INSTITUTO DE BIOLOGIA
CARLOS HENRIQUE TONHATTI
DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES
DE Poecilia Vivipara (CYPRINODONTIFORMES: POECILIIDAE)
DO NORTE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Campinas
2017
DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE
POPULAÇÕES DE Poecilia Vivipara
(CYPRINODONTIFORMES: POECILIIDAE) DO
NORTE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Genética e Biologia Molecular, na área de concentração em Genética Animal e Evolução
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRES-PONDE A VERSÃO FINAL DA TESE DE-FENDIDA PELO ALUNO CARLOS HEN-RIQUE TONHATTI E ORIENTADA PELO Prof. Dr. SÉRGIO FURTADO DOS REIS
Orientador: Prof. Dr. SÉRGIO FURTADO DOS REIS
Coorientadora: Dra. PRIANDA LABORDA RIOS
Campinas
2017
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Sérgio Furtado dos Reis Profa. Dra. Dra. Ana Cristina Petry Prof. Dr. Mateus Henrique dos Santos
Profa. Dr. Maria Imaculada Zucchi Prof. Dr. André Victor Lucci Freitas
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de defesa que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A
gradeço à minha família pela confiança, apoio, paciência desde o começo em todos os meus ciclos de aprendizado, em todas as minhas escolhas. Aos meus pais e minha irmã que com muito carinho me incentivaram e apoiaram. Em especial à minha companheira Ana Paula de Andrade que esteve ao meu lado durante todo este doutorado, que me deu força, amparo e rumo. Sem ela eu não chegaria até o fim deste projeto.Aos amigos eternos que mesmo sem poder vê-los nos últimos anos tenho a honra e felicidade de poder contar com vocês: Marcelinho, Duartina, Zé bola, Luluzinha, Rô Carrilho, Bisa, Bispo, Romântico. Aqueles que tiveram o “azar” de me ter sob o mesmo teto: Jefferson, Pietro, Gastão, Maraisa, Andre Rech, Felipe, Maurício e tantos outros com os quais aprendi muito em momentos inesquecíveis. Aos “amigxs”da Rep. Regina que me acolheram em um momento muito delicado e que me ensinaram muito sobre repeito. Em especial ao João Paulo “o terceiro elemento” que com “domínio de palco” se tornou um amigo/irmão muito especial.
Às pessoas maravilhosas que encontrei no meu caminho em terras estrangeiras e que fizeram do meu ano “apartado” um ano inesquecível: Nadia Shimata, Aislan Gomide ,
Otto, Giane Silvestre e a minha “parça” Rafaela Selem Moreira. Thanks for my lovely friend Barbara Yates the Angel that make USA easier for me and show me the translation of “friendship”. Also thanks to Dr. Montgomery Slatkin that welcomed me at UC Berkeley and teach me more that I expected. Thanks for people from Integrative Biology Department that
make my time in Berkeley very interesting and enjoyable. Não posso deixar de agradecer à
Camila Vieira que me mostrou o caminho das pedras para conseguir tudo isso e a Madza que mostrou ser possível mudar de rumo várias vezes.
Aos meus mestres de sempre que não me canso de repetir o orgulho de ter aprendido com vocês: Francisco Carlos Motta, José Pereira, João Batista.
Aos colegas e amigos que fiz nestes últimos anos com os quais aprendi, ensinei, compartilhei muita coisa e que sempre terei o maior carinho: Juliana Yamada, Carol Leme, Barbara Henning, Matheus Viana e outros. Em especial à Mariane Azevedo que, pacientemente, me ensinou e ajudou em um momento crucial.
Aos amigos Rute Beatriz Garcia Clemente-Carvalho e José Louvise Gomes Júnior que nestes últimos anos foram amigos à distância os quais sinto muito a falta deles no dia-a-dia do trabalho. Ambos foram boas influências profissionais as quais sempre terei em mente.
Prianda Laborda Rios pela paciente coorientação e a Dra. Anete Pereira de Souza pela ajuda e por abrir o LAGM para tanta gente poder trabalhar.
À Unicamp que sempre será “Minha casa” que por tanto tempo esteve presente na minha vida e que formou o profissional que sou hoje. Onde fui estagiário de nível médio e superior, bolsista trabalho, prestador de serviço, funcionário concursado, monitor de evento e disciplina, professor tutor, membro do CAB, construtor de forno de barro, iniciando, graduando, mestrando, doutorando e tantas outras coisas. Fazendo amigos e lembranças. Não poderia esquecer de agradecer ao Sappe que me permitiu entender e sobreviver a esta torre de marfim tão aconchegante e traiçoeira.
À FAPESP, Capes e CNPq que através de bolsas e auxílios permitiram a minha caminhada até aqui. Ao Programa de Doutorado Sanduíche no Exterior- PDSE/Capes que proporcionou meu ano de intercâmbio em Berkeley, Califórnia.
E finalmente, agradeço sinceramente “Aos Joões, Marias, Chicas e Raimundos” que mesmo sem me conhecerem financiaram meus estudos e aos quais espero retribuir.
A interação entre o ambiente e a biologia de uma espécie influencia a estrutura genética das populações dessa espécie que ocorrem neste ambiente. Assim ao decompor a estrutura genética de uma especie é possível compreender como esta é influenciada pelo ambiente em que vive. Neste trabalho tento estimar a diversidade e a estrutura genética de populações naturais de um peixe tropical Poecilia vivipara que habitam a região norte do estado do Rio de Janeiro para então compreender a interação entre o ambiente e a biologia desta espécie.
A colonização recente (< 5000 anos) da região norte do Rio de Janeiro pelas populações de Poecilia vivipara gera um ambiente propicio para análises evolutivas e ecológicas devido a diversidade encontrada e as escalas de tempo e espaço apresentadas pelo sistema. A região Norte do Rio de Janeiro apresenta a peculiaridade da formação do delta do Rio Paraíba do Sul como um número muito grande lagoas, riachos e pântanos fornecendo uma grande variabilidade de habitats em um pequeno espaço geográfico.
O principal objetivo desta tese foi estimar a variação genética das populações de Poecilia
vivipara que ocorrem dentro do delta do Rio Paraíba do Sul e de populações externas a
este delta. Com estas informações, tentar inferir a estrutura genética dessas populações e identificar os possíveis fatores responsáveis pela estruturação. Para tanto 420 indivíduos foram coletados e caracterizados geneticamente com o uso de marcadores moleculares. Foi utilizado a Região de Controle da replicação mitocondrial e 18 locos microssatélites isolados para este trabalho.
Os resultados demonstram uma grande variabilidade molecular em ambos os marcadores em praticamente todas as populações. Houve detecção de estrutura genética entre as populações e esta estrutura não pode ser explicada pela distancia entre as populações. A hipótese alternativa aceita para explicar a estrutura foi que a historia de formação das lagoas mais precisamente o processo predominante na formação das lagoas. Estes processos foram a sedimentação fluvial e a sedimentação marinha.
Ademais, outras características da biologia da espécie puderam ser observadas como: a importância das drenagens como facilitadoras da migração, a dispersão igual entre fêmeas e machos e a evidência de seleção natural sobre os locos microssatélites.
The interaction between the environment and the biology of a species influences the genetic structure of the populations of this species occurring in this environment. Thus, by decomposing the structure genetics of a species, it is possible to understand how it is influenced by the environment in that lives. In this work I try to estimate the diversity and genetic structure of populations of a tropical fish Poecilia vivipara that inhabit the northern region of the state of Rio de Janeiro to then understand the interaction between the environment and the biology of this species.
The recent colonization (< 5000) of the northern region of Rio de Janeiro by the populations of Poecilia vivipara creates an environment conducive to evolutionary and ecological analysis due to the diversity the time and space scales presented by the system. The northen region of Rio de Janeiro presents the specularity of the formation of the Paraiba do Sul river as a very large number of ponds, streams and swamps providing a large variability of habitats in a small geographic space.
The main objective of this thesis was to estimate the genetic variation of the populations of Poecilia vivipara in the delta of the Paraíba do Sul River and this delta. Using this information, try to infer the genetic structure of these populations and identify the possible factors responsible for structuring. For this purpose, 420 individuals were collected and characterized genetically with the use of molecular markers. We used the Control Region of mitochondrial replication and 18 microsatellite loci isolated for this work.
The results demonstrate a big amount of molecular variability in both markers in practically all populations. There was a genetic structure and this structure can not be explained by the distance between populations. The alternative hypothesis accepted to explain the structure was that the history of lagoons more precisely the predominant process in pond formation. These processes were river sedimentation and marine sedimentation.
In addition, other characteristics of the biology of the species could be observed as: a importance of drainage as facilitators of migration, equal dispersion among females and males and the evidence of natural selection on the microsatellite loci.
