ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS DE Anacardium occidentale & Glycyrrhiza
glabra PELA CAPTURA DO RADICAL LIVRE DPPH
Thiago José Matos Rocha1; Kelly Cristina Barbosa Silva Santos1; Bonifácio Pereira do Nascimento Filho1; Bruno Dyego da Rocha Noé1; Helena Ferreira do Nascimento1; Aldenir Feitosa dos Santos 1,2,3
RESUMO: A produção de radicais livres é controlada nos seres vivos por diversos compostos
antioxidantes. Os antioxidantes são compostos que estabilizam ou desativam radicais livres antes que estes ataquem alvos biológicos nas células. O trabalho teve como objetivo realizar triagem fitoquímica e avaliar a atividade antioxidante de Anacardium occidentale e Glycyrrhiza glabra pelo método fotocolorimétrico do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH). Foram avaliadas as concentrações de 5, 10, 50, 125 e 500 µg/mL. Os extratos de A. occidentale e G. glabra foram preparados por maceração com etanol à temperatura ambiente e cada extração teve duração de quatro dias. Os extratos foram filtrados e reunidos. Foram realizados testes colorimétricos para pesquisa de metabólitos secundários. A atividade antioxidante das plantas medicinais foi avaliada por meio da capacidade sequestrante do radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picrilidrazil). O extrato etanólico apresentou um rendimento superior a 29% para A. occidentale e 25% para G. glabra. Os extratos de A. occidentale apresentaram maior atividade antioxidante quando comparado aos resultados de G. glabra. Os extratos de A. occidentale exibiram atividade antioxidante em todas as concentrações avaliadas, enquanto que G. glabra apresentou atividade em menores proporções. Portanto, A. occidentale e G. glabra podem agir como antioxidantes.
Unitermos: Anacardium occidentale, Glycyrrhiza glabra, Atividade antioxidante.
ANTIOXIDANT ACTIVITY OF EXTRACTS OF Anacardium occidentale AND Glycyrrhiza glabra BY DPPH FREE RADICAL CAPTURE
ABSTRACT: The production of free radicals in living organisms is controlled by several
antioxidant compounds, which correspond to compounds that stabilize or inactivate free radicals before they attack biological targets in cells. This study aimed to do a phytochemical screening and evaluate the antioxidant activity of Anacardium occidentale and Glycyrrhiza glabra by the method spectrophotometric of free radical 2,2-diphenyl-1-picril-hydrazyl (DPPH). We evaluated the concentrations of 5, 10, 50, 125 and 500 µg/mL. Extracts of A. occidentale and G. glabra were prepared by maceration with ethanol at room temperature and each extraction lasted four days. The extracts were filtered and pooled. The solvent was evaporated on the rotary evaporator connected to the vacuum pump and the dry extracts were weighed and the yield calculated. Colorimetric tests were performed to search for secondary metabolites. The antioxidant activity of medicinal plants was evaluated through the ability of free radical DPPH (1,1-diphenyl-2-picrilidrazil). The ethanoloc extract showed a yield exceeding 29% for A. occidentale and 25% for G. glabra. A. occidentale extracts showed higher antioxidant activity compared to the results of G. glabra. Extracts of A. occidentale exhibited antioxidant activity at all concentrations evaluated while G. glabra showed activity in lowers proportions. Therefore, A. occidentale and G. glabra can act as antioxidant.
Uniterms: Anacardium occidentale, Glycyrrhiza glabra, Antioxidant activity.
