UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA AGRÍCOLA
LUÍSA MATTIELLO FRANCISCO
PROCESSAMENTO ANAERÓBIO DE UM SUBSTRATO
COMPLEXO USANDO CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM,
CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII E CULTURA MISTA
CAMPINAS 2018
LUÍSA MATTIELLO FRANCISCO
PROCESSAMENTO ANAERÓBIO DE UM SUBSTRATO
COMPLEXO USANDO CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM,
CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII E CULTURA MISTA
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia Agrícola da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Engenharia Agrícola, na Área de Água e Solo.
Orientador: Prof. Dr. Gustavo Mockaitis
CAMPINAS 2018 ESSE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA LUÍSA MATTIELLO FRANCISCO E ORIENTADA PELO PROFESSOR DOUTOR GUSTAVO MOCKAITIS.
Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado defendida por Luísa Mattiello Francisco, aprovada pela Comissão Julgadora em 24 de maio de 2018, na Faculdade de Engenharia Agrícola da Universidade Estadual de Campinas.
________________________________________________________________ Prof. Dr. Gustavo Mockaitis – Presidente e Orientador
FEAGRI/UNICAMP
_________________________________________________________________ Prof. Dr. Eugenio Foresti – Membro Titular
USP/São Carlos
_________________________________________________________________ Prof. Dr. Marcelo Zaiat – Membro Titular
USP/São Carlos
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica da discente.
DEDICATÓRIA
Dedico esse Trabalho aos meus pais Antônio e Fátima, sempre presentes em cada passo da minha vida, pelos quase 30 anos de muita saúde, crescimento pessoal,
alegrias, realizações e contínuo
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Gustavo Mockaitis por sua orientação.
Ao Prof Dr. Guilherme Peixoto pela presença, acompanhamento e colaboração apesar da distância física, trazendo alternativas em momentos cruciais da pesquisa.
Aos Professores do LPB/EESC que continuaram ao meu lado, apoiando e auxiliando mesmo após minha graduação.
À Ritinha da pós-graduação da FEAGRI por todo auxílio e cuidado.
Às amigas do laboratório, principalmente Maria Lidia, Maria Paula e Juliana Martins por toda ajuda no dia a dia do laboratório, compartilhando conhecimentos e experiências.
Ao aluno de iniciação científica Guilherme por toda dedicação e perseverança durante a fase experimental.
Ao Weslei pela atenção, ajuda e disponibilidade na fase final do trabalho.
Ao CEMPEQC pelo apoio da sua estrutura física para a realização de análises, confiando na minha pesquisa e trabalho.
À minha família por tudo que me ensinou e continua me ensinado. Sendo meus exemplos e fonte de admiração.
Ao meu irmão, Bruno, e minha cunhada, Marília, por me apoiarem e sempre trazerem alegria, em especial agora com a Clara.
Ao meu namorado, Thiago, pela paciência, força e companheirismo. A CAPES, pela concessão temporária de bolsa.
“Se eu vi mais longe, foi por estar sobre ombros de gigantes.” Isaac Newton
RESUMO
O presente trabalho avaliou de forma exploratória a produção de ácidos e solventes a partir de um substrato complexo em reatores anaeróbios (frascos de 500 mL) operados em tréplicas à temperatura de 35 °C. Três diferentes inóculos foram estudados: Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii e biomassa anaeróbia proveniente de reator UASB pré-tratada com choque ácido e térmico. O substrato complexo, contendo sacarose como carboidrato sem adição de vitaminas, solução tampão e micronutrientes, visa a futura substituição do mesmo por vinhaça da cana de açúcar. O ensaio foi conduzido em duas etapas distintas nas quais foram investigadas a influência do inóculo e a variação das relações S/M (substrato/micro-organismo), por meio do aumento da concentração de substrato. As concentrações de sacarose no substrato complexo foram de 2,6 g·L-1 (condições de 5.000 mg O
2·L-1 em termos de DQO), 5,2 g·L-1
(condições de 10.000 mg O2·L-1 em termos de DQO) e 10,5 g·L-1 (condições de 20.000 mg
O2·L-1 em termos de DQO), mantendo a concentração de inóculo inicial em 500 mg SVT∙L-1.
A produção dos ácidos ocorreu de forma distinta entre as culturas puras e a cultura anaeróbia mista. As culturas puras (C. acetobutylicum e C. beijerinckii) resultaram em elevada produção de ácido lático. Concentrações de DQO de 10.000 mg O2·L-1 e 20.000 mg O2·L-1 produziram
respectivamente máximas de ácido lático de 3.331 mg·L-1 e 6.417 mg·L-1 com C. acetobutylicum
e máximas de 5.709 mg·L-1 e 7.136 mg·L-1 com C. beijerinckii. Em contrapartida, os reatores
com cultura anaeróbia mista produziram ácido butírico com máxima de 1.092 mg·L-1 em
concentrações de DQO de 10.000 mg O2·L-1 e máxima de 4.695 mg·L-1 em concentrações de
DQO de 20.000 mg O2·L-1. Os solventes detectados foram etanol e butanol principalmente
quando utilizado cultura anaeróbia mista, com máximas de etanol de 3.644 mg·L-1 (0,9
g-etanol·g-sacarose-1) e butanol de 22,3 mg·L-1 (0,007 g-butanol·g-sacarose-1) em concentrações
de DQO de 20.000 mg O2·L-1. Houve repetibilidade nos reatores ao considerar nível de
significância de 0,05, independente da concentração e inóculo utilizado. Desta forma, o presente estudo identificou adaptabilidade dos três inóculos ao substrato complexo e variabilidade na produção de ácidos e solventes nas diferentes relações S/M trabalhadas.
PALAVRAS-CHAVE: Ácido lático; Ácido butírico; Solventes; C. acetobutylicum; C. beijerinckii; Relação S/M; Processamento anaeróbio.
ABSTRACT
This study investigated the production of acids and solvents from a complex substrate in anaerobic reactors (500 mL bottles) operated in triplicates at 35 °C temperature. Three different inoculum were studied: Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii and anaerobic biomass from UASB pretreated with acid and thermal shock. The nutrient medium had as carbon source a complex substrate containing sucrose without addition of vitamins, buffer solution and micronutrients. This complex substrate is expected to be replaceable in the future by vinasse of sugar cane. The experiment was conducted in two distinct stages in which were investigated the influence of the inoculum used and the variation of F/M-ratio(food-to-microorganisms) by increasing substrate concentration. The concentration of sucrose in the complex substrate were 2.6 g·L-1 (conditions of 5,000 mg O
2·L-1 in terms of COD), 5.2 g·L-1
(conditions of 10,000 mg O2·L-1 in terms of COD) and 10.5 g·L-1 (conditions of 20,000 mg O2·L -1 in terms of COD), keeping the initial concentration of inoculum in 500 mg SVT∙L-1. Pure
culture and mixed anaerobic culture produced different acid concentration. Pure cultures (C. acetobutylicum and C. beijerinckii) resulted in high lactic acid production. Concentrations of COD of 10,000 mg O2·L-1 and 20,000 mg O2·L-1 respectively produced optimum lactic acid of
3,331 mg·L-1 and 6,417 mg·L-1 with C. acetobutylicum and optimum of 5,709 mg·L-1 and 7.136
mg·L-1 with C. beijerinckii. On the other hand, reactors with mixed anaerobic culture produced
optimum of 1,092 mg·L-1 butyric acid in COD concentrations of 10,000 mg O
2·L-1 and a
maximum of 4,695 mg·L-1 in concentrations of COD of 20,000 mg O2·L-1. The solvents
ethanol and butanol were detected mainly with mixed anaerobic cultures. The optimum ethanol production reached 3,644 mg·L-1 (0.9 g-ethanol·g-sucrose-1) and butanol reached 22.3 mg·L-1
(0.007 g-butanol·g-sucrose-1) at conditions of 20,000 mg O
2·L-1 in terms of COD. There was
repeatability in the reactors when considering level of significance of 0.05, independent of the concentration and inoculum used. Therefore, the present study identified the adaptability of all three inoculums to the complex substrate and the variability production of acids and solvents in the different F/M-ratio.