1 INTRODUÇÃO GERAL . . . 12
2 MARCADOR MITOCONDRIAL REGIÃO DE CONTROLE . . . 25
2.1 Introdução . . . 25
2.1.1 Região de controle da replicação do DNA mitocondrial . . . 27
2.2 Métodos . . . 29
2.2.1 Extração de DNA . . . 29
2.2.2 Amplificação e sequenciamento da Região de Controle . . . 29
2.2.3 Estatísticas . . . 30
2.3 Resultados . . . 31
2.4 Discussão . . . 35
3 MARCADORES NUCLEARES MICROSSATÉLITES . . . 37
3.1 Introdução . . . 37
3.1.1 Isolamento dos locos microssatélites . . . 38
3.1.2 Genotipagem . . . 39
3.1.2.1 Erros de genotipagem . . . 40
3.2 Métodos . . . 42
3.2.1 Desenvolvimento dos marcadores microssatélites . . . 42
3.2.2 Padronização da genotipagem das populações amostradas . . . 43
3.2.3 Análise dos dados . . . 45
3.2.3.1 Detecção e correção dos erros de genotipagem . . . 45
3.3 Resultados . . . 47
3.3.1 Desenvolvimento dos marcadores microssatélites . . . 47
3.3.2 Padronização da genotipagem . . . 52
3.3.3 Genotipagem dos indivíduos nas populações naturais . . . 54
3.4 Discussão . . . 59
4 ESTRUTURA GENÉTICA NAS POPULAÇÕES DE POECILIA VI-VIPARA. . . 61
4.1 Introdução . . . 61
4.1.1 Espaço-tempo em genética de populações . . . 61
4.1.2 Estatísticas sobre estrutura genética populacional . . . 63
4.1.2.1 Diferenciação entre subpopulações . . . 63
4.2 Métodos . . . 68
4.3 Resultados . . . 70
4.3.1 Diferenciação entre subpopulações . . . 70
4.3.2 Isolamento por distância . . . 75
4.3.3 Rede de haplótipos . . . 83
4.4 Discussão . . . 85
REFERÊNCIAS . . . 89
APÊNDICE A – CÓDIGOS PARA EXTRAÇÃO DOS DADOS DE FST GERADOS PELO ARLEQUIN . . . 103
APÊNDICE B – CÓDIGO PARA RODAR O STRUCTURE EM MODO PARALELO. . . . 107
APÊNDICE C – CÓDIGOS PARA ANÁLISE DE DIVERSIDADE EM MICROSSATÉLITE . . . 109
1 Introdução Geral
Esta introdução visa a apresentar os principais conceitos que embasam o desenvolvimento de todo o meu trabalho de doutorado o qual gerou a presente tese. Começo apresentando uma contextualização geral, apresentando os assuntos de modo mais geral possível, construindo o embasamento para a escolha do problema e do recorte feito para esta tese. Em seguida apresento a contextualização mais específica desse trabalho demonstrando as características dos sistemas escolhidos, as hipóteses e o desenho experimental utilizado.
Contextualização Geral
Influência da história de formação da paisagem sobre a estrutura genética
A interação entre o ambiente e a biologia de uma espécie influencia a estrutura genética das populações dessa espécie que ocorrem neste ambiente. Esta influência ocorre devido a interferência que o ambiente pode gerar sobre a conectividade entre as populações e seus indivíduos e o quanto as características intrínsecas da espécie podem sobrepor esta interferência. Deste modo, a dispersão de organismos pode conectar populações quando o mecanismo de dispersão supera o isolamento ambiental imposto. No entanto, o isolamento e subsequente divergência genética podem ocorrer se o organismo tem dispersão reduzida e há limitação de conectividade entre populações (MCGLASHAN; HUGHES, 2000).Ambientes homogêneos não apresentam dificuldades para a dispersão dos organismos, além da distância. Deste modo, é razoável supor que nesses ambientes a divergência entre as populações se deva exclusivamente ao efeito da distância sobre a dispersão dos organismos.
Ambientes heterogêneos (e.g. com vários habitats) podem apresentar dificulda-des para a dispersão dos organismos. Além da distância, os organismos tem que ultrapassar barreiras físicas presentes nestes ambientes. A eficiência das barreiras depende do orga-nismo em questão. Por exemplo, quedas d’água podem ser barreiras naturais para alguns peixes. Entretanto, se a altura não for relativamente alta estas quedas podem não ser barreiras para peixes que tem a habilidade de saltar em direção oposta à correnteza. Am-bientes heterogêneos como ilhas, estuários, cadeias de montanhas, sistemas de drenagem entre outros mostraram ser eficazes em promover divergência genética entre populações (MCGLASHAN; HUGHES, 2000).
Os ambientes heterogêneos que possuem alguma estrutura hierárquica nos seus componentes são excelentes oportunidades para decompor os fatores extrínsecos (ambientais, ecológicos) e intrínsecos (modo de reprodução, modo de vida) que determinam
a estrutura genética de uma população, pois representam níveis de isolamento que podem interferir na dispersão de organismos (MCGLASHAN; HUGHES, 2000). Por exemplo, se tomarmos uma bacia hidrográfica como uma unidade, podemos considerar as suas drenagens, como um nível hierárquico inferior. Dentro das drenagens podemos considerar os rios, riachos, córregos, canais, etc como níveis hierárquicos inferiores às drenagens. Dentro do curso fluvial, a ocorrência de cachoeiras, trechos de remanso e rápidos proporcionam níveis ainda mais inferiores.
Por isso, vários trabalhos tentam decompor a estrutura genética observada entre o que se conhece da biologia da espécie e a história da formação de barreiras entre as populações. Por exemplo, estrutura de drenagens sobre populações de peixes (MCGLASHAN; HUGHES, 2000; ABOIM et al., 2013), história de formação de platô tibetano sobre populações de mamíferos (ZHANG et al., 2013), a história da formação de bacias para a calibração de taxas de mutação em peixes (BURRIDGE et al., 2008). Estudos como estes são importantes para revelar a importância de processos geomorfológicos sobre os processos de formação da estrutura genética populacional. Dentre os processos geomorfológicos normalmente avaliados, cabe citar: elevação de platô (ANDRÉFOUËT et al., 2009; ZHANG et al., 2013), captura da cabeceira dos rios (HOWARD; MORGAN, 1993;BURRIDGE et al., 2008), movimento de glaciares (CARLSSON; NILSSON, 2001), ou seja, processos que podem isolar ou conectar populações, que de outro modo estariam espacialmente separadas (MCGLASHAN; HUGHES, 2000).
Uso de peixes como modelo
Nas últimas décadas, houve o aumento no uso de peixes como modelos experi-mentais usados em várias áreas de estudo como: toxicologia, genética, oncologia, neurobio-logia, econeurobio-logia, gerontoneurobio-logia, biologia do desenvolvimento (POWERS,1989;GERHARD, 2007). Esta grande aplicação dos peixes como modelo deve-se a grande diversidade do grupo e a origem múltipla (POWERS, 1989). Diferentes espécies de peixes apresentam ca-racterísticas úteis para responder questões específicas de cada área de estudo (GERHARD, 2007). Características gerais dos peixes também contribuem para escolha destes como modelo. Em geral, apresentam ciclo de vida curto, grande produção de ovos, baixo custo de manutenção em laboratório (comparado com modelos de mamíferos, aves e anfíbios) (BOLIS et al., 2001), facilidade de cruzamento em cativeiro (POWERS,1989). Também há muita informação sobre a criação em cativeiro devido a anos de experiência prática em fazendas de criação de peixes e aquarismo (POWERS, 1989).
Vários peixes da família Poecilidae são utilizados como modelos experimentais. Estes são tolerantes a variações ambientais, facilmente mantidos em cativeiro e usualmente abundantes e com grande distribuição geográfica, sendo portanto excelentes modelos para estudos morfológicos, comportamentais e de adaptação (MONTEIRO, 2008).
Provavelmente, o modelo mais conhecido seja Poecilia reticulata Peters 1859, que ocorre naturalmente em Trinidad, na Venezuela, na Guiana e no Suriname porém é uma das espécies mais amplamente distribuída por meio de introduções. É considerado um modelo de biologia evolutiva, ecologia e comportamento animal devido à extensa documentação sobre a espécie produzida nas últimas décadas (ver Houde(1997),Magurran (2005)). Possui uma alta variabilidade morfológica, ecológica e genética, o que possibilita a investigação de vários aspectos de sua biologia: (i) evolução ao longo de gradientes de predação e outros fatores ecológicos (ENDLER, 1995), (ii) pressão seletiva de predadores e escolha de parceiros pelas fêmeas sobre o padrão de coloração corporal dos machos (ENDLER; JAN, 1980; HOUDE, 1997; KEMP et al., 2009), (iii) efeitos do parasitismo sobre a aptidão do organismo (HOUDE, 1997;MAGURRAN, 2005), (iv) comportamento (SEGHERS; MAGURRAN, 1995), e dinâmica populacional (HOUDE, 1997). Devido a sua fácil disponibilidade e manuseio, P. reticulata é escolhida para estudos de toxicologia (HOUDE, 1997). Outras espécies do mesmo gênero também são utilizadas como modelos.
