UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
JULIA CARNAZ BENINCASA
"ESTUDO DO EFEITO DA OXIGENAÇÃO HIPERBÁRICA NA PROLIFERAÇÃO DAS
CÉLULAS PROGENITORAS ENDOTELIAIS E EM CÉLULAS ENDOTELIAIS ADULTAS
IN VITRO APÓS A ATIVAÇÃO COM TNF-α"
CAMPINAS
2017
JULIA CARNAZ BENINCASA
"ESTUDO DO EFEITO DA OXIGENAÇÃO HIPERBÁRICA NA PROLIFERAÇÃO DAS
CÉLULAS PROGENITORAS ENDOTELIAIS E EM CÉLULAS ENDOTELIAIS ADULTAS
IN VITRO APÓS A ATIVAÇÃO COM TNF-α"
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Celular e Estrutural na área de Biologia Celular
Orientadora: Drª. Cristina Pontes Vicente
CAMPINAS
(2017)
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA JULIA CARNAZ BENINCASA E ORIENTADA PELA DRª CRISTINA PONTES VICENTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
COMISSÃO EXAMINADORA
Drª Cristina Pontes Vicente
Drª Nicola Amanda Conran Zorzetto
Dr. Murilo Vieira Geraldo
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra
no processo de vida acadêmica do aluno.
“Diz-se que mesmo antes de um rio cair no
oceano ele treme de medo. Olha para trás, para
toda a jornada, as montanhas, o longo caminho
sinuoso através das florestas, através dos povoados,
e vê à sua frente um oceano tão vasto que entrar
nele nada mais é do que desaparecer para sempre.
Mas não há outra maneira. O rio não pode voltar.
Ninguém pode voltar. Voltar é impossível na
existência. Você pode apenas ir em frente. O rio
precisa se arriscar e entrar no oceano. E somente
quando ele entra no oceano é que o medo
desaparece. Porque apenas então o rio saberá que
não se trata de desaparecer no oceano, mas
tornar-se oceano.
Por um lado é desaparecimento e por outro lado é
renascimento.”
Osho
Agradecimentos
Gratidão sempre foi um sentimento presente em minha vida, mas tornou-se mais constante ao me deparar com pessoas tão especiais ao longo desses dois anos em Campinas. Nesta jornada em busca de um sonho, rumo ao desconhecido, fui tomada várias vezes pelo medo e pela insegurança. Não fossem essas pessoas que descrevo abaixo, não chegaria aqui com este sorriso que carrego no rosto.
A Deus e todos os anjos e bons espíritos que me guiam e protegem diariamente, permitindo cumprir a missão a mim concedida.
Aos meus pais, Ailton e Joanita, que se dedicaram tanto ao longo de minha vida pra que eu estivesse aqui hoje. Todo o esforço de vocês está sacramentado no meu coração e espero um dia poder encher seus olhos de muita alegria e muito orgulho. A vocês, meu eterno amor, minha eterna gratidão!
Ao meu parceiro incrível, Fê. “Meu melhor amigo é o meu amor” e o principal causador de dores constantes na bochecha por tantas risadas. Com você, divido minhas alegrias, minhas angústias, minhas loucuras diárias e, por causa do seu incansável incentivo e suporte, consegui chegar mais longe do que eu esperava e superar inúmeros medos, incluindo o de entrar nesta universidade. Não há espaço, nem palavras suficientes para descrever meu sentimento de gratidão por você! Te amo!
Aos meus dois terapeutas, a queridíssima Audrey (terapeuta de verdade) e Vossa Majestade, sr. Nestor (terapeuta e filho felino), que fizeram de tudo pra que eu não perdesse o juízo completo nos momentos mais dramáticos. Amo vocês pra sempre!!!
Às minhas amigas maravilhosas Adriana e Paula (eterno ‘Trióf’), que constantemente riem por piedade das minhas piadas ruins e me fazem chorar de rir das delas. Vocês são fundamentais para a manutenção da minha felicidade e do meu desequilíbrio mental. Obrigada por toda essa loucura divertida que representa nossa amizade. Amo MUITO vocês!
À minha irmã de alma, Lui! Ela é uma daquelas pessoas lindas que você não cansa de admirar por toda força que carrega na alma e que, paradoxalmente, tem a maior delicadeza em te ajudar a levantar, te colocar nos eixos e te fazer se sentir pertencente ao mundo de novo. As palavras e o coração de Luiza me salvaram muitas vezes desde que nos conhecemos. Você é um anjo, eu tenho certeza disso. Te amo, lindona.
Às ‘Xuxuzinhas’. Mulheres maravilhosas, empoderadas e extremamente inteligentes, nas quais me espelho diariamente na tentativa de ser uma pessoa melhor e mais justa. Gratidão por sempre me ouvirem e me apoiarem nessa fase louca que é a pós-graduação e, também, pelos inúmeros momentos de risadas nos nossos encontrinhos.
Às amizades queridas que ganhei nas caronas de Araraquara-Campinas. Os 200km ficaram bem mais curtos e prazerosos ao lado de vocês, Huang, Lara, Thaís Malavolta, Laís, Janaína, Tiago e tantas outras pessoas adoráveis que passaram por mim nestes dois anos. A vaga de vocês no meu coração estará sempre guardada. Obrigada por tudo!
Ao pessoal do meu laboratório, pela amizade, pelas tardes de café e pela ajuda nos (exaustivos) experimentos. Dressa, são tantos os motivos pra lhe agradecer, que eu precisaria de um agradecimento só pra você. Vou resumir com um ‘te amo, minha prê’. Má, obrigada por ser essa pessoa querida, que fala com os olhos e com o coração. Amo você, pequena. Lu, agradeço demais toda a ajuda e parceria nestes dois anos. Mimi, a parceirinha de comidinhas e travessuras quando o cansaço do trabalho já era grande. Obrigada pela amizade, parceria e pelas inúmeras ajudas com os experimentos. Carol, você arrasa, lindona! Sua alegria é contagiante e primordial no dia-a-dia do lab. Denise, obrigada pelas inúmeras dicas de trabalho e leitura, pelos compartilhamentos de orações dentro da nossa fé. Michel, obrigada por todo o carinho de sempre e pela intenção de ser meu personal dresser e hair stylist. Gi, você é minha irmãzinha de alma. Agradeço por todo conhecimento que me passou, seja acadêmico ou de vida. Camila, obrigada por toda ajuda e dicas nos experimentos, e, principalmente, pelos deliciosos brigadeiros. Toni, obrigada por todo o carinho conosco e dedicação no trabalho. Faz toda a diferença no trabalho ter um técnico tão cuidadoso como você.
Ao amigo colombiano Andres Osorio, pela amizade e enorme ajuda com os equipamentos e paciência de trabalhar comigo inclusive nos feriados. Muchas gracias!!!
A special thanks to my English friends, Scott Gardner and Rachel Fellows, for their friendship and all the funny moments we’ve shared throughout this last year. Also, thank you both for helping me improve my English (with a proper British accent) and, last but not least, for introducing me to the black tea with milk and no sugar.
À minha amiga querida Monica, pela grande ajuda na análise estatística dos resultados deste trabalho. Pessoa que conheci tão despretensiosamente e que, em pouco tempo de café, se tornou uma ótima amiga e verdadeira heroína nos meus momentos de desespero (dois já, e contando). Muito obrigada.
À minha orientadora, Cris, minha eterna gratidão por me receber de braços abertos em seu laboratório e me ensinar pacientemente todo seu vasto conhecimento em terapia celular. Carinho e admiração por esta professora, que nunca deixou adversidade alguma lhe tirar o sorriso do rosto.
Agradeço imensamente também à professora Drª. Selma Giorgio por nos conceder espaço em seu laboratório para utilização da câmara hiperbárica, bem como pelos valiosos conselhos sobre o projeto. Às professoras Drª. Luciana B. Lourenço e Drª. Shirley M. Recco-Pimentel e ao professor Dr. Cláudio Werneck, pelos equipamentos disponibilizados em seus laboratórios. À Líliam, Silvia, Helena e a todos demais funcionários da secretaria da Pós-graduação. À Universidade Estadual de Campinas, ao Instituto de Biologia e ao curso de Pós-graduação em Biologia Celular e Estrutural pela estrutura e recursos fornecidos para o desenvolvimento deste trabalho.
À CAPES/PROEX pela concessão da bolsa de mestrado, e à FAPESP pelo financiamento desta pesquisa.
