UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS FÍSICAS E MATEMÁTICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
SÍNTESE E APLICAÇÃO DE NOVOS DERIVADOS
IMIDAZÓLICOS DO ÉSTER DE HANTZSCH
ALLISON THOMÉ
Florianópolis
Nov/2019
2
ALLISON THOMÉ
SÍNTESE E APLICAÇÃO DE NOVOS DERIVADOS IMIDAZÓLICOS
DO ÉSTER DE HANTZSCH
Relatório apresentado ao Departamento de Química
da Universidade Federal de Santa Catarina,
como requisito parcial da disciplina de
Estágio II (QMC 5512)
__________________
Ricardo Ferreira Affeldt (Orientador)
Florianópolis
Nov/2019
3 AGRADECIMENTOS
À minha mãe com muito amor, que sempre me incentivou e me auxiliou a prosseguir na carreira de estudante, especialmente nos anos de graduação.
À minha pequena família construída nestes anos de faculdade, constituída por minha namorada Kauane Pavan e nossos numerosos animais de estimação, que formam meu lar, onde busco apoio, conforto, incentivo, conselhos e amor.
Ao professor Ricardo F. Affeldt, que por casual coincidência, foi apresentado e acolhido ao laboratório 312, pelo estimado professor Faruk Nome, a quem também dedico meus agradecimentos, no exato semestre em que eu me tornei bolsista de iniciação científica neste laboratório. Desde então, tenho trabalhado, recebido orientações, ensinamentos (químicos e Jedis), conselhos e apoio do professor Ricardo, as 1,4-dihidropridinas, que fora também seu tema de TCC e mestrado, no decorrer dos últimos três anos se tornou um tópico conhecido, ao qual dediquei esforço, horas de reação, algumas frustrações, vidrarias quebradas e horas de leitura de artigos.
Aos colegas do LACFI 312 e 203, peço desculpas pelos tubos de RMN não lavados e eventuais vidrarias sujas na gaveta e agradeço aos ensinamentos esporádicos adquiridos e compartilhados durante nossa convivência, aos reagentes emprestados e as desintoxicações metanólicas com soluções etanólicas nos bares da região depois de um dia de colunas cromatográficas. Em especial ao Heitor Bozani, que sintetizou o catalisador heterogêneo que tive a oportunidade de testar nas minhas reações e que incrementaram de maneira verde e sustentável o rendimento das minhas sínteses multicomponentes.
A todos os funcionários do departamento de química da UFSC, que sempre deram suportes aos estudantes do curso; A todos funcionários a central de análises do departamento de química e do laboratório de biologia molecular estrutural, pelas incontáveis análises que submeti durante estes anos, que não poderiam ter sido obtidas tão facilmente sem suas contribuições e que foram cruciais para a qualidade de todos os trabalhos que desenvolvi neste tempo.
Ao CNPq pelo auxílio financeiro, e à UFSC pela infraestrutura.
Ao professor Aldo Senna de Oliveira, que despertou meu interesse em química orgânica durante meus anos no curso técnico em química. E agradeço ao meu bando de amigos, do IFSC, do ensino fundamental e da vida.
4 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...12
2 REVISÃO DA LITERATURA...14
2.1 Éster de Hantzsch...14
2.2 Mecanismo de Formação das 1, 4-Dihidropiridinas...16
2.3 Derivados de Éster de Hantzsch...20
2.4 O Anel Imidazólico e seu Papel no Organismo e na Química...23
3 OBJETIVOS...27 3.1 Objetivos Gerais...27 3.2 Objetivos Específicos...27 4 MATERIAL E MÉTODOS...28 4.1 Materiais e Reagentes...28 4.1.1 Síntese e Purificação...28 4.1.2 Testes de Aplicabilidade...28 4.1.2.1 Fotoestabilidade...28 4.1.2.2 Quimiossensor Fluorescente...29
4.1.2.3 Ligante para Compostos de Coordenação...29
4.1.2.4 Simulações computacionais...29
4.2 Equipamentos...30
4.2.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear...30
4.2.2 Espectroscopia no Infravermelho...30
4.2.3 Espectrometria de Massas de Alta Resolução...30
4.2.4 Espectroscopia no UV-Vis e de Fluorescência...30
4.3 Procedimentos Experimentais...31
4.3.1 Síntese Multicomponentes Clássica Com Catalisador Heterogêneo...31
4.4 Segurança e Descarte de Resíduos no Laboratório...34
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...36
5.1 Síntese Multicomponente...36
5.2 Caracterização do Produto...38
5.3 Redução de Impactos no Procedimento de Síntese...44
5.4 Fotoestabilidade de 1,4-Dihidropiridinas...47
5.5 Aplicabilidade do Im-DHP como Quimiossensor Fluorescente...50
5 6 CONCLUSÃO ...57 7 REFERÊNCIAS ...59
6 LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Diagrama de barras onde é representado o número de resultados encontrados pela palavra-chave: “Dihydropyridine” na ferramenta Google Scholar, por
ano, de 1880 a 2019...15
FIGURA 2 - A estrutura da coenzima NADH em que o anel piridínico encontra-se destacado...16
FIGURA 3 - Representação estrutural de derivados de 1,4-diidropiridinas utilizados como fármacos no controle da pressão arterial...20
FIGURA 4 - Representação espacial da estrutura da Nitrendipina...21
FIGURA 5 - Representação estrutural do imidazol e esquema de orbitais ocupados por elétrons não ligantes dos nitrogênios N1 e N2 e do sistema de ressonância sp2...23
FIGURA 6 - Representação da proteína mioglobina com destaque no anel porfirínico e nos resíduos de histidina que encontram-se coordenado com o Ferro...24
FIGURA 7 - Representação de dois fármacos comerciais que possuem o nitroimidazol como parte de sua estrutura...25
FIGURA 8A - Representação de um complexo de paládio com imidazol utilizado para acoplamento do tipo Suzuki-Miyaura...26
FIGURA 8B - Representação de um líquido iônico de imidazol...26
FIGURA 9 – Simulação ao lado de foto da placa de CCD obtida pela eluição de alíquotas do início e no fim da reação. Foi utilizando uma solução 30/70 de acetato de etila/hexano como eluente e as manchas foram reveladas em vanilina sulfúrica. (Imagem autoral)...37
FIGURA 10 - Espectro de 1H-RMN (400 MHz) do produto, obtido em CD3OD...38
FIGURA 11 - Espectro de 13C-RMN (400 MHz) do produto, obtido em CD3OD...39
FIGURA 12 - Espectro de infravermelho do produto, obtido em pastilha de KBr...40
FIGURA 13 - EMAR do produto obtido em MeCN, em modo íon positivo...41
FIGURA 14 - Espectros na região do ultravioleta visível e de fluorescência do Im-DHP, obtido em metanol...43
FIGURA 15 - Derivados do Im-DHP obtidos por precipitação...44
7 FIGURA 17 – Espectro de infravermelho obtido em pastilhas de KBr dos compostos 6a-6d...47 FIGURA 18 – Estrutura do HEH, Ph-DHP e Im-DHP...48 FIGURA 19 – Cinética de oxidação do HEH em metanol, sob irradiação de luz azul...48 FIGURA 20 – Cinética de oxidação do Im-DHP em metanol, sob irradiação de luz azul...48 FIGURA 21 – Representação esquemática do ângulo formado entre os planos perpendiculares dos anéis da estrutura e Representação estrutural do Im-DHP obtido através da otimização de energia no software livre Orca 4.0.1...51 FIGURA 22 – Diagrama de intensidade de emissão do Im-DHP com diferentes metais...52 FIGURA 23 – Plot de Job de fluorescência do Im-DHP com Zn2+...53
FIGURA 24 – Espectros de infravermelho do complexo Znn(Im-DHP)m2+ e do
Im-DHP...54 FIGURA 25 - Estrutura do MTT e sua reação de redução no metabolismo de celulas...55 FIGURA 26 – Derivado imidazólico que apresenta atividade como bloqueador do canal de cálcio...55
8 LISTA DE ESQUEMAS
ESQUEMA 1 - Síntese multicomponente de 1,4-diidropiridinas...14 ESQUEMA 2 - Representação esquemática das etapas da reação de formação de 1,4-diidropiridinas...17 ESQUEMA 3 - Mecanismo da condensação de Knoevenagel proposto para formação do intermediário (5)...18 ESQUEMA 4 - Mecanismo da adição nucleofílica proposto para formação do intermediário (4)...19 ESQUEMA 5 - Mecanismo proposto para reação entre os intermediários (4) e (5) que leva a formação das 1,4-dihidropiridinas (6)...19 ESQUEMA 6 - Representação do equilíbrio conformacional do anel piridínico...22 ESQUEMA 7 - Oxidação do anel dihidropiridínico para seu análogo pirídinico na estrutura da Nifedipina...22 ESQUEMA 8 - Representação do equilíbrio entre as formas protonada e desprotonada da histidina...24 ESQUEMA 9 - Esquema da RMC proposta para síntese da nova classe de 1,4-dihidropiridinas ...31 ESQUEMA 10 - Estrutura do fragmento A, identificado no EMAR do composto 6ª...42 ESQUEMA 11 - Fotooxidação do Im-DHP na presença de O2 e luz azul ...49