Poecilia mexicana Steindachner 1863 ocorre na costa do México e da América
Central. É utilizada como modelo para evolução em gradientes ecológicos, demonstrando adaptação a condições tóxicas (PLATH et al.,2007;TOBLER,2008;EIFERT et al.,2015). Esta adaptação é utilizada para estudos comportamentais e morfológicos (PARZEFALL, 2001; PLATH; PARZEFALL; SCHLUPP, 2003; CULUMBER, 2015; BIERBACH et al., 2015).
Poecilia formosa Girard 1859 é uma espécie partenogênica que ocorre na bacia
amazônica (SCHARTL et al.,1995). É utilizada como modelo para evolução de organismos assexuados (VRIJENHOEK, 1994;STÖCK et al.,2010).
Poecilia latipinna Lesueur 1821 ocorre na América do Norte em populações em
um gradiente de salinidade apresentando uma grande tolerância a salinidade (NORDLIE; HANEY; WALSH,1992). É utilizada como modelo para escolha de parceiros (MACLAREN; ROWLAND; MORGAN,2004) e plasticidade fenotípica (TREXLER; TRAVIS; TREXLER, 2014).
Poecilia vivipara Bloch e Schneider 1801 ocorre por toda a costa Leste da
América do Sul, habitando o curso baixo de grandes rios (PARENTI; RAUCHEMBERGER, 1989). É utilizada como modelo para estudos de toxicidade (DORRINGTON et al., 2012; FERRANI, 2015; VIEIRA et al., 2014; TORREIRO-MELO et al., 2015), monitoramento ambiental (ADAM et al.,2010;MATTOS et al.,2010;MACHADO et al.,2014;FERREIRA et al.,2012) e parasitologia (SANTOS et al., 2007; SIMÕES; BARBOSA; SANTOS, 2009; SANTOS; SANTOS,2013).
Uso de marcadores moleculares
Nas últimas décadas, marcadores moleculares têm sido empregados em estudos de processos ecológicos e evolutivos. Uma grande variedade de classes de marcadores moleculares está disponível para estudar processos ecológicos e evolutivos em populações naturais. O tipo de informação gerada por diferentes marcadores depende de vários fatores (modo de herança, variabilidade intrínseca, etc) (FREELAND, 2005). A escolha de um marcador adequado para um determinado estudo deve considerar o modo de herança, a taxa de mutação, o tamanho amostral disponível e o nível de divergência das populações (KARL et al.,2012). A informação gerada usando diferentes classes de marcadores é frequentemente combinada em estudos de genética de populações com objetivo de estabelecer as relações entre os indivíduos e suas populações. Padrões discordantes de divergência revelados por marcadores diferentes são muitas vezes interpretados como se esses marcadores estivessem sujeitos a diferentes graus de deriva genética ou seleção, diferentes taxas de mutação, ou migração preferencial de um dos sexos (LARSSON et al., 2008). Entretanto, as mesmas observações podem ser resultados das diferentes propriedades estatísticas inerentes a cada classe de marcador molecular (RYMAN; PALM, 2006).
Locos mitocondriais e microssatélites (sequências simples repetidas em tandem, (LITT; LUTY, 1989)) representam duas classes de marcadores amplamente usados em
genética de populações (LU; BASLEY; BERNATCHEZ, 2001; YAMAMOTO et al.,
2011; ATICKEM et al., 2013; CAO et al., 2013; ANDO et al., 2014; VIÑAS et al., 2014). Estes marcadores possuem formas de transmissão e dinâmicas muito diferentes. O DNA mitocondrial, por ser haplóide e ser transmitido de modo uniparental, possui um tamanho efetivo menor sendo frequentemente indicado para estudos de redução do tamanho populacional e diferenciação. Por isso, espera-se que um marcador dessa classe evidencie mais fortemente o efeito da deriva que locos nucleares (KARL et al.,2012). Os locos microssatélites são marcadores codominantes e apresentam uma grande variação.
No entanto, dados empíricos apontam que ambas as classes de marcadores podem detectar divergência populacional independentemente. Deste modo, a divergência pode ser detectada por ambas as classes simultaneamente ou apenas por uma delas (KARL et al., 2012). Larsson et al. (2008) comparou as propriedades estatísticas entre o índice de fixação FST calculado usando DNA de organelas e do nuclear e verificou que a relação entre ambos depende de vários fatores e o valor não é constante. Esta relação depende do tamanho efetivo populacional, da taxa de migração dos indivíduos e de como o processo de divergência está ocorrendo. Antes do equilíbrio migração-deriva, é esperado que o FST medido usando DNA mitocondrial seja sempre maior que o mesmo índice medido usando DNA nuclear e que esta diferença diminua conforme as populações tendam para o equilíbrio. Quando o equilíbrio é atingido, estes valores estimados com ambos os marcadores são iguais (na ausência de migração). Portanto, em situação de equilíbrio genético a divergência entre
Figura 1 – Bacia hidrográfica do Rio Paraíba do Sul.
populações estimada por ambos tipos de marcadores será semelhante (LARSSON et al., 2008).
Contexto desse trabalho
Rio Paraíba do Sul
O Rio Paraíba do Sul é um dos principais rios da Região Sudeste do Brasil estendendo-se pelos estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais Figura 2. Com 1150 quilômetros de extensão, o Rio Paraíba do Sul e a bacia formada por ele, abrangem 180 municípios nos três estados tendo uma enorme contribuição para a economia desses municípios. É formado pela confluência dos rios Paraibuna e Paraitinga, no estado de São Paulo, e deságua na praia de Atafona no município de São João da Barra no estado do Rio de Janeiro. Por apresentar uma grande diferença de altitude entre a nascente e a foz, o curso do rio pode ser dividido em:
Curso Superior desde as nascentes do rio Paraitinga até Guararema, de 1800 a 550m de altitude;
Curso Médio Superior de Guararema até Cachoeira Paulista, de 550 m a 513m; Curso Médio Inferior de Cachoeira Paulista até Itaocara, de 513m a 40m; Curso Inferior de Itaocara até a foz no oceano Atlântico, de 40 a 0m.
As regiões drenadas pelo Rio Paraíba do Sul foram historicamente importantes para economia brasileira. A região vivenciou o ciclo da cana de açúcar, o início do ciclo do café e o início da industrialização como também o crescimento das metrópoles e a ocupação não planejada. Toda esta atividade econômica trouxe ao rio vários problemas ambientais como desmatamento das matas ciliares, contaminação por agrotóxicos e por lixo doméstico, assoreamento do leito, extração de areia e pesca predatória. As construções de barragens para a geração de energia elétrica e abastecimento ao longo de seu percurso geram retenção de sedimentos e redução da vazão, que ocasionam problemas de erosão da foz do Rio Paraíba do Sul em Atafona (COELHO, 2012;CUNHA et al.,2001, 252 p.).
O curso inferior do rio está sobre uma planície com um grande número de canais, lagoas e áreas de várzea as quais passam, naturalmente, por períodos de cheias. Com o aumento do assentamento humano nessa região e o uso das áreas da planície alagável para atividades agropastoris, os períodos de cheias trouxeram prejuízos financeiros devido às enchentes. Para minimizar as perdas, entre as decadas de 1950 e 1960 o estado através do DNOS executou uma série de obras de drenagem de córregos, construção de diques etc que geraram impactos ambientais na região.
Formação geológica do Rio Paraíba do Sul e do seu delta
O Rio Paraíba do Sul se formou pela captura das nascentes do Rio Paraibuna e Paraitinga. As nascentes destes dois rios eram as nascentes mais antigas do ancestral Rio Tietê. A mudança da nascente ocorreu devido ao soerguimento na costa da América do Sul que interceptaram esse curso primitivo do Rio Tietê, cujas nascentes mais a montante estão no município de Salesópolis. Esta barreira impediu que o Rio Tietê recebesse as águas dos dois outros rios secando parte do seu leito e mudando a sua nascente para a localização atual no município de Salesópolis. Por sua vez, as águas dos Rios Paraibuna e Paraitinga foram “capturadas” por outra drenagem, alterando em 180o o trajeto dos
mesmos formando o “cotovelo de Guararema”.