Resumo
As lesões arteriais causadas pela aterosclerose, hipertensão arterial, hipercolesterolemia e diabetes têm sido muito estudadas por se tratarem das principais causas de desenvolvimento das doenças cardiovasculares. Os mecanismos de reparo tecidual dependem da proliferação de células endoteliais no local da lesão e da captação de células progenitoras endoteliais (CPEs) a partir da circulação sanguínea. Derivadas de hemangioblastos na medula óssea, as CPEs foram descritas por Asahara et al., em 1997, como células capazes de migrar para lesões e se diferenciar em células endoteliais diferenciadas, formando novos vasos sanguíneos (vasculogênese) e auxiliando na cicatrização. No entanto, os mecanismos envolvidos na ativação, migração e incorporação destas células na parede do vaso lesionado ainda não estão esclarecidos. Recentemente, foi mostrado que o tratamento com oxigenação hiperbárica (HBO), que envolve o fornecimento de 100% de O2 a uma pressão maior que 1ATA, aumenta a liberação de CPEs da medula óssea na circulação periférica, através do aumento da produção do óxido nítrico, e, portanto, ativa os mecanismos de cicatrização e formação da neovasculatura. Baseado nisso, o intuito deste projeto foi estudar o efeito da HBO na proliferação in vitro de CPE e células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVEC), ativadas com do fator de necrose tumoral-α (TNF-α), e na produção de moléculas que afetam a adesão e o remodelamento vascular. Inicialmente, fizemos uma curva de proliferação destas células expostas a 60, 120 e 180 minutos de HBO. O tratamento por 60 minutos teve melhor efeito na proliferação de CPEs, enquanto para HUVEC, foram os períodos de 60 e 120 minutos. A imunofluorescência mostrou que 60 minutos de HBO diminuíram a presença de ICAM-1 e aumentaram a de eNOS para HUVECs e CPEs. A HBO melhorou a proliferação celular de CPEs e HUVECs ativadas com TNF-α, diminuiu a produção de espécies reativas de oxigênio e a adesão plaquetária, mas não alterou significativamente a cicatrização e migração in vitro das células. Esse estudo possibilitou maior compreensão dos processos envolvidos na resposta celular das CPEs e HUVEC na presença da HBO, demonstrando que a HBO pode ser considerada como um tratamento adicional à terapia celular para a regeneração vascular, melhorando a resposta inflamatória e o reestabelecimento do endotélio após lesão arterial.
Abstract
Arterial injuries, commonly caused by atherosclerosis, hypertension, hypercholesterolemia and diabetes, have been extensively studied, since they can be the main cause of heart diseases. Vascular repair mechanisms depend on the endothelial cells proliferation at the injured site and on the capture of the endothelial progenitor cells (EPCs) from peripheral blood. Asahara et al., in 1997, described these cells as bone marrow-derived hemangioblasts with the capability of migration to the injuries sites and differentiation to mature endothelial cell, inducing both local vascularization (vasculogenesis) and wound healing. Nevertheless, the mechanisms of EPC activation, migration and incorporation at the injured vessel wall remain unknown. Recently, it has been shown that the hyperbaric oxygen treatment (HBO), which involves the supply of 100% of O2 in a higher pressure than 1 ATA, increases EPC mobilization from bone marrow to the peripheral blood, through the activation of nitric oxide production, and consequently the improvement of the neovascularization and the healing process. Based on it, this project aimed to study the HBO effect on the proliferation of in vitro activated EPC and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) by tumor necrosis factor- α (TNF-α) and on the production of molecules that can affect cell adhesion and vascular remodeling. Initially, we assessed the cell proliferation of the cultures that were exposed to three different times of HBO. The 60 minutes treatment had the best effect on EPC proliferation, whereas for HUVEC, the best treatments were 60 and 120 minutes. The immunofluorescence assay revealed that 60 minutes in HBO chamber reduced ICAM-1 and increased eNOS presence for both HUVEC and EPC. HBO also increased the proliferation of EPCs and HUVECs treated with TNF-α, reduced the reactive oxygen species (ROS) production and platelet adhesion, although no significant differences were seen between the HBO-treated and control group on wound healing assay for both HUVEC and EPC. This study provided better understanding about the inflammatory process and of the effects of HBO on EPC and HUVEC, demonstrating that it can be considered as an additional treatment to cell therapy for vascular regeneration, reducing the inflammatory process and repairing the injured arterial vessel.
LISTA DE ABREVIATURAS
AKT – Via de sinalização por Serina-Treonina quinase (Serine-Threonine Kinase) ATA – Pressão Atmosférica Absoluta
BSA – Albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumine) C57bl/6 – Linhagem de camundongos
CD133 – Cluster of Differentiation 133 (ou AC133 em humanos e Prominin-1 em ratos) CD144 (VE-Cadherin) – Cluster of Differentiation 144 (Vascular Endothelial – Cadherin) CD31 – Cluster of Differentiation 31
CD34 – Cluster of Differentiation 34 (ortólogo de Sca-1 em camundongos) CD46 - Cluster of Differentiation 46
CE – Célula endotelial
CPEs/EPC – Células Progenitoras Endoteliais/ Endothelial Progenitor Cells CXCL12 – Ligante de quimiocina C-X-C 12 (C-X-C 12 Ligand)
CXCR-4 – Receptor de quimiocina C-X-C 4 (C-X-C 4 Receptor) DAPI – 4,6-Diamino-2 fenilindole
DCFDA - 2’, 7’ – Diclorofluoresceína diacetato
DMEM – Meio de cultura modificado por Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle's medium) DMSO – Dimetilsulfóxido
EGF – Fator de Crescimento Epidermal (Epidermal Growth Factor)
EGM-2 – Meio de cultura de crescimento endotelial (Endothelial Growth Factor-2) ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
eNOS – Óxido nítrico sintase endotelial (Endothelial Nitric Oxide Synthase) FDA – Food and Drugs Administration
FGF-B – Fator de Crescimento de Fibroblastos Humanos-b (Human Fibroblasts Growth Factor-base) FITC – Isotiocianato de Fluoresceína (Fluorescein isothiocyanate)
Flk1 – Receptor de VEGF (ortólogo de VEGFR-2 de camundongos) (Fetal Liver Kinase-1) HBO – Oxigenação Hiperbárica (Hyperbaric Oxygen)
HE – Hemotoxilina-Eosina
HRP – Peroxidase de Rábano (Horseradish Peroxidase)
HUVEC – Célula endotelial de veia umbilical humana (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) ICAM-1 – Molécula de adesão intercelular 1 (ou CD54) (Intercellular Adhesion Molecule-1) IGF – Fator de Crescimento semelhante à Insulina (Insulin-like Growth Factor)
IL-1 – Interleucina-1 IL-6 – Interleucina-6
KDR – Receptor de VEGF em humanos (ortólogo de VEGFR-2 de camundongos) (Kinase Insert Domain
Receptor) MMP - Metaloproteinases ml – Mililitro ng – Nanograma NO – Óxido Nítrico O2 – Gás Oxigênio
PAF – Fator Ativador de Plaquetas (Platelet-Activating Factor) PBS – Tampão fosfato-salino (Phosphate Buffered Saline) PE – Ficoeritrina (Phycoerithrin)
PI3K – Fosfatidilinositol -3 Quinase (Phosphatidilinositol-3 kinase) PS – Penicilina/Estreptomicina
ROS – Espécies Reativas de Oxigênio (Reactive Oxygen Species) SDF-1 α - Fator derivado de estroma 1α (Stromal Derived Factor -1α) SFB – Soro Fetal Bovino
TNF-α – Fator de necrose tumoral (Tumor Necrosis Factor-α) VCAM – Molécula de Adesão Vascular
VEGF – Fator de crescimento endotelial vascular (Vascular Endothelial Growth Factor)
VEGFR – Receptor do fator de crescimento endotelial vascular (Vascular Endothelial Growth Factor
vWF – Fator de von Willebrand (von Willebrand Factor) μg – Micrograma
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. As camadas do vaso sanguíneo: íntima, média e adventícia. Adaptado de Salisbury et al. (2012) [3].
Figura 2. Mobilização das CPEs da medula óssea para circulação periférica através da produção de NO pela eNOS. A lesão arterial causa a liberação de fatores na circulação, que chegam à medula óssea e ativam a via de sinalização PI3K/AKT para a produção de NO pela eNOS. O NO ativa as MMPs que quebram a ligação do fator c-Kit com as CPEs, liberando-as para a circulação periférica. Adaptado de Liu et al (2008) [27].
Figura 3. Representação da mobilização das CPEs na medula óssea, através da ligação do fator solúvel SDF-1α com seu receptor CXCR4, e migração destas células na circulação periférica para reparo de um tecido lesionado. O tecido lesionado libera quimiocinas, como, por exemplo, o SDF-1α, que são capazes de recrutar CPEs na medula óssea através da sua ligação com o receptor CXCR4, presente nessas células. As CPEs migram para a circulação periférica e chegam ao local da lesão, promovendo cicatrização do tecido. Adaptado de Liu et al., 2016 [31].