1 Graduação em Farmácia, Centro Estudos Superiores de Maceió - CESMAC. Rua Cônego Machado, 918, CEP:
57051-160, Maceió – Alagoas. Email: thy_rocha@hotmail.com; kelly.cbss@hotmail.com; bonifacionascimento@hotmail.com; bruno_noe1986@hotmail.com; bruno_noe1986@hotmail.com. ; 2Centro de Estudos Superiores de Maceió - CESMAC. Rua Cônego Machado, 918, CEP: 57051-160, Maceió – Alagoas. 3Universidade Estadual de Alagoas (UNEAL). Rua Governador Luiz Cavalcante, S/N - CEP.: 57312-000 - Alto Cruzeiro - Arapiraca – Alagoas. aldenirfeitosa@gmail.com
INTRODUÇÃO
Os radicais livres são moléculas muito reativas (Bhoola et al., 2003), derivados de oxigênio e nitrogênio, formados fisiologicamente no corpo humano. Tal formação envolve o combate a microorganismos invasores e o controle da pressão sangüínea. Alternativamente, a formação de radicais livres pode ser resultado do desacoplamento da cadeia respiratória, do descontrole dos mecanismos de combate a microorganismos ou do metabolismo de poluentes e medicamentos ou outros xenobióticos (Barreiros et al., 2003).
Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias que sofrem oxidação em detrimento de outra que seria importante que permanecesse no estado de oxidação natural, e isso se dá pelos mais diferentes mecanismos. Essas substâncias são capazes de estabilizar ou desativar os radicais livres antes que ataquem os alvos biológicos nas células (Barreiros et al., 2003).
Os sistemas antioxidantes podem ter origem endógena (por ex., superóxido dismutase), ou serem provenientes da dieta alimentar e outras fontes. Destas últimas destacam-se tocoferóis (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), polifenóis, selênio e carotenóides (Haslam, 1996; OMONI; ALUKO, 2004). Como já foi dito, quando há limitação na disponibilidade de antioxidantes podem ocorrer lesões oxidativas de caráter cumulativo.
Vários métodos são utilizados para determinar a atividade antioxidante em extratos e substâncias isoladas; um dos mais usados consiste em avaliar a atividade seqüestradora do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazila - DPPH•, de coloração púrpura que absorve a 516 nm. Por ação de um antioxidante (AH) ou uma espécie radicalar (R•), o DPPH• é reduzido formando difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, com conseqüente desaparecimento da absorção, podendo a mesma ser monitorada pelo decréscimo da absorbância. A partir dos resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade antioxidante ou determina-seqüestradora de radicais livres e/ou a porcentagem de DPPH• remanescente no meio reacional (Brand Wiliams et al., 1995; Sanches Moreno et al., 1998). A porcentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde à quantidade de DPPH consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50% é denominada concentração eficiente (CE50), também
chamada de concentração inibitória (CI50). Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra,
menor será a sua CE50 e maior a sua atividade antioxidante.
Embora plantas medicinais sejam raramente utilizadas como antioxidantes em medicina tradicional, suas características terapêuticas poderiam ser sustentadas devido, em parte, a sua capacidade varredora de radicais livres que podem estar envolvido em muitas doenças, devido principalmente a capacidade de neutralizarem radicais livres, ou seja, exibirem uma composição química rica em antioxidantes. Câncer, enfisema, cirrose, arterosclerose e artrites têm sido correlacionados com stress oxidativo (Morais et al., 2006). Foi determinado por Boscolo et al (2007) a existência de uma forte correlação entre a atividade antioxidante e patologias como febre e gripe nas espécies aroeira, embaúba e jambo branco. Tais patologias são ocasionadas dentre outros fatores, por possuírem altas taxas de radicais livres.
O trabalho teve como objetivo determinar atividade antioxidante, pelo ensaio do DPPH e realizar uma triagem fitoquímica do extrato etanólico Anacardium occidentale (cajueiro) e Glycyrrhiza glabra (alcaçuz).
MATERIAL E MÉTODOS Material vegetal
As plantas medicinais foram selecionadas a partir da relação de espécies medicinais comercializadas no município de Arapiraca-AL. Tais espécies vegetais foram adquiridas no mercado municipal deste município, onde ocorre sua comercialização. Esse material vegetal foi utilizado para o preparo dos extratos (Santos; Santos, 2007).