KEYWORDS: Lactic acid; Butyric acid; Solvents; C. acetobutyric; C. beijerinckii; F/M-ratio; Anaerobic processing.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Fluxograma do processo produtivo do etanol a partir da cana-de-açúcar em usinas anexas ... 21
Figura 2 – Rota metabólica de C. acetobutylicum. Transição da fermentação acidogênica (cor preto e linha contínua) para solventogênica (cor azul e linha tracejada). Os números indicam as enzimas: (1) enzimas presentes na glicólise; (2) Oxidoredutase de piruvato-ferredoxina; (3) Hidrogenase; (4) Acetiltransferase de fosfato; (5) Acetato quinase; (6) Acetaldeído desidrogenase; (7) Etanol desidrigenase; (8) Acetiltransferase (Tiolase); (9) Acetoacetil-CoA: acetato/butirato: CoA-transferase; (10) Acetoacetato descarboxilase; (11) 3-Hidroxibutiril-CoA desidrogenase; (12) Crotonase; (13) Butiril-CoA desidrogenase; (14) Butiltransferase de fosfato; (15) Butirato quinase; (16) Butiraldeido desidrogenase; (17) Butanol desidrogenase ... 28
Figura 3 – Fluxograma representativo do procedimento experimental. ... 36 Figura 4 – Perfis de concentração de sacarose nos ensaios com inóculo C. acetobutylicum (condições Ac-1 e Ac-5), C. beijerinckii (condições Bj-1 e Bj-5) e cultura anaeróbia mista (condições Lo-1 e Lo-5) ... 45
Figura 5 – Perfis de pH nos ensaios com inóculos C. acetobutylicum (condições Ac-1 e Ac-5), C. beijerinckii (condições Bj-1 e Bj-5) e cultura anaeróbia mista (condições 1 e Lo-5) ... 47
Figura 6 – Reatores com inóculo C. acetobutylicum e concentração de DQO de 5.000 mg O2·L-1 ... 53
Figura 7 – Reatores com inóculo C. beijerinckii e concentrações de DQO de 5.000 mg O2·L-1. ... 54
Figura 8 – Reatores com cultura anaeróbia mista e concentrações de DQO de 5.000 mg O2·L-1. ... 56
Figura 9 ‒ Perfis de concentração de sacarose nos ensaios com inóculos C. acetobutylicum (condições Ac-10 e Ac-20), C. beijerinckii (condições Bj-10 e Bj-20) e cultura anaeróbia mista (condições Lo-10 e Lo-20) ... 60
Figura 10 - Perfis de pH nos ensaios com inoculo C. acetobutylicum (condições Ac-10 e Ac-20), C. beijerinckii (condições Bj-10 e Bj-20) e cultura anaeróbia mista (condições Lo-10 e Lo-20) ... 64
10.000 mg O2·L-1. ... 69
Figura 12 – Reatores com inoculo C. beijerinckii para concentrações de DQO de 10.000 mg O2·L-1 ... 70
Figura 13 – Reatores com cultura anaeróbia mista para concentrações de DQO de 10.000 mg O2·L-1. ... 72
Figura 14 – Reatores com inóculo C. acetobutylicum para concentrações de DQO de 20.000 mg O2·L-1. ... 73
Figura 15 – Reatores com inóculo C. beijerinckii para concentrações de DQO de 20.000 mg O2·L-1. ... 74
Figura 16 – Reatores com cultura anaeróbia mista para concentrações de 20.000 mg O2·L-1. ... 75
Figura 17 – Produção de butanol nos reatores com concentrações de DQO de 10.000 mg O2·L-1 (condiçãoBj-10 ◊) e 20.000 mg O2·L-1 (condições Ac-20 ○, Bj-20 e Lo-20 □). . 77
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Composição da vinhaça segundo diversos autores ... 22 Tabela 2 – Caracterização físico-química e de macr- e micronutrientes da vinhaça de cana-de-açúcar ... 24
Tabela 3 – Composição química do substrato para a concentração final de 4.000 mg O2
L-1, em termos de demanda química de oxigênio (DQO)... 25
Tabela 4 – Reações a partir de glicose e energia de Gibbs em processos fermentativos ... 27 Tabela 5 – Delineamento experimental da investigação da influência da variação da carga orgânica específica (vinhaça sintética) em temperatura mesofílica e do tipo de inóculo35
Tabela 6 – Concentração de sacarose (mg∙L-1) nos ensaios de 1.000 mg O
2·L-1, 5.000
mg O2·L-1, 10.000 mg O2·L-1 e 20.000 mg O2·L-1 (em termos de DQO) com C. acetobutylicum,
C. beijerinckii e cultura anaeróbia mista ... 37 Tabela 7 – Variáveis e seus respectivos métodos de execução ... 39 Tabela 8 – Condições iniciais e finais dos ensaios com C. acetobutylicum utilizando vinhaça sintética como substrato nas concentrações 1.000 mg O2·L-1 e 5.000 mg O2·L-1 ... 42
Tabela 9 – Resultados das tréplicas dos ensaios com C. beijerinckii utilizando concentrações de DQO de 1.000 mg O2·L-1 e 5.000 mg O2·L-1 ... 43
Tabela 10 – Condições iniciais e finais dos ensaios com cultura anaeróbia mista utilizando concentrações de DQO de 1.000 mg O2·L-1e 5.000 mg O2·L-1... 44
Tabela 11 – Resultados da ANOVA para o consumo de sacarose nos ensaios com inóculo C. Acetobutylicum (Ac), C. beijerinckii (Bj) e cultura anaeróbia mista (Lo) ... 47
Tabela 12 – Resultados da ANOVA para o perfil de pH nos ensaios com inóculo C. Acetobutylicum (Ac), C. beijerinckii (Bj) e cultura anaeróbia mista (Lo) ... 49
Tabela 13 ‒ Concentrações de sulfato (SO42-) nos ensaios utilizando os inóculos C.
acetobutylicum (condições Ac-1 e Ac-5), C. beijerinckii (condições Bj-1 e Bj-5) e cultura anaeróbia mista (condições Lo-1 e Lo-5) ... 50
Tabela 14 – Resultados da ANOVA para o concentração de sulfato nos ensaios com inóculos C. Acetobutylicum (Ac), C. beijerinckii (Bj) e cultura anaeróbia mista (Lo) ... 50
Tabela 15 – Concentrações iniciais de ácidos orgânicos voláteis, álcoois e de sulfato para os ensaios em concentrações de DQO de 5.000 mg O2·L-1 com C. acetobutylicum, C.
Tabela 16 – Parâmetros cinéticos (Amáx, Amín, l e p) e coeficiente de correlação (R2) relativos a produção de etanol, ácido butírico e ácido actético obtidos no ensaio em concentrações de DQO de 5.000 mg O2·L-1 utilizando C. acetobutylicum como inóculo ... 54
Tabela 17 – Parâmetros cinéticos (Amáx, Amín, l e p) e coeficiente de correlação (R2) relativos a produção de etanol e ácido butírico obtidos no ensaio em concentrações de DQO de 5.000 mg O2·L-1 utilizando cultura anaeróbia mista como inóculo ... 57
Tabela 18 – Condições iniciais e finais dos ensaios com C. acetobutylicum utilizando substrato complexo nas concentrações de DQO de 10.000 mg O2·L-1e 20.000 mg O2·L-1 ... 57
Tabela 19 – Valores iniciais e finais dos parâmetros monitorados nos ensaios com C.
beijerinckii utilizando vinhaça sintética como substrato nas concentrações 10.000 mg O2·L-1e
20.000 mg O2·L-1 ... 58
Tabela 20 – Condições iniciais e finais dos ensaios com cultura anaeróbia mista nas concentrações de DQO de 10.000 mg O2·L-1e 20.000 mg O2·L-1... 59
Tabela 21 – Parâmetros cinéticos (k1app, CI e CR), eficiência absoluta (EA) e coeficiente
de correlação (R2) relativos ao consumo da sacarose e obtidos pelo ajuste dos perfis de
concentração de sacarose com inóculo C. acetobutylicum (condições Ac-10 e Ac-20) e C. beijerinckii (condições Bj-10 e Bj-20) ... 62
Tabela 22 – Parâmetros cinéticos (k1app, CI e CR), eficiência absoluta (EA) e coeficiente
de correlação (R2) relativos ao consumo da sacarose e obtidos pelo ajuste dos perfis de
concentração de sacarose nos ensaios com inoculo cultura anaeróbia mista (condições Lo-10 e Lo-20) ... 63
Tabela 23 – Resultados da ANOVA para o consumo de sacarose nos ensaios com inóculos C. acetobutylicum (Ac), C. beijerinckii (Bj) e cultura anaeróbia mista (Lo) ... 65
Tabela 24 – Resultados da ANOVA para o perfil de pH nos ensaios com inoculo C. acetobutylicum (Ac), C. beijerinckii (Bj) e cultura anaeróbia mista (Lo) ... 65
Tabela 25 ‒ Concentrações de sulfato (SO42-) nos ensaios utilizando os inóculos C.