Figura 4. Representação de uma lesão endotelial. As células endoteliais quiescentes passam para um estado ativo, aumentando a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1 e P-selectina), liberando e quimiocinas (SDF-1α) e citocinas (TNF-α), que atraem macrófagos e leucócitos e ativam plaquetas, prejudicando o fluxo sanguíneo.
Figura 5. Câmara de Oxigenação Hiperbárica. Laboratório de Leishmaniose (Departamento de Biologia Animal/UNICAMP) – Professora responsável: Dra. Selma Giorgio.
Figura 6. Três medidas entre as extremidades da área lesionada (uma na região superior, uma na região mediana e outra na inferior) para análise de cicatrização. Aumento de 200x. Barra = 50µm. Figura 7. Imagens de culturas CPEs, obtidas por microscopia de contraste de fase, após 7 (A), 14 (B) e 28 dias (C) da extração. Em destaque, uma das colônias em formação na cultura. Barra 100µm. Barra 100µm. Aumento de 40x.
Figura 8. Análise da expressão dos marcadores CD34, CD31 e CD45, por citometria de fluxo, em CPEs após 30 dias de cultivo, tratadas ou não com TNF-α. N=2 em duplicata (teste t de Student). Valores expressos em porcentagem em relação a 50.000 eventos. Asteriscos representam diferenças significativas (*p<0,05).
Figura 9. Análise de Proliferação Celular de HUVEC frente aos tratamentos com HBO por 60, 120 e 180 minutos. A proliferação celular foi medida por contagem das células em câmara de Neubauer, depois de adicionada tripsina 1x para perda de aderência à placa de cultura, após 24, 48 e 72h da exposição à HBO. N=4/grupo (ANOVA com pós-teste de Tuckey). Os asteriscos indicam diferenças significativas em relação ao controle (*p < 0.05, ***p < 0.001 em relação ao grupo controle).
Figura 10. Análise morfológica de HUVECs fixadas com acetona e coradas com HE. Grupos: Controle, tratadas com HBO por 60, 120 e 180 minutos (23°C, 100% de O2 e 2,5ATA), analisados nos tempos 24, 48 e 72h. Barra 50µm. Aumento 100x. Barra 50µm.
Figura 11. Análise de Proliferação Celular de CPE frente aos tratamentos com HBO por 60, 120 e 180 minutos. A proliferação celular foi medida por contagem das células em câmara de Neubauer, depois de adicionada tripsina 1x para perda de aderência à placa de cultura, após 24, 48 e 72h da exposição à HBO. N=4/grupo (ANOVA com pós-teste de Tuckey). Os asteriscos indicam diferenças significativas em relação ao controle (**p < 0.01, ***p < 0.001).
Figura 12. Análise morfológica de CPEs fixadas com acetona e coradas com HE. Grupos: Controle, tratadas com HBO por 60, 120 e 180 minutos (23°C, 100% de O2 e 2,5ATA), analisados nos tempos 24, 48 e 72h. Barra 50µm. Aumento 100x. Barra 50µm.
Figura 13. Imunofluorescência para análise da marcação de eNOS em células HUVEC. Grupos: controle, TNF-α, HBO 60’, TNF-α/HBO 60', HBO 120' e TNF-α/HBO 120'. As células foram marcadas com anticorpo anti-eNOS e a detecção foi feita com anticorpo secundário FITC. O núcleo das células foi marcado com DAPI. Aumento de 100x. Barra 50µm.
Figura 14. Quantificação da marcação de eNOS em HUVEC. Grupos controle, α, HBO 60’, TNF-α/HBO 60’, HBO 120’ e TNF-TNF-α/HBO 120’. A análise da intensidade de fluorescência foi feita utilizando
o programa Fiji Image J. N=4/grupo (ANOVA com pós-teste de Tuckey). Asterisco representa a diferença significativa do grupo HBO 60’ em relação ao controle (*p<0,05).
Figura 15. Imunofluorescência para análise da marcação de ICAM-1 em células HUVEC. Grupos: controle, TNF-α, HBO 60’, TNF-α/HBO 60', HBO 120' e TNF-α/HBO 120'. As células foram marcadas com anticorpo anti-ICAM e a detecção foi feita com anticorpo secundário FITC. O núcleo das células foi marcado com DAPI. Aumento de 100x. Barra 50µm.
Figura 16. Quantificação da marcação de ICAM-1 em HUVEC. Grupos controle, TNF-α, HBO por 60’, TNF-α/HBO por 60’, HBO por 120’ e TNF-α/HBO por 120’. A análise da intensidade de fluorescência foi feita utilizando o programa Fiji Image J. N=4/grupo (ANOVA com pós-teste de Tuckey). Os asteriscos representam diferença significativa do grupo TNF-α em relação ao controle (p<0,05) e do grupo TNF-α + HBO 60’ em relação ao grupo TNF-α (** p<0,01).
Figura 17. Imunofluorescência para análise da marcação de eNOS das CPE. Grupos: controle, TNF-α, HBO 60’, TNF-α/HBO 60', HBO 120' e TNF-α/HBO 120'. As células foram marcadas com anticorpo anti-eNOS e a detecção foi feita com anticorpo secundário FITC. O núcleo das células foi marcado com DAPI. Aumento de 100x. Barra 50µm.
Figura 18. Quantificação da marcação de eNOS em CPE. Grupos controle, α, HBO 60’, TNF-α/HBO 60’, HBO 120’ e TNF-TNF-α/HBO 120’. A análise da intensidade de fluorescência foi feita utilizando o programa Fiji Image J. N=4/grupo.
Figura 19. Imunofluorescência para análise de marcação de ICAM-1 em CPEs. Grupos: controle, TNF-α, HBO por 60’, TNF-α/HBO por 60', HBO por 120' e TNF-α/HBO por 120'. As células foram marcadas com anticorpo anti-ICAM e a detecção foi feita com anticorpo secundário FITC. O núcleo das células foi marcado com DAPI. Aumento de 100x. Barra 50µm.
Figura 20. Quantificação da marcação de ICAM-1 em CPE. Grupos controle, α, HBO 60’, TNF-α/HBO 60’, HBO 120’ e TNF-TNF-α/HBO 120’. A análise da intensidade de fluorescência foi feita utilizando o programa Fiji Image J. N=4/grupo (ANOVA com pós-teste de Tuckey). Os asteriscos representam diferença significativa do grupo TNF-α em relação ao grupo controle e do grupo TNF-α + HBO 60’ em relação ao grupo TNF-α (**p<0,01).
Figura 21. Análise de proliferação celular de HUVEC, realizada uma contagem na câmara de Neubauer em três tempos, 24, 48 e 72h. Os grupos analisados foram: controle, α, HBO, TNF-α/HBO. N=4/grupo (ANOVA com pós-teste de Tuckey). Os asteriscos representam diferenças estatísticas significativas do grupo TNF-α em relação ao controle e do grupo TNF-α/HBO em relação ao grupo TNF-α (*p<0,05).
Figura 22. Análise morfológica de células HUVEC fixadas com acetona e coradas com HE após 24, 48 e 72h. Grupos: controle, TNF-α, HBO e TNF-α/HBO. Barra = 50µm.
Figura 23. Análise de proliferação celular de CPE, realizada uma contagem na câmara de Neubauer em três tempos, 24, 48 e 72h. Grupos: controle, TNF-α, HBO e TNF-α/HBO. N=4/grupo (ANOVA com pós-teste de Tuckey). Os asteriscos representam diferenças estatísticas significativas do grupo TNF-α em relação ao grupo controle e do grupo TNF-α/HBO em relação ao grupo TNF-α (*p<0,05).
Figura 24. Análise morfológica de CPEs fixadas com acetona e coradas com HE após 24, 48 e 72h. Grupos: controle, TNF-α, HBO e TNF-α/HBO. Barra 50µm. Aumento 100x.
Figura 25. Análise do processo de cicatrização em HUVEC após 0, 6, 12, 18 e 24h da lesão. Com uma ponteira foi feita uma lesão na placa de cultura de HUVEC e a cicatrização foi analisada durante 24h pelo microscópio Zeiss Observer Z.1 e as medidas entre as extremidades da lesão .foram obtidas através do programa Fiji ImageJ. Grupos analisado: controle, TNF-α, HBO e TNF-α/HBO. Aumento de 200x. Barra = 50µm.
Figura 26. Análise de cicatrização em HUVEC após 6, 12, 18 e 24h da lesão, em relação ao tempo zero. Grupos analisados: Controle, TNF-α, HBO e TNF-α/HBO. N=3/grupo (ANOVA com pós-teste de Tuckey). Asteriscos representam a diferença estatística significativa em relação ao controle (*p<0,05).
