FUNGOS MICORRÍZICOS: CONSERVAÇÃO DE ORQUÍDEAS E BIOCONTROLE DE FITOPATÓGENOS

1 FUNGOS MICORRÍZICOS: CONSERVAÇÃO DE ORQUÍDEAS E

BIOCONTROLE DE FITOPATÓGENOS

Leila Garcês de Araújo1_{; Marlon Corrêa Pereira}2_{; Rafael Borges da Silva} Valadares3**_{; Marta Cristina Filippi Corsi}4_{; Sérgio Tadeu Sibov}4_{; Kellen Cristhina} Inácio Sousa1_{; Aline Pereira Luzini}1*_{; Jacqueline Campos Borba Carvalho}1* 1_{Universidade Federal de Goiás, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de} Biologia Geral, Laboratório de Genética de Microrganismos, CP 131, CEP 74001-970, Goiânia, GO – leilagarcesaraujo@gmail.com; *Mestrandas do Programa de Pós graduação em Genética e melhoramento de plantas; 2_{Universidade Federal de Viçosa,} Campus de Rio Paranaíba, Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, CP 22, CEP 38810-000, Rio Paranaíba, MG – marlon.pereira@ufv.br; 3_{Universidade de São Paulo,} Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, CEP 13418-900, Piracicaba, SP – rafaelbsvaladares@gmail.com, doutorando em Solos e Nutrição de Plantas; 4_Embrapa Arroz e Feijão, Laboratório de Fitopatologia, CP 179, CEP 75375-000, Sto Antônio de Goiás, GO - macrisfilippi@gmail.com; 5_{Universidade Federal de Goiás, Instituto de} Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral, Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais.

RESUMO

O Brasil possui em torno de 2500 espécies de orquídeas. Os biomas mais ricos em biodiversidade dessas espécies são a Mata Atlântica e o Cerrado, e ambos são considerados hotspots de maior biodiversidade do mundo. Grande parte das orquídeas possui associação micorrízica com fungos rizoctonioides. A identificação destes fungos pode ser realizada através de análises morfológicas, microscópicas e moleculares. Fungos rizoctonioides associados ao sistema radicular de orquídeas nativas da Mata Atlântica e do Cerrado estão sendo isolados e caracterizados visando a conservação de espécies vegetais e fúngicas por meio da germinação simbiótica in vitro de sementes de orquídeas, e também através da micorrização ex vitro. Além disso, os fungos micorrízicos promovem tolerância a estresses de natureza biótica como fitopatógenos e/ou abiótica, incluindo estresse hídrico, salinidade e metais pesados. Nesta revisão serão abordados sobre identificação, diversidade, germinação simbiótica in vitro,

2 especificidade micorrízica, mixotrofismo, regulação da simbiose micorrízica, filogenia molecular de fungos rizoctonoides, e do seu papel na conservação de orquídeas. Também serão discutidos o uso de fungos rizoctonioides e de fungos micorrízios arbusculares (FMAs), bem como dos metabólitos secundários produzidos por estes no biocontrole de fitopatógenos.

SUMMARY

Brazil is the home of approximately 2500 species of orchids. The Atlantic forest vegetation and Cerrado are very rich in biodiversity of these species and are considered hotspots in the world. A great part of these orchids have micorrhizal association with rhizoctonia-like fungi. The identification of these fungi can be done by morphological, microscopic and molecular analysis. Rhizoctonia-like fungi associated with root system of native orchids of Atlantic forest and Cerrado are being isolated and characterized with the objective of conserving plant species and fungi through in vitro symbiotic germination of orchid seeds and also through ex vitro mycorrhization. The micorrhizal fungi promote biotic stress tolerance to plant pathogens and /or abiotic tolerance to drought, salinity and heavy metals. This review will present different aspects on identification, diversity, in vitro symbiotic germination, micorrhizal specificity, mixotrophism, regulation of micorrhizal symbiosis, molecular phylogeny of

rhizoctonia-like fungi and their role in the conservation of orchids. Also, the use of rhizoctonia-like fungi and the arbuscular micorrhizal fungi (AMFs), as well as

secondary metabolites produced by these in the bio control of plant pathogens will be discussed.

3 INTRODUÇÃO

A família Orchidaceae é uma das maiores entre as angiospermas, são aproximadamente 500 gêneros e 35.000 espécies (Cribb et al., 2003). Apenas no Brasil foram catalogados 236 gêneros e 2437 espécies de orquídeas, sendo que dessas, 65 gêneros e 1627 espécies são endêmicas (Barros et al., 2012). Os biomas brasileiros com maior diversidade de orquídeas são Mata Atlântica e Cerrado (Barros et al., 2012) e ambos estão entre os ambientes mais ameaçados do mundo e são considerados “hotspots” de biodiversidade na América do Sul (Myers et al., 2000).

As espécies dessa família compartilham a habilidade de estabelecer uma associação mutualística com fungos micorrízicos, denominada associação micorrízica de orquídeas (Peterson et al., 2004). Essa associação se caracteriza pela colonização de células do córtex das raízes das orquídeas por enovelados de hifas fúngicas, os pelotons (Andersen & Rasmussen, 1996). Ela é essencial para o ciclo de vida das orquídeas, uma vez que os fungos simbiontes são indispensáveis para germinação das sementes, estabelecimento das plântulas e nutrição da planta adulta na natureza (Rasmussen, 1995; Peterson et al., 2004; Dearnaley, 2007).

Os principais fungos micorrízicos de orquídeas são Rhizoctonia-like, ou seja, rizoctonioides (Currah & Zelmer, 1992; Andersen & Rasmussen, 1996; Pereira et al., 2005a). Estudar a diversidade destes fungos, e seus papéis na simbiose se faz importante. Identificando os simbiontes é possível aplicá-los na produção de mudas para reintrodução nos habitats naturais, de forma que os simbiontes sejam também reintroduzidos. Além disso, os simbiontes podem ser aplicados na produção comercial de mudas de orquídeas através da micorrização.

O biocontrole é uma das principais medidas de controle a ser inserida no manejo integrado de doenças para assegurar uma agricultura sustentável (Lahlali &

4 Hijri, 2010). Os agentes de controle biológico podem atuar através do antagonismo e também indiretamente pela indução de mecanismos de defesa das plantas no controle de patógenos fúngicos de plantas (Doohan, 2005). Neste sentido, uma das principais estratégias do biocontrole que pode aumentar a durabilidade da resistência e reduzir os resíduos tóxicos produzidos pelo uso indiscriminado de agrotóxicos é a utilização de indutores bióticos e abióticos de resistência (Filippi et al., 2011).

Os fungos rizoctonioides incluem os gêneros fúngicos Ceratobasidium e

Thanatephorus que possuem várias estratégias tróficas tais como, parasitas, saprófitas

(rhizoctonia binucleada – RBN), e também simbiontes micorrízicos de orquídeas (Agrios, 2005; Moncalvo et al., 2006; Mosquera-espinosa et al., 2012).

Isolados de Rhizoctonia spp. não patogênicas, hipovirulentas e RBN obtidas do solo e de outras partes da planta foram usados para o biocontrole de vários fitopatógenos em muitos patossistemas. Os principais mecanismos de biocontrole envolvidos nessa interação foram competição por nutrientes e/ou indução de resistência (Xue et al., 1998; Burns & Benson, 2000; Sneh et al., 2004; Jabaji-Hare & Neate, 2005).

Até o momento, na literatura consultada, existem dois exemplos de uso de fungos micorrízicos de orquídeas no biocontrole de doenças fúngicas de plantas (Mosquera-espinosa et al., 2012; Carvalho et al., 2012). Por outro lado, existem mais trabalhos de fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) que são utilizados como indutores de resistência sistêmica cuja principal rota de sinalização é a do ácido jasmônico (Van der Ent et al., 2009a; Pozo et al., 2010).

Esta revisão abordará os assuntos principais para o entendimento da associação simbiótica de fungos micorrízicos com orquídeas, e do uso de fungos rizoctonioides e FMAs como agentes de controle biológico de doenças de plantas.