acetobutylicum (condições Ac-10 e Ac-20), C. beijerinckii (condições Bj-10 e Bj-20) e cultura anaeróbia mista (condições Lo-10 e Lo-20) ... 66
Tabela 26 – Resultados da ANOVA para o concentração de sulfato nos ensaios com inóculos C. acetobutylicum (Ac), C. beijerinckii (Bj) e cultura anaeróbia mista (Lo) ... 67
Tabela 27 – Concentrações iniciais de ácidos orgânicos voláteis, álcoois e de sulfato para os ensaios em concentrações de DQO de 10.000 mg O2.L-1 e 20.000 mg O2.L-1 utilizando
Tabela 28 – Parâmetros cinéticos (Amáx, Amín, l e p) e coeficiente de correlação (R2) relativos a produção de etanol e ácido butírico obtidos nos ensaios com concentração de DQO de 20.000 mg O2·L-1 utilizando cultura anaeróbia mista como inóculo ... 76
Tabela 29 – Concentrações iniciais de sacarose, concentrações finais de ácidos orgânicos voláteis (acético, butírico, propiônico e lático), concentrações finais de solventes (etanol e butanol), produtividade média (Pm,g·L-1·h-1), rendimento de etanol (YEtOH) e rendimento de
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABE Acetona, Butanol e Etanol
AGV Ácidos Graxos Voláteis
BRS Bactérias Redutoras de Sulfato
CG Cromatografia Gasosa
C/N Relação Carbono/Nitrogênio
DQO Demanda Química de Oxigênio
HPLC
NAD
Cromatografia Líquida
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
S/M Relação Substrato/Micro-organismo
STD Sulfetos Totais Dissolvidos
SVT Sólidos Voláteis Totais
UASB Up Flow Anaerobic Sludge Blanket (Reator anaeróbio de manta de lodo e escoamento ascendente)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 18
2 OBJETIVO ... 19
2.1 Objetivos específicos ... 19
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 20
3.1 Setor sucroalcooleiro no Brasil ... 20
3.2 Os resíduos da indústria sucroalcooleira ... 22
3.3 Biorrefinaria ... 26
3.4 Fermentação ABE ... 27
3.5 Fermentação lática ... 32
3.6 Produção de ácidos e solventes a partir de resíduos agroindustriais ... 32
3.7 Considerações finais ... 34 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 35 4.1 Procedimento Experimental ... 35 4.2 Meio Nutriente ... 36 4.3 Inóculo ... 37 4.4 Aparato Experimental ... 38 4.5 Análises físico-químicas ... 39 4.6 Modelo cinético ... 40 4.7 Análises estatísticas ... 41 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 42
5.1 Etapa 1 – Metabolismo das culturas C. acetobutylicum, C. beijerinckii e cultura anaeróbia mista ao utilizando substrato complexo em baixas concentrações ... 42
5.1.1 Comparação entre C. acetobutylicum, C. beijerinckii e cultura anaeróbia mista para concentração de DQO de 5.000 mg O2·L-1 ... 51
5.2 Etapa 2 – Metabolismo das culturas C. acetobutylicum, C. beijerinckii e cultura anaeróbia mista ao utilizar substrato complexo em altas concentrações ... 57
5.2.1 Comparação entre C. acetobutylicum, C. beijerinckii e cultura anaeróbia
mista para concentrações de DQO de 10.000 mg O2·L-1 e 20.000 mg O2·L-1 ... 67
5.3 Considerações finais ... 78
6 CONCLUSÃO ... 80
REFERENCIAS ... 82
APÊNDENCE 1 - Composição e concentração das soluções estoque e componentes dos meios nutrientes do substrato complexo para os ensaios de 1.000 mg O2·L-1, 5.000 mg O2·L-1, 10.000 mg O2·L-1 e 20.000 mg O2·L-1 (tem tremos de DQO). ... 86
1 INTRODUÇÃO
A busca pela substituição de combustíveis fósseis por outras fontes de energia renováveis cresce mundialmente, tendo como principal fator a pressão de políticas de preservação do meio ambiente. Os processos que utilizam biomassa como matéria-prima ao invés de fonte não renovável (petróleo) são denominados biorrefinaria. Exemplo de biorrefinaria no Brasil são as usinas de cana de açúcar. O aparente antagonismo entre a questão ambiental e o aumento da produtividade tomou dimensões que podem afetar a viabilidade econômica de alguns processos. Dessa forma, um conceito expandido de biorrefinaria visando um processo sustentável é a busca da utilização de todos os fluxos de materiais presentes em um processo biológico. Nas usinas de cana de açúcar, o novo conceito de biorrefinaria como um processo sustentável se estabelece ao utilizar seus resíduos, como a vinhaça, para a geração de produtos com maior valor agregado, como o butanol. A vinhaça é o resíduo da destilação do mosto fermentado da cana de açúcar, contendo alto teor de matéria orgânica, podendo servir como substrato para um processamento biológico subsequente.
O bioprocessamento anaeróbio solventogênico, que ocorre após a transformação acidogênica que gera principalmente os ácidos acético e butírico, é capaz de converter estes substratos em solventes, principalmente acetona, butanol e etanol. Este processo é intermediado em sua maior parte por bactérias do gênero Clostridium. No entanto, este processamento mostra eficiências de conversão e estabilidade muito boas apenas quando são utilizados substratos complexos. Diante dessa restrição, é necessário realizar estudos fundamentais sobre os fatores mais importantes que regulam as rotas metabólicas e a dinâmica dos microrganismos envolvidos nessa conversão para que um processo conduzido com resíduos também apresente bons rendimentos na produção de produtos com valor agregado. Este projeto objetiva avaliar de forma exploratória a produção de ácidos e solventes, por meio do bioprocessamento anaeróbio verificando a adaptabilidade de três diferentes inóculos (C. acetobutylicum, C. beijerinckii e cultura anaeróbia mista) e um substrato sintético complexo em processo conduzido em temperatura mesofílica (35 °C).
2 OBJETIVO
O presente projeto de pesquisa propõe, em duas etapas distintas, a investigação dos efeitos da variação da relação substrato/microrganismo (S/M) considerando três inóculos distintos. 2.1 Objetivos específicos
1. Avaliar a adaptação dos inóculos Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii e cultura mista ao substrato complexo;
2. Avaliar a produção de ácidos por meio da relação S/M com Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii e cultura mista como inóculo.
3. Avaliar a produção de solventes por meio da relação S/M com Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii e cultura mista como inóculo.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Setor sucroalcooleiro no Brasil
O etanol proveniente da cana-de-açúcar compõe parte significante da matriz bioenergética do Brasil. No levantamento de 2015, Brito Cruz et.al. (2016) mostram que 43,5% da matriz energética brasileira é proveniente de energia renovável, sendo 18,1% da cana de açúcar.
Essa representatividade do etanol na matriz energética do país iniciou-se por meio do Programa Nacional do Álcool (Proálcool) em Novembro de 1975 com a emissão do decreto nº 76.593 pelo Presidente Ernesto Geisel (LAW, 2008). A principal motivação do programa Proálcool foi diminuir a dependência brasileira do petróleo, cujo preço disparou subitamente em 1973 resultante do primeiro choque internacional do petróleo. O programa de incentivo ao preço do etanol, até 1999, foi realizado com o intuito do etanol ser competitivo à gasolina (COELHO et al., 2006). Outro fator que fortaleceu o programa trata-se da cana de açúcar ser uma cultura com balanço energético (diferença entre energia disponível e a energia consumida) positivo, ou seja, a energia produzida é maior que a energia consumida durante o plantio. Em 1989 ocorreu a crise do etanol com fim do Proálcool como um programa do governo, e consequentemente o decréscimo da produção de açúcar em 1990. Para compensar a queda do consumo de etanol, em 1993 foi redigida a Lei nº 8.723, a qual determinou que 22% de etanol fosse adicionado à gasolina (LAW, 2008). Como resultado, em 2003 houve a retomada do setor sucroalcooleiro com a introdução do automóvel “flex-fuel” no mercado brasileiro.
Na safra de 2014/2015 o Brasil produziu 634,8 milhões de toneladas de cana-de-açúcar em 9 milhões de hectares. Especificamente para produção de etanol foram 361 milhões de toneladas de cana-de-açúcar, equivalente à 56,9% da produção total (CONAB, 2017). O Estado de São Paulo possui alta influência nesse setor, representando 49,4% da produção de etanol do país. Na safra 2016/2017, o Estado de São Paulo produziu aproximadamente 365.9 milhões de toneladas de cana de açúcar (CENTRO-SUL, 2017).
A elevada produção de cana-de-açúcar no Brasil visa suprir o setor sucroalcooleiro, o qual gera, como principais produtos, o açúcar e o etanol. Os estudos de Moraes et al. (2015) e Junqueira e Dias (2012) destacam a existência de dois diferentes processos visando a produção de etanol nas usinas brasileiras: as usinas autônomas e as usinas anexas. As usinas autônomas possuem processos que produzem apenas etanol a partir do caldo de cana, enquanto as usinas anexas possuem processos que podem produzir açúcar a partir de uma fração de caldo de cana,
como também etanol a partir da outra fração do caldo de cana, juntamente com o melaço. A Figura 1 apresenta o processo produtivo de usinas anexas, as quais representam 71,88% (CONAB, 2017) das usinas brasileiras.