Com o maior aporte de água, o novo rio iniciou um novo ciclo de erosão e transporte de sedimentos através da sua calha depositando em vários lugares mas principalmente na foz. Este acontecimento somado com a retração recente (< 7000 anos) do mar originou a foz o Delta do Rio Paraíba do Sul.
Delta é o nome dado à formação deposicional de um rio em uma lagoa ou no oceano e sua formação depende de um conjunto de fatores. A formação de um delta está relacionada à quantidade de energia das margens continentais. Se a energia do rio em carrear sedimentos para a foz for maior que a energia das ondas e da maré para dispersar estes sedimentos, haverá o acúmulo costeiro de sedimentos, formando um delta. Os deltas podem ser classificados de acordo com o componente mais energético responsável por sua formação. Por exemplo, o delta do Rio Mississipi nos EUA tem predominância de
Figura 2 – Formação do delta do Rio Paraíba do Sul de 5100 anos antes do presente até hoje. Adaptado e simplificado de Martin et al. (1997)
processos fluviais sobre marinhos e os deltas do Rio Nilo no Egito e do Rio Amazonas foram formados por processos marinhos (por ondas e marés, respectivamente) predominando sobre processos fluviais 1.
Devido a suas características, os deltas são importantes como locais para assentamento humano, agricultura e para a indústria de exploração de petróleo pois, em geral, atendem aos critérios de existência das rochas geradoras e de rochas com capacidade reservatória de óleo e gás (MURILLO, 2008; WICANDER; MONROE, 2009).
O delta do Rio Paraíba do Sul é classificado como “dominado por ondas” (MURILLO, 2008) e a formação do delta levou à formação conjunta de um complexo de
lagoas. A formação das lagoas é recente e pode ser resumida da seguinte forma: durante o último avanço do mar (5100 anos antes do presente) os terraços marinhos foram erodidos formando sistemas lagunares. Com a posterior retração do mar, estes sistemas perderam contato direto com o mar formando ilhas-barreiras e a desembocadura do rio nessas lagunas desenvolveu deltas intra lagunares. Com a contínua retração do mar, ocorreu a transformação gradual das lagunas em lagoas de água doce ou salobra e, em alguns casos pântanos. As variações no nível relativo do mar após 5100 anos antes do presente foram de pequena amplitude e curta duração. Portando, há no delta do Rio Paraíba do Sul duas influências distintas: uma de sedimentação marinha oriunda das ilhas-barreiras e outra de sedimentação fluvial com sedimentos trazidos pelo rio e empurrados de volta contra a costa pelas ondas do mar (BIDEGAIN,2002; MARTIN et al., 1997).
(a) Macho
(b) Fêmea
Figura 3 – Fotos de P.vivipara (a) macho adulto, (b) fêmea adulta (Cortesia de José Louvise Gomes Junior. Republicado de Tonhatti (2012))
Poecilia vivipara
Poecilia vivipara é uma espécie de peixe de pequeno porte (2–5 cm de
com-primento) que apresenta dimorfismo sexual na forma de fêmeas que alcançam um maior tamanho de corpo em relação aos machos e machos com os primeiros raios da nadadeira anal modificados em órgão copulatório (gonopódio) Figura 3. É amplamente distribuída pela costa da América do Sul, da Venezuela até o Rio da Prata na Argentina (LUCINDA, 2003). Os fatores que influenciam a distribuição desta espécie não são conhecidos e, prova-velmente, P. vivipara não seja uma única espécie mas represente um complexo de espécies (BIZERRIL; da S PRIMO, 2001).
Como vários outros congêneres, P. vivipara é tolerante à variação ambiental (e.g. variação de salinidade, temperatura, etc) ocorrendo em diversos habitats. É ubiqua na região norte do estado do Rio de Janeiro, a qual é composta pelo delta do Rio Paraíba do Sul e lagoas de água doce e salgada. Estas lagoas apresentam um gradiente ambiental de salinidade da água resultante da proximidade com o oceano (BIZERRIL; da S PRIMO, 2001). Este gradiente de salinidade influencia a estrutura do habitat, a vegetação e a comunidade de peixes (SUZUKI; OVALLE; PEREIRA, 1998;SUZUKI et al.,2002). Deste modo, as populações de P. vivipara presentes nessa área estão sujeitas a diferentes
pressões de predação, estrutura de habitats, disponibilidade de alimento e características físico-químicas da água (MONTEIRO, 2008). Por estes motivos, estas populações de P.
vivipara podem ser usadas como modelo para estudos de biologia evolutiva e ecologia.
Neves e Monteiro (2003) investigaram diferenças morfológicas entre populações de P. vivipara em lagoas de águas doce e salobra na região norte do estado do Rio de Janeiro. Esses autores observaram que indivíduos de água doce são menores que os de água salgada. Esta diferença foi atribuída à seleção direcional devido à diferença na pressão seletiva de predadores. Monteiro e Gomes-Jr.(2005) eMonteiro (2008) reportaram um padrão espacial na variação da forma tanto em fêmeas quanto em machos. Este padrão foi associado positivamente com a salinidade da água a qual pode influenciar a taxa de crescimento. Indivíduos provenientes de água salgada apresentam altas taxas de crescimento e divergência na forma quando comparados com indivíduos de água doce (ARAÚJO; MONTEIRO, 2013; MONTEIRO; GOMES-JR., 2005; MONTEIRO, 2008).
Provavelmente a salinidade da água não seja o único agente de seleção nestas lagoas pois, o gradiente ambiental é multidimensional. Monteiro(2008) argumenta que as diferenças observadas são consistentes com a diferença na pressão de predação presente nessas lagoas. Populações da água doce estão sobre alta pressão seletiva devido ao aumento da densidade de seu principal predador, a traíra Hoplias malabaricus a qual é ausente em água salgada (MONTEIRO, 2008).
Deste modo, as populações de P. vivipara que ocorrem na região norte do estado do Rio de Janeiro demonstram se constituírem em modelos adequados para estudos evolutivos assim como P. reticulata em Trinidad. Para o melhor entendimento dos processos evolutivos e ecológicos, é necessário estimar a magnitude da variação genética, o fluxo e a estrutura genética entre as populações das diferentes lagoas desta região (MONTEIRO, 2008).
Tonhatti (2012) descreveu a variação genética em algumas das populações de
P. vivipara estudadas por Monteiro (2008). Para isso, sequenciou a região de controle
da replicação mitocondrial em oito populações que ocorrem no norte do estado do Rio de Janeiro com maior enfoque na região do delta do rio Paraíba do Sul. Os resultados mostraram: (i) que as populações possuem uma grande variação genética, (ii) a variação está estruturada entre as populações. O mesmo trabalho sugere que a formação do delta do rio Paraíba do Sul influenciou a diversidade genética da espécie nessa região.
Objetivos desta tese
O principal objetivo desta tese é estimar a variação genética das populações de Poecilia vivipara que ocorrem dentro do delta do Rio Paraíba do Sul e de populações externas a este delta. Com estas informações, tentar inferir a estrutura genética dessas populações e identificar os possíveis fatores responsáveis pela estruturação.
Devido às condições singulares da formação do delta do Rio Paraíba do Sul (tempo, extensão, etc) e dos resultados de trabalhos anteriores sobre as populações de P.
vivipara nesta região, esta tese também tem como objetivo testar a influência da história
de formação do delta sobre a diversidade genética das populações de P. vivapara.
Se a história de formação do delta não influenciar a estrutura da população é esperado que a distância/diferenciação entre as populações seja proporcional e à distância geográfica entre elas (hipótese nula, isolamento por distância). Se o isolamento por distância for refutado, a formação do delta passa a ser o fator mais plausível a ter influenciado nossa variável resposta na forma da estrutura genética. Dentre os cenários possíveis sobre como isso pode ter ocorrido, adotamos o cenário proposto por Tonhatti (2012) no qual a estrutura geológica deposicional do delta interfere na distrição da varição genética. Deste modo, populações nas lagoas na região fluvial seriam mas próximas entre si que as populações nas lagoas sob influência marinha.
Coleta do material
Os locais escolhidos para amostrar as populações foram os quais a ocorrência de P. vivipara era conhecida e que maximizariam as diferenças entre a influência fluvial e marinha. Foram reaproveitadas as amostras utilizadas em outros trabalhos em nosso laboratório sendo, necessárias apenas três novas coletas. A Figura 4 mostra o mapa da localização das amostras e a Tabela 1 mostra o resumo das características destes locais.
Em cada local foram coletados 30 indivíduos adultos de Poecilia vivipara. A coleta foi feita com uma rede de arrasto de malha fina (tela de mosquiteiro), seguida por anestesia com gelo ou solução de mentol saturada. Depois de anestesiados, foi realizada a secção do pedúnculo caudal de cada indivíduo sendo o material fixado em etanol absoluto em temperatura ambiente. No laboratório, o material foi mantido à −20◦C até a extração
do DNA. A extração foi realizada usando o protocolo de extração com sal modificado 2
(ALJANBI et al., 1997).
