hipotermia, até a recuperação da anestesia. Após esse procedimento, foram mantidos no biotério do Departamento de Anatomia do Instituto de Biologia da Unicamp até o momento do sacrifício.
4.4 Sacrifício e preparação do tecido
Os animais foram eutanasiados com 7 e 40 dias após o esmagamento dependendo do grupo experimental, por aprofundamento da anestesia (cloridrato de cetamina (150mg/Kg) (DOPALEN®) e de xilasina (20mg/Kg; ANASEDAN®) por injeção via intraperitoneal, seguindo-se à imediata perfusão transcardíaca com solução salina em PBS 0,1M (pH 7,34). Para obtenção de material para imunofluorescência, a perfusão prosseguiu com paraformaldeído 4% em PB. Segmentos da intumescência lombar foram dissecados, fixados em paraformaldeído 4% em PBS por 18h a 4ºC, incubados em soluções de sacarose 10%, 20% e 30% (24h cada, 4ºC), e congelados em meio de congelamento (Tissue-tek) à -37ºC com n-hexano resfriado em nitrogênio líquido. Cortes transversais de medula espinal com 12 µm de espessura, obtidos em criostato (Microm, HM525) foram montados em lâminas de vidro previamente gelatinizadas e mantidos a -20ºC até o uso. Foram utilizados cinco animais por grupo.
4.5 Imunofluorescência
As lâminas com os criocortes foram inicialmente climatizadas em câmara úmida e lavadas em PBS 0,01M. O bloqueio das proteínas inespecíficas foi feito por incubação em BSA 3% em PB por 45 minutos. A seguir os cortes foram incubados com os anticorpos primários descritos na tabela 3, diluídos em BSA 1%, por 4 horas. As lâminas foram lavadas com PBS 0,01M e incubadas por 45 minutos com o anticorpo secundário adequado, conjugado a fluorocromo (CY2 ou CY3) e, em seguida, lavadas com PB 0,01M. Os cortes foram cobertos por lamínulas com solução de glicerol/PBS (3:1). As lâminas imunomarcadas foram observadas em microscópio de fluorescência Leica DM5500 CTR 6500® (Leica Microsystems CMS GmbH) utilizando-se uma câmera de alta sensibilidade (Nikon, DXM 1200F) utilizando-se os filtros de rodamina (CY3).
Tabela 3. Lista de anticorpos primários utilizados para imunofluorescência.
Anticorpo Fornecedor Hospedeiro Código do produto Concentração
Sinaptofisina Novus Biologicals Coelho NBP2-25170 1/1000
GFAP Abcam Coelho AB779 1/1500
Iba-1 Wako Coelho 019-19741 1/750
VGLUT-1 Synaptic Systems Coelho 135303 1/1000
Para a quantificação, foram selecionadas três fotos representativas de cada animal, em todos os grupos. Para Sinaptofisina e VGLUT1, a densidade integrada de pixels, que representa a intensidade da imunomarcação, foi medida em oito áreas ao redor de cada motoneurônio (Figura 4) presente no núcleo motor lateral do corno anterior da medula espinal, de acordo com Oliveira et al. (2004), utilizando-se o software IMAGE J (versão 1.33u, National Institutes of Health, USA). A densidade integrada de pixels foi calculada para cada animal e então estabelecida a média para cada grupo.
Figura 4. Esquema de um motoneurônio alfa (lâmina IX) com terminais em aposição.
As linhas tracejadas representam áreas onde foi medida a densidade integrada de pixels.