Preparação dos extratos
Os extratos foram preparados por maceração com etanol à temperatura ambiente por quatro vezes consecutivas e cada extração teve duração de quatro dias. Os extratos foram filtrados e reunidos. O solvente foi evaporado em evaporador rotativo acoplado à bomba de vácuo,os extratos secos foram pesados e calculados pela expressão: Rendimento (%) = (massa do extrato/massa do material vegetal) x 100.
Preparo das amostras
A partir de 20 mg do extrato seco, foi preparada uma solução em etanol a 1,0 mg mL-1 (ou 1:1) para posteriores diluições da casca da raiz da G. glabra e A. occidentale.
Análise qualitativa in vitro da atividade antioxidante
A avaliação qualitativa da atividade antioxidante foi realizada pelo método físico-químico de separação, a cromatografia, conforme metodologia descrita na literatura com pequenas modificações (Souza et al., 2007). Cada extrato das duas plantas foram, separadamente, submetidas à dissolução em etanol 95%, aplicados em cromatoplacas (sílica gel F254,) e eluídos em sistemas de
solventes adequados. Quando necessário as cromatoplacas foram reveladas em luz ultravioleta. Após eluição as cromatoplacas foram imersas em solução etanólica de DPPH 0,3µg/mL-1 por 10 segundos. O surgimento de manchas amarelas sob fundo de coloração púrpura nos Rfs dos respectivos extratos é indicativo de atividade antioxidante.
Análise quantitativa in vitro da atividade antioxidante
A avaliação quantitativa da atividade antioxidante foi feita seguindo metodologia descrita na literatura, com pequenas modificações, monitorando-se o consumo do radical livre DPPH pelas 2 (duas) amostras, através da medida do decréscimo da absorbância de soluções de diferentes concentrações (Brand Wiliams et al., 1995; Sanchez Moreno et al., 1998). Estas medidas foram feitas em espectrofotômetro UV-Vis B582® no comprimento de onda 516 nm, fazendo também leitura do branco e do controle negativo.
Leitura das medidas de absorbância nas amostras
Para a preparação das amostras foi retirado uma alíquota do extrato bruto das 6 (seis) plantas, onde foram solubilizadas em etanol 95% obtendo uma solução estoque de concentração final 1,0 mg/mL-1. Diluições foram feitas, em triplicata, a partir da solução inicial nas concentrações de 500, 125, 50, 10 e 5 μg/mL-1. Foi adicionado 1,0 mL de DDPH 0,3 mM em etanol a 2,5 mL de solução de amostra (A). Etanol (1,0 mL) mais 2,5 mL da solução da amostra foi usado como branco (B) e a solução de DPPH (1,0 mL; 0,3 mM) mais etanol (2,5 mL) foi usada como controle negativo (C). As reações transcorreram à temperatura ambiente (em torno de 26ºC) e ausência de luz por 30 minutos. A seguir foram feitas as leituras das absorbâncias, a 516 nm. Os valores de absorbância foram convertidos em atividade antioxidante percentual (AAO%) usando a seguinte fórmula: AAO% = 100 - {[ABSA – ABSB) X 100] /ABSC}(MENSOR, 2001).
Prospecção dos constituintes químicos
A realização da triagem fitoquímica foi realizada segundo a metodologia de Matos (1988) com algumas adaptações, visando realizar a prospecção dos seguintes constituintes: fenóis, taninos pirogálicos, taninos flobaflênicos, antocianina e antocianidina, flavonas, xantonas, chalconas, auronas flavononóis, leucoantocianidinas, catequinas, flavononas, xantonas, esteróides, triterpenóides e saponinas.
De cada extrato etanólico seco obtido, foi retirada uma alíquota do extrato e foi solubilizada em água destilada, obtendo as soluções-estoque. Foram separadas sete porções de 3 mL em tubos de
ensaios numerados e identificados de acordo com cada tipo de extrato e uma porção de 10 mL em béquer rotulado. Aqueceu-se o béquer em banho-maria em uma chapa de aquecimento com agitação até evaporação total da parte líquida, a qual foi utilizada nos testes para esteróides, triterpenóides e saponinas.
