Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s

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Introdu¸cão Genômica Genética Schadt et al. (2003) Considera¸cões Finais

Sum´

ario

1 Introdu¸c˜ao

Mapeamento de QTL’s Microarranjos de DNA

Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL’s 2 Genˆomica Gen´etica

Jansen e Nap (2001) eQTL Exemplo: Jansen (2003) 3 Schadt et al. (2003) Camundongos Milho Humanos

4 Considera¸c˜oes Finais Desafios Atuais Perspectivas Softwares dispon´ıveis

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Introdu¸c˜ao

Genômica Genética Schadt et al. (2003) Considera¸cões Finais

Mapeamento de QTL’s

Microarranjos de DNA

Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL’s

Introdu¸c˜

ao

QTL’s (”Quantitative Trait Loci”) são regiões cromossômicas que influenciam a varia¸cão de caracteres quantitativos.

Mapeamento de QTL’s: estimar número de locos, posi¸cão, efeitos e intera¸cão (epistasia) entre regiões.

O conceito de mapeamento é relativamente antigo (Sax, 1923; Thoday, 1961), porém publica¸cões sobre este tema tornaram-se mais freqüentes a partir de 1990.

As principais raz˜oes para o aumento das publica¸c˜oes:

Amplo desenvolvimento e utiliza¸cão dos marcadores moleculares; Desenvolvimento de metodologias para constru¸cão de mapas de liga¸cão (Lander e Green, 1987);

Desenvolvimento de metodologias capazes de mapear QTL’s eficientemente (Lander e Botstein, 1989);

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

Mapeamento de QTL’s: Adaptado de Doerge (2002)

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

Acreditava-se nesta época que a descoberta de QTL’s levariam rapidamente ao descobrimento dos genes que envolvidos no controle genético de caracteres quantitativos de importância econômica.

Contudo, esta expectativa n˜ao foi confirmada!

Flint et al. (2005) citam que no banco de dados do NCBI apenas 20 genes candidatos foram identificados em roedores, enquanto havia 2750 QTL’s.

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

Wayne e McIntyre (2002) comentam que a principal dificuldade em caminhar do n´ıvel de QTL para n´ıvel de genes deve-se a ausˆencia de metodologias que permitam este tipo de estudo.

O controle genético de caracteres quantitativos está associado a inúmeros locos, mas trabalhos de comprova¸cão e valida¸cão somente são viáveis para um número reduzido de genes.

Logo, necessitam-se avan¸cos para a deteçcão de genes, e não para a deteçcão em QTL’s (Flint et al., 2005).

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

Mapeamento de QTL’s: Adaptado de Doerge (2002)

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

Os avan¸cos obtidos nas ´areas de genˆomica, permitiram o desenvolvimento da tecnologia de microarranjos de DNA.

Um microarranjo de DNA (chip de DNA) consiste em um arranjo pré-definido de moléculas de DNA quimicamente ligadas à uma superf´ıcie sólida.

Isto permite a deteçcão e quantifica¸cão de ácidos nucléicos (mRNA na forma de cDNA) quando hibridizadas com o DNA fixado no array (hibrida¸cão por complementariedade de bases).

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

Microarranjos de DNAFonte: Karp (2005)

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

Microarranjos de DNAFonte: http://en.wikipedia.org/wiki/DNA microarray

Exemplo de chip de DNA contendo a express˜ao de aproximadamente 40000 cDNAs 10 / 56

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

A principal contribui¸cão desta tecnologia é a possibilidade de estudar a expressão simultânea de milhares de genes.

Wayne e McIntyre (2002) comentam que o estudo de express˜ao gˆenica combinada com marcadores moleculares trata-se de uma valiosa

ferramenta que permitiriam o entendimento de caracteres quantitativo em n´ıvel gˆenico.