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FUNGOS MICORRÍZICOS DE ORQUÍDEAS: IDENTIFICAÇÃO,

DIVERSIDADE E GERMINAÇÃO SIMBIÓTICA IN VITRO

Os principais fungos micorrízicos de orquídeas pertencem ao grupo dos

Rhizoctonia-like (Currah & Zelmer, 1992; Rasmussen, 2002; Dearnaley, 2007), ou seja,

rizoctonioides (Pereira et al., 2005a). Representantes de quatro gêneros de fungos rizoctonioides, Ceratorhiza, Epulorhiza, Opadorhiza e Rhizoctonia, foram obtidos de orquídeas brasileiras e alguns isolados apresentaram grande eficiência em promover a germinação da semente e o desenvolvimento do embrião da orquídea em plântula (Pereira et al., 2003; 2005a; b; c; 2009; 2011a; Nogueira et al., 2005; Valadares et al., 2012; Pessoa et al., 2012; Souza, 2012).

Os fungos rizoctonioides se caracterizam por apresentar: (i) constrição da hifa na região do septo; (ii) ramificação da hifa logo após o septo e em ângulo reto; (iii) presença de cadeias de células intumescidas, as células monilioides, que são propágulos assexuais de resistência; (iv) formação de escleródios; (v) septo dolipórico complexo; (vi) ausência de esporos assexuados e (vii) ciclo sexual raro e de difícil observação (García et al., 2006). A identificação desses fungos micorrízicos pode ser realizada utilizando-se chaves taxonômicas baseadas em características culturais, morfológicas e fisiológicas (Currah & Zelmer, 1992; Currah et al., 1997). Entretanto, o processo de identificação é trabalhoso e despende muito tempo, estimulando a utilização de técnicas moleculares (Taylor et al., 2002).

A diversidade dos isolados dos simbiontes foi estudada pela análise da variabilidade existente entre os pertencentes a diferentes gêneros, a um mesmo gênero ou a uma mesma espécie (Horton & Bruns, 2001; Rasmussen, 2002; García et al., 2006). Para isso, pode-se utilizar, para comparação, características morfológicas e características moleculares, sendo as últimas avaliadas por meio de diferentes técnicas

6 baseadas na composição do DNA total desses fungos (Rasmussen, 2002; Taylor et al, 2002; Pereira et al., 2009).

As características morfológicas avaliadas durante a caracterização de isolados de fungos rizoctonioides podem ser utilizadas para agrupá-los utilizando técnicas biométricas, tais como distância generalizada de Mahalanobis e Variáveis Canônicas (Cruz & Regazzi, 1997). Características qualitativas (cor, aspecto, presença de micélio aéreo, margem da colônia e condição nuclear) e características quantitativas (taxa de crescimento, diâmetro de colônia, dimensões das células monilioides e diâmetro de hifa) podem ser analisadas utilizando essas técnicas, o que possibilita concluir sobre a semelhança ou distinção entre os isolados estudados (Pereira et al., 2009).

A análise da sequência da região ITS (Internal Transcribed Spacer) do gene nuclear ribossomal ilustrado na Figura 1 (nrDNA) de isolados é uma técnica molecular utilizada para identificação de fungos micorrízicos de orquídea (Taylor et al., 2002; Dearlaney, 2007) e para estudar a variabilidade inter e intraespecífica de fungos rizoctonioides (Sharon et al., 2008). Outras técnicas moleculares utilizadas no estudo da diversidade dos fungos micorrízicos são ITS-RFLP (Shefferson et al., 2007) e a composição total de ácidos graxo (Pereira et al., 2011b).

7 Figura 1. Unidades de repetição e subunidades gênicas da região ITS 1 e 2 (espaço interno transcrito) do gene nuclear ribossomal. ETS: Espaço externo transcrito, NTS: Espaço não transcrito, IGS: Espaçadores intergênicos. Adaptado de Dutra (2008).

Fungos micorrízicos de orquídeas podem ser identificados, independente do isolamento dos mesmos. O DNA total de raízes colonizadas pelos fungos micorrízicos pode ser extraído para amplificação de regiões do genoma do simbionte utilizando-se primers específicos a esses fungos (White et al., 1990; Taylor & McCormick, 2008). O amplificado, por sua vez, pode ser analisado para identificação dos mesmos utilizando diferentes técnicas. A região ITS é frenquentemente empregada nestes estudos (Taylor & McCormick, 2008). Após sua amplificação por PCR, os fragmentos obtidos podem ser analisados por ITS-RFLP ou sequenciados para comparação com sequências depositadas em bancos de dados internacionais (Taylor & Bruns, 1999; Shefferson et al., 2007; Okayama et al., 2012), como do NCBI alguns casos, pode ser necessário a clonagem dos fragmentos, uma vez que mais de um fungo pode colonizar um mesmo fragmento de raiz (Taylor & Bruns, 1999; Shefferson et al., 2007).

A associação orquídea-fungo é estabelecida na germinação das sementes e é mantida durante o desenvolvimento do embrião até formação da planta adulta (Rasmussen, 1995). A inexistência de um tecido de reserva de nutrientes, que possibilite a germinação e o desenvolvimento das sementes das orquídeas de forma autônoma, torna a associação com fungos micorrízicos indispensável em condições naturais (Rasmussen, 1995; Peterson et al., 2004). A semente obtém os nutrientes necessários à

8 sua germinação e desenvolvimento a partir da digestão dos pelotons formados após a colonização do tecido do embrião pelo fungo micorrízico (Rasmussen, 1995).

Após a germinação, o embrião da semente da orquídea desenvolve-se formando o protocormo, estrutura heterotrófica originada a partir da diferenciação das células do embrião. O protocormo origina a plântula, a qual se desenvolve na planta adulta (Peterson et al, 2004). Os pelotons podem ser observados em células do embrião, dos protocormos, das raízes, dos tubérculos e dos rizomas das orquídeas, o que possibilita a compreensão dessa associação em condições naturais de campo e em cultivos in vitro (Arditti, 1992; Rasmussen, 1995).

Algumas orquídeas clorofiladas, mesmo após adquirirem a capacidade de fotossintetizar continuam a depender dos fungos, principalmente, para obtenção de minerais (Dearnaley, 2007; Rasmussen & Rasmussen, 2009). Por outro lado as orquídeas aclorofiladas são mico-heterotróficas durante todo seu ciclo de vida, ou seja, dependem do fungo micorrízico para obter carboidratos para o seu crescimento e desenvolvimento, mesmo durante a fase adulta (Peterson et al., 2004, Rasmussen & Rasmussen, 2009).

ESPECIFICIDADE MICORRÍZICA NA ASSOCIAÇÃO COM ORQUÍDEA A maioria das espécies de orquídeas possui especificidade em relação a determinados grupos, espécies ou isolados de fungos micorrízicos (Hadley & Pegg, 1989). A especificidade na associação entre orquídeas e fungos micorrízicos pode ser definida como a gama de fungos a qual uma espécie particular de orquídea se associa (Thompson, 1994). No entanto, uma simples lista taxonômica de associações encontradas poderia mascarar a complexidade da especificidade entre ou dentro de populações, já que condições abióticas, tais como composição do substrato, temperatura, altitude, região geográfica e as variações genéticas entre diferentes

9 populações afetam a interação entre a orquídea e o fungo micorrízico (Thompson, 1994; Rasmussen, 1995; Taylor & Bruns, 1999; Otero et al., 2004; 2007).

A infecção inicial pode ser evento chave para o reconhecimento entre os simbiontes, definindo a compatibilidade da associação (Rasmussen, 1995). Quando há incompatibilidade, a planta induz a formação de compostos inibitórios ao crescimento do fungo, como o acúmulo de compostos fenólicos nas células infectadas pela hifa fúngica (Arditti, 1992). Alguns fungos, por mais que colonizem as células do embrião, não são capazes de sustentar o desenvolvimento da orquídea até a formação da primeira folha com produção de clorofila, início da autotrofia da planta (Arditti, 1992; Pereira et al., 2005b; 2011a). Para que a orquídea colonize determinada região é necessária a presença, no substrato, de fungo compatível e eficiente em permitir o desenvolvimento da orquídea (Mckendrick et al., 2002). Assim, a especificidade pode determinar as regiões de crescimento de uma espécie de orquídea devido à presença ou ausência do fungo compatível (Taylor & Bruns, 1999; Mckendrick et al., 2002).

A especificidade foi estudada pela identificação dos fungos micorrízicos associados (Taylor & Bruns, 1999, Otero et al., 2004, Shefferson et al., 2007) ou pela indução da germinação de sementes in vitro ou ex vitro (Mckendrick et al., 2002; Otero et al., 2004; Pereira et al., 2011a). O tipo de estudo desenvolvido pode levar a obtenção de diferentes resultados e, consequentemente, a diferentes compreensões da especificidade da associação micorrízica em orquídeas (Taylor & Bruns, 1999).