Figura 1 – Fluxograma do processo produtivo do etanol a partir da cana-de-açúcar em usinas anexas
Fonte: Adaptado de Junqueira e Dias (2012)
Diferentemente das usinas anexas conforme apresentado na Figura 1, as usinas autônomas, as quais produzem apenas etanol, não possuem os processos de concentração do caldo, cristalização e secagem referentes à produção do açúcar (JUNQUEIRA e DIAS, 2012). Apesar das diferenças de processos entre as usinas, todas possuem elevada produção de resíduos como bagaço e vinhaça.
3.2 Os resíduos da indústria sucroalcooleira
O etanol, apesar de ser uma interessante alternativa como biocombustível, continua sendo tema de pesquisa em busca de melhorias no processo produtivo. Nas usinas brasileiras, em média, uma tonelada de cana gera 280 kg de bagaço (RABELO et al., 2011) e 800 a 1.000 litros de vinhaça (BNDES & CGEE, 2008). A vinhaça da cana-de-açúcar é o resíduo líquido gerado em alta escala no processo produtivo do etanol. Conforme citado por Fuess e Garcia (2014) para 1 litro de etanol produzido são gerados em média 13 litros de vinhaça, podendo atingir 20 litros, dependendo da matéria-prima e da tecnologia utilizada.
Juntamente com a elevada quantidade de vinhaça gerada no processo produtivo do álcool, outro fator é seu potencial poluidor. A vinhaça possui elevadas concentrações de potássio, cálcio e magnésio, e encontra-se entre 85 ˚C a 90 ˚C na saída da torre de destilação (ROSSETTO, 1987 apud ROCHA, 2012). Conforme apresentado na Figura 1, existem dois diferentes tipos de vinhaça: vinhaça de mosto misto (resultado do caldo de cana juntamente com o melaço, em usinas anexas) e vinhaça do caldo (resultado do caldo de cana, em usinas autônomas). A vinhaça de mosto misto possui concentrações média de matéria orgânico superior à da vinhaça do caldo de cana, devido principalmente aos compostos fenólicos em sua composição, como ácidos tânicos e ácidos húmicos. A Tabela 1 apresenta a composição média da vinhaça de mosto misto e vinhaça do caldo (autônomas).
Tabela 1 – Composição da vinhaça segundo diversos autores
Parâmetro Referências Driessen et al. (1994) Prada et al. (1998) Siqueira et al. (2013) Ferraz Jr. et al. (2014) Santos et al. (2014)
Matéria-prima Caldo Caldo + melaço
DQOs(g L-1) 22 15-33 36,0-49,0 35,2 32,1-33,9 DBO (g L-1) 15 6-16,5 nd 16,7 Nd Ptotal (mg L-1) 58 10-120 35-111 160 208-236 NTK (mg L-1) 400 150-700 570-1.603 700 1.354-1.619 K (mg L-1) nd 1.200-2.100 2.334-3.147 nd 4.200-4.800 SO42- (mg L-1) 400 600-700 2.300-2.900 1.400 2.100-2.900 pH 3,5 3,7-4,6 4,3-4,6 4,6 4,3
Conforme apresentado na Tabela 1, a vinhaça possui elevada concentração de matéria orgânico (DQO e DBO).
Quando o tema é a vinhaça, uma alternativa mais utilizada pela agroindústria sucroalcooleira do Brasil é a disposição desse efluente no solo agrícola como forma de fertilização, conhecido como fertirrigação. Inicialmente a disposição da vinhaça no solo, se estendia aos corpos hídricos. Em 1980, no entanto, as portarias do Ministério do Interior no 323,
no 158 e no 124, proibiram o lançamento direto e indireto da vinhaça em qualquer corpo hídrico.
Devido ao aumento de plantio de cana no Brasil, juntamente com o crescimento da conscientização e força ambiental, em 2006 ficou vigente no estado de São Paulo a norma P 4.231 da CETESB (CETESB, 2006) que estabelece os critérios e procedimentos para a aplicação de vinhaça para enriquecimento do solo agrícola. Alguns parâmetros utilizados para limitação dessa prática é a profundidade e a fertilidade do solo, a concentração de potássio (não pode exceder 5% da Capacidade de Troca Iônica – CTC) e a extração média pela cultura (185kg de K2O por hectare por corte), além da avaliação da qualidade das águas subterrâneas e do solo.
A existência desses parâmetros, possibilita em casos que haja alteração das características do solo e da água, a suspensão da aplicação da vinhaça, e consequentemente a comunicação da Secretaria responsável. A vinhaça a ser aplicada ao solo como atividade de fertirrigação também deverá ser caracterizada, quanto aos seguintes parâmetros: pH, resíduo não filtrável total, dureza, condutividade elétrica, nitrogênio nitrato, nitrogênio nitrito, nitrogênio amoniacal, nitrogênio total Kjeldhal (NTK), sódio, cálcio, potássio, magnésio, sulfato, fosfato total, DQO e DBO (CETESB, 2006). Apesar do estado de São Paulo ter regularizado os critérios de aplicação da vinhaça em solo agrícola, a norma P 4.231 da CETESB negligencia o teor de matéria orgânica e os impactos das emissões atmosféricas (MORAES et al, 2015), os quais são fatores que interferem diretamente alteração do meio.
Com intuito de buscar alternativas à fertiirigação, existem diversos estudos relacionados com a vinhaça, desde a caracterização, o tratamento, até a disposição final deste efluente. A Tabela 2 apresenta, conforme realizado por Fuess (2017), a caracterização físico-química, de macronutrientes e micronutrientes da vinhaça proveniente da cana-de-açúcar. A caracterização baseou-se em seis coletas distintas da safra de 2014 da usina São Martinho, localizada em Pradópolis região de Ribeirão Preto - SP.
Tabela 2 – Caracterização físico-química e de macr- e micronutrientes da vinhaça de cana-de-açúcar Parâmetro Coletas C1 (mai-14) C2 (jun-14) C3 (jul-14) C4 (ago-14) C5 (out-14) C6 e 7 (nov/dez-14) DQOta (g L-1) 32,2 29,1 23,4 31,6 31,6 21,7 DQOs (g L-1) 26,1 23,8 18,3 26,2 25,6 17,6 DBO (g L-1) 19,2 17,3 11,7 14,5 15,3 9,7 Razão DBO/DQO 0,60 0,60 0,60 0,45 0,48 0,44 COT (g L-1) 14,1 10,8 7,7 12,2 10,5 5,7 CH (g L-1) 6,9 5,1 4,6 6,8 6,6 3,9 Ptotal (mg L-1) 147 21 26 151 290 43 NTK (mg L-1) 774 1.243 848 713 743 598 SSV (mg L-1) 940 781 790 1.158 931 1.411 Fenóis totais (mg L-1) 1,5 1,7 3,5 1,1 1,6 0,5 K (mg L-1) 4.175 4.000 2.720 2.500 4.050 4.010 SO42- (mg L-1) 1.805 1.726 1.163 1.044 2.000 2.079 pH 4,6 4,7 4,5 4,4 4,5 4,3 Cálcio 2280 1663 812 1365 1155 2240 Magnésio 348 287 190 264 260 189 Sódio 26,5 16,8 29,1 32,9 27,3 66 Ferro 9,93 9,75 9,78 8,34 9,73 8,84 Manganês 3,61 3,01 2,01 3,79 3,73 4,33 Cobalto 0,26 0,20 0,13 0,19 0,14 0,25 Níquel 0,24 0,26 0,12 0,13 0,29 0,15 Zinco 0,77 0,35 0,43 0,32 0,54 0,38 Cobre 0,48 0,38 0,19 0,34 0,26 0,27 Chumbo 0,48 0,34 0,18 0,23 0,12 0,41 Cádmio 0,12 0,05 0,07 0,09 0,08 0,07 Cromo 0,18 0,08 0,03 0,05 0,07 0,04
DQOta é a DQO total. DQOs é a DQO solúvel. Fonte: Adaptada de Fuess (2017)
Apesar das coletas serem realizadas no mesmo ano, a variação da concentração dos compostos nas coletas podem ser observadas na Tabela 2. Quando se trata de safras em anos e
locais distintos a concentração e composição da vinhaça se torna ainda mais evidente.