Testes para fenóis, taninos pirogálicos e taninos flobafênicos
No tubo “1” de cada extrato foram colocadas três gotas de solução alcoólica de FeCl3, após
agitação foi observada a ocorrência de variação de cor ou formação de precipitado abundante escuro. A coloração entre azul e o vermelho é indicativa de fenóis, precipitado escuro de tonalidade azul é indicativa da presença de taninos pirogálicos (taninos hidrolisáveis) e verde da presença de taninos flobafênicos (taninos condensados ou catéquicos). Para comparação foi realizado um teste em branco usando apenas água e o cloreto férrico.
Teste para antocianina e antocianidina, flavonas, flavonóis, chalconas e auroras, flavononóis
O tubo “2” foi acidulado com ácido clorídrico (HCl) a pH 3, o extrato do tubo “3” foi alcalinizado a pH 8,5 e o tubo “4” alcalinizado a pH 11 através da adição de hidróxido de sódio (NaOH). A variação de cor conforme a tabela 1 indicou a presença ou ausência dos aleloquímicos.
Tabela 1. Teste para antocianina e antocianidina, flavonas, flavonóis e xantonas, chalconas e
auronas, flavonóis
Constituintes Tubos de ensaio com pHs diferentes
Antocianinas e antocianidinas Flavonas, flavonóis e xantonas Chalconas e auronas Flavonóis
Ácido pH 3 Alcalino pH 8,5 Alcalino pH 11 (tubo "2") (tubo "3") (tubo "4")
vermelha Lilás azul-púrpura
- - amarela
vermelha - vermelho púrpura
- - vermelho laranja
Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavonas
O tubo “5” foi acidulado por adição de HCl até pH 2 e o tubo “6” foi alcalinizado pela adição de NaOH até pH 11. Ambos foram aquecidos com o auxílio de uma lamparina de álcool durante 3 minutos. A variação de cor conforme a tabela 2 indicou a presença ou ausência dos aleloquímicos.
Tabela 2. Teste para Leucoantocianidinas, catequinas e flavanonas.
Constituintes Cor do meio
Leucoantocianidinas Catequinas Flavanonas Ácido Alcalino vermelha - pardo-amarelada - - vermelho-laranja
Teste para flavonóis, flavonas, flavanonóis e xantonas
Ao tubo “7” foi acidulado uma pequena fita de magnésio e 1,0 mL de HCl concentrado. Após o término da reação, indicada pelo fim da efervescência, o tubo “7” foi comparado com o tubo “5” (ambos acidulados). Esperava-se o aparecimento ou a intensificação de cor vermelha indicando a presença de flavonóis, flavononas, flavononóis e/ou xantonas, livres ou seus heterosídios.
Teste para esteróides e triterpenóides
O resíduo seco do béquer foi extraído três vezes com 2 mL de clorofórmio e homogeneizado. A solução foi filtrada gota a gota em um pequeno funil com algodão, coberta com alguns decigramas de Na2SO4 anidro, para um tubo de ensaio. Foi acidulado 1 mL de anidro
acético, agitou-se suavemente, e adicionou-se três gotas de H2SO4 concentrado. Agitou-se
novamente o observou-se a projeção de cores, indicando: coloração azul evanescente seguida de verde permanente é indicativa da presença de esteróides livres. A coloração parada até vermelha indica triterpenóides pentacíclicos livres.
Teste para saponinas
O resíduo insolúvel em clorofórmio, separado na operação anterior, foi redissolvido em 8 mL de água destilada e a solução foi filtrada para um tubo de ensaio. Agitou-se o tubo com a solução, fortemente, por três minutos e observou-se a formação de espuma, se fosse persistente por quinze minutos a abundante (colarinho) é indicativa da presença de saponinas (heteróides saponínicos).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os rendimentos obtidos na extração por maceração dos materiais vegetais constam na (tabela 3) e, exceto o obtido com o alcaçuz, todos os demais materiais vegetais resultaram em uma boa quantidade de material vegetal que viabilizará a realização dos experimentos.
Tabela 3. Rendimentos dos extratos etanólicos estudados.