MIXOTROFISMO

A simbiose entre plantas e fungos é uma interação comum na natureza, transitando de maneira contínua entre o parasitismo e o mutualismo. A regulação destas interações é baseada em um balanço bem afinado entre as demandas de cada organismo envolvido na interação (Kogel et al., 2006). Neste contexto, a interação micorrízica de

10 orquídeas deve ser considerada única. Apesar da maioria das orquídeas produzir clorofila enquanto adultas, todas as espécies são parasitas obrigatórios de seus fungos micorrízicos nos estágios iniciais do seu desenvolvimento. O ciclo de vida das orquídeas é portanto considerado mixotrófico, combinando a absorção de carbono orgânico derivado de seus fungos micorrízicos e fotoassimilação, simultaneamente ou ao longo do tempo (Rasmussen & Rasmussen, 2009).

As plântulas geralmente começam seu ciclo de vida utilizando reservas energéticas contidas nas sementes, armazenadas a partir da fotossíntese da planta mãe. Em contraste, sementes de orquídeas não possuem reservas energéticas e dependem de carboidratos derivados da associação micorrízica. Assim, se todo o ciclo de vida de uma orquídea for considerado, estas nunca são exclusivamente autotróficas. Em termos de conservação, isto significa que o fungo empregado durante a germinação tem que ser sempre considerado. Esta combinação temporal ou simultânea entre os metabolismos micotróficos e fotossintéticos, característica de Orchidaceae, pode ser descrita como mixotrofia (Rasmussen & Rasmussen, 2007; Selosse & Roy, 2009).

Estudos baseados na abundância natural de isótopos estáveis de carbono e nitrogênio indicaram que mesmo orquídeas fotossintetizantes também obtém frações significativas do carbono e nitrogênio alocados na biomassa através da associação micorrízica (Tedersoo et al., 2007; Zimmer et al., 2007; Hynson et al., 2009). Em um estudo mais recente, Girlanda et al. (2011) verificaram que quatro espécies de orquídeas na região do mediterrâneo possuíam dependência nutricional de seus micobiontes ou especificidade micorrízica. Também utilizando de análises de isótopos estáveis para determinar o grau de micoheterotrofia e sequenciamento da região ITS amplificados diretamente da raíz para avaliar a diversidade micorrízica associada, concluíram que,

11 mesmo orquídeas expostas ao sol possuem certo grau de micotrofismo e, quanto maior a dependência nutricional, maior a especificidade.

Em relação a definição ecológica da simbiose micorrízica em orquídeas, uma questão que está sendo amplamente discutida se refere ao que o fungo micorrízico recebe em troca, ou seja, a interação micorrízica em orquídeas é verdadeiramente mutualista ou se trata de um parasitismo da planta em relação ao fungo ? Cameron et al. (2006, 2008) demonstraram, utilizando radioisótopos de 14_{C, que plantas adultas de}

Goodyera repens retornavam para o fungo micorrízico (Ceratobasidium cornigerum)

até cinco vezes mais carbono, do que a quantidade transferida do fungo para a planta. No entanto, Rasmussen & Rasmussen (2009), criticaram as condições experimentais utilizadas pelos autores citados, afirmando que, esta transferência de carbono para o fungo foi avaliada em apenas oito dias, e portanto pode não representar as condições que ocorrem no campo. Mais ainda, discutem que esta transferência em direção ao fungo pode ser reflexo da escassez de carbono no meio de cultura onde o fungo estava sendo cultivado e portanto, uma tentativa do fungo de "pegar" carbono da planta. Sobretudo esta é uma discussão interessante e que está motivando uma série de trabalhos, com destaque para os realizados na regulação fisiológica da interação e que buscam elucidar a função de certas moléculas características de interações mutualistas, parasíticas ou patogênicas.

REGULAÇÃO DA SIMBIOSE MICORRÍZICA DE ORQUÍDEAS

Hifas fúngicas penetram no tecido das orquídeas pela parede celular, geralmente em regiões onde a cutícula é menos espessa ou ausente. Vários fungos saprófítas e ectomicorrízicos secretam enzimas degradativas em direção a parede celular vegetal, incluindo fungos micorrízicos de orquídeas (Rasmussen, 1995). É sabido que esta atividade enzimática por ser regulada por estímulos externos (Carlile & Watkinson,

12 1997), assim, é plausível que as orquídeas possam produzir algum sinal químico com objetivo de estimular a secreção destas enzimas fúngicas. O fato de que alguns orgãos da planta nunca são colonizados pelos fungos sugere que, defesas estruturais e fisiológicas regulam a colonização fúngica nos bulbos, raízes e provavelmente também a nível celular. É sabido que enzimas pertencentes a vias de fitoalexinas com atividade antifúngica são produzidas em orquídeas, e que sua atividade biológica é aumentada diversas vezes em resposta à ferimentos ou infecção fúngica (Reinecke & Kindl 1994a,b).

Ensaios enzimáticos envolvendo a simbiose micorrízica em orquídeas foram realizados primeiramente por Blakeman et al. (1976). Neste trabalho foram quantificadas as atividades das enzimas polifenol oxidase, ácido ascórbico oxidase e catalase em protocormos de Dactylorhiza purpurella e em um híbrido do gênero

Cymbidium. Os autores observaram que as atividades destas enzimas eram aumentadas

em protocormos simbióticos e, o pico da atividade geralmente coincidia com o pico da atividade respiratória e subsequente digestão dos pelotons, exceto para peroxidase a qual tinha seu pico de atividade logo ao primeiro contato com o fungo micorrízico. Salomé & Barroso (1983) por sua vez, utilizaram técnicas de localização citoquímica para detectar polifenol oxidases em Ophryis lutea durante a colonização de Rhizoctonia

repens. Eles encontraram grandes quantidades dos produtos desta reação em

citoplasmas fúngicos durante os primeiros estágios da colonização e, numa etapa subsequente estas mesmas moléculas eram detectadas em pequenas quantidades nas hifas fúngicas e maiores quantidades na interface fungo-planta. Eles então sugeriram que estas enzimas podiam ser produzidas pelo fungo e podiam atuar na proteção das hifas na interface próximo ao plasmalema, onde provavelmente atuariam como oxidantes de compostos fenólicos produzidos pela planta hospedeira.

13 Também considerando o metabolismo de fitoalexinas, Beyrle et al. (1995), realizaram ensaios enzimáticos de atividade de fenilalanina amônio-liase (PAL) e orquinol, utilizando protocormos simbióticos e assimbióticos de Orchis morio, com objetivo de estudar os efeitos da colonização micorrízica na rota metabólica do ácido chiquímico. Detectaram que a concentração de ambas enzimas aumentavam na presença do fungo em comparação aos protocormos assimbióticos, sugerindo que a rota do ácido chiquímico deve ter um papel no controle da simbiose micorrízico de orquídeas. Shimura et al. (2007) demonstraram que as fitoalexinas lusiatrina e crisina estavam presentes em protocormos simbióticos de Cypripedium macranthos, sugerindo funções relacionadas a inibição da colonização fúngica em tecidos fotossintetizantes.

Expressão gênica e proteômica

Até a presente data, a avaliação de alterações da expressão gênica em micorrizas orquidoides foi descrita uma única vez em plantas adultas. Dois genes mostraram expressão diferencial e eram micorriza-específicos, uma vez que eram expressos na presença de fungos micorrízicos e não eram afetados pela infecção com fungos fitopatôgenicos. Uma trealose-6-fostato sintase teve expressão diminuída em micorriza orquidoide, sugerindo alterações no transporte de carbono e, uma proteína de ligação a nucleotídeos (nucleotide-binding protein) teve expressão aumentada, possivelmente pelo aumento da citocinese, em preparação para a entrada do fungo nos tecidos da orquídea (Watkinson, 2003). Atualmente, outros estudos estão sendo conduzidos utilizando-se técnicas de sequenciamento de RNA em larga escala como por exemplo o pirosequenciamento (454-Roche) e RNAseq (Valadares et al., Perotto et al., dados não publicados).