Devido à diversidade da composição durante as safras, alguns pesquisadores optam por utilizar uma solução sintética com características semelhantes à da vinhaça para realização de pesquisas. Godoi et al. (2017a), ao estudarem a eficiência de remoção de DQO e de sulfato no reator anaeróbio de leito fixo-estruturado e fluxo descendente (DFSBR), utilizaram um efluente sintético com características semelhantes à fração solúvel (1:5) da vinhaça de cana-de-açúcar, juntamente com uma solução ácida rica em minério de ferro. A composição do substrato de Godoi et al. (2017a) foi definida com base na caracterização da vinhaça real descrita na Tabela 2 de Fuess (2017), complementarmente com Alves (2015) e Longo (2015). A Tabela 3 apresenta a composição química e a sua respectiva concentração, considerando uma concentração final de 4.000 mg O2 L-1, em termos de demanda química de oxigênio (DQO).
Tabela 3 – Composição química do substrato para a concentração final de 4.000 mg O2 L-1, em
termos de demanda química de oxigênio (DQO)
Composição Concentração (mg·L-1) Composição Concentração (mg·L-1) Sacarose 2.100 Cálcio 80,0 Etanol 582 Sódio 135,7
Ácido acético 345 Magnésio 48,2
Ácido propiônico 111 Manganês 0,52
Ácido butírico 140 Zinco 0,08
Fenol 1,5 Cobre 0,06
Sulfato 2.000 Chumbo 0,06
N-amoniacal 165,5 Níquel 0,03
Fósforo 12,9 Cádmio 0,01
Potássio 453,5 Ferro total Variável (1 - 400)
Fonte: Godoi (2017b).
A Tabela 3 representa a totalidade da composição da vinhaça sintética realizada na pesquisa de Godoi et al. (2017a). Além da vinhaça sintética os autores utilizaram soluções complementares de vitaminas e micronutrientes no reator visando favorecer o processamento anaeróbio do meio. Conforme Godoi et al. (2017a) vinhaça sintética também apresentou função de doadora de elétrons para o metabolismo das bactérias redutoras de sulfato (BRS).
3.3 Biorrefinaria
Com o propósito de utilizar a biomassa residual para produzir novos produtos com valor agregado, criou-se o conceito de biorrefinaria (CHERUBINI, 2010). O termo biorrefinaria foi criado com base no conceito de refinarias, as quais a partir do petróleo são extraídos diversos produtos como: gasolina, querosene, lubrificantes e graxas. Cada produto da refinaria é resultado de diferentes etapas do processo de refino do petróleo. Desta forma o conceito de biorrefinaria está diretamente vinculado ao desenvolvimento de pesquisas e tecnologias, de tal forma que possam ser adquiridos da biomassa produtos como ácidos, solventes, gases e outros.
Khanal et al. (2008) ressaltam os potenciais energéticos de diversas biomassas visando a produção de biocombustíveis em biorrefinarias. Alguns exemplos de biomassa citadas pelos autores são provenientes de cana-de-açúcar, milho, mandioca, celulose, óleo vegetal e gordura animal. Khanal et al. (2008) apontam três principais motivos para a aplicação de biomassa como matéria-prima, visando o conceito de biorrefinaria. O primeiro fator deve-se às biomassas possuírem essencialmente como características alta concentração de matéria orgânica biodegradável e alta concentração de micronutrientes para o crescimento das bactérias. O segundo fator trata-se de uma alternativa para o uso da biomassa, a qual muitas vezes é considerada resíduo e portanto necessária de tratamento. E por fim, o terceiro fator levantado pelos autores é a alternativa ao uso do combustível fóssil, reduzindo assim a dependência por essa fonte de energia.
Dias et al., (2014) ressaltam que o processamento da cana-de-açúcar no Brasil pode ser considerado como uma biorefinaria, pois convertem a matéria prima (cana-de-açúcar) em diversos produtos como o etanol, açúcar, eletricidade, dentre outros. Visando a produção do etanol de segunda geração, o qual utiliza o bagaço de cana para produzir mais etanol, Dias et al. (2012) informam que a combinação do etanol de primeira geração com o de segunda geração é uma alternativa nas biorrefinarias, complementando o processo já existente.
Os estudos que analisam a viabilidade do processo anaeróbio como alternativa para tratamento de resíduos, consideram todos os produtos resultantes desse processo. Fuess e Garcia (2014) demonstram que a contabilização do biogás (metano) como fonte de energia é um grande fator para viabilização do processo anaeróbio como tratamento de resíduo. O melhor cenário apresentado pelos autores é o processo anaeróbio para o tratamento da vinhaça juntamente com a combustão do bagaço. Outro produto possível de ser obtido da biomassa e outros resíduos por meio da fermentação anaeróbia é o butanol, sendo nesse caso considerado parte da terceira geração de um sistema de biorrefinaria.
3.4 Fermentação ABE
A fermentação ABE (acetona, butanol e etanol) foi assim denominada após 1861 quando o bioprocessamento visando a produção de butanol foi relatada pela primeira vez (JONES e WOODS, 1986). As bactérias anaeróbias eficazes no processo da fermentação ABE são as do gênero Clostridium, pertencendo pelo menos 60 espécies de bactérias à esse gênero. Na década de 1920, Chaim Weizmann descobriu a bactéria anaeróbia C. acetobutylicum, a qual produz naturalmente acetona, butanol e etanol na proporção de 3:6:1 a partir do substrato puro de glicose (LUTKE-EVERSLOH e BAHL, 2011).
Outras bactérias do gênero Clostridium também são capazes de produzir butanol através da fermentação ABE, tais como, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. aurantibutyricum, C. pasteurianum, C. sporogenes e C. tetanomorphum (KUMAR e GAYEN, 2011). A principal diferença entre elas está associada à quantidade, proporção e solventes produzidos.
Kumar e Gayen (2011) ressaltam que a sequência metabólica do C. acetobutylicum na fermentação ABE possui duas fases: acidogênese e solventogênese. No processo acidogênico ocorre o crescimento celular e a produção dos ácidos orgânicos (ácido acético e ácido butírico) com a consequente diminuição do pH do meio para 4,5. Em seguida, no processo solventogênico, os ácidos produzidos na fase anterior encontram-se em concentrações elevadas e na forma não dissociados possibilitando que sejam processados em solventes (acetona, butanol e etanol).
Dentre as diversas rotas metabólicas presentes no processo anaeróbio é possível relacionar a partir da glicose como substrato as reações da acidogênise e solventogênise. A Tabela 4 apresenta as reações de produção de lactato, acetato e butirato na acidogênese e os respectivos valor da energia livre de Gibbs (REIS, 2014; SAADY, 2013 apud SILVA, 2015). Tabela 4 – Reações a partir de glicose e energia de Gibbs em processos fermentativos
Processo Anaeróbio Reação ΔGo
(kJ mol-1)
Acidogênese para lactato 𝐶6𝐻12𝑂6→ 2𝐶𝐻3𝐶𝐻(𝑂𝐻)𝐶𝑂𝑂𝐻
Acidogênese para acetato 𝐶6𝐻12𝑂6+ 𝐻2𝑂 → 2𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻 + 4𝐻2+ 2𝐶𝑂2
-206
Acidogênese para butirato 𝐶6𝐻12𝑂6→ 𝐶𝐻3𝐶𝐻2𝐶𝐻2𝐶𝑂𝑂𝐻 + 2𝐶𝑂2+ 2𝐻2
-254
Solventogênese para etanol 𝐶6𝐻12𝑂6→ 2𝐶𝐻3𝐶𝐻2𝑂𝐻 + 2𝐶𝑂2
-164,8
As duas etapas, acidogênese e solventogênese, estão diretamente relacionadas, como pode ser visto na Figura 2.
Figura 2 – Rota metabólica de C. acetobutylicum. Transição da fermentação acidogênica (cor preto e linha contínua) para solventogênica (cor azul e linha tracejada). Os números indicam as enzimas: (1) enzimas presentes na glicólise; (2) Oxidoredutase de piruvato-ferredoxina; (3) Hidrogenase; (4) Acetiltransferase de fosfato; (5) Acetato quinase; (6) Acetaldeído desidrogenase; (7) Etanol desidrigenase; (8) Acetiltransferase (Tiolase); (9) Acetoacetil-CoA: acetato/butirato: CoA-transferase; (10) Acetoacetato descarboxilase; (11) 3-Hidroxibutiril-CoA desidrogenase; (12) Crotonase; (13) Butiril-CoA desidrogenase; (14) Butiltransferase de fosfato; (15) Butirato quinase; (16) Butiraldeido desidrogenase; (17) Butanol desidrogenase
Com o intuito de focar na necessidade desta pesquisa, a Figura 2 apresenta a rota com 17 enzimas distintas. A denominação das enzimas é realizada de acordo com o substrato a qual se ligam ou a reação que catalisam, com a adição do prefixo “-ase” (MADIGAN et al, 2010). A enzima oxidoredutase de piruvato-ferredoxina, representada na Figura 2 pelo número 2, catalisa a ferrodoxina, proteína ferro-enxofre (frequentemente abreviada por “Fd”) que atua como agente de transferência de elétrons.