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

Microarranjos de DNAFonte: http://en.wikipedia.org/wiki/DNA microarray

cDNA cor comp. de onda (µm)

1 verde 500 2 amarelo 565 3 verde 542 4 vermelho 700 5 vermelho 666 6 amarelo 587 . . . ... ... 10000 verde 508

Resultado hipotético para um experimento de microarranjos de DNA: A expressão gênica é interpretada como variável quantitativa.

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

Combina¸c˜ao de microarranjos de DNA com mapeamento de QTL’s

ind. cDNA - comp. de onda (µm)

1 2 3 4 5 6 ... 10000 1 500 565 542 700 666 587 ... 508 2 605 618 627 613 692 526 . . . 624 3 696 552 577 701 573 563 . . . 563 4 577 600 595 612 664 624 . . . 526 . . . ... ... ... ... ... ... ... n 616 594 562 502 544 617 . . . 662

Representa¸cão de uma popula¸cão segregante composta por n indiv´ıduos e com fenotipagem através de m cDNAs.

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

ind. Fen´otipos Marcadores Moleculares

Alt.(cm) Prod.(g) NR T. ´Oleo (gkg−1) A B C . . .

1 113 55 17 48 aa BB Cc . . . 2 103 62 13 51 AA BB cc . . . 3 98 49 10 33 Aa bb cc . . . 4 127 67 15 69 Aa Bb cc . . . . . . ... ... ... ... ... ... ... 100 111 72 12 43 aa Bb CC . . .

Popula¸c˜ao para mapeamento de QTL’s considerando algumas caracter´ısticas fenot´ıpicas (agrˆonomicas) e diversos marcadores moleculares.

(15)

Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

ind. cDNA Marcadores Moleculares

1 2 3 4 A B C . . . 1 500 565 542 700 aa BB Cc . . . 2 605 618 627 613 AA BB cc . . . 3 696 552 577 701 Aa bb cc . . . 4 577 600 595 612 Aa Bb cc . . . . . . ... ... ... ... ... ... ... 100 616 594 562 502 aa Bb CC . . .

Popula¸c˜ao para mapeamento de QTL’s considerando algumas caracter´ısticas fenot´ıpicas obtidas com microarranjos de DNA e diversos marcadores moleculares.

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

ind. cDNA Fen´otipos Marcadores Moleculares 1 2 3 4 Alt.(cm) Prod.(g) NR T. ´Oleo A B C . . . 1 500 565 542 700 113 55 17 48 aa BB Cc . . . 2 605 618 627 613 103 62 13 51 AA BB cc . . . 3 696 552 577 701 98 49 10 33 Aa bb cc . . . 4 577 600 595 612 127 67 15 69 Aa Bb cc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 616 594 562 502 111 72 12 43 aa Bb CC . . .

Popula¸c˜ao para mapeamento de QTL’s considerando algumas caracter´ısticas fenot´ıpicas (agronˆomicas e microarranjos de DNA) e diversos marcadores moleculares.

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Introdu¸c˜ao

Introdu¸c˜

ao

Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL’sFonte: Schadt et al. 2003

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Introdu¸c˜ao

Genˆomica Gen´etica

Schadt et al. (2003) Considera¸c˜oes Finais

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Exemplo: Jansen (2003)

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

Jansen e Nap (2001) foram os primeiros autores que reconheceram o potencial de aplicar mapeamento de QTL’s em dados de microarrays.

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

Jansen e Nap (2001) propõem a reconstru¸cão de rotas metabólicas (”networks”), a partir da associa¸cão entre marcadores e cDNA.

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

Jansen e Nap (2001)

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

eQTL

Schadt et al. (2003) definiram o termo eQTL (QTL expresso).

O mapeamento de eQTL’s permite identificar regi˜oes do genoma que

controlam (regulam) a express˜ao gˆenica. Cada ”spot”de um

microarranjo de DNA ´e um car´ater quantitativo.

Os eQTL’s podem atuar na regula¸c˜ao de um gene atrav´es de duas formas:

A¸c˜ao em cis A¸c˜ao em trans

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

eQTL

A¸cão em cis: O n´ıvel de transcri¸cão é regulado por polimorfismo do DNA do próprio gene (eQTL e gene próximos).