Um receptor solúvel com um domínio de ligação à carboidratos do tipo lectina semelhante aos encontrados em plantas colonizadas por fungos micorrízicos

14 arbusculares e também leguminosas durante a interação com bactérias nodulantes e com atividade antifúngica foi identificada em orquídeas do gênero Gastrodia (Wang et al., 2001). Estas proteínas, denominadas gastrodianinas também foram encontradas nas orquídeas Epipactis helleborine e Listera ovata sugerindo que uma nova classe de proteínas relacionadas ao controle da infecção fúngica tinham sido descobetas. Receptores semelhantes também foram encontradas em raízes colonizadas de

Oeceoclades maculata utilizando a técnica de proteômica quantitativa iTRAQ acoplada

a espectrometria de massa em tandem (Valadares et al., dados não publicados).

Utilizando esta mesma técnica Valadares et al. (2012) analisaram alterações no proteoma de protocormos de Oncidium sphacelatum germinados utilizando um isolado Ceratobasidium sp., durante as fases micoheterotrófica (aclorofilada) e mixotrófica (clorofilada) em um sistema de cultivo in vitro. Conforme era esperado proteínas relacionadas ao metabolismo de açúcares foram altamente induzidas na primeira amostra em contraste a proteínas relacionadas a fotossíntese. Associada a essa alteração no metabolismo, proteínas relacionadas ao sistema de defesa e resposta oxidativa foram diferencialmente reguladas nas duas amostras. De acordo com os mesmos autores, é provável que altas concentrações de radicais oxidativos na primeira amostra (aclorofilada) estejam relacionadas à uma rápida ativação das respostas de defesa vegetal, o que pode ser útil tanto para rápida degradação dos pelotons (fornecimento de energia) como para restringir a colonização fúngica a tecidos parenquimáticos. Conforme Shimura et al. (2007) da mesma maneira, a repressão moderada do sistema de defesa na fase mixotrófica (clorofilada) pode ser compreendida como uma estratégia de manutenção da simbiose a níveis que continuem a suprir a demanda energética da planta mas previnam a eliminação completa do simbionte. Estes autores concluíram que diversos mecanismos similares ao encontrados nas interações

15 entre plantas e fungos micorrízicos arbusculares também estão presentes nas micorrizas orquidoides e que, a intensidade destas respostas possa ter alguma ligação com a necessidade energética de cada etapa do ciclo de vida de Orchidaceae.

FILOGENIA MOLECULAR DE FUNGOS MICORRÍZICOS

RIZOCTONIOIDES

Abordagens moleculares filogenéticas facilitam o estudo da especificidade entre orquídea e micorriza, nesse contexto podemos definir especificidade micorrízica como a amplitude filogenética das associações entre taxas distintos (Otero et al., 2007). Algumas espécies de orquídeas apresentam níveis variados de especificidade micorrízicas, identidade e amplitude filogenética de fungos micorrízicos revelando assim alguns traços evolutivos destas (Otero et al., 2004; Shefferson et al., 2007; Yuan et al., 2010). Para se discutir a especificidade entre orquídea e fungos micorrízicos é necessário que se compreenda as relações filogenéticas de ambos os grupos (Otero et al., 2004).

Uma relação específica significa que uma orquídea interage com taxa de fungos contidos dentro de um único e restrito clado filogenético. Estudos realizados evidenciram que as relações entre orquídea e fungo micorrízico são consideradas as mais específicas, quando comparados a outros sistemas micorrízicos existentes em outras plantas que são generalistas exibindo amplas associações micorrízicas (Otero et al., 2007; Shefferson et al., 2007). Antes acreditava-se que existia uma ampla gama te táxons fúngicos em interações micorrízicas com orquídeas, mas estudos recentes de filogenia molecular mostram que o número de táxons não é assim tão grande (Bougoure et al., 2005).

Embora, as orquídeas possam apresentar filogeneticamente vários fungos micorrízicos, estes desempenham melhor suas funções com associações específicas

16 (Otero et al., 2007). Algumas plantas são sustentadas por um subconjunto filogeneticamente específico de fungos micorrízicos que são disponibilizados durante todo seu ciclo de vida (Bidartondo & Read, 2008). Portanto verifica-se que em cada etapa da vida da planta esta é colonizada por subconjuntos específicos de fungos micorrízicos (Chen et al., 2012).

Acredita-se que as plantas em que a seleção natural é capaz de agir possuam a característica de escolha de seu parceiro fúngico e assim sua especificidade fúngica (Bruns et al., 2002). Durante a história evolutiva das orquídeas certas linhagens fúngicas foram abandonadas e outras foram favorecidas. Isso implica na existência de linhagens que são mais vantajosas para orquídeas do que outras, e assim elas tenham selecionado dentro da comunidade fúngica o melhor parceiro que supra suas necessidades nutricionais (Rasmussen & Rasmussen, 2009).

Outra hipótese estudada é que os padrões de distribuição geográficos de fungos micorrízicos influenciam na especificidade micorrízica e na diversidade filogenética. Os fungos simbiontes apresentam uma estreita distribuição geográfica, dificultando sua associação com as orquídeas o que vem a induzir a especificidade com a orquídea por não apresentar simbiontes alternativos. Essa especificidade refletiu em uma grande divisão filogenética, mas somente na filogenia do hospedeiro, evidenciando uma relação assimétrica nas associações micorrízicas orquidoides. Uma possível justificativa para essa assimetria está no fato dos fungos micorrízicos de orquídeas não serem dependentes da orquídea para sua dispersão e reprodução, podendo sobreviver não apenas como simbionte, mas também como saprófitas ou parasitas. Portanto é pouco provável que os fungos evoluíram apenas em resposta às orquídeas, já que eles são muito menos limitados na sua escolha de hospedeiro, do que a orquídea que

17 apresenta uma restrição filogenética na escolha de seu simbionte (Jacquemyn et al., 2011; Martos et al., 2012).

Alguns gêneros de orquídeas epífitas e terrestres são extremamente específicos, ou seja, apresentam estreita gama filogenética de fungos micorrízicos (Yuan et al., 2010). Martos et al. (2012) sugerem que associações epífitas são mais conservadoras e podem coevoluir mais do que as terrestres. Essa especialização filogenética mais estreita foi provavelmente ocasionada pelas condições de vida bem mais estressantes em nichos de epífitas do que terrestres. Uma hipótese para isso, está no fato de que os nichos de epífitas forçaram uma maior cooperação entre orquídeas e fungos, pois crescem em condições abióticas extremas como ambiente seco, alta luminosidade e baixa disponibilidade de nutrientes. Por outro lado, os fungos de orquídeas terrestres formam um clado diferente do de epífitas, essa associação entre filogenia e habitat já era esperada, pois muitos grupos de orquídeas mudam seus parceiros micorrízicos de acordo com a mudança de habitat (Mosquera-Espinosa et al., 2012). Por exemplo, os fungos de raízes de Vanilla poitaei obtidos de plantas que se encontravam no solo e na casca da árvore diferiram filogeneticamente de forma significativa entre si (Figura 2), com isso os isolados de Ceratobasidium spp. são mais comuns em raízes obtidas do solo e Tulasnella spp. em raízes obtidas em casca de árvore (Porras-Alfaro & Bayman, 2007; Mosquera-Espinosa et al., 2012). Evidenciando que de acordo com o habitat a diversidade filogenética de fungos que interagem com as orquídeas podem ser diferentes.

18 Figura 2. Filogenia de Ceratobasidium obtida a partir da análise da região ITS dos isolados de orquídeas epífitas e terrestres (Mosquera-Espinosa et al., 2012).

Yuan et al. (2010) relataram que os fungos diferem em sua capacidade de se desenvolver em diferentes condições ecológicas, resultando em mudanças na amplitude filogenética das suas associações micorrízicas para se adaptarem às alterações ambientais. A mudança de simbiontes pela orquídea em novos ambientes tem implicações na conservação ex situ destas que se encontram ameaçadas de extinção. A capacidade da planta em alternar sua associação entre fungos é uma forte adaptação a

19 ambientes severos, demonstrando que as associações entre orquídea e fungo são sensíveis a estímulos ambientais favorecendo a sobrevivência dos simbiontes. A especificidade da orquídea pode limitar a distribuição das espécies e também a capacidade de sobrevivência das plantas transplantadas, no entanto a plasticidade e sua amplitude filogenética adaptável às condições de seu habitat faz com que a conservação

ex situ, e a propagação por meio de micorrização seja possível.