9 LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Resultados obtidos na síntese multicomponente do composto 4a...36 TABELA 2 - Identidade dos picos A-D e seu erro relativo a fórmula estrutural teórica...42 TABELA 3 - Procedimentos de síntese a 90 ºC, sem solvente por 2 horas...45 TABELA 4 - Efeito do solvente na fotoestabilidade de 1,4-DHPS...49 TABELA 5 - Efeito de cloretos de metais sobre espectro de emissão do Im-DHP após 10 minutos de reação com 5 equivalentes dos metais...51
10 LISTA DE ABREVIATURAS
1,4-DHP – 1,4-Dihidropiridinas;
13C-RMN - Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 13C; 1H-RMN – Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H;
CC – Cromatografia em coluna;
CCD – Cromatografia em camada delgada; CD3OD – Metanol deuterado;
CEBIME – Centro de biologia molecular estrutural EMAR – Espectrometria de massas de alta resolução; HEH – Éster de Hantzsch;
Im-DHP – dimetil 4-(1H-imidazol-2-il)-2,6-dimetil-1,4-dihidropiridina-3,5-dicarboxilato; IV – Espectroscopia de infravermelho;
kobs – Constante cinética observada;
LACFI – Laboratório de Catálise e Fenômenos Interfaciais; NADH – Dinucleótido de nicotinamida e adenina protonada; ppm – Parte por milhão;
Ph-DHP – enil 4-(1H-imidazol-2-il)-2,6-dietil-1,4-dihidropiridina-3,5-dicarboxilato; RMC – Reação multicomponente;
RPM – Rotações por minuto; TMS – Trimetilsilano;
UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina; UV-Vis – Ultravioleta-visível;
δ – Deslocamento químico;
-Comprimento de onda;Máx – Comprimento de onda de máxima absorção; Ems – Comprimento de onda de emissão;
- Coeficiente de absortividade molar; - Frequência vibracional.11 RESUMO
As 1,4-dihidropiridinas (1,4-DHP’s) são heterociclos nitrogenados não aromáticos fluorescentes, que desde sua descoberta, têm sido extensivamente estudadas, encontrando-se aplicações nas áreas de farmacologia, química orgânica sintética, quimiossensores, síntese de compostos de coordenação e recentemente na fotoquímica e fotocatálise. Visando a obtenção de novos derivados e estudos das suas possíveis aplicações, o presente trabalho utilizou a metodologia clássica de síntese tricomponente para obter e caracterizar uma série de 4 derivados imidazólicos inéditos desta classe de compostos, sendo que estes foram testados frente a atividade biológica, estabilidade fotoquímica, aplicabilidade como quimiossensores e ligantes em compostos de coordenação com diferentes centros metálicos.
Palavras-chave: Dihidropiridinas, Síntese Multicomponente, Química Verde, Quimiossensores, Fotoquímica.
12 1. INTRODUÇÃO
A química tem a cada dia mais achado caminho e disseminado suas aplicações nos mais variados campos de estudo das ciências naturais e médicas. Parte dessas conquistas só pôde ser possível com os recentes avanços em determinação estrutural, simulações computacionais, melhores equipamentos e também nas metodologias de síntese, que juntos com outros inúmeros avanços produz uma química mais consistente e altamente interdisciplinar.
O cenário na química orgânica sintética segue a tendência, a muito que síntese não está limitada somente a moléculas orgânicas e ao laboratório de síntese, é rotina de muitos laboratórios contarem com parcerias para realização de determinações físico-químicas e analíticas, bem como resoluções estruturais e simulações computacionais junto a área de química teórica. Algumas metodologias e substâncias que são frutos destas parcerias já são de uso comum na síntese orgânica, como é o caso das nanopartículas metálicas e polímeros funcionalizados miméticos a sistemas enzimáticos, largamente aplicados como catalisadores para obter compostos antes impossíveis ou muito caros de serem obtidos.
Uma parte fundamental no processo de síntese de um novo composto está nas escolhas de quais metodologias, reagentes e equipamentos usar. Estas escolhas não devem ser feitas somente levando em conta a otimização da rota sintética, devemos considerar e minimizar ao máximo nossos impactos ambientais. Os laboratórios de química podem ser grandes causadores de danos ambientais, se trabalharem sem cautela. Com a variedade de técnicas, materiais, metodologias e informação disponíveis em muitos casos é factível produzir uma solução consistente em síntese orgânica que utilize e siga as metodologias e métricas da química verde.
Neste contexto, o presente projeto tem como objetivo a preparação de novos derivados imidazólicos do Éster de Hantzsch (HEH) através de diferentes metodologias, a fim comparar qual abordagem produz menos resíduos. As reações multicomponente (RMC) já são conhecidamente verdes por sua economia atômica e menor geração de resíduos, também foram avaliadas diferentes otimizações reacionais, na presença e ausência de solventes e catalisadores. Os solventes foram escolhidos levando em consideração um baixo impacto ambiental e possibilidade de recuperação, no caso dos catalisadores, optou-se pelo uso de catalisadores
13 heterogêneos, que podem ser removidos, lavados e reutilizados no processo de síntese.
Uma vez estabelecida a metodologia sintética foi preparado uma série de derivados para validação da rota sintética. Estes compostos foram caracterizados por diferentes técnicas, o que permitiu dar início a uma série de testes de suas possíveis aplicações.
Os testes de aplicabilidade empregaram experimentos de fotoestabilidade já que as 1,4-dihidropiridinas possuem um carbono e um nitrogênio de hibridização sp3,
um processo oxidativo torna estes sp2, aromatizando o anel, este processo pode ser
desencadeado pela presença de luz.1 A molécula em questão também possuí 4 grupos básicos (nitrogênio piridínico, nitrogênio imidazólico e 2 carbonilas), que foram testados frente a complexação com diferentes centros metálicos para produção de quimiossensores fluorescentes. Alguns destes complexos puderam ser isolados e caracterizados, estes possuem uma nova gama de aplicações, a serem exploradas futuramente. Por fim, uma parceria com o Laboratório de Oncologia Experimental e Hematopatias (LOEH) do Departamento de Análises Clínicas do Centro de Ciências da Saúde (CCS), do curso de Farmácia, promoveu ensaios biológicos investigando a atividade citotóxica destes derivados.
14 2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Éster de Hantzsch
Em 1881 Arthur Hantzsch publicou um artigo intitulado “Sobre a síntese de compostos do tipo piridina a partir do éster acetoacético, amônia e aldeído”2, Neste
artigo, Hantzsch descreveu a utilidade deste tipo de composto como intermediários na síntese de piridinas substituídas, justamente o tema de seu segundo trabalho sobre o assunto.3 Estes artigos já utilizavam a metodologia multicomponente em uma etapa,
onde os três reagentes de partida são adicionados simultaneamente para reagir. Estes artigos deram origem a classe de moléculas hoje conhecidas como 1,4-Dihidropiridinas, Piridinas de Hantzsch ou Ésteres de Hantzsch (HEH).3-4
A síntese clássica descrita por Hantzsch, representada no Esquema 1 usa uma mistura de um equivalente de éster acetoacético, formaldeído e amônia (gasosa ou na forma de sais), esta mistura então é refluxada em etanol. 3
Esquema 1. Síntese multicomponente de 1,4-dihidropiridinas. (Adaptado de Saini et al. 2007)4
Um levantamento de dados feitos através da ferramenta acadêmica Google Scholar mostra como foi a evolução temporal da relevância acadêmica destes compostos, como mostra a Figura 1.