A¸cão em trans: O n´ıvel de transcri¸cão é regulado por polimorfismo em uma região, a qual o gene não está fisicamente localizado.

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001)

eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

eQTL

Fatores de transcri¸cão podem ter eQTL em cis, mas como estão envolvidos na expressão de outros genes, podem também ser detectados como eQTL’s atuando em trans.

eQTL’s com maiores valores de LOD tendem a apresentar a¸c˜ao em cis. Por outro, lado eQTL’s de efeito moderado tendem a indicar a¸c˜ao em trans.

Varia¸cões de primeira ordem (devido ao próprio gene) são mais fáceis de se detectar, em rela¸cão a efeitos secundários (eQTL de um gene atuando na expressão de outros genes) (Schadt et al., 2003).

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Introdu¸c˜ao

Jansen e Nap (2001) eQTL

Genˆ

omica Gen´

etica

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Introdu¸cão Genômica Genética

Schadt et al. (2003)

Considera¸c˜oes Finais

Camundongos Milho Humanos

Schadt et al. (2003)

Objetivo: realizar um estudo compreensivo para a expressão gênica, através de eQTL’s, utilizando camundongos, plantas e humanos.

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Schadt et al. (2003)

Camundongos:

Quantos genes apresentavam expressão diferencial; Distribui¸cão dos eQTL’s ao longo do genoma; Explica¸cão molecular para presen¸ca do eQTL; Combina¸cão de expressão gênica com mapeamento;

Milho:

Visualiza¸c˜ao de epistasia;

Humanos:

Associa¸c˜ao entre camundongos e seres humanos; Algumas an´alises em humanos (Potencial);

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Camundongos

Milho Humanos

Schadt et al. (2003)

Camundongos

Popula¸c˜ao segregante: 111 indiv´ıduos F2 obtido atrav´es do cruzamento

das linhagens C57BL/6J e DBA/2J:

O mapa genético foi constru´ıdo com marcadores microssatélites, cuja a densidade média era de 13 cM;

Realizou-se Mapeamento por Intervalo;

O chip de DNA dispon´ıvel para camundongos continha (23574 genes); Avaliaram-se c´elulas do Tecido Hep´atico e Massa de Gordura na Pata (medida de obesidade);

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Camundongos

Milho Humanos

Schadt et al. (2003)

Quantifica¸c˜ao dos eQTL’s

Foram detectados:

11021 genes com LOD superior a 3; 3701 genes com LOD superior a 4,3; 965 genes com LOD superior a 7;

Para os genes dispon´ıveis no chip de DNA, 18460 (78%) podiam ser mapeados fisicamente:

34% dos eQTL’s com LOD superior a 4,3 apresentavam a¸c˜ao em cis. 71% dos eQTL’s com LOD superior a 7 apresentavam a¸c˜ao em cis.

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Camundongos

Milho Humanos

Schadt et al. (2003)

Distribui¸c˜ao dos eQTL’s

Os autores dividiram o genoma de camundongos em 920 bins (2cM) e para cada posi¸cão calculou-se a freqüência de eQTL’s presentes em cada bin.

Os cromossomos 2, 6, 7, 9, 10, 12, 16 e 17 contém regiões com mais de 1% do número total de eQTL (hotspots).

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Camundongos

Milho Humanos

Schadt et al. (2003)

Polimorfismo molecular

Para a compreensão dos eQTL’s buscou-se identificar as causas que levariam a deteçcão de eQTL’s. Logo, 3 genes podem ser destacados.

Gene C5: dele¸cão em 2 pb na região codante para linhagem DBA que reduz rapidamente a transcri¸cão em compara¸cão com B6;

Gene ALAD est´a duplicado em DBA;

Gene St7 sofre splicing diferenciado: em B6 h´a splicing, enquanto n˜ao ocorre em DBA.