FILOGENIA DE FUNGOS RIZOCTONIOIDES MICORRÍZICOS E

FITOPATOGÊNICOS

Análises filogenéticas separam claramente os táxons de fungos associados a orquídeas dos não associados a estas plantas. Irwin et al. (2007) sugerem que espécies de Ceratobasidium fitopatogênicas são muito diferentes das espécies micorrízicas (Figura 3), pois formam clados distintos. Luzini et al. (2012) também verificaram que espécies de Rhizoctonia micorrízicas de orquídeas do Cerrado pertencem a linhagens diferentes das fitopatogênicas. O que demonstra que o tipo de interação entre fungo e planta pode variar de acordo com as condições ambientais e do hospedeiro, fazendo com que as linhagens fúngicas ancestrais se divergissem formando novas linhagens com caracteres plesiomórficos e apomórficos, caracterizando cada tipo de interação.

20 Figura 3. Árvore filogenética obtida a partir da análise da região ITS. A- Isolados fitopatogênicos, B e C – Isolados micorrízicos (Irwin et al., 2007).

Mosquera-Espinosa et al. (2012) demonstraram que Thanatephorus formou um clado (Figura 2) dentro de Ceratobasidium corroborando a hipótese de que esse gênero é parafilético como relatado por Porras-Alfaro & Bayman (2007). Este clado é composto principalmente por fungos fitopatogênicos incluindo um importante patógeno do arroz da Colômbia, mas inclui também isolados micorrízicos da Colômbia e Porto Rico, Ceratobasidium que estimularam a germinação de sementes de orquídeas.

Isolados de Thanatephorus cucumeris fase anamórfica de Rhizoctonia

21 seringueira e de outras espécies cultivadas da região Amazônica, foram caracterizados filogeneticamente para distinção de AGs. A inferência filogenética de Thanatephorus sp. e Ceratobasidium spp. pela região ITS é considerada uma feramenta confiável na distinção de AGs. Com este estudo obteve-se um novo grupo de R. solani (AG-2-2 Hb) que é o principal agente causal da mancha areolada em seringueira, e distinguiu-se a presença de outros grupos de anastomose que também a infectavam, bem como de

Ceratobasidium sp. (AG-R). Com a distinção dessa grande diversidade de AGs obtida

por meio da caracterização filogenética foi possível perceber a necessidade de obtenção de clones resistentes a mais de um AG (Gaino et al., 2010).

BIOCONTROLE DE FITOPATÓGENOS Mecanismos de defesa das plantas contra fitopatógenos

Na fitopatologia a resistência é a regra, e a suscetibilidade é a exceção, isso acontece devido a ação dos mecanismos de defesa das plantas contra fitopatógenos (Agrios, 2005). Por isso, as plantas possuem resistência para a maioria dos microrganismos, e isto é referido como imunidade inata que é garantida por mecanismos de resistência não-hospedeiro (Camargo, 2011) .

O sistema de imunidade inata da planta é a primeira linha de defesa contra fitopatógenos, que é capaz de reconhecer moléculas específicas de microrganismos. Os sistemas de imunidade inata da planta podem reconhecer padrões moleculares associados a micróbios chamados atualmente de MAMPs (Microbe-Associated

Molecular Patterns), ou PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns, no caso de

patógenos), que são estruturas dos microrganismos que são reconhecidas pelas plantas através de regiões específicas. Portanto, os MAMPs ativam os mecanismos de defesa após seu reconhecimento pelo hospedeiro (Bent & Mackey, 2007; Resende et al., 2010).

22 Os MAMPs são reconhecidos por receptores de reconhecimento padrão denominados de PRRs (Pattern Recognition Receptors) ancorados nas membranas das plantas. Os PRRs são capazes de reconhecer moléculas características que identificam classes de micróbios ou plantas. Na interação planta-fungo, os PRRs são capazes de reconhecer MAMPs como a quitina, e além disso, reconhecem os oligogalacturonídeos (ogas), que são os únicos MAMPs provenientes de plantas (Boller & Felix, 2009).

A percepção dos MAMPs é a primeira barreira de imunidade inata da planta, que é chamada de imunidade disparada por PAMP ou PTI (PAMP-Triggered

Immunity). Por outro lado, os microrganismos possuem proteínas efetoras que são

produzidas dentro do hospedeiro e que suprimem PTI, permitindo o sucesso da colonização pelo patógeno. Mas também, existem alguns exemplos, em que proteínas intracelulares da planta reconhecem os efetores ou proteínas alvo modificadas do patógeno e ativam a resposta imune que é mais rápida, prolongada e robusta do que o sistema PTI, resultando na imunidade disparada por efetor ou ETI: Effector-Triggered

Immunity (Jones & Dangl, 2006; Boller & He, 2009; Thomma et al., 2011).

As plantas possuem mecanismos de defesa em relação à infecção por microrganismos que são ativados após o contato planta-patógeno, conhecidos como mecanismos ativos de defesa, com a finalidade de suprimir o fitopatógeno (Tumelero et al., 2011).

Os mecanismos de defesa das plantas são divididos em pré-formados, isto é, presentes na planta antes do contato com o patógeno desafiador, e os pós-formados, que são produzidos ou ativados em resposta à presença do fitopatógeno (Pascholati et al., 2008). Como os mecanismos pré-formados (resistência constitutiva) são produzidos independentemente da presença do patógeno, isso representa um custo energético a mais para a planta. Por outro lado, os mecanismos pós-formados apresentam um sistema de

23 defesa latente que pode ser ativado, com o objetivo de economizar energia, apenas na presença do patógeno e/ou de um indutor de resistência biótico ou abiótico (Pascholati & Kuhn, 2006).

Os dois mecanismos citados ainda subdividem-se em estruturais e bioquímicos. Nos pré-formados estruturais tem-se a formação da cutícula, tricomas, estômatos, fibras e vasos condutores, e nos bioquímicos são produzidos fenóis, alcalóides, lactonas, glicosídeos, glicosídeos fenólicos e cianogênicos, e inibidores proteicos. Nos pós-formados estruturais destacam-se papilas, halos, lignificação, camadas de cortiça e tiloses, e nos bioquímicos fitoalexinas, proteínas relacionadas a patogênese (PRPs), glicoproteínas e inibidores de protease (Pascholati et al., 2008).

Algumas plantas podem detectar o ataque do patógeno na superfície ou no interior dos tecidos através de moléculas de reconhecimento denominadas de indutores de defesa. Estes indutores podem ser específicos, produzidos com relação estreita entre o patógeno e o hospedeiro, ou não específicos que são ativados por genes que codificam várias respostas relacionadas à defesa (Pascholati et al., 2008).

Principais mecanismos de controle biológico de doenças por fungos incluindo micorrízicos

Os agentes de biocontrole podem atuar diretamente, e também indiretamente pela indução de mecanismos de defesa das plantas no controle de doenças fúngicas de plantas (Doohan, 2005). E uma das principais estratégias do controle biológico para se aumentar a durabilidade da resistência e reduzir os resíduos tóxicos produzidos pelo uso indiscriminado de agrotóxicos é a utilização de indutores bióticos e abióticos de resistência (Filippi et al., 2011).

24 Os fungos de controle biológico são organismos benéficos que reduzem os efeitos negativos dos fitopatógenos e promovem respostas positivas nas plantas. Estes fungos de biocontrole não somente controlam doenças de plantas mas também promovem resistência a estresses abióticos melhorando a capacidade fotossintética, e ainda aumentam a eficiência de uso do nitrogênio pelas plantas. Como consequência as plantas tratadas com estes fungos podem produzir mais e de uma maneira mais sustentável. Todos estes benefícios dos fungos de biocontrole são devido a capacidade deles de reprogramar a expressão de genes na planta, provavelmente através da ativação de um número limitado de rotas metabólicas na planta (Shoresh et al., 2010).

Existem diferentes mecanismos para que um organismo possa exercer o controle biológico sobre patógenos, e os mais estudados são: competição, antibiose, hiperparasitismo, indução de resistência, alelopatia, e hipovirulência (Mizubuti & Maffia, 2009). Nesta revisão serão abordados somente a antibiose e a indução de resistência por serem os mecanismos mais encontrados na interação fungos micorrízicos-planta-patógeno.