Como é possível observar na Figura 2 a fermentação ABE possui a presença de coenzimas. Madigan et al (2010) explicam que coenzimas são pequenas moléculas não proteicas que participam da catálise como intermediadores, mas não são consideradas substratos, sendo possíveis de associarem-se a várias enzimas diferentes. A maioria das coenzimas é derivada de vitaminas e são constantemente recicladas em um equilíbrio dinâmico, sendo fundamentais para reações redox (redução-oxidação), no entanto são diretamente envolvidas na fermentação. A coenzima nicotinamida adenina dinucleotideo (NAD+) permite reações de oxidação e de redução, doando ou recendo elétrons, respectivamente em sua forma oxidada (NAD+) ou reduzida (NADH). A coenzima A (CoA) produz compostos de alta energia como por exemplo o Acetil-CoA, o qual ao hidrolisar gera energia livre, conservada na síntese de ATP (MADIGAN et al, 2010).
A produção de lactato em grande escala comparado aos demais produtos apresenta como um desvio de rota da fase acidogênica para a solventogênica na fermentação ABE. Jones e Woods (1986) explicam que apesar de ser uma rota fraca em termos energéticos, a conversão de piruvato a lactato se torna uma alternativa interessante quando há inibição da hidrogenase, representada na Figura 2 pelo número 3. A inibição da hidrogenase ocorre devido à presença elevada de monóxido de carbono (CO) ou de células com pouco ferro e consequentemente baixos níveis de ferredoxina-oxidoredutase. Outra característica como produção intermediária da mudança de rota para produção de lactato é a presença de acetoína. A acetoína (3-hidroxi-2-butane) é uma estrutura análoga à acetoacetona, porém incapaz de ser descarboxilada (representada pelo número 10 na Figura 2). Doremus et al (1985) ressaltam que essa inibição da descarboxilase impede a produção de acetona, apresentando assim uma relação inversa entre a produção de acetona e acetoína. Os autores destacam que a produção da acetoína ocorre durante a fase de produção de ácidos em condições de alta pressão e taxa de agitação reduzida, resultando no aumento da pressão parcial de H2.
Os fatores que influenciam a transição da fase acidogênica para solvetogênese são temas ainda em discussão. Dentre os fatores que podem influenciar o processo, o pH e a concentração de ácido butírico são frequentemente apontados. Monot et al. (1984) afirmam que a redução do
pH possui influência direta nessa transição de fases. É também salientado que um dos fatores de inibição da fase solvetogênese é a concentração elevada de solventes, sendo o butanol o solvente mais inibidor de atividade microbiana do meio.
Davies (1942) apud Jones e Woods (1986) explica que a absorção de ácido acético e ácido butírico só ocorre quando em paralelo está sendo metabolisado o açúcar e após o início da reação de descarboxilação do acetoacetato (número 10 na Figura 2). Desta forma, a absorção de ácidos e a formação de acetona (pH favorável de 5,0 conforme Zerner et al., 1966) estão conectadas. A absorção de ácido acético e ácido butírico não ocorre sem a formação equivalente de acetona.
Apesar da produção de etanol fazer também parte da fase solventogênica, Jones e Woods (1986) consideram que essa rota pode ocorrer independentemente da produção de acetona e butanol. A rota do etanol possui duas dehidrogenações em pararelo, representadas respectivavemnte pelos números 6 e 7 na Figura 2, do Acetil-CoA para acetoaldeido e posteriormente etanol, possibilitando assim produção de etanol no meio sem a produção de outros solventes.
O fluxo energético da fermentação ABE possui grande influência na tarnsição de fases e na produção dos ácidos. Jones e Woods (1986) afirmam que a produção de ácido acético é mais favorável energeticamente (ATP) que a de ácido butítico. Os autores exemplificam que 4 mol de ATP seriam produzidos se toda glicose fosse consumida para produzir apenas ácido acético, H2 e CO2, enquanto 3 mol de ATP seriam produzidos se toda glicose fosse consumida
para produzir apenas ácido butírico, H2 e CO2. Em contrapartida, a rota acética não consome o
NADH produzido na glicólise (representada pelo número 1 da Figura 2), equanto a rota butírica consome o NADH, sendo a rota butírica favorável ao redox neutro e consumo de mais glicose.
A relação entre os gases H2 e CO2 produzidos é outro fator apontado por Jones e Woods
(1986) como influenciador do processo de transição entre a fase acidogênica para a fase solventogênica. Os autores ressaltam que na fase solventogênica a produção de H2 diminui, ao
passo que a produção de CO2 aumenta.
Para compreender melhor esse processo e o tornar prático, diversos estudos foram realizados variando diferentes fatores que influenciam a fermentação ABE.
Wang et al. (2014) estudaram a produção de butanol e hidrogênio pela fermentação ABE, com C. acetobutylicum ATCC824 (análogo ao utilizado no presente trabalho) como inóculo. O substrato utilizado variou a fonte de carbono entre glicose, xilose e uma mistura de glicose com xilose. As concentrações trabalhadas desses substratos foram de 20 g∙L-1 à 80
do que a xilose na fermentação ABE. A produção de butanol e hidrogênio também foi viável ao utilizar a mistura de glicose com xilose, pois o C. acetobutylicum consumiu mais glicose que xilose (apenas de 20 a 50%). Os autores concluíram que é possível utilizar o hidrolisado das microalgas nessas condições. Para trabalhos futuros sugerem o uso de microalgas reais para confirmar os resultados obtidos nesse trabalho.
Gallego et al. (2015) estudaram a produção de solventes, especificamente butanol, em condições com e sem controle de pH, com a biomassa da Pennisetum hybridum, popularmente conhecida como “rei da grama”, muito presente na Colômbia. A caracterização da biomassa “rei da grama” apresentou concentração máxima de açúcar de 78 g∙L-1. Primeiramente foi realizado
um experimento com concentração de glicose de 60 g∙L-1, como estudo controle.
Posteriormente, foi realizado o estudo com substrato proveniente da hidrólise alcalina da biomassa “rei da grama”, em reator em batelada à 37 ºC com C. acetobutylicum ATCC824. Os autores concluíram que a maior produção de solvente aconteceu com o hidrolisado da biomassa “rei da grama” e não com a glicose. A maior produção de butanol com o hidrolisado ocorreu sem o controle do pH, sendo de 18 g∙L-1 de solventes totais (ABE) e 10,4 g∙L-1 de butanol.
Ao comparar as culturas Clostridium beijerinckii BA101 e Clostridium acetobutylicum P262, Ezeji et al. (2003) obtiveram da literatura que C. beijerinckii BA101 é capaz de produzir 32,6 g∙L-1 total de solventes ABE e tolera no máximo 165 g∙L-1 de açúcar, enquanto C.
acetobutylicum P262 tolera no máximo 227 g∙L-1 de açúcar. Adicionalmente os autores
ressaltam que culturas visando a produção de butanol são afetadas negativamente por agitações mecânicas e em reatores em batelada concentrações de açúcar superior à 60 g∙L-1 são inibitórias
para produção de butanol. Jones e Woods (1986) explicam que C. beijerinckii e C. acetobutylicum produzem quase a mesma relação de solventes, com a principal diferença do C. beijerinckii produzir isopropanol ao invés de acetona.
Ezeji et al. (2003) estudaram a eficiência da produção de solventes ABE com C. beijerinckii BA101 ao realizar os experimentos em reatores em batelada (processo não-integrado) com reator contínuo com remoção dos solventes ABE através da técnica de remoção in situ de gás (processo integrado). Os experimentos em batelada foram realizados em frascos de 2 L por 60 horas à 35 ºC com meio contendo 60 g-glicose∙L-1, 5 % (vol/vol) de inóculo C.
beijerinckii BA101, solução tampão (50 g-KH2PO4∙L-1, 50 g-K2HPO4∙L-1, 220g-C2H7NO2∙L-1),
vitaminas (0,1 g-ácido 4-aminobenzoico∙L-1, 0,1 g-tiamina∙L-1, 0,001 g-biotina∙L-1) e
micronutrientes (20 g-MgSO4.7H2O∙L-1, 1g-MnSO.H2O∙L-1; 1FeSO4.7H
2O∙L-1; 1g-NaCl∙L-1).
Os autores obtiveram maior eficiência ao utilizar processo integrado, o qual produziu 23,6 g∙L-1 total de solventes ABE a partir de 60 g-glicose∙L-1 e 75,9 g∙L-1 total de solventes ABE a
partir de 161,7 g-glicose∙L-1. Ao passo que com reatores em batelada obteve produção de 17,5
g∙L-1 total de solventes ABE a partir de 45,4 g-glicose∙L-1, restando 14,6 g-glicose∙L-1 não
utilizado devido ao efeito tóxico do butanol sobre a biomassa. Ao utilizar reatores em batelada a produtividade média de solventes ABE e o rendimento foram respectivamente 0,29 g∙L-1∙h-1
e 0,40. No processo integrado, o tempo (39 h) de fermentação foi menor e os ácidos foram totalmente convertidos em solventes, quando comparado ao processo de reatores em batelada que apresentaram ácidos residuais no fim da fermentação.