Tab el a 1 – Cara cterísticas dos lo cais de coleta das populaçõ es de Po ecilia vivip ar a. Lo cal Sigla La titude Longitude Influência sedimen tar Bacia hidrográfica Barra do itabap oana BI ∗∗ -21,336 -40,972 -Rio Itabap oana Itao cara IT ∗∗∗ -21,520 -41,079 -Rio Paraíba do Sul Ururaí UR ∗∗∗ -21,819 -41,392 Fluvial Rio Paraíba do Sul Im buri IM ∗∗∗ -21,479 -41,196 Fluvial Rio Paraíba do Sul Camp elo CA ∗∗ -21,632 -41,191 Fluvial Rio Paraíba do Sul Cima CI ∗∗ -21,787 -41,516 Fluvial Rio Paraíba do Sul Buena BU ∗ -21,520 -21,079 Marinha Rio Paraíba do Sul Comércio CO ∗∗ -21,577 -41,067 Marinha Rio Paraíba do Sul A tafona A T -21,628 -41,024 Marinha Rio Paraíba do Sul Grussaí GR ∗∗ -21,819 -41,392 Marinha Rio Paraíba do Sul Taí TA ∗∗ -21,787 -41,144 Marinha Rio Paraíba do Sul A çu A C ∗∗ -21,994 -41,000 Marinha Rio Paraíba do Sul Cabiúnas CB ∗ -22,301 -41,693 -Rio Macaé e das Ostras Nota – ∗ Amostras coletadas p or JL Gomes Jr. ∗∗ Amostras col etadas p or JL Gomes Jr e utilizadas em T onhatti ( 2012 ). ∗∗∗ Amostras coletadas p or JL Gomes Jr e CH T onhatti para o presen te trabalho.
Estrutura da tese
Esta tese foi dividida em duas partes principais. A primeira parte aborda a diversidade genética das populações de P. vivipara usando marcadores moleculares e compreende os capítulos 1 e 2. No primeiro Capítulo eu apresento os métodos e resultados sobre a diversidade molecular usando apenas marcadores mitocondriais e discuto sobre trabalhos que fizeram levantamento semelhantes em outros grupos. No segundo capítulo eu apresento o desenvolvimento dos marcadores microssatélites, os métodos e resultados, discutindo sobre a grande diversidade molecular encontrada.
A segunda parte da tese é sobre estrutura genética das populações estudadas. As informações sobre os dois marcadores apresentadas nos dois primeiros capítulos são utilizadas no terceiro Capítulo para avaliar a estrutura genética das populações e tentar responder quais os fatores principais na estruturação dessas populações. No terceiro Capítulo também são discutidas outras características sobre a biologia da espécie Poecilia
vivipara frente aos resultados encontrados. Em anexo encontram-se parte dos códigos
Figura 4 – Localização das amostras populacionais de Poecilia vivipara e a influência fluvial e marinha sob cada população dentro do delta do Rio Paraíba do Sul.. Siglas das populações: AC - Açú, AT - Atafona, BI - Barra de Itabapoana, BU - Buena, CA - Campelo, CB - Cabiunas, CI - Lagoa de Cima, CO - Comércio,
GR - Grussaí, FE - Lagoa Feia, IM - Imburí, IT - Itaocara, TA - Taí, UR - Rio Ururaí
2 Marcador DNA mitocondrial: região de
controle da replicação
A sequência da região de controle da replicação mitocondrial foi usada para descrever a diversidade genética do DNA mitocondrial de P. vivipara. A região de controle é um marcador mitocondrial muito usado para estudos em populações naturais devido a facilidade e rapidez em relação aos outros marcadores moleculares. Além disso, a utilização de primers universais permite a avaliação genética de espécies as quais se tem pouca ou nenhuma informação sobre a estrutura e/ou sequência do DNA.
Neste Capítulo descrevo os procedimentos e os resultados da avaliação da diversidade da região de controle da replicação mitocondrial em P. vivipara. Estes resultados são uma compilação de resultados anteriores (TONHATTI, 2012) com novos resultados provenientes desta tese.
2.1
Introdução
O DNA mitocondrial foi o marcador molecular mais popular nas últimas quatro décadas. As principais características que o tornou popular são: a relativa facilidade de amplificar; a conservação dos genes entre os grupos animais com poucas duplicações e sem introns; a alta variação encontrada em populações naturais; regiões variáveis são tipicamente flanqueadas por regiões altamente conservadas, o que facilita o desenvolvimento de primers (GALTIER et al., 2009). A história do desenvolvimento das técnicas para lidar com DNA mitocondrial se mistura com o desenvolvimento da própria genética molecular e propiciou o desenvolvimento de muitos métodos estatísticos que foram herdados por outros marcadores.
A descoberta das enzimas de restrição (LINN; ARBER,1968) possibilitou as primeiras análises da variação no nível do DNA mitocondrial (técnica conhecida como polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição, RFLP, do inglês Restriction
Fragment Length Polymorphism) possibilitando os primeiros mapas de restrição (BROWN;
VINOGRAD,1974;UPHOLT; DAWID,1977). Em 1975Brown e Wrightforam os primeiros a avaliar a variação molecular no DNA mitocondrial em populações naturais discutindo sobre a origem da partenogênese em uma espécie de lagarto. Este trabalho abriu o caminho para uma serie de trabalhos futuros que usaram DNA mitocondrial para avaliar questões evolutivas e populacionais em populações naturais nos mais diversos grupos animais. Em 1979 Brown, George e Wilson avaliaram sequências de DNA mitocondrial de primatas deduzindo que o DNA mitocondrial possuía uma rápida evolução sugerindo, uma taxa de
2% de divergência por milhão de ano. A publicação de Avise et al. (1987) fomentou o uso do DNA mitocondrial como marcador molecular para estudos em genética de populações e sistemática influenciando gerações de pesquisadores a adotarem o DNA mitocondrial em suas pesquisas. Neste artigo, os autores listam as características de um marcador molecular ideal, a saber:
• Ser facilmente identificado e universal; • Ser fácil de isolar e analisar;
• Ser estruturalmente simples, sem introns, pseudogenes, elementos repetitivos, etc; • Não ter recombinação ou outro tipo de rearranjo genético;
• Possuir caracteres qualitativos que possibilitem análises filogenéticas usando máxima parcimônia;
• Ter uma taxa de evolução relativamente alta.
Segundo os autores, todas estas características eram encontradas no DNA mitocondrial, tornando-o um excelente marcador molecular. Eles reconheceram alguns possíveis problemas relacionados ao uso do DNA mitocondrial como marcador e como contorná-las:
• heteroplasmia: 1 todas as análises que utilizam DNA mitocondrial têm a premissa
que todas as moléculas em um indivíduo são idênticas. Mais de um tipo de DNA em um indivíduo poderia enviesar as análises. Porém, resultados empíricos mostravam que esta condição era transitória e dificilmente enviesariam as análises.
• homoplasia: 2 em uma reconstrução filogenética reconhecer se um carácter é
ho-mologo ou homoplástico é de fundamental importância, pois apenas os primeiros têm informação relevante. Devido a alta taxa de mutação e o pequeno tamanho do genoma mitocondrial é muito provável que sítios em indivíduos diferentes apresentem o mesmo estado (e.g. A, T, C, G) sem ter nenhuma relação de ancestralidade, apenas por convergência. Porém, se ao invés de comparar sítio a sítio o DNA mitocondrial de dois indivíduos compararmos toda a molécula de DNA, a chance de ocorrer uma homoplasia é muito pequena. Por isso, o autor recomenda comparar haplótipos ao invés de sítios.
1 condição na qual há mais de um tipo de DNA mitocondrial no mesmo indivíduo (BALLARD;
WHI-TLOCK,2004)
2 condição de compartilhar um carácter idêntico (por estado) mas que não pode ser explicado por
um ancestral comum de um grupo. Contrário de homologia quando o carácter é idêntico devido a ancestralidade comum (LEMEY; SALEMI; VAMDAMME, 2009)
• Seleção natural: os autores reconhecem que a pressão da seleção sobre o DNA mitocondrial pode influenciar as análises que envolvam estimativas de distância genética e conceito de relógio molecular. Além disso, a seleção em uma região do DNA mitocondrial estaria associada a toda a molécula, pois não há recombinação. Os autores argumentam que, até aquela data, a maioria das variações encontradas não tinham influência na aptidão do organismo.