Antibiose

É a produção, por parte de um microrganismo, de compostos tóxicos como antibióticos e bacteriocinas para outros microrganismos inibindo assim o crescimento podendo até matar os patógenos. A antibiose é um dos métodos mais estudados de antagonismo de fitopatógenos (Mizubuti & Maffia, 2009).

Fungos antagonistas de fitopatógenos foram obtidos em vários patossistemas de sistemas radiculares como Thichoderma harzianum para Rhizoctonia

solani, Fusarium sp., Armillaria sp., e parte aérea para Venturia sp. e Botrytis sp.

25

rolfsii, Rhizoctonia tuliparum e Sclerotinia sclerotiorum (Melo & Azevedo, 1998;

Silva et al., 1999; Remuska & Pria, 2007). Além disso, a antibiose com fungos e bactérias também foi um mecanismo de biocontrole de Magnaporthe oryzae em arroz (Kawamata et al., 2004; Araújo et al., 2010; Gonçalves et al., 2012; Filippi et al., 2011; Li et al., 2011). Carvalho et al. (2012) verificaram que o isolado de Rhizoctonia sp. (En07) multinucleado obtido da orquídea nativa do cerrado Epidendrum nocturnum apresentou maior halo de inibição in vitro para M. oryzae (Tabela 1). Souza (2012) também verificou que este isolado foi o melhor para germinar as sementes in vitro de

Cyrtopodium saintlegerianum com 81,64 e 90,73% de germinação em dois

experimentos. Além disso, Silva et al. (2012) observaram que este mesmo isolado ainda promoveu maior crescimento das plântulas de C. saintlegerianum após seis meses de micorrização ex vitro do fungo no esfagno.

Indução de resistência

Os uso fungicidas ainda é um dos métodos mais eficazes para o controle de doenças causadas por oomicetos e fungos verdadeiros. Entretanto a legislação está limitando e reduzindo o seu uso, e este deve ser realizado no manejo integrado de doenças. Além disso, está também estimulando a identificação de técnicas adicionais e ambientalmente melhores para o controle dessas doenças. Entre estas a indução de resistência é duradoura, de amplo espectro e controla as doenças através da ativação dos mecanismos de defesa da própria planta (Buonaurio et al., 2009). O primeiro trabalho de indução de resistência foi realizado por Beauverie (1901) no qual obteve-se proteção contra Botrytis cinerea através da aplicação de um isolado atenuado do mesmo fungo.

A indução de resistência pode ser localizada ou sistêmica, e induzida por patógenos, microrganismos avirulentos, microrganismos não patogênicos e alguns produtos químicos (Walters & Fountaine, 2009). Muitas alterações bioquímicas,

26 citológicas e moleculares estão associadas com a indução de resistência em plantas que estão sistematicamente protegendo contra doenças fúngicas. Tais mudanças provavelmente podem diretamente ou indiretamente serem responsáveis pela resistência. Entre estas tem-se as alterações na parede celular, a produção de fitoalexinas, de PRPs e a reação de hipersensibilidade. Os mecanismos de defesa em plantas que ocorrem na indução de resistência contra patógenos fúngicos são semelhantes aos mecanismos usados pela planta que mostram resistência gene-a-gene e não hospedeira, e são baseados no desenvolvimento de barreiras estruturais e bioquímicas após a indução e/ou inoculação desafiadora (Buonaurio et al., 2009).

Respostas de defesa de plantas são coordenadas por pequenas moléculas que são sinais que coordenam a expressão de genes que codificam proteínas e compostos relacionados a defesa (Jones & Dangl, 2006). Entre estas moléculas os fitohormônios ácido jasmônico (AJ), ácido salicílico (AS), ácido abscísico (ABA) e etileno (ET) possuem muita importância (Pieterse et al., 2009).

Rotas de sinalização envolvidas na indução de resistência sistêmica

De acordo com Walters et al. (2007) e Pieterse et al. (2009), Existem pelo menos três tipos de resistência sistêmica caracterizados, que são efetivos contra fitopatógenos biotróficos e necrotróficos: resistência sistêmica adquirida (SAR), resistência sistêmica induzida (ISR) e resistência induzida pelo ácido β-aminobutírico (BABA-IR). As rotas metabólicas que desencadeiam ou controlam estes sistemas e as respostas de defesa a eles associadas encontram-se bem caracterizados em Arabidopsis

thaliana (Van der Ent et al., 2008; Pieterse et al., 2009), conforme ilustrado na Figura 4.

SAR, é dependente de AS, pode ser induzida por patógenos causadores de necrose, e por tratamentos químicos tais como Acibenzolar-S-Metil (ASM) que estão associados

27 ao acúmulo de PRPs, e reguladas pela proteína NPR1 (Durrant & Dong, 2004). ISR pode ser induzida por microrganismos benéficos como rizobactérias (Van Loon et al., 1998) e pelo fungo Trichoderma spp. (Van der Ent et al., 2009), não requer a presença de AS, podendo ocorrer sem a produção PRPs, mas é dependente de AJ, ET e de NPR1 (Pieterse et al., 1998). Por outro lado, a rota metabólica de BABA-IR depende da presença de AS e ABA (Zimmerli et al., 2001). Conforme, Pieterse et al. (2005) SAR parece constituir-se em um aumento das defesas dependentes de AS, enquanto ISR parece ser baseada em um aumento da defesas dependentes de AJ e ET.

Embora exista exceções, geralmente os fungos biotróficos são mais sensíveis às defesas induzidas e mediadas por AS, tais como SAR, enquanto os fungos necrotróficos são controlados mais pelas defesas mediadas por AJ e ET como ISR (Glazebrook, 2005). Por outro lado, BABA-IR é efetivo por controlar tanto fungos biotróficos quanto necrotróficos (Walters & Fountaine, 2009).

É importante também observar que há comunicação entre as rotas de sinalização pelos fitohorônios citados, e isso é um mecanismo poderoso de regulação na planta (Pierterse et al., 2009). Como ilustrado na Figura 4, as interações entre estas rotas podem ser mutualmente antagonistas ou sinergistas, proporcionando efeitos funcionais positivos e negativos. Com isso a planta minimiza os custos energéticos e segue sinalizações flexíveis fazendo com que o hospedeiro se defenda de um invasor (Van der Ent et al., 2008; Pieterse et al., 2009). De acordo com o tipo do desafiador uma rota de sinalização prevalecerá sobre as demais (Jung et al., 2012). Portanto, dependendo da interação planta-patógeno-agente de controle biológico, mais de um fitohormônio será produzido conferindo uma maior proteção da planta, e são necessárias pesquisas sobre estes fitohormônios para saber qual mecanismo prevalecerá.

28 Interação positiva:

Interação negativa:

Figura 4. Transdução de sinais em Arabidopsis thaliana que controlam a resistência sistêmica adquirida (SAR), resistência sistêmica induzida (ISR) e a resistência induzida pelo ácido β-aminobutírico (BABA-IR). ABA – Ácido abscísico; ASM – Acibenzolar-S-Metil; BABA - β-aminobutírico; ET – Etileno; IBS – Indução de BABA; INA – Ácido 2,6-dicloroisonicotínico; JA- Ácido jasmônico; NPR1 – Não expressor de genes PR1; AS – Ácido salicílico. Caixas de texto e linhas pretas, cinza claro e cinza escuro são rotas de ISR, SAR e BABA-IR, respectivamente. Adaptado de Buonaurio et al. (2009).

Rhizobacteria Trichoderma spp. ASM, INA, AS Patógenos causadores de necrose

BABA

AJ

ET

AS

ISR SAR BABA-IR

AJ AS ET ABA IBS 2; IBS3

29 Indução de resistência por fungos rizoctonioides, incluindo micorrízicos contra fitopatógenos fúngicos

Estudos iniciais sobre micorrizas mostraram que estas melhoram o crescimento e/ou a produtividade das plantas micorrizadas, e isso inicialmente foi atribuído exclusivamente ao melhoramento nutricional da planta (Linderman, 1994). Mais tarde outros autores reportaram que isso era devido à maior tolerância das plantas micorrizadas a estresses abióticos tais como seca, salinidade ou presença de metais pesados (Miransari, 2010; Simith et al., 2010). Evidências também foram acumuladas para maior resistência das plantas micorrizadas a um grande número de fungos do solo, bactérias fitopatogênicas, nematóides e insetos-praga (Azcón-Aguilar & Barca, 1997; Whipps, 2004). Entretanto somente na última década que a indução de resistência contra fitopatógenos utilizando fungos micorrízicos foi estudada (Pozo & Azcón-Aguilar, 2007; Campos-Soriano et al., 2012).