15 Figura 1 – Diagrama de barras onde é representado o número de resultados encontrados pela palavra-chave: “Dihydropyridine” na ferramenta Google Scholar, por ano, de 1880 a 2019. (Imagem Autoral)
Após sua descoberta estes compostos passaram cerca de 75 anos com pouca relevância acadêmica, durante este período fora-se descoberto em 1930,5 que
compostos do tipo 1,4-dihidropiridina, representado na Figura 2, tem a capacidade de atuar em mecanismo de transferência de hidrogênio. Muito similar ao funcionamento da coenzima Dinucleótido de nicotinamida e adenina protonada (NADH), que possui uma dihidropiridina em sua estrutura, sendo através desta que se faz importante nos processos de oxirredução do metabolismo humano. 4
16 Figura 2 – A estrutura da coenzima NADH em que o anel piridínico encontra-se destacado. (Adaptado de Saini, et al. 2007)4
Esta descoberta culminou em estudos sobre a aplicabilidade de 1,4-DHP’s como agente redutor, em 1958 fora publicado um artigo onde estes derivados foram utilizados para redução de cetoácidos.6 O aumento do número de pesquisas na área,
em conjunto com as recentes descobertas impulsionaram o estudo das aplicabilidades das piridinas de Hantzsch, que após a década de 60 se concentrou nas atividades biológicas de fármacos desta classe de moléculas. Em 1971 surgiram patentes de 1,4-DHP’s para o tratamento de Angina Pectoris, conhecido como Angina de Peito, uma doença arterial coronária7;
Em 1972 seus efeitos como anti-hipertensivos já eram avaliados e surgiram comercialmente dihidropiridinas nos tratamentos de hipertensão8. Em pouco tempo
descobriu-se o mecanismo de ação destas drogas, em 1983 fora publicado na Nature o artigo intitulado: “Novel Dihydropyridines with positive ionotropic action through of
Ca2+ channels” que discorre sobre a atividade das 1,4-DHP’s como bloqueadores do
canal de cálcio9, esta publicação coincide com o período de ápice (ver Figura 1), que
mostra que entre 1983-1990 foi produzido o maior volume de publicações, com 1341 resultados obtidos na pesquisa da palavra chave “dihydropyridine” na ferramenta de pesquisa Google Scholar. Nesta época também se produziram estudos da aplicabilidade destes compostos como agente antitumoral10, antinflamatório11,
anticonvulsionante12 e antibiótico13.
No início dos anos 2000 até o presente ano estas moléculas ainda encontram relevância acadêmica, com derivados e metodologias surgindo com abordagens modernas e verdes, como é o caso da síntese que faz uso de catalisadores heterogêneos reutilizáveis14, líquidos iônicos15, ultrassom16 e até em meio aquoso sob
17 alta pressão.17 Suas aplicações ainda continuam em desenvolvimento, com novos
fármacos para o tratamento da hipertensão18, agente antitumoral no tratamento de
câncer de mama19, ou mesmo atuando como agente antimicrobiano e antioxidante20.
2.2. Mecanismo de Formação de Piridinas de Hantzsch
A reação clássica de Hantzsch, representadas pelo Esquema 2, emprega reagentes tipicamente utilizados em reações de condensação do tipo Knoevenagel, um aldeído (2) e um composto carbonílico que possuí um carbono com hidrogênio ácido (1).21 As semelhanças existem inclusive no uso de seus catalisadores, que
geralmente são metais que atuam como ácidos de Lewis, ativando a reatividade da carbonila e estabilizando os intermediários da reação. A grande diferença entre estes sistemas é que na síntese de Hantzsch faz-se o uso do terceiro componente, a amônia (3), que pode ser adicionada ao meio reacional na forma gasosa ou salina.21
Esquema 2 – Representação esquemática das etapas da reação de formação de 1,4-diidropiridinas. (Adaptado de Saini, et al. 2007)4
A reação multicomponente, no entanto, pode ser sensível às condições reacionais. Há um número maior de reagentes que através de substituições nas posições R1, R2 e R3, podem levar a diferentes caminhos reacionais, subprodutos e até mesmo a 3,4 - Dihidropiridinas.22 Os rendimentos são afetados por condições
reacionais como na presença ou ausência de solvente e catalisadores, temperatura de reação, pH e outras muitas condições descritas na literatura.21-22
O mecanismo mais provável para reação em refluxo de etanol sem catalisadores pode ser descrito através da formação de dois intermediários chaves (4) e (5), que reagem para formação da piridina de Hantzsch (6). O intermediário (5) é aquele formado através da condensação de Knoevenagel,21 que tem seu mecanismo
18 Esquema 3 - Mecanismo da condensação de Knoevenagel proposto para formação do intermediário (5). (Adaptado de Neto, et al. 2008).21
O mecanismo se inicia com uma desprotonação do carbono, este é deficiente de elétrons por indução das carbonilas. O pKa deste carbono é de aproximadamente 10,5, se R2 for alifático de cadeia curta o pKa não é fortemente alterado, já que a cadeia alifática não produz grandes mudanças na conjugação da carbonila.21 A
desprotonação produz um enolato, que pode então atacar a carbonila de (2), para formar (1,2A), que rearranja por transferência protônica levando a (1,2B) que sofre eliminação de água, originando a dupla ligação do intermediário (5).21
O intermediário (4) é formado através de uma adição nucleofílica entre a amônia (3) e o éster acetoacético (1), o mecanismo é descrito pelo Esquema 4.21
19 Esquema 4 - Mecanismo da adição nucleofílica proposto para formação do intermediário (4). (Adaptado de Neto, et al. 2008).21
Trata-se outra vez de uma condensação, o mecanismo se inicia pelo ataque nucleofílico da amônia (3) sobre a carbonila de (1), um rearranjo protônico gera o intermediário (1,3A), que pode eliminar a água, gerando (1,3B), o qual, transferência de prótons, forma o intermediário (4).Por fim, a reação entre os dois intermediários chaves gera as 1,4-dihidropiridinas, como representa o mecanismo do Esquema 5.21
Esquema 5 – Mecanismo proposto para reação entre os intermediários (4) e (5) que leva a formação das 1,4-diidropiridinas (6). (Adaptado de Neto, et al. 2008).21
20 O mecanismo proposto se inicia com adição de Michael entre os intermediários (4) e (5), gerando o intermediário (4,5A), que sofre transferência de prótons, levando a formação de um R-NH2 vizinho a uma carbonila em (4,5B), pode ocorrer um ataque
nucleófilo intramolecular que leva a formação da enamina (4,5C), que após eliminar água gera a 1,4-Diidropiridina (6) como produto.21
2.3. Derivados de Éster de Hantzsch
A reação para formação de 1,4-dihidropiridinas pode levar a uma variedade de produtos derivados da estrutura base através de modificações nas cadeias laterais dos reagentes de partida. A produção de novos derivados pode apresentar desafio sintético quando se leva em conta o caráter multicomponente da síntese, novos caminhos reacionais podem surgir, desfavorecendo ou inibindo a formação de intermediários importantes.21
A descoberta de novos derivados deste grupo de moléculas sempre encontra aplicações em estudos farmacêuticos, a mais famosa aplicação deste grupo é nos fármacos para controle da pressão arterial. A Figura 3 ilustra alguns dos mais conhecidos utilizados para este fim.23
Figura 3 – Representação estrutural de derivados de 1,4-diidropiridinas utilizados como fármacos no controle da pressão arterial. (Imagem autoral).