Figura 27. Análise do processo de cicatrização em CPEs após 0, 6, 12, 18 e 24h da lesão. Com uma ponteira foi feita uma lesão na placa de cultura de CPE e a cicatrização foi analisada durante 24h pelo microscópio Zeiss Observer Z.1 e as medidas entre as extremidades da lesão .foram obtidas através do programa Fiji ImageJ. Grupos analisado: controle, TNF-α, HBO e TNF-α/HBO. Aumento de 200x. Barra = 50µm.
Figura 28. Análise de cicatrização em CPE após 6, 12, 18 e 24h da lesão, em relação ao tempo zero. N=3/grupo (ANOVA com pós-teste de Tuckey). Grupos analisados: Controle, α, HBO e TNF-α/HBO. N=3/grupo.
Figura 29. Análise da quantidade de ROS produzidas em culturas de HUVEC (A) e CPE (B). Os gráficos mostram a porcentagem de ROS presente nos grupos TNF-α, HBO e TNF-α/HBO em relação ao grupo controle. Utilizando o reagente DCFDA, que na presença de ROS forma um subproduto fluorescente, medimos a absorbância com o leitor de ELISA (485nm) e os valores obtidos foram relacionados ao controle para obter as porcentagens. N=4/grupo (ANOVA com pós-teste de Tuckey). Asteriscos representam diferenças estatísticas significativas ao grupo controle (*p<0,05).
Figura 30. Análise da adesão de plaquetas às culturas de HUVEC. Grupos analisados: Controle, TNF-α, HBO e TNF-α/HBO. (A) Microscopia de contraste de fase mostrando a cultura de HUVEC. (B) Microscopia de fluorescência mostrando as plaquetas marcadas com anticorpo conjugado (CD41-FITC em verde). Após 30 minutos de interação, as plaquetas aderidas às HUVEC foram contadas utilizando o programa Fiji ImageJ. Aumento de 100x. Barra = 50µm.
Figura 31. Número de plaquetas aderidas em relação ao número de células HUVECs. N=3/grupo (ANOVA com pós-teste de Tuckey). Asteriscos representam diferenças estatísticas significativas do grupo TNF-α em relação ao controle e do TNF-α/HBO em relação ao grupo TNF-α (**p<0,01).
SUMÁRIO AGRADECIMENTOS 06 RESUMO 08 ABSTRACT 09 LISTA DE ABREVIATURAS 10 LISTA DE FIGURAS 13 1. INTRODUÇÃO 19
1.1. Vasos Sanguíneos e Células Endoteliais Diferenciadas 19
1.2. Células Progenitoras Endoteliais (CPEs) 20
1.3. Fatores que influenciam na migração das CPES 23
1.4. Fatores envolvidos na Lesão Vascular 25
1.5. Oxigênio e Oxigenação Hiperbárica (Hyperbaric Oxygen – HBO) 27
2. OBJETIVO GERAL 31
3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 31
4. MATERIAIS E MÉTODOS 32
4.1. Animais 32
4.2. Isolamento e Cultivo das CPEs 32
4.3. Caracterização das CPE por citometria de fluxo 33
4.4. Células Endoteliais Diferenciadas 33
4.5. Oxigenação Hiperbárica (HBO) 33
4.6. Grupos Analisados 34
4.7. Proliferação e Morfologia Celular 36
4.8. Imunofluorescência das Células 37
4.9. Análise de Cicatrização 37
4.10. Análise da presença de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) produzidas
em culturas de CPEs e HUVECs, após tratamento com HBO e TNF-α. 39
4.11. Quantificação de SDF-1α por ELISA 40
4.12. Ensaio de Adesão Celular com Plaquetas em HUVEC 40
4.13. Análise Estatística 41
5. RESULTADOS 42
6. DISCUSSÃO 70
7. BIBLIOGRAFIA 74
1. INTRODUÇÃO
1.1. Vasos Sanguíneos e Células Endoteliais Diferenciadas
Os vasos sanguíneos são divididos em três camadas: a íntima (mais interna e em contato com o sangue); a média, formada principalmente de fibras elásticas e células musculares lisas; e a mais externa, a adventícia, que contém principalmente fibras colágenas e fibroblastos (figura 1). Na camada íntima, encontram-se as células endoteliais (CEs), que atuam como uma barreira não-aderente para plaquetas e leucócitos, e regulam a coagulação sanguínea [1]. O endotélio está envolvido no controle da trombose, na interação de plaquetas e leucócitos com a parede do vaso e na regulação do crescimento de vasos sanguíneos [2].
Figura 1. As camadas do vaso sanguíneo: íntima, média e adventícia. Adaptado de Salisbury et al. (2012) [3].
As CEs têm função importante na regulação da pressão e do fluxo sanguíneo devido à sua capacidade de manter uma superfície antitrombótica pela liberação de vasodilatadores como óxido nítrico (NO) e prostaciclinas, bem como vasoconstritores incluindo endotelina e fator de ativação plaquetária (PAF), modulando o trânsito do plasma e outros constituintes celulares através da
vasculatura [1]. Em um endotélio saudável, o NO (óxido nítrico) e a prostaciclina mantêm os níveis necessários para manutenção da pressão sanguínea, reduzem a força de cisalhamento e inibem a ativação plaquetária. Modelos animais confirmam a função antitrombótica desses fatores, onde camundongos com falta da enzima óxido nítrico sintase endotelial apresentam resposta vasodilatadora prejudicada nos vasos sanguíneos e predisposição para eventos trombóticos [4]. Perturbações, como inflamação ou atrito pela alta força hidrodinâmica, podem induzir as células endoteliais a criar um ambiente pró-trombótico e anti-fibrinolítico [5].
A lesão endotelial desencadeia a perda na funcionalidade do vaso, podendo estar, dessa maneira, intimamente relacionada às doenças cardiovasculares, como aterosclerose, trombose e hipertensão [6]. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), estas disfunções representam a principal causa de óbito no mundo, principalmente em países de baixa e média renda [7]. No Brasil, o Ministério da Saúde mostrou que, em 2011, 30% das mortes estavam relacionadas às doenças cardiovasculares [8]. Os estudos sobre tratamentos e mecanismos de reparo das lesões endoteliais ampliam o conhecimento para prevenção e diminuição na ocorrência dessas doenças.
Os processos de renovação e regeneração do vaso lesionado estão relacionados à proliferação das CEs e a migração de células progenitoras endoteliais (CPE) para a circulação sanguínea [1, 9]. Existe um crescente interesse acerca das CPEs, especialmente na sua função em manter a integridade endotelial e aumentar a neovascularização. Em razão disso, estudos recentes apontam as CPEs como uma potente terapia celular reparadora das doenças cardiovasculares [10].
1.2. Células Progenitoras Endoteliais (CPEs)
As células progenitoras endoteliais hematopoiéticas são derivadas de hemangioblastos e precursoras de células endoteliais diferenciadas. Embora sua origem seja na medula óssea, onde existe um microambiente ideal para sua proliferação, migração e diferenciação em CEs, as CPEs foram inicialmente isoladas do sangue periférico de humanos adultos, em 1997, por Asahara e colaboradores [11]. Estas células desempenham importante função no reparo vascular e na
formação de novos vasos (neovasculogênese) em razão da sua capacidade de proliferar e migrar para o local da lesão arterial e se diferenciar, tanto in vivo, como in vitro, em CE [11-13]. Yoder et al (2012) definiu o termo “célula progenitora” como sendo a população de células envolvidas no desenvolvimento, reparo ou regeneração da vasculatura sistêmica. A partir disso, especificou-se as CPEs como células circulantes que aumentam sua progênie, devido ao seu alto potencial de proliferação e capacidade de diferenciação restrita à linhagem endotelial, além da habilidade de formar tubos semelhantes às estruturas de capilares in vitro e formar vasos sanguíneos estáveis em humanos [13].
As culturas de CPEs hematopoiéticas com meio comercial EGM-2 (suplementado com VEGF, FGF-B, IGF, EGF, ácido ascórbico, heparina, hidrocortisona e soro fetal bovino (SFB)), proliferam rapidamente, formando colônias multidimensionais com morfologia variada, incluindo agrupamentos de células arredondadas e fusiformes [14, 15]. Em contraste, as CEs formam uma monocamada de células em formato cúbico (“cobblestone”) e seu crescimento in vitro é inibido quando atingida a confluência da placa de cultura [14].