Em 1989, um grande avanço tornou o uso do DNA mitocondrial ainda mais popular com a publicação do primeiro trabalho a usar PCR para estudar sequências de DNA mitocondrial (KOCHER, 1989). Os autores conseguiram isolar e sequenciar o loco do citocromo b de mais de 100 espécies animais incluindo mamíferos, aves, anfíbios, peixes e alguns invertebrados. Pela facilidade e universalidade da técnica, vários outros pesquisadores utilizaram a mesma abordagem para descrever a variação molecular do DNA mitocondrial, tornando o citocromo b e a região de controle marcadores moleculares populares nos trabalhos de genética de populações e filogeografia.
Em 2000 Avise, reforçou as características do DNA mitocondrial como um ótimo marcador citando uma extensa lista de trabalhos que haviam sido publicados desde seu trabalho de 1987. Porém, em 2009 Galtier e colaboradores (GALTIER et al., 2009) revisaram os trabalhos que utilizaram DNA mitocondrial para saber, a posteriori, se os resultados empíricos se adequavam nas premissas sobre o DNA mitocondrial. O resultado foi que os resultados não se adequavam as premissas. Segundo os autores “O DNA mitocondrial não é imune à recombinação, à seleção positiva e nem à taxa evolutiva errática”, três das principais características mais citadas para promover o DNA mitocondrial como marcador ideal. Mesmo assim, os autores reafirmam que o DNA mitocondrial é o marcador mais conveniente e barato para analisar uma nova espécie servindo como um primeiro indicador da variação molecular e, com o uso de outros dados, pode ser utilizado para estabelecer limites entre espécies. Embora a relevância como marcador neutro esteja em declínio, há um crescimento do interesse nos processos seletivos e funcionais associados com a variação do DNA mitocondrial. A comparação entre genomas mitocondriais é uma área promissora para a qual dados populacionais são cada vez mais bem vindos (GALTIER et al.,2009).
2.1.1
Região de controle da replicação do DNA mitocondrial
A região de controle da replicação mitocondrial está entre os genes tRNApro e
tRNAphe (Figura 5). É uma região não codificante, sendo reconhecida como a porção mais
variável do DNA mitocondrial. É comumente variável no nível intraespecífico, o que a torna amplamente usada nos estudos de variabilidade genética entre populações e análises filogenéticas. A região de controle (control region, em inglês) e o D-loop, (displacement
loop)são algumas vezes usados erroneamente como sinônimos na literatura. A rigor não são
(MICHIKAWA et al., 1999). A Figura 6 mostra um diagrama da estrutura da região de controle de mamíferos. Observe que a região D-loop está inteiramente dentro da região de controle e que a região de controle esta delimitada pelos genes tRNApro e tRNAphe. Como
mencionado anteriormente, a presença de regiões conservadas (genes para tRNAs e rRNA) flanqueando da região de controle facilita o uso desta região como marcador devido ao uso de primers universais.
Figura 5 – Representação gráfica do genoma mitocondrial de Danio rerio (zebrafish,
paulis-tinha). O círculo externo mostra a anotação do genoma (preto - genes, vermelho
RNA transportador, marrom claro RNA ribossômico, marrom escuro D
-loop, região de controle). O círculo interno representa a porcentagem de CG a
cada 5pb, linhas escuras representam maiores quantidades de GC. Figura criada a partir de dados deBroughton, Milam e Roe(2001). Disponível em MitoFish —
Mitocondrial Genome Database for Fish <http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/>
Figura 6 – Diagrama esquemático da região de controle da replicação mitocondrial de mamíferos. A região de controle é composta por um domínio conservado flanqueado por duas seções variáveis e mais três blocos de sequência conservados (CSB– Conserved Sequence Blocks, em inglês) dentro de um domínio variável.
Figura redesenhada a partir de Avise (2000, p. 27). Fora de escala.
2.2
Métodos
2.2.1
Extração de DNA
O DNA genômico foi extraído utilizando o protocolo conhecido como “salting
out” (ALJANBI et al., 1997). Uma amostra de tecido de aproximadamente 2 mm2 de
músculo do pedúnculo caudal de P. vivipara foi dissecada e incubada em 110 µl de tampão de lise (20 µl de SDS 10 %, 10 µl de proteinase K 20 mg/ml e 80 µl de TNE 1×) overnight a 55◦C. Posteriormente, foram adicionados 5 µl RNAse 10 mg/ml e incubado (por 10 minutos
em temperatura ambiente) e 35 µl NaCl 5 M seguido de centrifugação por 15 minutos a 14000 RPM.
O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, ao qual foram adicionados 330 µl de etanol absoluto gelado e incubado (−20◦C, overnight). Após a centrifugação por
15 minutos a 14000 RPM, descartou-se o sobrenadante. Em seguida, foram adicionados 150 µl de etanol 70 % e novamente realizou-se a centrifugação por três minutos a 13000 RPM. O sobrenadante foi descartado e o tubo deixado secar em temperatura ambiente. Depois de seca, cada amostra de DNA foi ressuspendida em 35 µl de tampão (TE) e incubada a 55◦C por duas horas.
2.2.2
Amplificação e sequenciamento da Região de Controle
As reações de amplificação da região de controle da replicação mitocondrial seguiram a padronização utilizada em Tonhatti (2012). Cada reação foi preparada usando: 2,5 µl de tampão 10×, 3,25 µl de dNTP 2,0 mM, 3 µl de MgCl2 25 mM, 0,63 µl de cada
5 U/µl, 3 µl de DNA 10 ng/µl e água q.s.p. 25 µl. O programa utilizado foi (96◦C 2 min,
53◦C 45 s, 72◦C 2 min, 39×(94◦C 30 s, 50◦C 45 s, 72◦C 2 min) 72◦C 10 min, 5◦C forever).
Os produtos de PCR foram purificados utilizando o kit Wizard Sv Gel and
PCR Clean-up System da Promega Corporation. Ao produto de PCR foi adicionado um
volume igual de Membrane Binding Solution. Em seguida, a solução foi transferida para a coluna e deixada em repouso por um minuto antes de ser centrifugada a 14000 RPM por um minuto e o eluído descartado. A coluna foi lavada com 700 µl de Membrane Wash
Solution centrifugando a 14000 RPM por um minuto, repetindo o processo com 500 µl
por cinco minutos. Para secar a coluna, uma centrifugação adicional foi realizada por um minuto, na mesma velocidade. Para a eluição do DNA, 35 µl de água estéril foi aplicada ao centro da coluna, a qual foi deixada em repouso por um minuto antes de ser centrifugada por um minuto a 14000 RPM.
O sequenciamento do DNA foi realizado pela empresa Macrogen Inc. — Coreia do Sul. Os primers utilizados para sequenciamento foram os mesmos que os usados na amplificação. A edição e alinhamento das sequências foi feita usando o programa
ChromasPro versão 1.5 — Technelysium Pty Ltd, Tewantin QLD, Austrália. A sequência
forward foi alinhada ao reverso complementar da sequência reverse, usando o algoritmo
de alinhamento global. A edição manual das sequências foi realizada. Os nucleotídeos ambíguos foram resolvidos analisando o cromatograma e a atribuição foi feita considerando o pico com melhor nota Q para aquela posição (EWING; GREEN, 1998). Os pares de bases do início e do final de cada sequência, totalizando cerca de 80pb, foram descartados por terem baixa qualidade.
As sequências foram alinhadas usando o algoritmo de alinhamento progres-sivo implementado no programa ClustalW. Com o alinhamento é possível reconhecer as sequências idênticas entre os indivíduos. Por serem indivíduos de uma mesma população amostrada, supõe-se que a identidade entre as sequências seja consequência do processo de herança. Assim, cada sequência diferente pode ser definida como um haplótipo diferente. Haplótipo é definido como um trecho de DNA de uma única molécula o qual é herdado como uma única unidade (SALZBURGER; EWING; HAESELER, 2011). A identificação e contagem dos haplótipos foram feitas usando o programa Arlequin versão 3.5 ( EXCOF-FIER; LISCHER, 2010), usando como referência os haplótipos descritos em Tonhatti (2012).
2.2.3
Estatísticas
A variação dos haplótipos em uma população foi estimada pela diversidade haplotípica (h) sendo calculada pela equação (NEI, 1973):
h = 1 −
m
X
i=1
onde xi é frequência do haplótipo e m é o número de haplótipos encontrados. Assim, h representa a probabilidade de dois alelos escolhidos ao acaso dentro de uma população serem diferentes, sendo equivalente à heterozigosidade comumente estimada para locos diplóides.