Os gêneros fúngicos Ceratobasidium e Thanatephorus (Agaricomicotina, Cantharellales) incluem várias estratégias tróficas como fitopatógenos, saprófitas e também simbiontes micorrízicos de orquídeas (Agrios, 2005; Moncalvo et al., 2006)

Rhizoctonia também inclui espécies com teleomorfos em Ceratobasidium

os quais possuem hifas com células binucleadas chamadas de RBN que é oposto às células multinucleadas de Thanatephorus (Mosqueira-Spinosa et al., 2012). No Brasil, RBN foram isoladas, pela primeira vez na década de 90, em áreas agrícolas de São Paulo cultivadas com amendoim, feijão e soja (Ceresini et al., 1996; Ceresini & Souza, 1997; Fenille, 2001; Fenille et al., 2002).

Algumas espécies de Ceratobasidium são micorrizas simbiontes, cujas sementes requerem associação com o fungo micorrízico para obter nutrição suficiente

30 para germinação (Otero et al., 2002). As micorrizas de orquídeas são diferentes dos outros tipos de micorrizas, em que o fungo provavelmente recebe pouco ou nada da planta (Rasmussen & Rasmussen, 2009; Selosse & Roy, 2009). Não está claro como estes fungos ganham e repassam carbono para orquídeas podendo ser parasitas, saprófitas ou associarem a micorrizas de outras plantas. O entendimento das estratégias nutricionais de micorrizas de orquídeas podem levar a novas estratégias de conservação das orquidáceas, a maior família de plantas que inclui muitas espécies raras e que podem ser extintas (Flanagan et al., 2006; Clements et al., 2011).

Por outro lado, outras espécies de Ceratobasidium são patógenos de plantas, mas algumas não patogênicas foram usados para o biocontrole de patógenos de solo (Burns & Benson, 2000; Sneh et al., 2004) e de parte aérea (Xue et al., 1998; Jabaji-Hare & Neate, 2005). Isolados de Rhizoctonia spp. não patogênicas, hipovirulentas e RBN obtidas do solo e de outras partes da planta foram usados para o biocontrole de R.

solani, Pythium ultimum, Alternaria macrospora, Colletotrichum lindemuthianum e P. ultimum var. Sporangiiferum, em várias culturas tais como: algodão, soja, rabanete, Catharanthus roseus, Agrostis stolonifera, pepino, feijão, batata, milho, trigo, Capsicum annum, Celosia argentea e Poinsetia (Tabela 1). Os resultados de pesquisas

com RBN, citados na Tabela 1 demonstraram que os principais mecanismos de controle biológico envolvidos em vários patossistemas são competição por nutrientes e/ou indução de resistência, também chamada de proteção cruzada. Os mecanismos envolvidos na indução de resistência pelas RBN foram alterações bioquímicas ocorridas nas células das plantas. Destas , destacaram-se a produção de fitoalexinas, de PRPs como quitinases, β-1,3-glucanases e peroxidases. Entretanto, a maioria dos trabalhos citados na Tabela 1 não identificaram as rotas responsáveis pela indução de resistência. De acordo com Jabaji-Hare & Neate (2005) um fator importante na demonstração da

31 ISR por RBN é a separação espacial entre o agente de biocontrole e a inoculação desafiadora com o patógeno. Na tabela citada, verificou-se também que as RBN protegeram as plantas mais dos patógenos de solo e raiz, com poucos trabalhos de uso das mesmas para patógenos foliares, mas para estes poucos trabalhos os resultados foram também promissores.

Até o momento um dos únicos trabalhos encontrado na literatura sobre uso de fungos rizoctonioides micorrízicos de orquídeas utilizados no biocontrole de fitopatógenos foi o realizado por Mosquera-espinosa et al. (2012). Estes autores avaliaram a patogenicidade de isolados micorrízicos de orquídeas de Ceratobasidium spp. em arroz e verificaram que alguns dos isolados produziram sintomas de queima da bainha em arroz, mas com incidência significativamente menor do que na testemunha (R. solani) que apresentou 85% de incidência. Não houve diferença entre os isolados de de orquídeas Ceratobasidium spp. e Tulasnella spp. quanto a incidência de queima da bainha. A severidade de queima da bainha pelos isolados de Ceratobasidium spp. de orquídeas variou de 0,3 a 1,4% diferindo estatisticamente da testemunha que apresentou severidade de 34,5%. Os mesmos autores também estudaram o biocontrole de R. solani em plantas de arroz com isolados de Ceratobasidium spp. de orquídeas e verificaram que quando os isolados foram pulverizados em plântulas de arroz três dias antes da inoculação desafiadora houve redução significativa da severidade da doença.

Muitos dos trabalhos citados na Tabela 1 em que foram obtidos resultados promissores na supressão de fitopatógenos com RBN e fungos rizoctonioides micorrízicos, concluíram que são necessários estudos posteriores para se avaliar a patogenicidade destes isolados em outras culturas. Além disso, também afirmam que são necessários estudos para verificar se os mecanismos de resistência sistêmica agem

32 sozinhos ou em conjunto utilizando técnicas moleculares de expressão gênica dos genes envolvidos nos referidos mecanismos.

Tabela 1. Mecanismos de biocontrole dos agentes de controle biológicos fúngicos rizoctonioides incluindo micorrízicos em vários patossistemas.

Agente de biocontrole fúngico

Origem Patógeno Hospedeiro Mecanismo de biocontrole Referência Rhizoctonia sp. binucleada Festuca arundinacea Rhizoctonia solani Feijão Indução de resistência Cardoso & Echandi (1987a) Rhizoctonia spp. binucleada Alguns de solo e outros de locais desconhecidos

R. solani Feijão - Cardoso &

Echandi (1987b)

Rhizoctonia sp.

binucleada

- R. solani Batata - Escande &

Echandi (1991) Rhizoctonia sp. binucleada - Pythium ultimum var. sporangiiferum Capsicum annum e Celosia argentea - Harris et al. (1993) Rhizoctonia spp. binucleada R. solani Capsicum annum - Harris et al. (1994) Rhizoctonia sp. binucleada

- R. solani Soja Indução de

resistência Poromarto et al. (1998) Rhizoctonia sp. binucleada - Pythium ultimum Catharanthus roseus - Burns & Benson (2000) Rhizoctonia sp. binucleada R. solani Poinsétia (Euphorbia pulcherrima)

ISR Hwang & Benson (2003)

Rhizoctonia sp.

binucleada

Soja R. solani Soja - Khan et al.

(2005) Rhizoctonia spp. binucleada não patogênica Agrostis sp.; Poa sp.; Stenotaphrum sp. R. solani Agrostis stolonifera - Burpee & Goulty (1984)

33

Rhizoctonia sp.

binucleada não patogênica

Solo e trigo R. solani Pepino -

Villajuan-Abgona et al. (1996) Rhizoctonia spp. binucleada não patogênica - R. solani; Colletotrichum lindemuthianum Feijão Indução de resistência – Aumento de PRPs Xue et al. (1998) Rhizoctonia spp. binucleada não patogênica Solo, trigo, Primula sp. R. solani; Alternaria macrospora

Algodão ISR Jabaji-Hare

& Neate (2005)

Rhizoctonia sp.

binucleada não patogênica

- R. solani Feijão - Wen et al.

(2005) Rhizoctonia spp. binucleada não patogênica Amendoim, soja e feijão

R. solani Soja Indução de

resistência Basseto et al. (2008) Rhizoctonia spp. binucleada hipovirulenta

Solo R. solani Milho ISR Pascual et

al. (2000)

Rhizoctonia

spp.

hipovirulenta

Solo R. solani Rabanete - Sneh et al.

(2004)

R. solani não

patogênica

Solos Rhizoctonia spp. Algodão,

trigo e rabanete ISR Ichielevich-Auster et al. (1985) Rhizoctonia spp. não patogênica

Solos R. solani Pepino Indução de

resistência Sneh & Ichielevich-Auster et al. (1998) Rhizoctonia sp. (micorrízico) Epidendrum nocturnum Magnaporthe oryzae

Arroz Antibiose Carvalho et al. (2012) Ceratobasidium spp. (micorrízico) Orquídeas (66 espécies)

R. solani Arroz -

Mosquera-Espinosa et al. (2012) ISR: Indução de resistência sistêmica; PRPs: Proteínas relacionadas a patogênese (Peroxidase; β-1,3-glucanase e quitinase); - não encontrado.