O processo de fermentação AB em escala industrial no período de 1914 até 1945 possibilitou Ross (1961), citado em Jones e Woods (1986), afirmar que os três principais fatores que determinam a viabilidade econômica da fermentação AB serem: custo da matéria-prima, custo do solvente produzido bem como valor associado para recuperá-lo e custo da planta. O autor destaca que o substrato representa 60 % do custo total do processo, sendo fundamental considerar a disponibilidade do substrato nas proximidades da planta, pois o transporte do mesmo acarreta um custo adicional. O segundo fator responsável por 15 – 20 % do custo total do processo de fermentação AB é a fonte energética, a qual 65 % é consumida para o processo de destilação para obtenção do solvente.
3.5 Fermentação lática
A Figura 2 apresenta a rota metabólica do piruvato para o lactato como um desvio da fermentação ABE, no entanto a formação de lactato é uma rota de suma importância e amplamente estudada.
Ewaschuk et al. (2005) explicam que a enzima D- Lactato dehidrogenase (LDH) existe na reação de piruvato para lactato ao utilizar C. acetobutylicum ATCC 824.
A enzima D- Lactato dehidrogenase (LDH) possui o cofator frutose-1-6-difosfato, sendo portanto uma enzima com ativação alostérica (ÖZKAN et al., 2004).
3.6 Produção de ácidos e solventes a partir de resíduos agroindustriais
A vinhaça da cana-de-açúcar, conforme apresentado anteriormente, é um resíduo gerado em grande escala no Brasil devido à significância do setor sucroalcooleiro no país. A digestão anaeróbia é uma interessante alternativa de tratamento da vinhaça, pois pode desempenhar remoção de DQO. Conforme citado por Fuess (2017), eficiências de remoção de DQO em vinhaças pode variar entre 73% e 89% dependendo do sistema de reatores utilizados. O processo anaeróbio solventogênico é atrativo pois gera produtos com maior valor agregado, como butanol, ácido acético, ácido butírico e ácido propiônico, a partir de matéria prima de
baixo valor com baixas exigências energéticas. Portanto, quantidades significativas de vinhaça podem ser utilizadas como matéria-prima para a conversão de novos produtos e bioenergia (CHERUBINI, 2010).
O butanol é um produto químico industrial importante, utilizado como matéria-prima na indústria do plástico e como extrator de qualidade alimentar na indústria alimentícia (EZEJI et al., 2003). Durre (2007) ressalta que o butanol pode também ser utilizado como biocombustível, sendo mais eficiente que o etanol, com menor volatilidade e compatível com motores à gasolina. Nos dias de hoje, a maior parte do butanol é produzido a partir da hidrogenação de crotonaldeído e da hidroformilação de olefinas, provenientes do petróleo (GALLEGO et al., 2015).
Sindhu et al. (2016) descrevem a importância de alguns produtos gerados na fermentação anaeróbia da cana de açúcar. O ácido lático pode ser usado nas indústrias químicas, farmacêuticas, cosméticas e alimentares, além de poder empregar na produção de solventes e polímeros biodegradáveis, os quais vem aumentando muito o consumo nos últimos anos. Os autores afirmam que o ácido butírico, dentre outras atividades, vêm apresentando mais aplicabilidade no mercado nutracêutico como agentes bioativos e terapêuticos. Por outro lado, o ácido propiônico possui aplicabilidade nas indústrias de plástico, celulósicas, herbicidas, perfumes e alimentos. Sindhu et al. (2016) ressaltam que apesar de todos esses produtos poderem também serem produzidos por síntese química e proveniente de petróleo, a produção fermentativa se torna interessante por ser uma alternativa à poluição ambiental causada pela indústria petroquímica.
O processamento de resíduos para a obtenção de produtos de valor agregado apresenta o duplo objetivo de reduzir o impacto ambiental proveniente da disposição inadequada do resíduo e ao mesmo tempo obter maior aproveitamento das matérias primas utilizadas no processo. A digestão anaeróbia, utilizando culturas mistas, é uma alternativa interessante para o bioprocessamento de resíduos na obtenção de produtos com valor agregado, considerando o potencial para a obtenção de diversos metabólitos. Adicionalmente, a cultura mista possibilita a resistência à contaminação do sistema por espécies alóctones, sendo assim uma alternativa à limitação de condições estéreis da fermentação AB destacada por Jones e Woods (1986) . Esta diversidade traz também como vantagens a versatilidade na utilização de substratos complexos, a facilidade em controlar o metabolismo pela manipulação das condições ambientais e a estabilidade na produção dos produtos desejados. Por outro lado, a diversidade metabólica pode fazer com que o processo não apresente altas eficiências de conversão em um produto específico.
3.7 Considerações finais
A vinhaça se apresenta como uma fonte de matéria orgânica favorável para produção de butanol através de bioprocessamento aneróbio. Além de possuir alto valor comercial, o butanol se torna ainda mais viável neste caso de utilização de efluente agroindustrial como substrato (fonte de carbono) por meio de bioprocessamento anaéróbio com bactérias compatíveis à rota metabólica do butanol (KUMAR e GAYEN, 2011).
Para estudos fundamentais do processo, o uso de substratos sintéticos é uma interessante alternativa, visto que os componentes são conhecidos, podendo, assim, identificar a relação entre as vias metabólicas e os produtos. Portanto, visando à produção do butanol através do processo solventogênico, o uso de vinhaça sintética como substrato se fez plausível. Considerando a produção biológica de solventes, a fermentação anaeróbia como tratamento biológico e o reaproveitamento de resíduos, este projeto propõe um estudo da influência da vinhaça sintética sobre a produção de biobutanol usando de três diferentes inóculos em temperatura mesofílica (35 ºC).
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Procedimento Experimental
O procedimento experimental foi dividido em duas etapas. A primeira etapa do projeto visou o acompanhamento do crescimento das culturas puras de C. acetobutylicum e de C. beijerinckii bem como a investigação da adaptação dessas culturas ao substrato complexo em concentrações de 1.000 e 5.000 mg O2∙L-1, em termos de demanda química de oxigênio (DQO).
Em um ensaio conduzido em paralelo, utilizou-se uma cultura anaeróbia mista proveniente de um biorreator UASB submetida a um pré-tratamento ácido e térmico. Dessa forma, neste primeiro estágio experimental, investigou-se o metabolismo de cada tipo de cultura por meio da análise do substrato e dos metabólitos formados (carboidratos, sulfato, sulfeto e demanda química de oxigênio). Os resultados obtidos na primeira etapa possibilitaram elevar a concentração do substrato a 10.000 e 20.000 mg O2∙L-1, em termos de demanda química de
oxigênio (DQO). Na segunda etapa avaliou-se a influência da variação da relação entre substrato e inóculo (S/M) e, consequentemente, da carga orgânica específica aplicada, na produção de ácidos e solventes. Como definido na primeira etapa, utilizou-se duas culturas puras distintas para inoculação em reatores específicos e um inóculo de cultura mista submetido a tratamentos para eliminação dos microrganismos acetogênicos e metanogênicos.
Nas duas etapas mencionadas, não houve variação da concentração de inóculo, manteve-se a relação de 500 mg SVT∙L-1. Essa relação de inóculo foi determinada conforme a variação
de 2 a 4% utilizado nos fermentadores em escala industrial citado por Jones & Woods (1986). Desta forma, a etapa 2 utilizou concentrações de 5% para 10.000 mg O2∙L-1 e 2,5% para 20.000
mg O2∙L-1. O delineamento experimental da pesquisa se encontra pormenorizado na Tabela 5
Tabela 5 – Delineamento experimental da investigação da influência da variação da carga orgânica específica (vinhaça sintética) em temperatura mesofílica e do tipo de inóculo
Matéria Orgânica (mg O2·L-1) S/M (mg O2·mg SVT-1) Condições Experimentais C. acetobutylicum C. beijerinckii Cultura Anaeróbia Eta pa 1 1.000 2 Ac-1 Bj-1 Lo-1 5.000 10 Ac-5 Bj-5 Lo-5 Eta pa 2 10.000 20 Ac-10 Bj-10 Lo-10 20.000 40 Ac-20 Bj-20 Lo-20
Conforme apresentando na Tabela 5 os inóculos C. acetobutylicum, C. beijerinckii e cultura anaeróbia mista passarão a ser referenciados respectivamente com as siglas “Ac”, “Bj” e “Lo”, de maneira a simplificar a discussão dos resultados.