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Camundongos

Milho Humanos

Schadt et al. (2003)

Combinando mapeamento e express˜ao gˆenica

Os autores desejavam associar a express˜ao gˆenica com caracteres quantitativos (obesidade).

Para isto selecionaram-se os 280 genes (pronunciada express˜ao

diferencial), e realizaram-se agrupamento com os indiv´ıduos de fen´otipos extremos.

Diferentemente do esperado houve a separa¸c˜ao da popula¸c˜ao de

mapeamento em 3 grupos: n˜ao obesos e 2 subgrupos de indiv´ıduos obesos

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Camundongos

Milho Humanos

Schadt et al. (2003)

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Camundongos

Milho Humanos

Schadt et al. (2003)

Ao realizar o mapeamento de QTL’s com essas subpopula¸c˜oes verifica-se que nos cromossomos 2 e 19 os QTL’s se expressam de forma diferencial dentro destes subgrupos, o que indica a complexidade de caracteres quantitativos como obesidade.

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Camundongos

Milho

Humanos

Schadt et al. (2003)

Milho

Assim, utilizou-se uma popula¸c˜ao F2:3composta por 76 plantas

provenientes do cruzamento de materiais de diferentes grupos heter´oticos: ”stiff stalk”e ”Lancaster”.

O mapa genético de milho foi constru´ıdo com marcadores microsatélites cuja distância média era de 12 cM.

Resultados:

6481 genes apresentavam ao menos 1 QTL’s com LOD superior a 3. 7322 eQTL’s foram detectados

80% dos eQTL’s com LOD superior a 7 apresentavam a¸c˜ao em cis.

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Camundongos

Milho

Humanos

Schadt et al. (2003)

Epistasia

Utilizando genes de cromossomos distintos e sem a¸cão em trans espera-se ausência de correla¸cão para a expressão gênica.

No entanto, algumas intera¸c˜oes foram identificadas -epistasia.

Aproximadamente 10% dos genes apresentavam este tipo de intera¸c˜ao.

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Schadt et al. (2003)

Epistasia 48 / 56

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Camundongos Milho

Humanos

Schadt et al. (2003)

Humanos

Alguns resultados obtidos com camundongos podem ser extrapolados para seres humanos, uma vez que a região que contém o locos no cromossomo 2 de camundongos apresenta homeologia com o cromossomo humano 20q12-q13.12 (regiões associadas a obesidade).

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Camundongos Milho

Humanos

Schadt et al. (2003)

Humanos

Um estudo preliminar em humanos foi realizado com fam´ılias de referˆencias do CEPH (Centre d’Etude du Polymorphisme Humain):

56 indiv´ıduos oriundos de 4 fam´ılias de referência; Informa¸cões de pais e avós;

Chips de DNA para humanos (2726 genes com express˜ao diferencial) C´elulas do sistema imune humano;

O tamanho amostral ´e muito pequeno para realizar an´alises mais elaboradas.

Acredita-se, no m´ımino 30% dos genes expressos podem ter eQTL’s detectados.

Estudos de expressão gênica em células do sistema imunológico em humanos podem ser alvos futuros para terapia gênica.

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Introdu¸cão Genômica Genética Schadt et al. (2003)

Desafios Atuais

Perspectivas Softwares dispon´ıveis

Considera¸c˜

oes Finais

Desafios Atuais

Elevado volume de dados ainda compromete an´alises mais elaboradas.

Como lidar com falsos positivos;

Como validar eQTL’s com a¸cão em trans? (importância para estudo de epistasia, rotas metabólicas);

Estudos consideram a possibilidade de utilizar FDR para estabelecer n´ıvel de significância, porém não há um consenso.