Material Vegetal *Rendimento (%) = (ME/MMV) x 100 % (Cálculo) A. occidentale (cajueiro) (29, 281g/ 100,0010g) x 100 29,28% G. glabra (alcaçuz) (3,58g/68,0852g) x 100 25,26% * ME= massa do extrato
MMV = massa do material vegetal
Os extratos vegetais secos foram submetidos à cromatografia em camada delgada (CCD) e eluídos com solventes em gradiente crescente de polaridade pura e em combinação: CHCL3, AcOEt
e MeOH (tabela 4).
Tabela 4. Sistemas eluentes utilizados na cromatografia em camada delgada.
Extrato Eluente
G. glabra (alcaçuz) CHCL3/ MeOH (1:1)
A. occidentale (cajueiro) CHCL3/ MeOH (1:1)
Na avaliação preliminar qualitativa dos extratos por cromatografia de camada delgada em gel de sílica, revelada com solução etanólica a 0,4mol do radical DPPH foram observadas manchas amareladas em todos os Rfs dos extratos etanólicos vegetais analisados o que indica que
essas amostras apresentam atividade antioxidante e são viáveis para o teste de avaliação quantitativa da atividade antioxidante percentual.
A capacidade de seqüestrar radicais livres em relação ao radical estável 2,2-difenil-1-picril hidrazil (DPPH) foi inicialmente escolhida por se tratar de uma metodologia simples rápida e sensitiva, muito conveniente para realização de “screening” de um grande número de amostras com diferentes polaridades. As substâncias antioxidantes presentes no extrato reagiram com o DPPH que é um radical estável, e converte-o em 2,2-difenil-1-picril hidrazina (Roesler et al., 2007). O mesmo autor também relata que o grau de descoloração indica o potencial antioxidante do extrato, ou seja, um extrato que apresenta alto potencial em seqüestrar radicais livres.
Os valores de absorbância obtidos nos testes com o radical livre DPPH, para cada planta medicinal estudada, são apresentados e convertidos em atividade antioxidante percentual (AAO%) (tabela 5 e 6).
Tabela 5. Valores de absorbância, média, desvio padrão e AA% de G. glabra (alcaçuz)
Concentração Absorbância Média da Desvio
padrão AAO% (μg mL-1) 1 2 3 Absorbância 500 0,386 0,733 0,719 0,613 0,1964 23,106 Branco 500 0,004 0,004 0,003 0,004 0,0006 125 0,624 0,635 0,629 0,629 0,0055 21,549 Branco 125 0,007 0,008 0,009 0,008 0,0010 50 0,669 0,688 0,679 0,679 0,0095 15,488 Branco 50 0,008 0,010 0,010 0,009 0,0012 10 0,713 0,719 0,703 0,712 0,0081 11,195 Branco 10 0,009 0,008 0,008 0,008 0,0006 5 0,745 0,733 0,719 0,732 0,0130 8,712 Branco 5 0,009 0,010 0,009 0,009 0,0006 Controle negativo 0,819 0,772 0,785 0,792 0,0243
Os resultados da AAO% dos extratos etanólico das amostras, nas concentrações de 500, 125, 50, 10 e 5 μg/mL,-1
mostram que o alcaçuz apresenta atividade seqüestradora do radical DPPH em todas as concentrações avaliadas, e que entre essas duas variáveis existe uma relação concentração dependente, nas concentrações avaliadas, uma vez que quanto maior a concentração do extrato etanólico maior a capacidade seqüestradora de radicais livres, ou seja, maior a atividade antioxidante (figura 1). Por meio da análise de regressão linear entre a concentração avaliadas do extrato etanólico das cascas da raiz do alcaçuz e a sua atividade antioxidante percentual (capacidade em seqüestrar radicais livres), obtiveram-se os coeficientes angular e linear, o que possibilitou a determinação da equação da reta y = 12,716 + 0,0239x com coeficiente de determinação (R2) 0,6248 e o cálculo do valor de CE50 de 1560 g mL-1 para a amostra vegetal.