Asahara et al. (1997) mostraram que as CPEs isoladas e cultivadas in vitro expressam uma variedade de proteínas marcadoras de superfície celular, que são tipicamente expressas por células endoteliais diferenciadas [11-13]. Embora o perfil imunofenotípico para as CPEs ainda não seja um consenso na literatura, os principais e mais aceitos marcadores para estas células são tanto marcadores de células mais precoces, CD133, CD34 e o receptor para o fator de crescimento celular (VEGFR2), quanto o CD31 de CEs diferenciadas [9, 11, 13, 14, 16 e 17]. Além do CD31, as CEs têm como principais marcadores CD144 (VE-Caderina), VEGFR2, vWF, e CD46, e ausência dos marcadores progenitores (CD34, CD133) [1, 16].
O marcador CD34 é uma proteína transmembrânica com uma importante função no início da hematopoiese, que medeia a adesão das células tronco hematopoiéticas à matriz extracelular da medula óssea, essencial para a mobilização e regulação das CPEs [17] e o marcador CD133, que é
inicialmente expresso nos hemangioblastos, tem sua expressão diminuída durante a diferenciação. Conjuntos de células CD34+ que expressam CD133 apresentam características fenotípicas e funcionais de populações imaturas de células-tronco e progenitoras [14, 16, 17].
O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) interage com os dois receptores tirosino-quinases específicos do endotélio, VEGFR-2 (ou Flk-1/KDR) e VEGFR-1, induzindo a angiogênese, estimulando a proliferação, migração, e regulando a permeabilidade vascular, através da mobilização e recrutamento das CPEs do tecido hematopoiético para o sangue periférico [18-24].
O CD31 atua no controle da função plaquetária e trombótica, na resposta mecano-sensitiva das células endoteliais, bem como na regulação de múltiplos estágios de migração de leucócitos através da parede dos vasos sanguíneos [23, 24].
Com base em trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório, podemos obter CPEs a partir da cultura de células mononucleares isoladas de medula de camundongos e cultivadas por 30 dias de cultura (por volta de 15 passagens) em meio de cultura comercial EGM-2. Estas células, quando analisadas para a presença de marcadores de CPE, foram positivas para CD34, CD133, VEGFR-2, CD31 e VE-caderina (CD144) [15].
Embora as CPEs sejam extremamente raras no sangue periférico, sendo que a porcentagem de células CD34+ expressando CD133+ e VEGFR2+ é de apenas 2% do total de células CD34+ circulantes, sua transmigração através da monocamada endotelial pode aumentar notavelmente quando as CEs deixam de ser quiescentes e tornam-se ativas por citocinas e/ou ocorrem lesões vasculares [18, 25]. Uma vez aderidas às CE ativadas, as CPEs podem agir de maneira parácrina, produzindo citocinas angiogênicas e fatores de crescimento, que aumentam a proliferação de CEs residentes e contribuem para o restabelecimento da homeostase do endotélio [6]. Vários estudos mostram que as CPEs são capazes de se instalar em lesões, tumores, áreas de isquemia e participar da formação da neovasculatura [11, 12, 26].
1.3. Fatores que influenciam na migração das CPEs
As CPEs residem em um nicho de células-tronco na medula óssea, que é caracterizado pela baixa tensão de oxigênio e altos níveis de fator derivado de estroma 1 (SDF-1α). O recrutamento de CPEs ocorre sob condições patológicas, como traumas ou isquemias, e tanto a saída destas células da medula óssea, como a chegada ao local de neovascularização estão sujeitos à ativação de muitos fatores, incluindo quimiocinas e fatores de crescimento [27]. O VEGF é secretado pelos tecidos lesionados e liga-se ao receptor de membrana VEGFR-2, presente nas células estromais da medula óssea, estimulando a via de sinalização AKT, através de fosfatidilinositol-3 quinase (PI3K), que, por sua vez, fosforila e ativa a enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) [27, 28]. Esta enzima é expressa nas células endoteliais vasculares ou no estroma da medula óssea, e produz o NO, um gás volátil que tem capacidade de vasodilatação. O NO ativa também as metaloproteinases (MMP), como a MMP-9, que digerem a matriz extracelular e estimulam a migração das células tronco hematopoiéticas e progenitoras, mudando seu estado “quiescente” para “proliferativo”, estimulando rapidamente a mobilização destas células para a circulação periférica (figura 2) [27-29].
Figura 2. Mobilização das CPEs da medula óssea para circulação periférica através da produção de NO pela eNOS. A lesão arterial causa a liberação de fatores na circulação, que chegam à medula óssea e ativam a via de sinalização PI3K/AKT para a produção de NO pela eNOS. O NO ativa as MMPs que quebram a ligação do fator c-Kit com as CPEs, liberando-as para a circulação periférica. Adaptado de Liu et al (2008) [27].
O fator derivado de estroma-1, SDF-1α (ou CXCL12) é um dos fatores responsáveis pela sinalização e chegada das CPE ao local lesionado, quando em maior concentração na circulação que na medula óssea. Inicialmente, este fator foi descrito como sendo um quimioatrativo capaz de induzir seletivamente a migração de CPEs da medula óssea para o sangue periférico ao se ligar com o receptor transmembrânico do tipo C-X-C, CXCR4, presente na membrana das CPE (figura 3) [27, 28, 30, 31]. Esta ligação estimula as MMPs a quebrarem o fator c-Kit na membrana das células liberando-as para a circulação. O SDF-1α pertence à família de citocinas e atua em respostas inflamatórias, com grande importância na atração de células hematopoiéticas [32, 33]. A interação entre SDF-1α e CRCR4 induz um rápido aumento do nível de íons cálcio intracelular, resultando no fenômeno biológico de quimiotaxia. Esta ligação está envolvida na homeostase, no desenvolvimento vascular, na proliferação e migração de células progenitoras, atuando na reparação de tecidos lesionados e inflamados [34].
Figura 3. Representação da mobilização das CPEs na medula óssea, através da ligação do fator solúvel SDF-1α com seu receptor CXCR4, e migração destas células na circulação periférica para reparo de um tecido lesionado. O tecido lesionado libera quimiocinas, como, por exemplo, o SDF-1α, que são capazes de recrutar CPEs na medula óssea através da sua ligação com o receptor CXCR4, presente nessas células. As CPEs migram para a circulação periférica e chegam ao local da lesão, promovendo cicatrização do tecido. Adaptado de Liu et al., 2016 [31].
1.4. Fatores envolvidos na Lesão Vascular
As células endoteliais e musculares lisas, em condições fisiológicas, mantêm a homeostase através da produção de moléculas anticoagulantes e antiplaquetárias. Na superfície destas células, estão presentes moléculas de adesão como selectinas, receptores de imunoglobulina, integrinas e caderinas, que participam de inúmeras interações. Em circunstâncias normais, elas medeiam interações entre as células endoteliais e a matriz, e regulam a permeabilidade vascular. No entanto, durante o processo inflamatório, a expressão superficial das moléculas de adesão é alterada, participando de interações entre leucócitos e a superfície endotelial ativada, bem como na ativação e extravasamento leucocitários [35].
Além do aumento da expressão de moléculas de adesão, tais como moléculas de adesão intercelular (ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3), molécula de adesão de célula vascular VCAM e P-selectina, ocorre também a liberação de fatores pró-inflamatórios, como citocinas (fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8), e quimiocinas, como o fator descrito acima, SDF-1α. Em conjunto, estes fatores causam a ativação plaquetária, migração e adesão de monócitos, linfócitos e neutrófilos para o espaço subendotelial, ocluindo o vaso e prejudicando o fluxo sanguíneo (figura 4) [36-38].
Figura 4. Representação de uma lesão endotelial. As células endoteliais quiescentes passam para um estado ativo, aumentando a expressão de moléculas de adesão (ICAM-1 e P-selectina), liberando e quimiocinas (SDF-1α) e citocinas (TNF-α), que atraem macrófagos e leucócitos e ativam plaquetas, prejudicando o fluxo sanguíneo.
O fator de necrose tumoral (TNF-α) é uma glicoproteína produzida principalmente por monócitos e macrófagos ativados em situações patológicas, embora outras células, como mastócitos, linfócitos T, B e Natural Killer, neutrófilos, CEs, células musculares lisas e cardíacas, osteoclastos e fibroblastos possam ser também outras fontes desta molécula [41]. O TNF- é um dos responsáveis pelo processo de ativação do endotélio, no qual as CEs, que normalmente são antitrombóticas e antiaderentes, tornam-se pró-trombóticas e adesivas, resultando em um ambiente propício para formação de trombos em função do aumento da expressão de P-Selectina, ICAM-1, ativação e adesão de plaquetas, migração e adesão de monócitos, macrófagos e leucócitos [31]. Esta citocina ativa também o fator nuclear de transcrição NFκB, o qual, por sua vez, está relacionado à apoptose, e ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (do inglês, Reactive Oxygen Species - ROS) [38, 41, 42].