21 Todos os compostos acima são utilizados para o tratamento da pressão arterial, no entanto, os compostos I, II, III são fármacos antagonistas ao canal de cálcio, ou seja, eles bloqueiam os canais da membrana plasmática das células do músculo cardíaco, impedindo a passagem do fluxo de íons de Ca2+, que promove inibição das
contrações do músculo cardíaco.23 Já o composto V é agonista ao canal de cálcio e
estimula as contrações do músculo cardíaco. O composto IV por sua vez pode ser utilizado para os dois fins, sendo um isômero S um agonista, enquanto o R, antagonista.23-24
As características estruturais dos derivados permitem que estes liguem-se no mesmo sítio ativo, pequenas diferenças na geometria, ligações de hidrogênio do grupo amino, orientação do grupo éster, efeito hidrofóbico das cadeias laterais e diferenças de densidade eletrônica dos grupos substituintes promovem os efeitos opostos observados no controle da pressão arterial.24
A principal modificação encontrada na estrutura dos fármacos está localizada no carbono sp3 do anel central. Em todas estruturas há presença de um anel
aromático, este produz um incremento na atividade como bloqueador dos canais de cálcio, a adição de heteroátomos no substituinte aumenta ainda mais esta atividade, mas pode promover aumento da toxicidade em animais.24 A presença destes anéis
são extremamente importantes para a atividade farmacológica, não por efeitos de natureza eletrônica, mas sim através do seu tamanho e posição no espaço. A repulsão eletrônica dos grupos laterais no anel piridínico restringe o anel substituinte a ficar no plano paralelo ao anel piridínico, como mostrado na Figura 4.25-25
22 A Nitrendipina possui o grupo nitro na posição meta que promove uma maior restrição estérica do anel substituinte, forçando este ao plano perpendicular ao o ciclo principal da 1,4-diidropiridina. Este já é um efeito pronunciando nesta classe de moléculas pois há no anel central um carbono e um nitrogênio de hibridização sp3 que
gera uma geometria tetraédrica e promove esta conformação espacial destorcida.25
Sendo assim, o anel central das 1,4-DHP’s pode possuir duas conformações, como representa o Esquema 6.26
Esquema 6 – Representação do equilíbrio conformacional do anel piridínico. (Adaptado de Hoffman e Cimiraglia, 1988).26
O equilíbrio conformacional pode ser modulado através de modificações dos substituintes laterais, parte da atividade biológica destes compostos reside neste pequeno equilíbrio, que permite uma “maleabilidade” a estrutura do fármaco.26
A oxidação do anel piridínico leva a aromatização destes compostos, como representa o Esquema 7. Este processo remove o equilíbrio conformacional do anel central, levando os substituintes a ficarem no mesmo plano. A oxidação de 1,4-DHP para sua correspondente piridina é a principal rota metabólica de eliminação dos análogos da nifedipina, o processo de oxidação ocorre via catálise do citocromo P450 no fígado durante a etapa de metabolismo do fármaco.27
Esquema 7 – Oxidação do anel dihidropiridínico para seu análogo piridínico na estrutura da Nifedipina. (Adaptado de Nikoorazm, 2013).27
23 A oxidação ocorre com a perda 2 átomos de hidrogênio, dos átomos sp3 do
anel. Estes hidrogênios comumente são liberados ao meio através de hidreto (H-), e
como hidrogênio radicalar (H.) na presença de luz,4 além de fonte de hidrogênio, estas
podem também ser fontes de elétrons e prótons em reações fotorredox.28 Esta
característica expande o leque de aplicações de 1,4-DHP’s, que foram relatados como agentes redutores para redução de ligações C=O, C=N e C=C, e mais recentemente como agente de transferência de grupos alquílicos via fragmentação oxidativa.28-29
2.4. O Anel Imidazólico e seu Papel no Organismo e na Química
O imidazol é um anel aromático de cinco membros, representado na Figura 5, e possuí dois átomos de nitrogênio que atribuem duas características importantes ao imidazol. O (N1) comporta-se como nitrogênio pirrólico, seu par de elétrons não ligante encontra-se conjugado ao sistema sp2, já o (N2) comporta-se como um nitrogênio de
piridina, que tem seu par de elétrons básico.30
Figura 5 – Representação estrutural do imidazol e esquema de orbitais ocupados por elétrons não ligantes dos nitrogênios N1 e N2 e do sistema de ressonância sp2.
(Adaptado de Manocha, et al. 2016).31
A histidina é um análogo do imidazol que desempenha importante papel biológico. Trata-se de um aminoácido que possuí o anel imidazólico como cadeia lateral, este é o único aminoácido dentre os 20 essenciais que possuí pKa em torno de 6, o que permite que em meio fisiológico este facilmente alterne entre sua estrutura protonada e desprotonada, como representa a Esquema 8.32
24 Esquema 8 – Representação do equilíbrio entre as formas protonada e desprotonada da histidina. (Adaptado de Ingle, 2011).32
Através deste equilíbrio e por ser comumente encontrada como resíduo de aminoácidos, a histidina pode desempenhar a função de catalisador ácido-base e na coordenação com centros metálicos, tornando provável encontrar-se presente no sítio ativo de diversas enzimas, como é o caso da mioglobina, representada pela Figura 6.32-33
Figura 6 – Representação da proteína mioglobina com destaque no anel porfirínico e nos resíduos de histidina que encontram-se coordenado com o Ferro.33
A mioglobina, apresenta um papel e estrutura semelhante a hemoglobina, ambas atuam no transporte de oxigênio, a mioglobina é comumente encontrada no músculo esquelético e cardíaco.34 Estudos da mioglobina de vertebrados mostram que os
resíduos de histidina foram fortemente conservados pela evolução, sendo atribuído a histidina o papel de controle “fino” dos ligantes que se coordenam ao centro metálico. O próton do nitrogênio imidazólico faz ligação de hidrogênio com oxigênio molecular, estabilizando a ligação Fe-O2, a proximidade da cadeia lateral imidazólica da His64
25 promove a ligação de hidrogênio ao oxigênio ao mesmo tempo que inibe estericamente a aproximação de CO e isocianato de metila.33-34
As características que tornam o imidazol importante para o organismo, tornam também este um grupo comum em diversas estruturas de fármacos, já que este é um composto polar e ionizável, este pode ser utilizado para aumentar a solubilidade e biodisponibilidade de fármacos que são pouco solúveis. A inserção do imidazol em fármacos pode promover aumento na atividade destes, sendo a ele atribuído atividades antitumorais, anticoagulantes, anti-inflamatórias, antibacterianas, antifúngicas e até antiviral.35
Os nitroimidazóis, representados na Figura 7, possuem conhecida atividade antibiótica. Esta classe começou a ser comercializada em 1960, após apresentar bons resultados clínicos e baixa toxicidade, novas estruturas com o anel imidazólico surgiram como resposta para tratamento da doença de chagas, infecções fúngicas e bacterianas, aplicados em tratamentos humanos e veterinários.30
Figura 7 – Representação de dois fármacos comerciais que possuem o nitroimidazol como parte de sua estrutura. (Imagem autoral)
Na química o imidazol também possui importantes aplicações, os imidazolidenos por exemplo, são utilizados no lugar de organofosfanos como ligantes na catálise com metais de transição, tendo importante papel catalítico na Metátese de olefinas, reações de acoplamento tipo Heck e Suzuki. Um complexo de paládio (II), utilizado para acoplamento Suzuki-Miyaura, encontra-se representado na Figura 8A.36-37
26 Figura 8 – A – Representação de um complexo de paládio com imidazol utilizado para acoplamento do tipo Suzuki-Miyaura;38 B – Representação de um líquido iônico de
imidazol.39 (Imagem autoral)
Os sais de imidazóis 1,3 substituídos são representantes do grupo de solventes chamados líquidos iônicos. Os líquidos iônicos que possuem imidazol na sua estrutura, representados na Figura 8B, apresentam características notáveis, como baixa pressão de vapor, habilidade de solubilizar material orgânico, inorgânico e polimérico e alto coeficiente de absortividade térmica. Estes têm adquirido popularidade como solvente em procedimentos verdes, tais como sínteses, processos eletroquímicos e de separação.30
27 3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos Gerais
O presente trabalho tem com objetivo geral realizar a síntese de novos derivados do HEH através da utilização do 2-imidazolcarboxaldeído como fonte de aldeído, empregando a metodologia multicomponente. Buscou-se realizar testes de citotoxicidade, estabilidade fotoquímica, quimiossensor fluorescente e ligante bidentado em complexos de coordenação com diferentes centros metálicos.