34 Indução de resistência por fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) contra fitopatógenos fúngicos

As associações de FMAs promovem mudanças significantes no próprio ambiente como na rizosfera alterando a estrutura do solo, o conteúdo de carbono no solo e a diversidade microbiana. As mudanças na comunidade microbiana da rizosfera podem influenciar indiretamente o resultado das interações com outros organismos incluindo patógenos e microrganismos benéficos (Cipollini et al., 2012; Effmert et al., 2012). Assim como ocorrem mudanças na rizosfera também há várias modificações dentro das plantas. Tais variações podem ser na arquitetura, no perfil metabólico, no acúmulo de compostos de defesa como fitohormônios, compostos fenólicos e espécies reativas de oxigênio (López-Ráez et al., 2010a, b.).

Como os FMAs são simbiontes obrigatórios eles se assemelham aos patógenos biotróficos e são capazes de acionar as respostas de defesas nas plantas nos estágios inicais (Paszkowski, 2006). Para o sucesso da colonização, o fungo tem que suportar estas reações e modular ativamente as respostas da planta. Esta modulação pode resultar no pré-condicionamento ou priming dos tecidos para a ativação eficiente dos mecanismos de defesa após o ataque do desafiador (Pozo & Azcón-Aguilar, 2007). Verificou-se também em alguns trabalhos que o pré-condicionamento das respostas da planta por microrganismos benéficos, incluindo FMAs tem como principal rota de sinalização a do AJ que é um mecanismo de ISR (Van der Ent et al., 2009a; Pozo et al., 2010).

35 Regulação do sistema imune da planta hospedeira por FMAs

Uma associação micorrízica funcional requer um alto grau de coordenação entre o hospedeiro e o fungo. O fungo tem que regular o sistema imune e os mecanismos de defesa da planta para o sucesso da colonização (Kloppholz et al., 2011; Zamioudis & Pieterse, 2012). Dos estágios pré-simbióticos até uma associação bem estabelecida com FMAs os mecanismos de defesas da planta são altamente regulados para controlar a simbiose. E esta regulação tem efeito direto sobre os patógenos de raízes (Jung et al., 2012).

Durante os estágios iniciais da interação, as plantas reconhecem a presença dos FMAs, ativando algumas respostas relacionadas à defesa que serão subsequentemente suprimidas (Garcia-Garrido & Ocampo, 2002; Liu et al., 2003). Antes da penetração das raízes, os fungos acionam o sistema imune das plantas como um patógeno biotrófico (Paszkowski, 2006). Na fase inicial da colonização, a produção de strigolactona (SL) é alta. No início, o FMA é reconhecido como um organismo estranho o que aumenta os níveis de AS nas raízes. Depois do estabelecimento da simbiose, a produção de SL e AS é diminuída enquanto a do AJ é aumentada (Figura 5). Também há um acúmulo de compostos de defesa como espécies reativas de oxigênio, enzimas hidrolíticas e ativação de rotas de fenilpropanóides (Dumas-Gaudot 2000; De Román et al., 2011). Estas reações são temporariamente e espacialmente limitadas comparadas às reações durante a interação planta-patógeno, sugerindo um papel importante da simbiose no biocontrole (Garcia-Garrido & Ocampo, 2002). Certamente a sinalização de AS tem um efeito negativo na colonização de FMAs (De Román et al., 2011), e o estabelecimento dos FMAs também requer a inibição de certas respostas

36 reguladas por AS, e isso já foi demonstrado também por outros simbiontes mutualistas (Soto et al., 2009; Dumas-Gaudot, 2000).

Estudos de como os FMAs invadem e manipulam o sistema imune dos hospedeiros mostraram que estes fungos podem suprimir as vias de defesa por AS por secretarem proteínas efetoras que interferem no sistema imune (Campos-Soriano et al., 2010; Kloppholz et al., 2011). Não somente o AS, mas o nível de outros fitohormônios relacionados a defesa tais como AJ, ABA e ET, são alterados durante a interação planta-FMAs (Hause et al., 2007; López-Ráez et al., 2010b; Ludwig-Müller, 2010). Certamente com o progresso da colonização a regulação de AJ tem um papel importante no funcionamento correto da simbiose por FMAs (Hause et al., 2007; Hause & Schaarschmidt, 2009). A resistência induzida é geralmente manifestada somente quando a simbiose com FMAs está bem estabelecida, portanto as mudanças na sinalização também ocorrerão quando essa simbiose estiver bem estabelecida, e isso é denominado de indução de resistência por micorriza – FMAs ou MIR: Mycorrhiza-Induced

Resistance (Pozo et al., 2002).

Deve-se ressaltar que as mudanças hormonais associadas a simbiose dependem também do tipo de FMA envolvido na mesma (López-Ráez et al., 2010b). Estas diferenças podem se correlacionar com as diferentes capacidades das várias espécies de FMAs de induzir resistência (Pozo et al., 2002). Portanto o nível de proteção conferido pela micorrização é altamente dependente do fungo empregado na simbiose.

Nota-se então que a dependência do sucesso da micorrização no controle da sinalização de AJ e AS pode explicar a variação na proteção conferida pela simbiose (Pozo & Azcón-Aguilar, 2007; Pozo et al., 2009). Portanto, as plantas em simbiose com

37 FMAs são mais resistentes a patógenos necrotróficos cuja sinalização é dependente de AJ, e são mais suscetíveis a patógenos biotróficos nos quais as defesas são reguladas por AS. Este padrão correlaciona-se com a ativação das defesas dependentes de AJ e repressão das respostas sinalizadas por AS quando a simbiose está bem estabelecida (Jung et al., 2012; Figura 5).

Verifica-se que dependendo do indutor de resistência (FMA) e do desafiador uma rota de sinalização será utilizada para supressão da doença e que esta será melhor controlada por FMAs para patógenos necrotróficos, através da ISR.

Pré-condicionamento de respostas de defesa dependentes de ácido jasmônico na indução de resistência por FMAs

A indução de resistência não necessariamente requer a ativação direta de mecanismos de defesa, mas também pode ter ação indireta que resulta de uma sensibilização do tecido após o estímulo apropriado de expressar os mecanismos de

Figura 5. Alterações hormonais nas raízes associadas à simbiose com fungos micorrízicos arbusculares (FMAs). SLs - strigolactonas; AS – Ácido salicílico e AJ - Ácido jasmônico. Adaptado de Jung et al. (2012).

38 defesa mais eficientemente após o ataque do patógeno. Este pré-condicionamento do sistema imune inato da planta é comum após a interação com microrganismos benéficos, e tem papel importante na vantagem adaptativa comparados com os métodos de ativação direta de defesa (Conrath et al., 2006; Van Hulten et al., 2006; Van Wees et al., 2008).

A Figura 6 mostra como ocorre a regulação dessas rotas de sinalização envolvidas no pré-condicionamento por FMAs. Em plantas não micorrizadas o sinal ativa a rota dependente de AJ e leva a ativação de genes de defesa em tecidos locais e sistêmicos. Por outro lado em plantas micorrizadas a resposta sinal é amplificada levando ao pré-condicionamento da resposta de defesa (Jung et al., 2012).

A indução do pré-condicionamento está associada com o acúmulo moderado de moléculas regulatórias relacionadas a defesa tais como fatores de transcrição ou MAP quinases (Pozo et al., 2008; Beckers et al., 2009; Van Der Ent et al., 2009b). Por exemplo na indução de resistência por rizobactéria em Arabidopsis foi dependente de pré-condicionamento do AJ através da acumulação do fator de transcrição MYC2, que é um fator muito importante na regulação das respostas de AJ (Pozo et al., 2008).

Os estudos iniciais mostraram que o pré-condicionamento de plantas micorrizadas com FMAs ocorreram em raízes (Benhamou et al., 1994). Entretanto observou-se que a ISR por FMAs, também ocorre em outras partes das plantas e para vários fitopatógenos (Tabela 2).

Verificou-se que muitos dos trabalhos citados na Tabela 2 ao contrário dos obtidos pelas RBN identificaram os mecanismos envolvidos na indução de resistência