O termo ‘espécies reativas de oxigênio’ é designado às moléculas que contêm oxigênio e que, por causa dos elétrons presentes na camada de valência, são extremamente reativas e causam danos oxidativos aos componentes celulares, incluindo DNA, proteínas e lipídios. Estes danos são um impeditivo para o prosseguimento do ciclo celular, além de causarem a senescência prematura ou apoptose, contribuindo para o fenótipo de doenças associadas ao envelhecimento e câncer, como predito pela “teoria do envelhecimento em função de radicais livres” [59-62]. Em situações fisiológicas normais, as ROS são subprodutos da fosforilação oxidativa que ocorre nas mitocôndrias, importantes para a renovação oxidativa de proteínas envolvidas na transdução de sinal, o que faz com que atuem como mediadoras centrais na via de sinalização envolvida na proliferação, diferenciação e quiescência [59-61, 63]. Em condições patológicas, os macrófagos ativados migram para o local lesionado e secretam metaloproteinases, que, por sua vez, aumentam a concentração de ROS e, consequentemente, o dano oxidativo e morte celular [42]. Quando na presença da enzima superóxido dismutase, as ROS levam à formação de peróxido de hidrogênio, o qual se difunde rapidamente pela célula e reage com grupamentos de cisteína nas proteínas, alterando a função celular [39]. A característica de anti-aderência do endotélio saudável, mediada pela presença do NO,
é perdida quando a concentração de ROS aumenta, visto que inativa a enzima eNOS, reduzindo, consequentemente, a produção de NO e desencadeia estes processos inflamatórios que ocluem os vasos sanguíneos, como visto em pacientes com hipercolesterolemia, aterosclerose, hipertensão, diabetes, isquemias, tumores e fumantes crônicos [36, 38, 40].
Restabelecer o fluxo sanguíneo no vaso lesionado é um dos pré-requisitos para uma resposta de reparo bem sucedida. No entanto, CEs diferenciadas têm capacidade regenerativa limitada. Por isso, existe um crescente interesse acerca das CPEs, especialmente por seu papel na manutenção da integridade e função endotelial, e neovascularização. Essas patologias levam à diminuição das CPE circulantes e consequente dificuldade de recuperação das lesões, por isso, a busca de novas alternativas terapêuticas que estimulem a migração e adesão destas células ao local da lesão tem sido objeto de muitos estudos em casos de doenças cardiovasculares e diabetes. Vários estudos mostram que as CPEs podem contribuir para a formação de novos vasos (neovasculogênese) [10, 18].
1.5. Oxigênio e Oxigenação Hiperbárica (Hyperbaric Oxygen - HBO)
O oxigênio desempenha papel fundamental na cicatrização, tendo em vista que a baixa tensão de oxigênio (hipóxia) é um dos fatores mais críticos no agravamento de lesões. A tensão positiva de oxigênio está relacionada à produção de colágeno, através da ativação de fibroblastos, modulação da resposta inflamatória, aceleração dos fatores de crescimento, ação antibiótica, epitelização e angiogênese levando a cicatrização do vaso [43-46].
O tratamento de hiperoxigenação, através da utilização de uma câmara hiperbárica, tem sido alvo de muitos estudos, envolvendo isquemias em tecidos cardíacos, medula espinhal, cérebro, fígado, bem como ulcerações em pés diabéticos e tumores [27, 47-50].
O uso de câmaras hiperbáricas na medicina teve início em 1662, pelo físico britânico Henshaw, quando a terapia consistia em fazer pacientes com doenças agudas respirar o ar sob pressões
elevadas, ou a pressões mais baixas, no caso de doenças crônicas. A descoberta do oxigênio só veio mais tarde, em 1775, também na Inglaterra, por Joseph Priestley. Seus experimentos foram testados e utilizados pelo químico francês Laurent Lavoisier. Em meados de 1830, a terapia com oxigenação hiperbárica ganhou espaço na área de cicatrização de feridas, sendo, inclusive, administrada em soldados feridos da primeira guerra mundial. A partir de 1962, o interesse internacional sobre HBO aumentou após a descoberta de sua eficácia no tratamento de envenenamento por monóxido de carbono e as clínicas médicas americanas mais sofisticadas receberam unidades hiperbáricas [51].
Em 1968, foram definidas suas indicações clínicas e terapêuticas pela Administração de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos (FDA – Food and Drugs Administration), indicando-a como uma terapia segura, que estimula a cicatrização em ulcerações. No Brasil, a HBO é regulamentada pelo Conselho Federal de Medicina, mediante resolução CFM 1457/95, e faz parte do rol da Agência Nacional de Saúde (ANS) desde 2010, sendo, portanto, coberta pelos principais planos de saúde. O tratamento envolve o fornecimento de oxigênio medicinal, à concentração de 100%, dentro de uma câmara que possua uma pressão maior que 1 atmosfera, com o objetivo de aumentar em pelo menos 10 vezes a pressão tecidual de oxigênio [28, 43, 44].
A aplicação de uma pressão neste tratamento está relacionada à lei física de Henry, que diz: “a quantidade de gás que se dissolve num meio líquido, a uma determinada temperatura, é diretamente proporcional à pressão do gás sobre o líquido”, ou seja, quanto maior a pressão, maior a quantidade de gás dissolvida no sangue. Desta forma, consegue-se obter, além da saturação de 100% da hemoglobina, um aumento significativo do volume de oxigênio livre não ligado à hemoglobina. O volume de oxigênio dissolvido no plasma sanguíneo, que é desprezível à pressão atmosférica ao nível do mar, aumenta muito durante a sessão de oxigenoterapia hiperbárica, podendo atingir uma quantidade suficiente para suprir os consumos celulares totais do corpo humano em repouso, sem necessitar do oxigênio ligado à hemoglobina. Este oxigênio dissolvido no plasma é distribuído através da corrente sanguínea, aumentando em até 20 vezes a quantidade de
oxigênio dissolvido em todos os tecidos do corpo e consequentemente, no local comprometido pela deficiência de oxigênio [52-54].
A HBO ativa mecanismos que contribuem para a cicatrização, incluindo proliferação de fibroblastos, síntese de colágeno, produção de fatores de crescimento, capacidade antibacteriana e estimulação da angiogênese [55]. O tratamento com HBO também tem participação na modulação da resposta inflamatória, tendo em vista que reduz a ativação de leucócitos, bem como a liberação de citocinas como TNF-α, interleucinas 1 e 6 (IL-1 e IL-6) [77]. Em 2015, foi mostrado que a HBO aumenta a liberação de CPEs da medula óssea, aumentando a cicatrização de locais lesionados [6]. Além disso, a HBO tem grande participação na produção de óxido nítrico (NO) em vários tecidos importantes, como no córtex cerebral e tecido pulmonar periférico, a partir da estimulação da enzima óxido nítrico sintase, tendo em vista que esse gás atua não somente como vasodilatador, mas previne adesão e agregação plaquetária, assim como adesão e migração de leucócitos na parede arterial e inibe a proliferação de células musculares, que poderiam desencadear o processo aterosclerótico [28]. Portanto, a HBO tende a beneficiar a cicatrização, via ativação da eNOS e produção de NO, mobilizando CPEs para a circulação periférica [29, 56].
Wang (2011) e colaboradores mostraram em seu trabalho que o tratamento com HBO, de 2-8h a 2,5 ATA, aumentou a formação de ROS em culturas de células endoteliais de artéria coronariana de humanos, o que causaria toxicidade oxidativa. Ainda de acordo com este grupo de pesquisadores, o uso prolongado poderia causar efeitos significativamente tóxicos ao sistema neurológico in vivo, bem como nas culturas celulares [57]. Thom et al. (2009) observaram, no entanto, que a quantidade desse estresse oxidativo nas culturas celulares está relacionado ao tempo de exposição e à pressão do tratamento, sendo o período entre 60 a 120 minutos mais utilizado em pacientes, e a pressão, variando de 2,4 a 3 ATA. Estes pesquisadores ainda afirmam que a célula possui enzimas antioxidantes, como a superóxido dismutase, catalase, peroxidases e redutases, e os antioxidantes
não-enzimáticos como vitamina C e E, tiredoxina, glutationa, ácido úrico, β-caroteno, e caroteno, que são capazes de reverter a concentração das ROS [58, 59].
Thom et al. (2009) mostraram que as ROS produzidas durante a HBO estabilizaram o fator indutor de hipóxia-1 (HIF-1), o qual, por sua vez, atua diretamente sobre o fator derivado de estroma (SDF-1α), responsável pelo recrutamento das CPEs e, consequentemente, obtiveram um aumento na proliferação, angiogênese e cicatrização [58].