3.2. Objetivos Específicos
Realizar a síntese aplicando abordagem clássica na reação tricomponente; Otimizar a síntese com diferentes condições reacionais, a fim de encontrar
condições ótimas para formação do composto e que minimize os impactos ambientais produzidos;
Caracterizar o produto através das técnicas de espectroscopia por ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono ( 1H e 13C –RMN), espectroscopia
de infravermelho (IV) e espectrometria de massas de alta resolução (EMAR); Caracterizar os espectros na região UV-Vis dos compostos através da técnica
de espectrometria de ultravioleta-visível (UV-vis) e de fluorescência; Avaliar a fotoestabilidade dos compostos na presença de luz azul;
Avaliar a aplicabilidade deste composto como sensor fluorescente para diferentes cloretos de metais;
Avaliar a formação de composto de coordenação com Zinco (II);
Avaliar a citotixicidade do composto em células de linfoma de Burkitt e de Leucecima linfoblástica aguda de células T.
28 4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Materiais e Reagentes 4.1.1. Síntese e Purificação
Para realização dos processos de síntese foram utilizados os reagentes: 1H-imidazol-2-carboxaldeído, acetoacetato de metila, etila, tertbutila e benzila da marca Sigma-Aldrich e o acetato de amônio da marca Vetec. Estes foram obtidos de fontes comerciais e utilizados sem purificação prévia. O processo de síntese empregou Etanol da marca Dinâmica como solvente. O acompanhamento reacional da síntese foi feito por cromatografia em camada delgada (CCD), em folhas de alumínio com sílica gel suportada da marca Whatman com 0,25 mm de espessura, recortadas para 2x4 cm, sendo esta a fase estacionária e uma mistura de acetato de etila/hexano, previamente destilados como fase móvel. Como método de revelação utilizou-se câmara de luz ultravioleta (254 nm) e solução de vanilina sulfúrica preparada em laboratório.
Ao fim das reações, o catalisador heterogêneo foi removido por lavagem com etanol seguido por centrifugação em um aparelho da marca Centribio modelo 80-2B. O produto final pôde ser obtido da reação bruta através precipitação em éter etílico da marca Qhemis ou através de cromatografia em coluna (CC) utilizado uma coluna de vidro, sílica gel flash (Sigma-Aldrich) 60 Å (70-230 mesh) como fase estacionária e misturas de acetato de etila e hexano como eluente. Para remoção do solvente após a coluna foi utilizado um evaporador rotativo Buchi modelo RII e uma linha de vácuo para a secagem final dos produtos, equipada com uma bomba de alto vácuo Vacuubrand modelo RZ6.
4.1.2. Testes De Aplicabilidade 4.1.2.1. Fotoestabilidade
O teste de fotoestabilidade foi conduzido no espectrofotômetro descritos no item 4.2.4., para fins comparativos o estudo foi realizado com duas amostras, sendo uma o Éster de Hantzsch e a outra o novo derivado imidazólico. Os compostos foram solubilizados em metanol, uma alíquota, transferida à uma cubeta de quartzo que foi irradiada por duas lâmpadas de LED azul, sob agitação magnética. O espectro de
29 absorção na região UV-Vis fora coletado a cada 5 minutos a fim de observar mudanças no perfil de absorção da solução. Outra fonte de irradiação utilizada durante estes experimentos foi um laser de 268 nm do espectrômetro flash fotólise modelo LKS-80, durante estes experimentos fora avaliado a mudança no espectro de absorção e emissão das amostras através da irradiação por pulsos do laser.
4.1.2.2 Quimiossensor Fluorescente
Os testes para aplicabilidade como quimiossensor fluorescente foram conduzidos no espectrômetro de fluorescência descritos na sessão 4.2.4. O teste foi conduzido em metanol, já que os derivados sintetizados não apresentaram solubilidade em água e alguns sais não apresentam solubilidade em etanol. Foram testados uma série de 11 sais, todos cloretos. Os cloretos de: Sódio, e Potássio, que são metais alcalinos de carga 1+; Magnésio e Cálcio, alcalinos terrosos de carga 2+; Cobre (II), Cobalto (II), Estanho (II), Zinco (II) e Ferro (II), representantes dos metais de transição de carga 2+; O Ferro (III) e Al(III) que são os metais de transição de carga 3+. Todos os sais utilizados foram obtidos de fontes comerciais e foram testados sem purificação prévia.
4.1.2.3. Ligante para Compostos de Coordenação
Para testar a viabilidade de formação de composto de coordenação foi escolhido o metal que apresentou boa resposta ao teste como quimiossensor. Este foi o Zinco. Para análise da estequiometria do complexo foi realizado um plot de Job de fluorescência, conduzido no fluorímetro descrito na sessão 4.2.4. em metanol. Uma vez determinado a proporção estequiométrica, foi realizado o processo de síntese do composto com Nitrato de Zinco Hexaidratado (Vetec) e derivado imidazólico já purificado, em Metanol. O produto foi caracterizado por IV a fim obter informações sobre o complexo formado.
4.1.2.4. Simulações Computacionais
Para avaliar a geometria de algumas estruturas fora realizado cálculo computacional utilizando a teoria do funcional de densidade (DFT) no vácuo através do software Orca 4.0.1. A minimização de energia da estrutura fora realizada utilizando o funcional híbrido B3LYP, função de base DEF2-TZVPP. O ruído do gradiente foi
30 reduzido utilizando TightSCF e foi utilizado RIJCOS* para acelerar integrais de 2 elétrons, que necessita uso da função de base adicional DEF2/J.
4.2. Equipamentos
4.2.1. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
Os espectros de 1H-RMN e de 13C-RMN foram obtidos em espectrômetros da
marca Varian AS-400, operados em 400 MHz, localizado na Central de Análises do Departamento de Química da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Os compostos foram analisados depois de testes de solubilidade dos compostos, onde o Metanol se mostrou o melhor solvente, sendo assim foi utilizado sua versão deuterada (CD3OD- Sigma-Aldrich. Os deslocamentos químicos (δ) foram obtido em parte por
milhão (ppm) em relação ao Trimetilsilano (TMS), padrão para 1H-RMN, e CD3OD
como padrão para 13C-RMN.
4.2.2. Espectroscopia no Infravermelho
Os espectros na região do infravermelho foram obtidos em espectrômetro da marca ABB, modelo FTLA 2000, localizado na Central de Análises da UFSC. Os espectros dos compostos sintetizados foram obtidos em pastilha de KBr.
4.2.3. Espectrometria de Massas de Alta Resolução
Os espectros de massa de alta resolução foram obtidos de um espectrômetro de massas da marca Bruken Daltonics, modelo micrOTOF-Q II, que fica localizado no centro de biologia molecular estrutural (CEBIME), na UFSC. O espectrômetro de massas foi obtido em modo de íon positivo, com fonte de ionização ESI, utilizando acetonitrila da marca Sigma-Aldrich como solvente.
4.2.4. Espectroscopia no UV-Vis e de Fluorescência
Os espectros na região do UV-vis foram obtidos em um aparelho da marca Varian, modelo Cary 50. Os espectros de fluorescência foram obtidos em um aparelho da marca Varian, modelo Cary Eclipse, com largura de fenda de absorção e emissão em 10mm, com a fonte de energia operando em potência média. Os espectrômetros ficam localizados no Laboratório de Catálise e Fenômenos Interfaciais (LACFI – 312) Os espectros em ambas técnicas foram obtidos em Metanol ou Etanol como solventes.
31 4.3. Procedimentos Experimentais
4.3.1 Síntese Multicomponente Clássica Com Catalisador Heterogêneo
A síntese das 1,4-dihidropiridinas foi realizda através da abordagem multicomponentes clássica, descrita no Esquema 9. Duas condições foram testadas, uma que não faz uso de catalisadores e a outra utiliza 50mg para cada 0,25 mmol de aldeído. Os catalisadores heterogêneos escolhidos foram do tipo SBA-15, de Ferro ou de Ferro/Cobre combinados. Trata-se de um material mesoporoso constituído de metais suportados em sílica, obtido através da reciclagem de vidro comum.
Esquema 9 – Esquema da RMC proposta para síntese da nova classe de 1,4-dihidropiridinas. (Imagem Autoral).
A reação consiste na adição de 1 equivalente de aldeído imidazólico (0,25 mmol), 2 equivalentes de éster acetoacético (0,50 mmol), 4 equivalentes do acetato de amônio (1 mmol) a um tubo de ensaio aberto. Duas novas condições são testadas, uma que não utiliza solventes, e outra que faz uso de 3 mL de Etanol, que é levado a um banho de óleo à 75 ºC e lá ficou sob agitação durante 1,5 horas.