A variação nos sítios entre os haplótipos pode ser estimada pelos sítios segre-gantes (S), que é definida como o número de sítios de uma amostra de sequências que estão ocupados por 2 ou mais nucleotídeos diferentes (HARTL; CLARK, 2007). Porém, por depender do tamanho amostral o S não é uma boa estatística para estimar a variação nos sítios (TAJIMA,1989). Uma melhor estimativa dessa variação pode ser feita usando a diversidade nucleotídica (π) que é definida como número médio de diferenças nucleotí-dicas ou substituições por sítio de um grupo de sequências de DNA amostrados de uma população (NEI, 1987), que pode ser calculada usando a equação:
π=Xfifjpij (2.2)
onde fi e fj representam a frequência dos haplótipos i e j na população e pij representa a divergência entre eles. Normalmente, este parâmetro é normalizado pelo comprimento da sequência, ou seja, a diversidade nucleotídica por sítio.
O número de sítios segregantes e as diversidades haplotípica e nucleotídica
foram calculados usando os pacotes Ape (PARADIS; CLAUDE; STRIMMER, 2004) e
Pegas (PARADIS, 2010) no ambiente de programação R (R Core Team, 2016).
2.3
Resultados
Sequências de 911 pb de comprimento da região de controle de replicação mitocondrial de 408 indivíduos de P. vivipara foram obtidas (233 sequências foram obtidas originalmente por Tonhatti (2012)). O alinhamento destas sequências revelou 45 sítios polimórficos com 46 substituições definindo 41 haplótipos (Tabela 2). Em comparação com Tonhatti(2012), o alinhamento destas sequências revelou 6 novos sítios segregantes e 7 novos haplótipos. A distribuição dos sítios segregantes pelas sequências é mostrada na Figura 7. Foram encontradas inserções e deleções em sequências de dois indivíduos provenientes de Itaocara. Estas sequências foram identificadas como região de controle de Poecilia
reticulata usando uma busca no banco de sequências GenBank. Estas duas sequências
foram descartadas das análises que se seguiram. Nas sequências de P. vivipara não foram encontradas inserções ou deleções. A composição de nucleotídeos dessas sequências foi rica em A-T (A: 33,12 %, T: 32,9 %, C: 21,44, G: 12,54).
A composição de cada amostra populacional é mostrada na Tabela 2. A Figura 8traz os mesmos dados visualmente sumarizados. Com exceção da amostra de Imburí (IM) todas as amostras mostraram diversidade na região de controle. Dentre estas, o número
de haplótipos variou de 2 a 10 para amostras de Barra do Itabapoana (BI) e Lagoa Feia (FE), respectivamente. A diversidade haplotípica variou de 0,071 a 0,874 para amostras de Barra de Itabapoana (BI) e Atafona (AT), respectivamente. A diversidade nucleotídica variou de 0,0003 a 0,009 para Cabiúnas (CB) e Açú (AC).
A Tabela 3 mostra os resultados obtidos para todas as populações avaliadas nesse projeto. A população que demonstrou a menor variação foi Imburí (IM) na qual todos os indivíduos foram idênticos.
Tabela 2 – Frequência dos haplótipos em cada população de Poecilia vivipara. Haplótipo BI BU IM IT AT CO CI CA TA GR UR FE AC CB Total HAP01 0 4 30 0 2 16 0 2 17 9 7 9 10 1 107 HAP02 0 5 0 1 4 0 20 13 5 7 10 9 7 0 81 HAP03 0 8 0 0 10 9 1 8 2 8 1 2 2 0 51 HAP04 27 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 27 HAP05 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 3 0 4 HAP06 0 0 0 0 2 0 0 1 0 1 0 0 1 0 5 HAP07 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 HAP08 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 1 0 0 0 4 HAP09 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 2 1 0 0 5 HAP10 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 HAP11 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 3 HAP12 0 0 0 4 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 7 HAP13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 2 HAP14 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 2 HAP15 0 0 0 9 0 2 0 0 0 1 0 0 0 0 12 HAP16 0 0 0 0 4 1 0 0 0 1 0 0 0 0 6 HAP17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 2 HAP18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 2 HAP19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 HAP20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 HAP21 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 HAP22 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 HAP23 0 0 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 3 HAP24 0 0 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 3 HAP25 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 HAP26 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 HAP27 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 HAP28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 2 HAP29 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 HAP30 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 HAP31 0 12 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 13 HAP32 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 HAP33 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 HAP34 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 HAP35 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 2 HAP36 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 HAP37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 26 26 HAP38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 HAP39 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 HAP40 0 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 HAP41 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
siglas das populações: AC - Açú, AT - Atafona, BI - Barra de Itabapoana, BU - Buena, CA - Campelo, CB - Cabiúnas, CI - Lagoa de Cima, CO - Comércio, GR - Grussaí, FE - Lagoa Feia, IM - Imburí, IT - Itaocara, TA - Taí, UR - Rio Ururaí.
Figura 8 – Composição de haplótipos em cada população de Poecilia vivipara amostrada. Tabela 3 – Índices de diversidade molecular da região de controle do Poecilia vivipara em 14 populações. n = tamanho amostral, S = sítios segregantes, nh = número de haplótipos, h = diversidade haplotípica, π = diversidade nucleotídica.
População n S nh h π B. do Itabapoana (BI) 28 7 2 0, 071 0, 001 Cima (CI) 30 7 7 0, 552 0, 001 Campelo (CA 30 16 8 0, 747 0, 003 Comércio (CO) 29 17 5 0, 594 0, 008 Taí (TA) 29 18 7 0, 670 0, 008 Grussaí (GR) 29 19 8 0, 791 0, 008 Feia (FE) 30 19 10 0, 825 0, 008 Açú (AC) 28 20 10 0, 815 0, 009 Buena (BU) 29 15 5 0, 756 0, 007 Ururaí (UR) 24 19 8 0, 757 0, 007 Itaocara (IT) 20 14 4 0, 679 0, 008 Imburí (IM) 30 0 1 0 0 Cabiúnas (CB) 28 3 4 0, 206 0, 0003 Atafona (AT) 22 18 9 0, 874 0, 005 Total 386 44 39 0,8561 0,008 Média 27,57 3,14 2,78 0.0641 0.0005
2.4
Discussão
Neste Capítulo, descrevo a variação molecular em populações naturais de P.
vivipara usando a região de controle da replicação mitocondrial como marcador. Esta
descrição expande geograficamente a descrição realizada anteriormente (TONHATTI, 2012). Os resultados demonstram que as populações de P. vivipara amostradas possuem altos níveis de variação molecular.
A única população que não apresentou variação foi Imburí (IM). Este é um dado conflitante não apenas com o restante dos dados desse trabalho, mas também com o esperado para a região de controle em uma população natural visto a grande variação usualmente encontrada nesta região em animais (AVISE, 2000; SATOH et al., 2016). Este desvio será discutido com mais detalhes mais à adiante (Capitulo4), onde serão compiladas as informações disponíveis sobre esta população, sua estrutura e história de colonização. O comprimento da sequência (911 pares de base) ficou dentro do esperado para peixes (856–1500 pares de base (LEE et al., 1995), 724–1401 pares de base (SATOH et al.,2016)). Não houve variação de tamanho entre as sequências analisadas. A variação no comprimento de regiões do DNA dentro de uma mesma espécie já foi relatada em peixes (WETJEN et al., 2017). A variação no comprimento é normalmente correlacionada com ocorrência de heteroplasmia. A condição de heteroplasmia pode ser considerada rara na natureza (GRZYBOWSKI, 2000), sendo relatada em peixes (HOARAU et al., 2002).
Não foi testada a hipótese de heteroplasmia para o DNA mitocondrial de P.
vivipara pois não é um teste rotineiro neste tipo de estudo e não constava do plano inicial do
trabalho. No entanto, a consistência dos resultados obtidos (uniformidade no comprimento da sequência, qualidade dos eletroferogramas de sequenciamento, etc) sugerem que não há heteroplasmia nas amostras analisadas. A atuação da seleção natural para locos do DNA mitocondrial em peixes é relatada por alguns autores. Porém, estes relatos indicam que a seleção ocorre apenas, ou é mais detectável, nas regiões que codificam proteínas e não na região de controle (HANEY; SILLIMAN; RAND,2010;MA; O’FARRELL, 2016).
A região de controle da replicação mitocondrial em animais continua sendo um bom marcador molecular especialmente quando não há outras informações sobre a espécie em estudo (GALTIER et al., 2009). O que é discutível são as premissas de que este marcador seja seletivamente neutro e a ausência de recombinação e o quanto isso influenciaria as análises, principalmente em análises demográficas. Para contornar estes problemas é altamente recomendado o uso combinado com outros marcadores que possuam outras características (HANEY; SILLIMAN; RAND, 2010).
Deste modo, as populações de P. vivipara amostradas apresentam uma alta diversidade molecular na região de controle da replicação mitocondrial. O uso dessa região genômica para o melhor entendimento das dinâmicas ecológicas e evolutivas dessa
espécie deve ser feito com cuidado e com o uso de outros marcadores. O próximo capítulo tratará da aquisição de mais informação sobre a variação molecular em P. vivipara, usando marcadores nucleares.