Em relação à terapia celular, Milovanova et al. (2009) [64], mostraram que a HBO estimula o crescimento e diferenciação de células CD34+, através de ativação autócrina, responsiva ao estresse oxidativo. A combinação do tratamento de oxigenação hiperbárica com o transplante de células-tronco mesenquimais da medula óssea, em lesões do sistema nervoso, tem se mostrado promissora para fins terapêuticos, no qual as células encontram um microambiente favorável para a sobrevivência, após o transplante, com baixa produção de citocinas pró-inflamatórias e aumento da proliferação [56, 65]. Porém, pouco ainda se sabe sobre o efeito molecular da HBO sobre as células progenitoras endoteliais, portanto, um estudo in vitro mais aprofundado pode elucidar os impactos do estresse oxidativo em relação às CPEs, de forma a desvendar os mecanismos de ação deste tratamento para o seu desenvolvimento como adjuvante à terapia celular, tornando-a mais efetiva.
2. OBJETIVO GERAL
Analisar o efeito da oxigenação hiperbárica em células progenitoras endoteliais de camundongo e em células endoteliais diferenciadas humanas após ativação com TNF-α in vitro.
3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar a proliferação celular da linhagem HUVEC e da cultura primária de CPEs após a exposição ao tratamento de HBO em diferentes tempos – 60, 120 e 180 minutos.
2. Comparar o efeito da HBO na proliferação das células (CPEs e HUVEC) tratadas ou não com TNF-α.
3. Analisar a presença de ICAM-1 e eNOS em HUVEC e CPEs por imunofluorescência, após a ativação destas células com o fator inflamatório TNF-α e o tratamento com HBO. Analisar se a HBO altera a presença de fatores que interferem na adesão celular e ativação do endotélio. 4. Analisar a cicatrização in vitro e verificar se a HBO interfere na migração das CPEs e HUVEC,
e, se este processo poderia alterar o remodelamento do endotélio após a lesão arterial.
5. Verificar a atividade de ROS em HUVEC e CPEs submetidas à HBO e à inflamação in vitro.
6. Analisar o nível do fator SDF-1α nas culturas de CPEs tratadas com TNF-α e após o tratamento com HBO.
7. Avaliar a adesão de plaquetas humanas em monocamadas de HUVEC tratadas ou não com TNF-α e HBO.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Animais
Para a extração da medula óssea, foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6J, adquiridos no CEMIB/UNICAMP, com 7-8 semanas de idade, pesando aproximadamente 24g. Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Biologia Celular e Estrutural da UNICAMP, sob a responsabilidade da Profª. Dra. Cristina Pontes Vicente.O projeto foi aprovado pelo comitê de ética da UNICAMP (4171-1).
4.2. Isolamento e Cultivo das CPEs
A medula óssea foi extraída dos camundongos eutanasiados com superdosagem de anestesia 5 vezes (100mg/kg de ketamina e 16mg/kg de xilasina), seguida de deslocamento cervical. Após a eutanásia, os animais foram lavados com uma solução de álcool iodado para evitar qualquer contaminação. O canal medular dos ossos fêmur, tíbia e úmero foi lavado com meio de cultura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's médium) contendo 10% de soro fetal bovino (SFB- Nutricell) e 1% de penicilina (100U/L)/estreptomicina (0.1g/L) (PS - Nutricell). As células mononucleares foram isoladas através de gradiente de Ficoll (Ficoll Paque Plus – GE-Healthcare), com centrifugação a 1500rpm durante 40 minutos e, então, plaqueadas em garrafas de 25cm² cobertas com gelatina porcina 1% (Sigma-Aldrich, EUA) e cultivadas em meio EGM-2 (Endothelial Growth Medium-2) suplementado com o kit para cultura de células endoteliais (VEGF, FGF-B, IGF, EGF, ácido ascórbico, heparina, hidrocortisona e soro fetal bovino (SFB) (LONZA, Suíça) e 10% de SFB. O meio de cultura EGM-2 diferencia as células mononucleares em células CPEs. Foram feitas 6 extrações celulares, utilizando um grupo de 5 animais por vez.
Após 5 dias da cultura primária, as células não-aderentes foram removidas com da troca do meio. A cultura celular foi mantida em uma estufa úmida e aquecida a 37°C, com 5% CO2. Após a
quinta passagem, as células foram congeladas em solução de 90% SFB com 10% de Dimetil-Sulfóxido (DMSO) e mantidas a -180°C no nitrogênio líquido até sua utilização nos experimentos.
4.3. Caracterização das CPE por citometria de fluxo
Para caracterização das CPEs, utilizamos anticorpos conjugados CD34-FITC (0,5mg/ml, eBioscence, Thermo Fischer, EUA), CD31-PE (0,2mg/ml, BD Biosciences, EUA) e CD45-APC (0,2mg/ml, eBioscence, Thermo Fischer, EUA) para os marcadores CD34, CD31 e CD45, respectivamente. Os ensaios foram realizados com CPEs após 30 dias de cultura em meio EGM-2. Aproximadamente 106 células/ml de cada grupo, controle e tratado com TNF-α por 24h (n=2/grupo em duplicata), foram tripsinizadas, ressuspendidas em 200μl de PBS/BSA (2%) e incubadas com os anticorpos descritos acima, por 40 minutos à temperatura ambiente, centrifugadas e ressuspendidas em PBS/BSA (2%) com paraformaldeído (4%) e, em seguida, analisadas pelo citômetro BD FACSCalibur™ System. As análises foram realizadas com o programa FlowJo (FlowJo, EUA).
4.4. Células Endoteliais Diferenciadas
As células endoteliais isoladas de veia de cordão umbilical humano (HUVEC) têm sido o modelo mais comum de estudo in vitro com células endoteliais diferenciadas, tendo servido de base para a definição de vários conceitos na biologia vascular. As HUVEC (Cell Biologics, Reino Unido) foram cultivadas em garrafas de 25cm², em meio DMEM + 10% SFB, trocado a cada dois dias.
4.5. Oxigenação Hiperbárica (HBO)
A utilização da câmara de oxigenação hiperbárica (figura 5) foi feita em parceria com o Laboratório de Leishmaniose da Professora Drª. Selma Giorgio, do Departamento de Doenças Tropicais da UNICAMP.
Todos os experimentos com a HBO foram feitos a 23°C, 100% de O2 e 2,5ATA. Inicialmente, foram feitos testes para comparar as temperaturas 23 e 37°C. Não havendo diferenças entre as temperaturas para a proliferação das culturas de CPEs e HUVEC (resultados não apresentados),
escolhemos trabalhar à 23°C. Em seguida, testamos o melhor tempo, entre os tempos de 60, 120 e 180 minutos, de oxigenação hiperbárica na proliferação e viabilidade celular da cultura primária de CPE e da linhagem de HUVEC.
Figura 5. Câmara de Oxigenação Hiperbárica. Laboratório de Leishmaniose (Departamento de Biologia Animal/UNICAMP) – Professora responsável: Dra. Selma Giorgio.
4.6. Grupos analisados
Para os experimentos de proliferação celular, proliferação após inflamação, detecção de eNOS, ICAM e ROS, e cicatrização, utilizamos os grupos:
Controle: CPEs e HUVECs cultivadas em meio EGM-2 e DMEM, ambos com 10% SFB, respectivamente, sem tratamento.
TNF-α: para simular uma inflamação in vitro, não citotóxica, adicionamos a citocina TNF-α, a uma concentração de 10ng/ml (proporção de 1:100), ao meio de cultura das células (DMEM com 2% de SFB para HUVEC, ou EGM-2 com 2% de SFB para CPE) em 24h antes da análise do experimento, de acordo com o protocolo de Sainson et al. (2015) [66].
HBO: CPEs e HUVECs, cultivadas em EGM-2 e DMEM, ambos com 10% SFB, respectivamente, tratadas na câmara hiperbárica a 2,5ATA, 23°C e 100% O2.
TNF-α/HBO: CPEs e HUVECs, cultivadas em EGM-2 e DMEM, ambos com 2% SFB, respectivamente, ativadas com TNF-α na concentração de 10ng/ml (1:100) por 24h e tratadas em seguida com a HBO.
OBS: No experimento de detecção de ROS, foi utilizado meio de cultura DMEM sem fenol para HUVEC, e EGM-2 (que também não possui fenol vermelho) para CPE, ambos sem SFB, para não interferir na fluorescência do reagente DCFDA adicionado.
Para o experimento de quantificação de SDF-1α, coletamos o meio de cultura das CPEs, que foram divididas em quatro grupos:
Controle: CPEs cultivadas em EGM-2, sem SFB (visto que este poderia influenciar na leitura do comprimento de onda), coletados 4 e 8h após o início do experimento.