O tempo reacional fora determinado após análise de CCD, sendo que alíquotas da reação foram coletadas para análise a cada 10 minutos, as amostras foram eluídos com uma mistura 30/70 de acetato de etila/hexano, previamente destilados. O produto pôde ser visualizado na placa de CCD nos três métodos de revelação testados: Lâmpada UV curto (254 nm); Lâmpada UV longo (354 nm); Solução reveladora vanilina sulfúrica em spray, borrifada sobre a placa e aquecida com o soprador de ar até a completa coloração das manchas.
32 O primeiro procedimento realizado após a síntese é a remoção do catalisador heterogêneo. Para tal, 5 mL de etanol foram adicionados a reação ainda quente, até completa solubilização do produto precipitado. Em seguida a solução foi transferida para um tubo Vortex e centrifugada por 10 minutos à 4000 RPM. A fração líquida foi então transferida a um balão de fundo redondo, e o sólido, lavado com mais 3x5 mL de etanol. O produto pode ser obtido de diferentes maneiras, sendo que para este item a metodologia adotada fora a de cromatografia em coluna.
Sendo assim, à reação líquida fora adicionado sílica flash, a mistura foi levada ao evaporador rotatório, onde o etanol pôde ser removido por pressão reduzida (131 atm) e aquecimento (60ºC). A sílica, agora fase estacionária, foi adicionada a uma coluna, de 15mm de raio, já com aproximadamente 10cm de altura de uma coluna de sílica flash. A eluição foi feita com 250mL de uma mistura 20/80 de acetato de etila/hexano, utilizando um nebulizador como fonte de pressão positiva, até a completa remoção das impurezas e reagentes, etapa esta acompanhada e otimizada utilizando mesmo solvente de eluição em placas de CCD. O produto é muito mais polar e permaneceu na base durante a passagem da primeira solução eluente, sendo assim para eluição do produto foi utilizado 100 mL de uma mistura de 10/90 de metanol/acetato de etila, também acompanhado e otimizados por CCD. Foram coletadas amostras em tubo de ensaio, àquelas que mostraram, por CCD, a mancha do suposto produto foi adicionada a um balão volumétrico previamente pesado. O solvente então foi removido em evaporador rotatório e o produto foi seco em bomba de alto vácuo por 4 horas, após tal período este foi quantificado e caracterizado.
Um procedimento alternativo fora adotado para obtenção do produto, sendo a precipitação a técnica escolhida. O precedimento foi realizado após a remoção do catalisador, como descrito anteriormente. Para precipitação foi utilizado 5 mL de éter etílico são adicionados à reação bruta obtida após remoção do solvente no evaporador rotatório, que promove a precipitação do produto. Este pode então ser coletado por filtração a vácuo convencional e lavado com éter etílico gelado, seguido de secagem em bomba de alto vácuo.
33 6a - dimetil 4-(1H-imidazol-2-il)-2,6-dimetil-1,4-dihidropiridina-3,5-dicarboxilato.
Rendimento = 82% (coluna cromatográfica) e 68% (precipitação Et2O); Sólido amarelo
pálido, fluorescente.
RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) δ (ppm): 7,18 (s, 2H), 5,29 (s, 1H), 3,67 (s, 6H), 2,34 (s, 6H). RMN de 13C (400 MHz, CD3OD) δ (ppm): 167,5, 151,4, 148,5, 119,0, 97,0, 50,4, 34,1, 17,4. IV (Pastilha KBr)ν̅cm-1: 3296 (N-H), 3180, 3052, 2952 (C-H), 1682
(C=O), 1657 (C=C), 1516, 1436, 1336 (C-O), 1221, 1226, 1020, 819, 726, 656, 586. UV-Vis/Fluorescência (Metanol) nm: 350,7/436,4. EMAR (ESI, MeCN, ion positivo) m/z : [M+H]+ obtido: 292,1297, calculado: 292,1292.
6b - dietil 4-(1H-imidazol-2-il)-2,6-dimetil-1,4-dihidropiridina-3,5-dicarboxilato.
Rendimento = 64% (precipitação Et2O); Sólido amarelo, fluorescente.
IV (Pastilha KBr) ν̅cm-1: 3365 (N-H), 3169, 3045, 2982 (C-H), 2904, 2814, 1669
(C=O), 1658 (C=C), 1513, 1447, 1372 (C-O), 1304, 1212, 1094, 1021, 882, 743, 660, 580. UV-Vis (Metanol)nm: 351,3.
34 6c - di-tert-butil 4-(1H-imidazol-2-il)-2,6-dimetil-1,4-dihidropiridina-3,5-dicarboxilato.
Rendimento = 27% (precipitação Et2O); Sólido amarelo esverdeado, fluorescente.
IV (Pastilha KBr)ν̅cm-1: 3338 (N-H), 3183, 2974 (C-H), 2810, 1680 (C=O), 1650
(C=C), 1528, 1456, 1385 (C-O), 1240, 1167, 1115, 1094, 1014, 884, 817, 706, 596, 454. UV-Vis (Metanol)nm: 351,2.
6d - dibenzil 4-(1H-imidazol-2-il)-2,6-dimethil-1,4-dihidropiridina-3,5-dicarboxilato.
Rendimento = 56% (precipitação Et2O); Sólido branco amarelado, fluorescente.
IV (Pastilha KBr)ν̅cm-1: 3351 (N-H), 3147, 3029, 2886, 2796, 1685 (C=O), 1656
(C=C), 1497, 1334 (C-O), 1286, 1205, 1117, 1017, 874, 821, 742, 696, 578, 486. UV-Vis (Metanol) nm: 355,2.
4.4. Segurança e Descarte de Resíduos no Laboratório
Os reagentes utilizados sempre foram avaliados frente sua toxicidade, a ficha de segurança dos acetoacetatos utilizados somente apresenta frases de cautela frente a flamabilidade. O 2-imidazolcarboxaldeído e acetato de amônio por sua vez possuem alerta de nocividade frente a exposição aos vapores, podendo causar irritação na pele, olhos e no trato respiratório, os riscos podem se agravar por aquecimento no caso do acetato de amônio, já que o sal se decompõe termicamente formando amônia e ácido acético. Sendo que o uso destes compostos sempre fora feito utilizando jaleco, luvas
35 e óculos de proteção e dentro de ambientes ventilados e as reações sempre foram conduzidas na capela, sob exaustão.
O laboratório 312, no qual os experimentos foram conduzidos conta com um sistema de coleta de resíduos. Os resíduos gerados neste trabalho sempre foram descartados seguindo as normas internas de descarte do laboratório, que prevê a separação de resíduos por categoria de solventes, sendo que o recipiente em que os resíduos deste trabalho foram descartados é classificado como “orgânicos não halogenados”. O etanol fora o único solvente passível de recuperação, este pode ser recuperado após o processo de síntese através no evaporador rotatório, o solvente é destinado a uso interno no laboratório, sendo comumente empregado na limpeza de vidrarias.
36 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Síntese Multicomponente
Foram realizados diferentes procedimentos de síntese, a fim de avaliar a influência do catalisador, da temperatura e da presença ou não de solventes. Primeiramente fora feito a otimização do processo de síntese, que tem seu resultado sumarizado na Tabela 1, estes testes fizeram uso de etanol como solvente, o procedimento de purificação adotado fora a cromatografia em coluna.
Tabela 1 – Resultados obtidos na síntese multicomponente do Im-DHP.
Nº Temp. Catalisador Solvente Tempo
Rend.%
1
75ºC
Fe-SBA-15
EtOH
30 min
82%
2
75ºC
Fe-SBA-15
EtOH
1h30min
93%
3
75ºC
-
EtOH
1h30min
63%
4
75ºC
-
EtOH
24h
85%
O catalisador Fe-SBA-15 não fora caracterizado quanto a proporção de metal/sílica, sendo assim a quantidade adicionada à reação (200 mg/mmol de aldeído) fora determinada por simples correlação rendimento/quantidade mássica, dado obtido para formação de 1,4-dihidropiridinas durante período de iniciação científica. O catalisador foi caracterizado por adsorção-dessorção de nitrogênio gasoso através das técnicas de BET e BJH, resultando, respectivamente em um material de alta área específica (219,67 m2g-1) e mesoporoso (3,9 nm), características adequadas para um
catalisador heterogêneo.