4.6 Avaliação da função motora
Foi realizada avaliações dois dias antes da lesão em animais dos grupos experimentais e até 40 dias após o esmagamento. Os animais foram colocados para
andar ao longo de uma passarela com um assoalho de vidro (100 cm comprimento x 15 cm largura x 0.6 cm espessura) localizada em uma sala escura. Uma lâmpada fluorescente ilumina e realça pontos de contato das patas com o assoalho de vidro, mediante a pressão exercida pelas mesmas durante a marcha. O assoalho do corredor é monitorado por uma câmera Fujinon DF6HA-1B equipada com uma objetiva grande angular (Cosimar 8,5 mm) que detecta a média de intensidade em pixels. A intensidade do sinal varia de acordo com a pressão aplicada pela pata do animal. Esses sinais são digitalizados pelo PCImage-SG quadro à quadro (Matrix vision GmH, Oppenheimer, Alemanha) e o programa CatWalk adquire, armazena e analisa os vídeos dos animais caminhando pelo corredor. Para o cálculo do índice de recuperação motora do nervo isquiático, foram utilizados dois parâmetros: a distância entre o primeiro e o quinto dedo (toe spread, TS) e a distância entre o terceiro dedo e o calcanhar (print length, PL). Estes parâmetros foram utilizados para a medição das pegadas das patas posterior direita (normal) e posterior esquerda (lesada) e os valores aplicados na seguinte fórmula descrita por Bain, et al (1989):
IFI= 118,9*((EPL-NPL)/NPL)-51,2*((ETS-NTS)/NTS)-7,5 (E = lado lesionado, N = lado normal)
4.7 Western blotting
Para quantificar a proteína TLR4, na intumescência lombar (lados ipsi e contralateral) obtidas 24 horas após a lesão. As medulas, foram dissecadas a fresco, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em temperatura -80. Posteriormente, foram então homogenizadas durante 30 segundos em tampão de extração de proteína RIPA (NaCl 150 mM, Tris 50 Mm pH 8,0, PMSF 1 mM, EDTA 1Mm, 0,5% de ácido Na-desoxicolato, 0,1% de SDS e 1% de Triton X – 100). A concentração total de proteína foi determinada se utilizando do ensaio Bio-Rad de proteínas de Bradford. O Western blotting foi realizado após a eletroforese com 40-60 g de proteína em cada amostra de tecido em gel de poliacrilamida a 10%, sob condições redutoras. Após eletroforese, o material foi transferido eletricamente
(Sistema Höefer) para membranas de nitrocelulose (Hybond-ECL; Amersham Biosciences, Chalfont St. Giles, Reino Unido) sob corrente constante de 400mA em cuba refrigerada. As membranas foram bloqueadas com a solução Rad Block por uma hora sob agitação em temperatura ambiente. Em seguida, foram incubadas com leite desnatado a 1% em TBS-T contendo o anticorpo anti-TLR4 na diluição 1:1000. A seguir, as membranas foram lavadas com TBS-T e incubadas com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase na diluição de 1:1000 por 45 min. Após nova série de lavagens, a atividade peroxidásica foi revelada através do emprego de luminol (sc2048, Santa Cruz Biotechnology). Para a exposição e digitalização das bandas foi utilizado o sistema de captura Syngene G-box. A intensidade de marcação obtida foi determinada por densidade integrada de pixels das bandas, utilizando o programa IMAGE J (NIH,EUA). Os experimentos foram realizados em triplicada, sendo os resultados apresentados como média ±EP.
4.8 Análise da expressão gênica pela técnica qRT–PCR
- Análise da qualidade da integridade do RNA extraído das amostras. - Extração do RNA total
Com a medula ainda congelada foi adicionado o trizol (Quiazol). O tecido foi então lizado completamente e homogeneizado. A solução resultante foi incubada por 5 min à temperatura ambiente para dissolução de complexos nucleoprotéicos. Adicionou-se 200 l de clorofórmio, seguida de agitação vigorosa. Outra incubação foi realizada por 5 min, à temperatura ambiente, seguida por centrifugação (12.000 rpm, 15min, 4ºC). A fase aquosa superior onde se localiza o RNA foi então transferida para um novo tubo, onde foi adicionado 1 volume de álcool etílico 70%. Após homogeneização o material foi purificado utilizando o kit RNeasy Lipid Tissue Mini Kit ( Qiagen – cat nº 74804) que se baseia em sucessivas centrifugações em colunas e tratamentos com tampões específicos. Após a adesão do RNA na membrana da coluna e diversas lavagens com tampões, o RNA foi eluído em água livre de RNAse e mantido no biofreezer (-80°) até o momento do uso.
4.8.1 Validação da quantidade e qualidade e integridade do RNA
Logo após a extração foi realizada a quantificação do RNA com o uso de um nanofotometro. Com o mesmo aparelho a qualidade das amostras foram avaliadas através das razões de absorbância 260/280 nm e 260/230. Essas razões devem ficar idealmente entre 1,7 – 2,5 para RNA. A razão 260/280 indica a pureza do RNA (280) em relação a proteínas. Já a razão 260/230 indica a pureza do RNA em relação a substâncias químicas, como o etanol ou isotiocianato de guanidina, presente no trizol ou kit utilizado para extração. A integridade do RNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 1% sob condições desnaturantes. Um sistema de desnaturação é sugerido porque o RNA apresenta extensa estrutura secundária, através do emparelhamento de bases intramoleculares e isto impede sua migração estritamente de acordo com o seu tamanho. RNA intacto deve apresentar bandas 28S e 18S de RNAr bem delimitadas (figura 5). A banda de RNAr 28S deve ser aproximadamente duas vezes mais intensa que a de RNAr 18S. Esta proporção de 2:1 (28S: 18S) é uma boa indicação de que o RNA está intacto. RNA parcialmente degradado terá uma aparência manchada de arraste, não terá as bandas de RNAr bem definidas ou não vai apresentar uma proporção de 2: 1. RNA completamente degradado aparece como um arraste (smear) com baixo peso molecular.
Figura 5. Bandas de RNAr 28S e 18S bem delimitadas. É possível observar que a
banda 28S é o dobro da 18S, indicando que o RNA tem boa integridade.