TNF-α: CPEs cultivadas em EGM-2, sem SFB, mantido por 24h com TNF-α na concentração não-tóxica de 10ng/ml (proporção de 1:100) para simular uma inflamação in vitro. O meio foi coletado após 4 e 8h das 24h.
HBO: meio coletado das CPEs, cultivadas em EGM-2 sem SFB, após 4 e 8h do tratamento com HBO (2,5ATA, 23°C e 100% O2).
TNF-α/HBO: meio coletado das CPEs, cultivadas em EGM-2 sem SFB, mantido por 24h com TNF-α na concentração não-tóxica de 10ng/ml (proporção de 1:100), após 4 e 8h do tratamento com HBO (2,5ATA, 23°C e 100% O2).
Para o experimento de adesão celular de plaquetas, utilizamos culturas de HUVEC, divididas em quatro grupos:
TNF-α: HUVECs cultivadas em DMEM com 2% SFB, mantido por 24h com TNF-α na concentração não-tóxica de 10ng/ml (proporção de 1:100) para simular uma inflamação in vitro.
HBO: HUVECs cultivadas em DMEM com 10% SFB e tratadas com HBO (2,5ATA, 23°C e 100% O2).
TNF-α/HBO: HUVECs cultivadas em DMEM com 2% SFB, mantido por 24h com TNF-α na concentração não-tóxica de 10ng/ml (proporção de 1:100) e tratadas, em seguida, com HBO (2,5ATA, 23°C e 100% O2).
4.7. Proliferação e Morfologia Celular
Três tempos do tratamento in vitro com HBO foram comparados na análise de proliferação dos grupos de HUVEC e CPEs. As células foram cultivadas, em meio DMEM (para HUVEC) ou EGM-2 (para CPE) em placas de 24 poços (n=4/grupo), na concentração de 2x104 células/poço e colocadas na câmara hiperbárica por 60, 120 e 180 minutos.
Depois de lavadas com PBS 1x, foi adicionada tripsina às placas de culturas para que as células perdessem a aderência. Após 3 minutos, a tripsina foi inativada com adição de SFB e a solução foi centrifugada a 1500rpm por 10 minutos. Em seguida, as células foram coradas com azul de tripan (0,4%) e, com o auxílio da câmara de Neubauer, contadas em duplicata no Microscópio Olympus BX60 (câmera QColor 3), nos três tempos, 24, 48 e 72h, para análise da quantificação e viabilidade celular.
Para a análise da morfologia celular, as células foram cultivadas em lamínulas e, após 48h dos tratamentos, foram fixadas com acetona e coradas com hematoxilina e eosina (HE). Em seguida, foi feita a montagem das lâminas com Cytoseal 60 (Richard Allan Scientific) e as imagens foram obtidas pelo programa AxioVision, num aumento de 100x do microscópio Zeiss Observer Z.1 (Zeiss, Alemanha).
4.8. Imunofluorescência das Células
Análise de imunofluorescência foi realizada para verificar a expressão dos marcadores de eNOS e ICAM-1 nos quatro grupos de CPEs e HUVEC. Aproximadamente 20000 células por poço (n=4/grupo para cada proteína) foram cultivadas em lamínulas nas placas de 24 poços e, após 48h do tratamento de cada grupo, as células aderidas nas lamínulas foram fixadas em acetona por 20 minutos à 10°C, lavadas com PBS e, em seguida, mantidas em BSA por 1h. Foram utilizados os anticorpos primários policlonal NOS-3 rabbit (SC-654) (Santa Cruz Biotechnology, EUA) para eNOS, monoclonal rat (CD54) (R&D Systems, EUA) para ICAM-1. Estes foram diluídos em 1:100 em solução de PBS-BSA 1%, conforme instruções do fabricante, e incubados nas lamínulas por pelo menos 2 horas. O excesso de anticorpo foi lavado com PBS e foram colocados os anticorpos secundários goat anti-rabbit FITC (Sigma-Aldrich, EUA), para eNOS, e goat anti-rat FITC (Sigma-Aldrich, EUA), para ICAM-1, na proporção de 1:250, por 45 minutos. As amostras foram lavadas e os núcleos, corados com DAPI (Sigma, EUA) por 15 minutos. As lâminas foram montadas com FluroShield® e examinadas em microscópio Olympus BX600. As imagens foram obtidas, num aumento de 100x, com câmera Olympus Optical U-ULH e auxílio do software QCapture 4.0. Para quantificação da marcação, utilizamos 4 imagens representativas de cada poço e medimos a intensidade de fluorescência utilizando o software Fiji Image J.
4.9. Análise de Cicatrização
O ensaio de cicatrização envolve uma lesão da monocamada celular com a ponteira, sendo uma forma de mimetizar uma ferida in vitro e analisar a taxa de migração celular. Uma vez que a camada é rompida, a perda da interação célula-célula resulta em um aumento na concentração de fatores de crescimento e citocinas, iniciando migração e proliferação das células [67].
As células (CPEs ou HUVEC) foram cultivadas em placas de cultura de 24 poços, com n=3/grupo, numa densidade de 5x104 por poço, formando uma monocamada confluente. Uma lesão linear foi simulada ao longo do diâmetro da placa com a ponta de uma ponteira de 200µl em todos
os grupos. Os poços foram lavados com PBS para retirar as células que se soltaram após a lesão. Em seguida, os grupos HBO e TNF-α/HBO foram colocados na câmara hiperbárica por 60 minutos. As placas dos grupos controle e TNF-α permaneceram na estufa. Finalizado o tratamento, todas as placas foram fotografadas em time lapse (a cada 30 minutos por 24 horas) no microscópio Zeiss Observer Z.1 (Zeiss, Alemanha), através do software Zeiss Zen, em aumento de 200x. A análise da cicatrização foi feita pelo software Fiji Image J nos tempos 0, 6, 12, 18 e 24h.
Em cada imagem, foram medidas três distâncias entre as extremidades da lesão, sendo uma na região superior, mediana e inferior, como mostra a figura 6.
Figura 6. Três medidas entre as extremidades da área lesionada (uma na região superior, uma na região mediana e outra na inferior) para análise de cicatrização. Aumento de 200x. Barra = 50µm.
Em seguida, foi calculada a média dessas distâncias, as quais foram utilizadas para relacionar o tamanho da lesão dos tempos 6, 12, 18 e 24h (TF) ao tamanho do tempo 0 (Ti), e, dessa forma, determinar a porcentagem da área cicatrizada pela equação seguinte, de acordo com Bartolini et al. (2013) [68].
(Distância T
i– Distância T
F) x 100
Distância T
i4.10. Análise da presença de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) produzidas em culturas de CPEs e HUVECs, após tratamento com HBO e TNF-α.
Os quatro grupos de HUVEC e CPEs (n=4 /grupo) foram cultivados em placas de 96 poços (1x104 células/poço) em meio de cultura sem fenol e sem SFB e, para determinar o nível de ROS presente nas culturas após os tratamentos, foi utilizado o kit DCFDA - Cellular Reactive Oxygen Species Detection Assay Kit (Invitrogen, EUA). O DCFDA (2’, 7’ – diclorofluoresceína diacetato) é um reagente fluorescente permeável à membrana, que mede espécies reativas de oxigênio (ROS) nas células. Uma vez difundido, o DCFDA é deacetilado por estearase celular a um componente não fluorescente, que é então oxidado pelas ROS em DCF (2’ – 7’ diclorofluorescina). Este, sim, emite fluorescência, o que torna possível observar a presença das ROS nos tecidos, de acordo com a intensidade da sua atividade.
As células foram incubadas por 30 minutos com 5µM do reagente DCFDA, a 37°C, e depois tratadas com HBO por 60 minutos (grupo HBO e TNF-α /HBO). Trinta minutos após a retirada da câmara hiperbárica, as placas foram então colocadas no leitor de ELISA (Expert Plus da Analítica), onde a fluorescência foi lida à 485mn para detecção das ROS nos quatro grupos de cada tipo celular.
Foi feito um controle negativo, onde 5µM do reagente DCFDA foi colocado com PBS, e um controle positivo, no qual utilizamos 10µM de H2O2 mais 5µM de DCFDA. No controle branco foi colocado apenas meio DMEM sem fenol e EGM-2. Do resultado obtido obtidas de cada grupo, subtraímos o resultado obtido no controle branco (só com meio), ou seja, do resultado obtido da amostra em meio EGM-2 foi subtraído o valor obtido no controle branco contendo somente o meio EGM-2, e do resultado obtido da amostra em meio DMEM foi subtraído o valor do controle branco contendo somente meio DMEM. Desta forma, determinamos a porcentagem de ROS produzida nos grupos em relação ao grupo controle.