A primeira diferença observada durante os procedimentos experimentais foi que a síntese que fez uso do catalisador heterogêneo apresentou uma coloração vermelho vinho muito intenso após 10 min. da reação, enquanto as reações conduzidas sem o catalisador apresentaram mudança do incolor para amarelo intenso. O mesmo acontece com o produto sólido, aquele obtido no processo catalisado apresenta cor com tons de marrom. Enquanto o na reação sem catalisador o sólido é amarelo. Esta característica fora a responsável pelos estudos de complexação com metais de transição, já que a diferença nas tonalidades de cor podem sugerir uma possível complexação entre um intermediário/produto da reação com o ferro (II) ou ferro (III) presentes na partícula heterogênea.
37 O tempo reacional fora otimizado através do uso de CCD, através das entradas 1 e 2 da tabela, uma eluição 30/70 em acetato de etila/hexano fora adotada após testes com os reagentes de partida, o imidazolaldeído não é revelado por nenhuma técnica aplicada, o mesmo acontece com o acetato de amônio, sendo assim o único reagente visível na CCD fora o acetoacetato de metila, que possuí um Rf = 0,54, esta não foi escolhida para acompanhar o desenvolvimento da reação pois ela difunde muito facilmente na placa e muitas vezes mistura-se com as manchas vizinhas. A Figura 9 mostra uma representação da placa de CDD obtida durante a execução do experimento.
Figura 9 – Simulação ao lado de foto da placa de CCD obtida pela eluição de alíquotas do início e no fim da reação. Foi utilizando uma solução 30/70 de acetato de etila/hexano como eluente e as manchas foram reveladas em vanilina sulfúrica. (Imagem autoral)
Alíquotas da reação foram coletadas em intervalos regulares de 5 minutos, nota-se que a mancha de Rf = 0,54 some durante a reação, enquanto a mancha na base aumenta. Isso sugere que o acetoacetato (Rf = 0,54) é consumido para dar origem ao produto (Rf = 0). Os experimentos em CCD auxiliaram na elucidação da metodologia de purificação, a informação do alto coeficiente de retenção na sílica, com Rf = 0, permitiu que este composto fosse facilmente isolado através da coluna cromatográfica, uma eluição com uma mistura 30/70 de acetato de etila/hexano pode remover os reagentes e intermediários, enquanto o produto permaneceu adsorvido na sílica. A eluição da coluna fora acompanhada por CCD, sendo assim, quando as alíquotas passaram a não apresentar mais nenhuma mancha revelada, fora trocado o
38 eluente, passando a uma mistura 10/90 metanol/acetato de etila. Com a mudança na polaridade o composto retido é facilmente removido, as alíquotas que continham somente a mancha na base foram misturadas, evaporadas e o produto final pode ser quantificado. O rendimento fora calculado considerando que o composto obtido fora o produto final, este rendimento mostrou influência na presença do catalisador, onde as Entradas 2-3 mostram que as reações sem uso de catalisadores ocorreram com menor conversão, sendo assim o catalisador se mostrou uma boa opção para o processo de síntese, promovendo um incremento no rendimento obtido.
5.2. Caracterização do Produto
O produto (Im-DHP) obtido foi caraterizado com diferentes técnicas espectroscópicas e espectrométricas a fim de comprovar a estrutura do produto inédito. Os primeiros passos da caracterização foram os espectros de RMN de 1H e
de 13C, que auxiliaram na comprovação da estrutura dos átomos de carbono e de
hidrogênios da molécula. Para complementar as evidências estruturais observadas através do RMN, fora observado a presença dos grupos funcionais através do espectro vibracional na região do IV. A Figura 10, 11 e 12 mostram os espectros obtidos.
39 No espectro de hidrogênio é possível observar 6 sinais de alta intensidade, nota-se que o hidrogênio N-H da piridina e do imidazol não podem ser observados, a presença de água em 5.06 ppm justifica a ausência deste sinal, já que estes são prótons ácidos e podem facilmente ser trocados por átomos de deutério, que inibe o aparecimento do sinal. Além disso a água aparece desblindado, justamente pela presença do metanol, produzindo uma forte ligação de hidrogênio entre os solventes. Em 7.18 ppm tem-se o sinal mais desblindado do espectro, que só pode ser referente aos hidrogênios do imidazol, estes aparecem sobrepostos justamente pelo efeito da presença de água comentado anteriormente, indicando que o anel imidazólico está simétrico, tornando assim o efeito da desblindagem magneticamente equivalente em ambos hidrogênios. O hidrogênio de integral igual a 1 hidrogênio aparece em 5.29 ppm e representa o hidrogênio ligado ao carbono sp3 da estrutura. O sinal em 3.67
ppm equivale a 6 hidrogênios, sendo o sinal dos grupos metílicos do éster, já que eles são mais desblindados por estarem próximos a conjugação do éster. Finalmente em 2.34 ppm aparecem os sinais do grupo metílico do anel central. Os sinais em 3.30-3.40 ppm são do metanol deuterado utilizado como solvente. O último sinal, em 1.94 ppm possivelmente corresponde ao íon acetato, que pode formar um sal com o produto, indicando que grupo imidazólico esta protonado na estrutura.
40 O espectro de carbono mostra todos os sinais correspondentes a estrutura da molécula, começando pelo imidazol, temos em 151.4 ppm o carbono que faz a ligação a dihidropiridina, enquanto os outros dois carbonos do imidazol aparecem em 119.0 ppm, esta informação corrobora com a hipótese do imidazol estar na forma aromática na estrutura, como observado através do espectro de hidrogênios anteriormente.
O anel central da dihidropiridina tem em 148.5 ppm os carbonos vizinhos ao nitrogênio, enquanto em 97.0 ppm os outros dois carbonos do anel central, faltando somente o carbono sp3, que aparece em 34.1 ppm. Os sinais do éster aparecem em
167.5 ppm, com os carbonos carbonílicos, sendo os mais desblindados da estrutura. O grupamento metílico do éster possuí uma desblindagem maior, sendo observado em 50.4 ppm enquanto os grupos metílicos conectados diretamente ao anel possuem deslocamento de 17.5 ppm. O sinal mais intenso, em 48.5 ppm corresponde ao CD3OD, utilizado como solvente. O último sinal ocorre em 21.20 ppm, sendo este um
deslocamento característico do íon acetato.40
41 O espectro de infravermelho corrobora para a identidade dos grupos funcionais, é possível observar em 3296 cm-1, que corresponde ao processo vibracional da
ligação N-H da dihidropiridina, o mesmo estiramento N-H do anel imidazólico geralmente aparece na forma de uma banda larga, que aparece como ombro em 3510 cm-1, este se sobrepõe ao estiramento N-H da dihidropiridina. A região entre 3100 e
2900 cm-1 pode ser atribuída aos estiramentos C-H. Os mais energéticos devem ser
os do tipo aromático e alceno, que estão presentes no anel central e no imidazol, já os estiramentos C-H de alquílicos devem ser os menos energéticos, estando abaixo de 3000 cm-1. É possível também observar três picos na região entre 1680-1640 cm -1, estes podem ser atribuídos ao estiramento C=O do éster e aos estiramentos C=C
das duplas ligações no anel central e do anel imidazólicos. Os picos abaixo deste valor não foram analisados pela dificuldade de atribuição de suas identidades.
Para comprovar a identidade do composto fora realizado o espectro de massas de alta resolução, que encontra-se na Figura 13.
42 Através do espectro de massas foi possível aferir a identidade de 4 picos, a Tabela 2 abaixo mostra a possível identidade do pico, bem como o erro relativo quando comparado a massa teórica calculada.
Tabela 2 – Identidade dos picos A-D e seu erro relativo a fórmula estrutural teórica.
Pico ID Massa (Exp.) Razão m/z Erro (*10-4)%
A [Frag A]+ 258,0876 258,0879 1,046
B [M+H]+ 292,1297 292,1292 1,770
C [M+Na]+ 314,1109 314,1111 0,347
D [2M+H]+ 583,2499 583,2510 2,040
O espectro de massas no modo íon positivo só detecta cátions, parte do preparo de amostra envolve a acidificação da amostra, sendo assim ocorre a formação e detecção de alguns adutos que se formam entre os compostos e até mesmo com fragmentos na fase gasosa.41. O pico A fora corresponde ao fragmento A (Frag. A),
que tem sua rota de fragmentação proposta pelo Esquema 10.