A Figura 3 complementa as informações da Tabela 5, apresentando um fluxograma da sequência de atividades desenvolvidas nessa pesquisa.
Figura 3 – Fluxograma representativo do procedimento experimental.
Conforme apresentado na Figura 3, inicialmente foi realizado o orçamento e compra dos materiais. Posteriormente ocorreu o preparo dos inóculos para assim possibilitar os experimentos da etapa 1 e consequentemente da etapa 2. Após toda a coleta de dados, as análises foram feitas.
As condições experimentais mencionadas e discutidas nos itens seguintes foram denominadas de acordo com a nomenclatura codificada pela Tabela 5, de maneira a melhor estruturar a discussão dos resultados. Em ambas as etapas o ciclo do reator iniciou-se após a inoculação e fechamento dos frascos, e o término do ensaio ocorreu-se após a estabilização da concentração de substrato remanescente.
4.2 Meio Nutriente
A composição do substrato utilizado nessa pesquisa baseou-se nos macro e micronutrientes empregados por Godoi et al. (2017b), conforme mostrado nas Tabela 3 da seção de Revisão Bibliográfica. Essa composição visa aproximar o substrato complexo à vinhaça de cana de açúcar. O estudo do metabolismo de um substrato complexo sintético e não o substrato
real objetiva a futura aplicação desse estudo fundamental no processamento biológico deste resíduo. Nesse sentido, é importante que o substrato utilizado nessa investigação não seja uma fonte de concentração e composição variáveis, o que prejudicaria as conclusões obtidas.
O substrato complexo foi elaborado a partir de quatro soluções estoque estéreis juntamente com substratos complexos em quatro concentrações diferentes. O APÊNDICE 1 mostra a composição e concentração das soluções estoque, bem como o volume de cada uma delas para que os meios nutrientes apresentassem as concentrações de matéria orgânica especificadas pela Tabela 5. Os sais que se encontram na forma hidratados tiveram as concentrações corrigidas.
Respeitando as concentrações de matéria orgânica determinadas nesse estudo com base na composição de Godoi et al. (2017b), Tabela 3, a Tabela 6 apresenta as concentrações médias de sacarose (açúcar demerara) com seu respectivo desvio padrão utilizadas nos ensaios de 1.000 mg O2·L-1, 5.000 mg O2·L-1, 10.000 mg O2·L-1 e 20.000 mg O2·L-1 (em termos de DQO).
Tabela 6 – Concentração de sacarose (mg∙L-1) nos ensaios de 1.000 mg O
2·L-1, 5.000
mg O2·L-1, 10.000 mg O2·L-1 e 20.000 mg O2·L-1 (em termos de DQO) com C. acetobutylicum,
C. beijerinckii e cultura anaeróbia mista
Sacarose (mg·L-1) Sacarose (mg·L-1) Eta pa 1 Ac-1 528,0 ± 1,06 Ac-5 2.628,8 ± 1,51 Bj-1 526,4 ± 0,00 Bj-5 2.628,8 ± 0,46 Lo-1 526,0 ± 0,00 Lo-5 2.629,6 ± 0,61 Eta pa 2 Ac-10 5.258,2 ± 0,28 Ac-20 10.512,2 ± 1,98 Bj-10 5.256,8 ± 1,70 Bj-20 10.515,8± 0,28 Lo-10 5.256,4 ± 0,57 Lo-20 10.512,6 ± 0,85
É possível observar pelo desvio padrão apresentado na Tabela 6 que as tréplicas possuíram pouca variação em relação à concentração de sacarose.
4.3 Inóculo
Para a execução do projeto foram utilizados 3 diferentes fontes de inóculo. O inóculo contendo comunidades anaeróbias foi obtido a partir do lodo granular de um reator anaeróbio de manta de lodo e fluxo ascendente (UASB) utilizado para o tratamento de água residuária de abatedouro de aves sediado em Pereiras. Esse inóculo foi selecionado com base nas características populacionais de microrganismos, compreendendo uma diversidade muito grande de organismos anaeróbios pertencentes a todos os grupos (acidogênicos, acetogênicos,
metanogênicos e solventogênicos). Antes de sua utilização, o inóculo anaeróbio foi submetido a um pré-tratamento físico-químico com o objetivo de inibir o crescimento de comunidades metanogênicas que poderiam usar os produtos metabólicos para a exclusiva geração de metano. Neste pré-tratamento, o grânulo de lodo foi macerado para melhorar a transferência de massa e de energia. Após a maceração do inóculo, foi adicionada uma solução concentrada de HCl até que se atingiu pH = 3,0, e então foi mantido nessas condições em temperatura ambiente por 24 horas. Após este período, o pH foi ajustado para 6,0 com uma solução de NaOH 3 mol L-1,
deixando novamente o inóculo em repouso por 2 dias em temperatura ambiente. Durante todo o procedimento de pré-tratamento pela variação de pH, tanto na redução do pH para 3,0 como no ajuste para pH 6,0, este parâmetro foi medido a cada hora, durante as primeiras 6 horas. Este procedimento visou eliminar qualquer fonte de tamponamento que pudesse interferir no pré-tratamento ácido. Após o pré-pré-tratamento ácido, o inóculo passou por um pré-pré-tratamento térmico, no qual o inóculo foi aquecido a 90 ºC por 20 minutos em banho de água, sob agitação constante e vigorosa, e posteriormente resfriado em um recipiente de gelo até atingir a temperatura de 35 ºC.
As culturas puras de C. acetobutylicum ATCC 824 e C. beijerinckii ATCC 25752 foram obtidas por meio de um banco de microrganismos da Fundação André Tosello, sediada em Campinas, SP. Ambas as linhagens estavam armazenadas em ampolas na forma liofilizada. A preservação por liofilização manteve a linhagem desidratada e sob vácuo, sendo reativada assim que a ampola é aberta e a linhagem entra em contato com oxigênio e umidade atmosférica. Após a reativação das bactérias foi realizada a transferência do conteúdo da ampola para um tubo de ensaio contendo 5 mL de meio de cultura líquido (RCM – Reinforced Clostridium Medium). A multiplicação de cada cultura foi realizada em Erlenmeyer de 2 litros com 1 litro de meio RCM mantido em estufa à 35 ºC durante pelo menos 7 dias até que a turbidez do meio estabilizasse. O acompanhamento da curva de crescimento das culturas foi realizada através da análise de turbidez (λ = 500 nm) e sólidos voláteis totais.
4.4 Aparato Experimental
O aparato experimental constituiu-se, em grande parte, a partir de frascos Duran® de 500
mL, sendo 250 mL de volume útil e 250 mL de headspace. Os reatores foram mantidos em um agitador (shaker) reciprocante (100 rpm) com estabilização da temperatura a 35 ºC. Após a esterilização do meio nutriente por autoclavagem, o pH era aferido e corrigido para 6,0. Posteriormente foi realizado o fluxionamento de nitrogênio no headspace dos frascos e no meio líquido por 10 minutos para garantir a completa troca de atmosfera, eliminando o oxigênio
atmosférico e deixando o meio em condições anaeróbias. Por fim, os frascos foram inoculados, fechados e fixados em shaker. Todos os ensaios das condições experimentais previamente descritas foram replicados em triplicatas.
4.5 Análises físico-químicas
Para o acompanhamento das diferentes condições nas etapas desse projeto, foram monitoradas, durante os experimentos, as seguintes variáveis de interesse: pH, concentração de matéria orgânica, carboidratos, ácidos orgânicos, álcoois, sulfato solúvel e sulfetos totais dissolvidos. A Tabela 7 apresenta as variáveis juntamente com seus respectivos métodos e referências.
Tabela 7 – Variáveis e seus respectivos métodos de execução
Parâmetros Método Referência
pH – Potencial Hidrogeniônico Potenciometria de eletrodo combinado de vidro STANDARD METHODS (1988) 4500-H+. B Electrometric Method Concentração de matéria orgânica
Demanda química de oxigênio (DQO) STANDARD METHODS (1988) 5220. Chemical Oxygen Demand Concentração de
carboidratos Carboidratos totais Dubois et al. (1956) Concentração de ácidos
orgânicos e álcoois Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) Shimadzu@ Penteado et al. (2012)
Concentração de butanol Cromatografia em fase gasosa Trace GC Ultra Pavini (2017)
Concentração de sulfato
solúvel (CSO4) Turbidimetria de precipitação
STANDARD METHODS (1988)
4500-SO42-. E Turbidimetric
Method Concentração de sulfetos
totais dissolvidos (STD) Método do azul de metileno
STANDARD METHODS (1988)
4500-S2-. D Methylene Blue
Method
As análises de composição da fase líquida foram determinadas por um cromatógrafo líquido (HPLC) modelo Shimadzu® modular, utilizando um sistema de bombas LC-10AD, um