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Desafios Atuais

Perspectivas Softwares dispon´ıveis

Considera¸c˜

oes Finais

Desafios Atuais

Atualmente, há modelos que permitem realizar o mapeamento de QTL’s para múltiplas caracter´ısticas, mas não há modelos com a capacidade de absorver esse excessivo número de variáveis;

An´alises conjuntas x An´alises individuais: tempo de processamento ainda ´

e fator limitante;

Op¸cões em utilizar técnicas de análise multivariada (não há consenso);

Estudos de rotas metab´olicas:

Jansen e Nap (2001) reconhecem que a abordagem proposta por eles ´e limitante para an´alise de conjunto de dados reais.

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Desafios Atuais

Perspectivas

Softwares dispon´ıveis

Considera¸c˜

oes Finais

Perspectivas

Jansen (2003):

Experimentos para ”perturba¸cão de sistemas”como knockout de genes, transgenia e mutagênese podem ser aplicados vários organismos, mas o conceito de genômica-genética (mapear eQTL’s) é o único meio de realizar estudo em seres humanos;

Darvasi (2003 e 2006):

Esta abordagem aproxima-se cada vez mais na identifica¸c˜ao e

entendimento dos genes que controlam caracteres quantitativos (75% da varia¸c˜ao gen´etica).

Espera-se que o entendimento da base gen´etica das doen¸cas traga muita contribui¸c˜ao para a medicina.

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Desafios Atuais

Perspectivas

Considera¸c˜

oes Finais

Perspectivas

Gibson e Weir (2005) destacam:

Novas ferramentas estat´ısticas e modelos devem ser desenvolvidos para manipular transcritos com estruturas de covariˆancias e n˜ao aditividade de transcritos;

Estudos de eQTL’s fornecem somente uma visão restrita, uma vez que não há estudos de comportamento de eQTL’s em popula¸cões naturais.

O conhecimento futuro de rotas metabólicas permitirão o estudo de epistasia em caracteres quantitativos de uma forma que atualmente não é poss´ıvel.

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Desafios Atuais Perspectivas

Considera¸c˜

oes Finais

Software dispon´ıveis

Programas para constru¸c˜ao de mapas de liga¸c˜ao e mapeamento de QTL’s. Mapmaker/Exp e Mapmaker/QTL; JoinMap; QTL Cartographer; Rqtl (programa R); WebQTL;

Programas que permitem manipular e avaliar dados de mapeamento de eQTL’s.

eQTL Viewer (Zou et al., 2007);

eQTL explorer (Mueller et al., 2006) - integrado com o WebQTL e QTLexpress;

WinQTLcart;

MOM model (Kendziorski et al., 2006): scripts desenvolvidos para R.

Mapeamento de eQTL via modelo de mistura com marcadores

(56)

Desafios Atuais Perspectivas

Referˆ

encias

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GIBSON, G; WEIR, B. The quantitative genetics of transcription. TRENDS in Genetics, v.21, p.616-623, 2005.

JANSEN, RC; NAP, JP. Genetical Genomics: the added value from segregation. TRENDS in Genetics, v.17, p.399-391, 2001.

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KARP, G. Biologia celular e molecular: conceitos e experimentos, 3aedi¸c˜ao, Manole, p.786, 2005. KENDZIORSKI, C; CHEN, M; YUAN, M; LAN, H; ATTIE, AD. Statistical Methods for Expression Quantitative Trait Loci (eQTL) Mapping. Biometrics 62, 19-27, 2006

MUELLER, M; GOEL, A; Thimma, M; Dickens, NJ; Aitman, TJ; Mangion, J. eQTL Explorer: integrated mining of combined genetic linkage and expression experiments, Bioinformatics, v.22, p.509-511. 2006. SCHADT et al. Genetics of expression surveyed in mayze, mouse and man. Nature, v.422, p.297-302, 2003.

WAYNE, ML; McINTYRE, LM. Combining mapping and arraying: An approach to candidate gene identification. Proc. Natl. Acad. Sci USA, v. 99, p.14903-14906, 2002.

ZOU,W; AYLOR, DL; ZENG, ZB. eQTL Viewer: visualizing how sequence variation affects genome-wide transcription. BCM Bioinformatics, v.8, p.7, 2007