As amostras (RNA) foram homogenizadas com formamida (agente desnaturante), TBE 10x, loading dye e brometo de etídio e aquecidas a 62ºC por 5 minutos e posteriormente mantidas em gelo por mais 5 minutos. Foram então
Banda 28S Banda 18S
aplicadas nos pocinhos do gel de agarose 1%, com tampão de corrida TBE 0,5%. A corrida teve duração de 55 minutos e voltagem constante de 120V. Após a corrida, o gel foi observado em um transiluminador UV, para a observação das bandas 28S e 18S.
4.8.2 Síntese do DNA complementar (cDNA)
Após atestar que o RNA tinha boa qualidade e integridade, foi realizada a síntese do DNA complementar (cDNA) utilizando-se o kit High Capacity, seguindo as instruções do fabricante. O cDNA foi sintetizado a partir de 1,0 μg de RNA total com o uso de oligo (dT)18 como primer.
4.8.3 Reação da Polimerase em Cadeia em Tempo Real
O cDNA produzido foi utilizado como molde para as reações de PCR em tempo real. As reações, feitas sempre em triplicata, foram realizadas utilizando-se os cDNA produzidos, TaqMan® Gene Expression Master Mix (2✕) (Life Technologies -
PN 4369016), água livre de RNase e os ensaios Taqman (primer + sondas de
hidrólise) para os genes contidos na tabela 4, perfazendo um volume final de 20μL.
Tabela 4. Ensaios Taqman utilizados no RT-qPCR
Genes
Código Life Technologies ®
HPRT1 Mm01545399_m1
CGRP Mm00801462_m1
GAP43 Mm00500404_m1
B2M Mm00437762_m1
Os genes de referência (GAPDH e HPRT1) foram marcados com fluoróforo VIC e os genes alvo com fluoróforo FAM. Todos os ensaios comprados são inventariados, o que significa que a Life Technologies fez extensivas validações desses ensaios, garantindo que todos apresentam 100% de eficiência de amplificação. A empresa sugere que as análises sejam feitas através do cálculo de ∆∆C, que em todos os testes se mostrou mais fidedigno. Em todos os casos foram feitos controles negativos,
contendo água RNase free em substituição a amostra. Todo o procedimento para a PCR quantitativa foi feito na plataforma de instrumentação MX3005P (GE). As reações foram realizadas seguindo a termociclagem indicada pelo Master Mix (tabela 5).
Tabela 5. Condições de termociclagem das reações de RT-qPCR
Os resultados foram analisados pelo programa MxPro (GE). O ciclo no qual se detecta fluorescência acima do limite basal estabelecido (threshold) é denominado ciclo de threshold ou Ct. Quanto maior a expressão de um gene, ou seja, quanto mais cópias existirem no início da reação, mais precocemente ocorre a amplificação e, conseqüentemente, menor é o Ct.
Amostras de todos os animais foram testadas com dois genes de referência: GAPDH e HPRT1 e os resultados foram analisados pelo software Bestkeeper. Um bom gene de referência tem um nível constante de expressão em todas as amostras do estudo. Sendo assim, é aceitável encontrar no máximo 0,5 Ct de variação entre todas as amostras experimentais, sendo assim, para os experimentos foi considerado como endógeno o HPRT1.
4.8.4 Análise dos dados
A quantificação relativa dos genes de interesse foi feita através do cálculo do ΔΔCt, seguindo os seguintes passos:
- Normalização pelo gene de referência: ΔCt = Ct gene alvo – Ct gene referência
- Normalização pelo calibrador (grupo AI): ΔΔCt = ΔCt amostra - ΔCt calibrador - Cálculo do “fold change” (quantificação relativa ao calibrador): 2-ΔΔCt
4.9 Análise estatística
Os resultados foram estatisticamente avaliados através de ANOVA e/ou teste t Student (para dados paramétricos) ou u de Mann Whitney (para dados não-paramétricos). Em todas as análises foram consideradas as significâncias de p< 0,05.
5. Resultados
5.1 Western Blotting
Para avaliar a expressão de TLR4 após lesão periférica, a quantidade de proteína TLR4 expressa no tecido nervoso medular, foi mensurada através da técnica de Western blotting, vinte e quatro horas após a lesão. A figura 6 e a tabela 6 demonstram que as bandas dos animais que receberam LPS estão mais marcadas em relação as bandas dos animais que receberam PBS. (Média ± EP).
Figura 6. Western Blotting para a proteína TLR4. (D = contralateral; E = ipsilateral).
Amostras numeradas com o número 100 provém de animais tratados com PBS e as numeradas com 200 receberam LPS. (A) Note à intensificação das bandas do grupo tratado com LPS em relação ao grupo controle tratado com PBS. (B) Gráfico com a quantificação de pixels e a comparação entre os grupos LPS e PBS, demonstrando aumento significativo da expressão de TLR4, p<0,05. Dip: densidade integrada de pixels.