3 Marcadores nucleares microssatélites
Microssatélites são uma ótima ferramenta para avaliar a diversidade nuclear de organismos devido à sua facilidade de obtenção e reprodutibilidade. Usando um número limitado de marcadores do tipo microssatélites é possível responder de modo eficiente a várias questões em ecologia molecular devido, ao alto polimorfismo encontrado nestes marcadores (GUICHOUX et al., 2011). Usando as técnicas adequadas, é possível otimizar o tempo e o custo possibilitando analisar um grande número de indivíduos e locos em pouco tempo. Marcadores nucleares do tipo microssatélites foram usados para descrever a diversidade genética nuclear de P. vivipara.
Neste capítulo descrevo todo o processo de isolamento e caracterização dos primeiros locos microssatélites para P. vivipara, a validação desses locos como marcadores moleculares e a variação desses locos em catorze populações.
3.1
Introdução
Microssatélites são pequenas regiões repetitivas em tandem no DNA também conhecidas por: SSR Simple Sequence Repeat (TAUTZ, 1989) e STR Sequence Tandem
Repeat (EDWARDS et al., 1991). A repetição tem um motivo entre um e seis pares de
bases1. Microssatélites são encontrados em genomas eucariotos e procariotos em regiões
co-dificantes e não coco-dificantes (PÉREZ-JIMÉNEZ et al.,2013;PHUMICHAI; PHUMICHAI; WONGKAEW,2015). Os microssatélites são considerados como marcadores codominantes. Marcadores codominantes são aqueles nos quais os genótipo heterozigoto é facilmente iden-tificado (AVISE, 2004). Há evidências que a distribuição dos microssatélites nos genomas não é aleatória (VIEIRA et al., 2016). Os microssatélies ocorrem com menor frequência em regiões codificantes, provavelmente, devido a alta taxa de mutação a qual pode com-prometer a expressão dos genes (VIEIRA et al.,2016). Nessas regiões, os microssatélites mais encontrados são os que possuem motivo de repetição de três e seis nucleotídeos, provavelmente, resultado de seleção natural contra a alteração do quadro de leitura para a transcrição (TÓTH et al., 2000; ZHANG et al.,2004; XU et al., 2013)
Há dois mecanismos propostos para o aparecimento dos locos microssatélites. O primeiro é o slippage (LEVINSON; GUTMAN,1987; STREISINGER et al., 1966), no qual durante a replicação do DNA a nova fita de DNA perde o contato com a fita molde, paralisando a reação. Uma nova hibridização entre as fitas é necessária para que a reação continue. Em regiões que não possuem repetições, há apenas um modo de hibridizar e 1 Para uso como marcador molecular normalmente não se usa motivos com um par de base devido à
o resultado da duplicação não é alterado pela perda temporária de contato. Porém, em regiões repetitivas as fitas podem hibridizar fora de fase, o que pode levar a uma nova fita maior ou menor que a fita molde (HANCOCK, 1999). O segundo mecanismo é a recombinação (SMITH, 1976; JEFFREYS et al.,1994), a qual ocorre durante o Crossing
over entre cromossomos mal alinhados. Isso acontece mais facilmente em regiões com
grandes repetições em tandem, nas quais os mecanismos de reparo tem dificuldade em determinar o correto alinhamento entre os dois cromossomos (HANCOCK, 1999).
As funções biológicas dos microssatélites não são plenamente conhecidas. Histo-ricamente, regiões repetitivas do DNA (e.g. regiões satélites, minisatélites, microssatélites) foram consideradas como regiões sem função devido à alta instabilidade. Deste modo, sempre foram consideradas seletivamente neutras (VIEIRA et al.,2016). No entanto, no início dos anos 1990, vários trabalhos foram publicados relacionando regiões repetitivas com doenças neurodegenerativas em humanos ,ver Ross (1995)). Mais tarde, as regiões repetitivas foram encontradas em transcritos e regiões reguladoras de expressão. Atual-mente, há evidências que regiões repetitivas podem estar envolvidas em processos como regulação da transcrição e tradução, organização da cromatina e ciclo celular (VIEIRA et al.,2016; KALIA et al., 2011). Os microssatélites foram propostos como hotspot para variação quantitativa e adaptativa (KASHI et al., 1990; KING, 1994; KASHI; KING; SOLLER, 1997), sendo relevantes para estudos de adaptação e plasticidade genotípica (NEVO,2001; KASHI; KING, 2006).
Microssatélites possuem altos níveis de polimorfismo e têm altas taxas de mutação de 10−3 a 10−4 por loco por geração quando comparados com as taxas de mutação
em outras regiões genômicas (aproximadamente 10−9 por geração em eucariotos) (LI
et al., 2002). Por serem abundantes e muito polimórficos, os microssatélites são ótimos marcadores moleculares para avaliar a similaridade genética entre indivíduos (KALIA et al.,2011). Desde modo, são comuns em estudos de mapeamento genômico, análise forense, análise de parentesco, genética de conservação, filogeografia e genética de populações (HODEL et al., 2016).
3.1.1
Isolamento dos locos microssatélites
Para utilizar os locos microssatélites como marcadores moleculares é necessário identificar as regiões repetidas e suas regiões flanqueadoras. Tradicionalmente, a identifica-ção dessas regiões é realizada com o isolamento dos locos microssatélites de uma biblioteca genômica da espécie de interesse. Conhecendo as regiões flanqueadores, torna-se possível projetar primers específicos para aquele loco. Para tanto, é necessário o sequenciamento de milhares de clones, o que torna o procedimento muito custoso.
O enriquecimento das bibliotecas genômicas com sondas para regiões repetidas reduz os custos e o tempo necessários para o isolamento dos locos microssatélites. Com
o enriquecimento, a densidade de locos microssatélites na biblioteca aumenta significati-vamente. Assim, o número de clones sequenciados necessários para obtenção dos locos é reduzido. Zane, Bargelloni e Patarnello (2002) revisaram as principais técnicas utilizadas para a construção das bibliotecas genômicas para isolamento de microssatélites.
Outras técnicas para o isolamento de locos microssatélites estão disponíveis. Dentre estas, técnicas cabe destacar RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), extensão de primers, FIASCO (Fasted Isolation by AFLP of Sequences COntaining
re-peats), reuso de locos desenvolvidos para espécies próximas, uso de dados gerados por
sequenciamento de segunda geração e sequências depositadas nos bancos de dados (ver Zane, Bargelloni e Patarnello (2002), Kalia et al.(2011)).
3.1.2
Genotipagem
Genotipagem é o processo pelo qual é possível conhecer o genótipo de um indivíduo. Um genótipo é A combinação dos alelos encontrados em um indivíduo em um loco
em particular (NIELSEN; SLATKIN,2013). Assim, a genotipagem dos locos microssatélites
de uma população tem como objetivo conhecer os alelos dos locos microssatélites de indivíduos de uma população em particular. Para tanto, o DNA dos indivíduos precisa ser extraído e os locos amplificados usando primers específicos. O polimorfismo dos locos microssatélites é dado no número de repetições de cada motivo, o que se traduz na diferença de tamanho do fragmento amplificado. Cada tamanho é considerado como um alelo distinto. Assim, para conhecer quais alelos de um loco são encontrados em um individuo é necessário estimar o tamanho do fragmento.
Tradicionalmente, a estimação do tamanho dos fragmentos para a genotipagem de locos microssatélites é feita por eletroforese em gel de poliacrilamida corada por nitrato de prata (CRESTE; NETO; FIGUEIRA,2001). A atribuição dos alelos é feita manualmente comparando a(s) banda(s) visíveis de um indivíduo com as bandas de outros indivíduos e com o padrão de peso molecular. Esta técnica exibe bons resultados de boa resolução, porém demanda tempo e experiência do operador na identificação dos alelos. Técnicas automatizadas foram criadas como alternativas mais rápidas e eficientes que a técnica tradicional.
As técnicas automatizadas se baseiam na separação de produtos de PCR marcados com sondas fluorescentes. Para tanto, a amplificação dos fragmentos de DNA é feita com o uso de primers marcados com sondas fluorescentes gerando, fragmentos marcados por estas sondas. A separação dos fragmentos é feita usando eletroforese em gel ou em capilar e analisados em um analisador automático de fragmentos de DNA (ZIEGLE et al., 1992;MANSFIELD et al., 1994; OETTING et al., 1995). Uma vantagem adicional do uso dessas técnicas automatizadas é a possibilidade de analisar vários locos microssatélites no mesmo capilar ou linha do gel, mesmo que haja sobreposição dos