Tabela 6. Valores de absorbância, média, desvio padrão e AA% de A. occidentale (cajueiro)
Concentração Absorbância Média da
Desvio Padrão AAO% (μg mL-1 ) 1 2 3 Absorbância 500 0,088 0,087 0,084 0,086 0,0021 92,833 Branco 500 0,039 0,038 0,036 0,038 0,0015 125 0,070 0,077 0,065 0,071 0,0060 90,280 Branco 125 0,006 0,003 0,005 0,005 0,0015 50 0,188 0,164 0,173 0,175 0,0121 74,914 Branco 50 0,005 0,004 0,005 0,005 0,0006 10 0,420 0,431 0,429 0,427 0,0059 38,390 Branco 10 0,009 0,006 0,010 0,008 0,0021 5 0,514 0,472 0,525 0,504 0,0280 27,050 Branco 5 0,007 0,008 0,010 0,008 0,0015 Controle negativo 0,671 0,689 0,677 0,679 0,0092
O cajueiro também apresenta atividade seqüestradora do radical DPPH em todas as concentrações avaliadas. Segundo Cavalcante et al. (2006) o sulco e a polpa de caju também apresentam em todas as concentrações estudadas uma atividade antioxidante, na qual também foi observada no teste DPPH.
Com relação à triagem fitoquímica foi observado que nos estratos das cascas da raiz do alcaçuz havia a presença de taninos flobafênicos; flavonas, flavonóis e xantonas; e esteróides. Também nos extratos das cascas da raiz do alcaçuz e das folhas do alecrim foi identificada a presença de catequinas (tabela 7).
Tabela 7. Prospecção dos constituintes químicos dos extratos das espécies estudadas. Extrato das Espécies Vegetais
Constituintes Químicos Cascas
Raiz Caule Alcaçuz Cajueiro Fenóis N N Taninos Pirogálicos N N Taninos Flobafênicos P P Antocianina e antocianidina N N
Flavonas, flavonóis e xantonas P N
Chalconas e auronas N N
Flavanonóis N P
Flavonóis, flavononas, flavononóis e xantonas N N Leucoantocianidinas N N Catequinas P P Flavononas N N Esteróides P N Triterpenóides N N Saponinas P P
CONCLUSÃO
As propriedades antioxidantes de extrato de plantas medicinais têm recebido considerável atenção nos últimos anos, sendo reconhecidas desde a antiguidade. Considerando que substâncias naturais podem ser responsáveis pelo efeito de proteção contra os riscos de muitos processos patológicos, os resultados descritos no trabalho mostram que em todas as concentrações avaliadas (500, 125, 50, 10 e 5 μg/mL-1
) dos extratos etanólicos das espécies alcaçuz e cajueiro apresentaram atividade seqüestradora do radical DPPH•, ou seja, apresentam a atividade antioxidante. O maior percentual de atividade antioxidante a 500 μg/mL-1 foi observado nos extratos etanólicos do cajueiro, enquanto que o alcaçuz 21, 54%. O extrato do cajueiro apresentou uma maior AAO% na concentração de 125 μg/mL-1
.
Na prospecção de constituintes químicos foi notada a presença de taninos flobafênicos; flavononas, flavononóis e xantonas; catequinas; leucoantocianidinas; chalconas; auronas; esteróides e saponinas. Tais resultados estimulam a continuidade dos estudos visando à determinação dos fenóis totais da espécie antioxidantes estudadas, uma vez que essas substâncias são muito citadas na literatura como responsáveis pelo potencial antioxidante das plantas. Portanto, as plantas medicinais aqui estudadas podem agir como antioxidantes e seqüestradores de radicais livres prejudiciais a saúde.
AGRADECIMENTOS
O trabalho foi realizado com o apoio do laboratório de iniciação científica da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde (FCBS) do Centro de Estudos Superiores de Maceió. Fica registrado nossa gratidão ao Programa Semente de Iniciação Científica (PSIC) por ter tornado possível desenvolver essa pesquisa.
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