Esquema 10 – Estrutura do fragmento A, identificado no EMAR do composto 6a.(Adaptado de Wei et al. 2015).42
A primeira fragmentação ocorre facilmente com eliminação de H2, a
aromatização leva a estrutura a planaridade, com os dois ciclos aromáticos em ressonância. Em seguida ocorre a fragmentação nas cadeias laterais, a carbonila é um centro eletrofílico que facilmente elimina –MeOH, formando o fragmento A.42
Os outros dois picos identificados correspondem aos adutos [M+Na]+ e
[2M+H]+, o aduto de sódio (Pico C) é comumente formado na espectroscopia de
massas que utiliza ionização por eletrospray (ESI), o modo positivo de detecção é sensível a sódio, que é uma impureza comum em nos solventes utilizados como fase
43 móvel e nos procedimentos de síntese.43Adutos do tipo dímero (Pico D) podem ser
formar facilmente nos espectros obtidos por ESI, neste aduto dois equivalentes do composto formam um dímero através de da ligação de hidrogênio com 1 próton.41
Os compostos também tiveram seus espectros de absorção na região UV-vis e o espectro de fluorescência obtidos, estes encontram-se na Figura 14.
Figura 14 – Espectros na região do ultravioleta visível e de fluorescência (
exc. =350 nm) do Im-DHP, obtido em metanol.
Para realizar os espectros fora utilizado uma solução metanólica do Im-DHP, a diluição resultou em uma concentração final de 3,39x10-5 mol L-1, a intensidade no
comprimento de onde de máxima absorção (Máx) fora de 0,3428. Sendo assim o
calculado é de 10096 L mol-1cm-1, um valor de coeficiente de absortividade alto, jáque na classe de 1,4-DHP’s utilizadas como fármaco o dos compostos oscila entre 4900-7000 L mol-1 cm-1. O Máx do Im-DHP está dentro da faixa comum da classe que
se estabelece entre 300-420 nm, já que o valor do Máx obtido foi de 350 nm e quando comparamos este com o Máx (372 nm,
6410 L mol-1 cm-1) do HEH em metanol (Apêndice 1), podemos observar um deslocamento para azul. Quando se insere um anel aromático na posição 4 da dihidropiridina, ocorre a extensão do sistema eletrônico π da DHP ao substituinte aromático, provocando a diminuição no Máx (deslocamento para vermelho) de absorção e comumente aumentando o
dos44 compostos.44 O efeito obtido foi contrário do esperado, mas pode ser justificado pela
presença da ligação N-H do imidazol, que pode realizar ligações de hidrogênio com o metanol, sendo esta a provável causa do deslocamento para azul.45 A banda de
absorção encontrada nos espectros das 1,4-DHP’s com substituintes aromáticos é uma combinação da absorção de dois sistemas conjugados π separados por um carbono sp3 isso torna o efeito dos substituintes muito relevante para os espectros
destes sistemas.46
O espectro de fluorescência possuí comprimento de onda de emissão (Ems) localizado em 436 nm, correspondendo a um deslocamento de Stokes (𝜈̅) de 5600 cm-1, quando comparado ao (Ems = 458 nm , 𝜈 ̅ = 5050 cm-1) do HEH em metanol
(Apêndice 2) podemos observar um deslocamento para vermelho, este efeito sugere que o estado excitado da Im-DHP é mais estabilizado quando comparado ao HEH, possivelmente em virtude da presença das ligações de hidrogênio do imidazol.44
5.3. Redução de Impactos no Procedimento de Síntese
A fim de investigar um processo de síntese que necessite purificação em coluna cromatográfica, que utiliza grande volume de solventes orgânicos tóxicos, como hexano e acetato de etila, fora investigado um procedimento alternativo com menor impacto ambiental. O procedimento adotado utiliza catalisador heterogêneo de ferro e cobre, FeCu-SBA15, desta vez sem solventes. Para obtenção do produto fora adotado o método de precipitação com éter. Fora testado também o efeito de substituintes nas cadeias laterais sobre o rendimento, gerando novos derivados (Figura 15).
45 Os derivados puderam ser obtidos por variações na cadeia leteral do éster acetoacético utilizando, sendo sintetizado 4 novos derivados, que tem seus rendimentos descritos na Tabela 3.
Tabela 3 - Procedimentos de síntese a 90 ºC, sem solvente por 2 horas.
Estrutura
Catalisador
Rend.%
6a
FeCu-SBA-15
68%
6b
FeCu-SBA-15
64%
6c
FeCu-SBA-15
27%
6d
FeCu-SBA-15
56%
6a
-
54%
6b
-
47%
6c
-
-
6d
-
44%
O processo de síntese mostrou que a inserção de grupos laterais volumosos diminui consideravelmente o rendimento da reação, com e sem adição de catalisadores. Estes grupos volumosos exercem impedimento estérico na etapa de ciclização do anel, promovendo os baixos rendimentos observados. A falta de solventes se mostrou um problema para as reações que utilizaram catalisadores, ocorre a formação de uma pasta viscosa junto com os reagentes e catalisadores sólidos, promovendo dificuldades de homogeinização pelo agitador magnético, que incrementa conforme se precipita o produto reacional. O procedimento de precipitação no entanto se mostrou um procedimento conveniente para obtenção dos produtos, este utiliza 5 mL’s de solvente, representando uma redução de 70x no volume de solvente quando comparado com o procedimento por coluna cromatográfica, há também reduções no custo e no tempo de execução do experimento. O eter etílico é um solvente altamente volátil, o que permite uma fácil recuperação do solvente após o procedimento de purificação.
Os produtos obtidos foram caraterizados somente por UV-Vis e espectroscopia de infravermelho, os produtos 6c e 6d apresentaram baixísssima solubilidade até mesmo em metanol, dificultando o processo de caracterização. No entanto, a obtenção do produto sólido, e as informações espectrais são bons indícios para confirmação do sucesso do processo de síntese. Os espectros de UV-Vis encontra-se na Figura 16.
46 Figura 16 – Espectros de UV-Vis dos compostos 6a-6d, obtidos em metanol.
Os espectros mostram uma tendência já relatada na literatura, a inserção de grupos laterais nas cadeias do éster não promove grandes efeitos no comprimento de onda máximo de absorção, pode-se observar que alterando a cadeia lateral de metil para etil e tert-butil não houve alterações significativas no espectro. Já a inserção do grupo benzílico mostrou o maior efeito sobre o espectro, onde surge um pico de alta intensidade em 220 nm, relativo a absorção dos dois novos anéis aromáticos inseridos na estrutura. Houve deslocamento para o vermelho,indicando que grupos volumosos diminuem a energia da banda de absorção.44
O infravermelho dos compostos, representados na Figura 17, apresentam novas evidências que corroboram com as obtidas anteriormente, sendo possível observar mudanças nas bandas vibracionais correspondente aos grupos inseridos.
6a 6b 6d 6c
47 Figura 17 – Espectro de infravermelho obtido em pastilhas de KBr dos compostos 6a-6d.
Os espectros apresentam o mesmo padrão de picos vibracionais, com o aumento do grupo lateral de metil para etil e tert-butil pode-se notar um incremento consideravel na transmitância da vibração C-H de alcanos, em 2950 cm-1, houve
também um aumento na intensidade da vibração N-H, indicando que os grupos volumosos alteram a geometria, consequentemente os modos vibracionais do anel central. A inserção do grupo benzílico produz efeito semelhante, deslocando para o vermelho as vibrações N-H e aumentando a intensidade da vibração angular da ligação C-H de grupos metílicos em 1480 cm-1 e do estiramento C-O do éster, em
1250 cm-1. Estes dados em conjunto com os espectros da absorção no UV-Vis
constituem boas evidências do sucessodo método de síntese empregado. 5.4. Fotoestabilidade de 1,4-Dihidropiridinas
Para realização do teste de fotoestabilidade foram preparadas soluções do HEH, Ph-DHP e Im-DHP (Figura 18), a fim de avaliar o efeito da inserção de grupos aromáticos e de diferentes solventes na fotoestabilidade dos compostos.
6a 6b 6d 6c
