2.4 Discussão
3.1.2 Genotipagem
Genotipagem é o processo pelo qual é possível conhecer o genótipo de um indivíduo. Um genótipo é A combinação dos alelos encontrados em um indivíduo em um loco
em particular (NIELSEN; SLATKIN,2013). Assim, a genotipagem dos locos microssatélites
de uma população tem como objetivo conhecer os alelos dos locos microssatélites de indivíduos de uma população em particular. Para tanto, o DNA dos indivíduos precisa ser extraído e os locos amplificados usando primers específicos. O polimorfismo dos locos microssatélites é dado no número de repetições de cada motivo, o que se traduz na diferença de tamanho do fragmento amplificado. Cada tamanho é considerado como um alelo distinto. Assim, para conhecer quais alelos de um loco são encontrados em um individuo é necessário estimar o tamanho do fragmento.
Tradicionalmente, a estimação do tamanho dos fragmentos para a genotipagem de locos microssatélites é feita por eletroforese em gel de poliacrilamida corada por nitrato de prata (CRESTE; NETO; FIGUEIRA,2001). A atribuição dos alelos é feita manualmente comparando a(s) banda(s) visíveis de um indivíduo com as bandas de outros indivíduos e com o padrão de peso molecular. Esta técnica exibe bons resultados de boa resolução, porém demanda tempo e experiência do operador na identificação dos alelos. Técnicas automatizadas foram criadas como alternativas mais rápidas e eficientes que a técnica tradicional.
As técnicas automatizadas se baseiam na separação de produtos de PCR marcados com sondas fluorescentes. Para tanto, a amplificação dos fragmentos de DNA é feita com o uso de primers marcados com sondas fluorescentes gerando, fragmentos marcados por estas sondas. A separação dos fragmentos é feita usando eletroforese em gel ou em capilar e analisados em um analisador automático de fragmentos de DNA (ZIEGLE et al., 1992;MANSFIELD et al., 1994; OETTING et al., 1995). Uma vantagem adicional do uso dessas técnicas automatizadas é a possibilidade de analisar vários locos microssatélites no mesmo capilar ou linha do gel, mesmo que haja sobreposição dos
tamanhos2. Esta vantagem é maximizada com o uso de fluorescências que fluoresçam em
diferentes comprimentos de luz. Ao marcar cada loco microssatélite com uma fluorescência diferente torna-se possível distinguir cada loco microssatélite no analisador automático (HAYDEN et al.,2008). Duas técnicas podem ser utilizadas para aproveitar esta vantagem.
A primeira é a Pós PCR multiplex também conhecida como multi pooling, que consiste em misturar produtos de PCR antes de realizar a eletroforese (HELLER, 2001). A segunda é a PCR multiplex, que consiste em amplificar dois ou mais locos microssatélites em uma mesma reação de PCR (HENEGARIU et al., 1997)3. O uso combinado dessas técnicas
otimiza o trabalho de aquisição de dados quando temos um grande número de locos e indivíduos (GUICHOUX et al.,2011).
3.1.2.1 Erros de genotipagem
A correta genotipagem depende de vários fatores tais como a qualidade das reações de amplificação, a visibilidade das bandas no gel, a experiência do operador, a acurácia do analisador automático (quando for o caso), etc. Cada um desses fatores depende de outros fatores menores. Nesta seção, farei um breve resumo dos fatores que influenciam a qualidade das reações de amplificação e que podem comprometer a genotipagem correta.
Vários fatores podem influenciar uma reação de PCR. Dentre estes, os que podem influenciar a genotipagem de microssatélites são: baixa concentração de DNA molde, amplificação preferencial, pareamento incorreto das fitas e falha na hibridização do
primer ao molde de DNA.
A baixa concentração de molde de DNA reduz a quantidade de produto gerado em uma reação de amplificação e com a pouca quantidade de produto torna-se difícil a detecção do produto em uma eletroforese. No caso dos locos microssatélites, uma outra complicação pode ser gerada pela baixa concentração de DNA molde. Em amostras muito diluídas, é possível que um dos alelos seja preferencialmente amplificado em detrimento do(s) outro(s) alelos (MILLER; JOYCE; WAITS, 2002; WANDELER et al., 2003). Isso pode ocorrer durante a pipetagem o que gera uma competição entre as cópias dos alelos durante a reação de amplificação. Nessa competição, o alelo que inicialmente estiver em maior número terá mais cópias no final. Em quantidade desigual, o alelo em maior número pode ser o único detectado gerando um falso homozigoto. Este processo é conhecido como
sampling stochastic error devido à sua característica aleatória e o padrão gerado é chamado
de allele dropout (NAVIDI; ARNHEIM; WATERMAN, 1992; TABERLET et al., 1996). A amplificação preferencial de um alelo em relação aos demais também pode 2 Na técnica que usa coloração com nitrato de prata é possível apenas analisar locos diferentes no mesmo
capilar ou linha do gel caso o tamanho dos locos seja bem distantes.
3 Para evitar confusão entre as nomenclaturas, vou adotar para todo este trabalho o termo multi pooling
para o ato de misturar os produtos de PCR antes da eletroforese e PCR multiplex para a amplificação conjunta de mais de um loco.
ocorrer quando a diferença dos tamanhos entre os alelos for muito grande. Alelos pequenos são preferencialmente amplificados em detrimento dos alelos maiores. Durante a ampli- ficação, a fase de extensão é suficiente para a extensão da maioria das cópias do alelo pequeno porém é muito curta para estender todas as cópias do alelo maior. Com isso, um número maior de cópias do alelo pequeno é gerado em relação ao número de cópias do alelo maior. Diferente do caso de DNA de baixa concentração, no qual há um fator estocástico envolvido, no caso de amplificação preferencial o padrão gerado é sempre o mesmo para o mesmo loco. Este processo é conhecido como Dominância do alelo menor (Short dominance allele) ou Large allele dropout (WATTIER et al., 1998).
O pareamento incorreto das fitas pode ocorrer durante a fase de extensão. A fita nova pode perder o contato com a fita molde durante alguns momentos. Ao voltar a ter contato, as fitas podem estar desalinhadas devido a presença das regiões repetidas. Assim, repetições podem ser deletadas ou inseridas nas novas fitas e isso pode ser propagado no outros ciclos. Trata-se do equivalente in vitro do mecanismo proposto para a criação e manutenção da diversidade dos locos microssatélites (ver seção 3.1). Este processo é conhecido como Slippage ou Stuttering (SHINDE et al., 2003).
A falha na hibridização do molde de DNA com o primer resulta na falha da amplificação do alelo. O primer deve hibridizar perfeitamente nas regiões flanqueadoras ao loco microssatélite alvo. As regiões flanqueadoras são, normalmente, conservadas dentro de uma espécie e às vezes até mesmo dentro de um gênero. Porém, pode haver alguma variação dentro da espécie (usualmente uma mutação de ponto) que não é conhecida pois, normalmente, apenas a sequência de um indivíduo é obtida e usada como base para o desenho do primer. No caso de haver duas variantes da região flanqueadora o primer irá hibridizar apenas com a região para qual ele foi desenhado, a outra região não irá amplificar e consequentemente o alelo associado a ela não irá amplificar e não será identificado. Os alelos que possuem esta variação na região flanqueadora e que não são amplificados são conhecidos por alelos nulos (SHAW; PIERCE; BOYLE, 1999).
Classicamente, estes erros podem ser estimados ou corrigidos realizando repli- catas das amplificações e das eletroforeses. Porém, este procedimento demanda um gasto de tempo e reagentes que nem sempre é possível. Por isso, métodos alternativos foram propostos, os quais dispensam o uso de replicatas.
Os erros mencionados acima podem gerar desvios nas proporções de Hardy- Weinberg. Tais desvios são similares aos desvios causados por fatores biológicos como endogamia, acasalamento preferencial ou efeito Wahlund. Porém, os erros acima mencio- nados produzem características específicas nos dados, além do desvio das proporções de
Hardy-Weinberg, que podem ser usadas para detectá-los (VAN OOSTERHOUT; WEET-