UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUDO DE BIOLOGIA
DANILO CARLOS GUARNIER
“LEISHMANIOSE CANINA NOS DISTRITOS DO MUNICÍPIO DE
CAMPINAS, SÃO PAULO”
Campinas - SP 2017
“LEISHMANIOSE CANINA NOS DISTRITOS DO MUNICÍPIO DE
CAMPINAS, SÃO PAULO”
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte
dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestre em
Biologia Animal, área de relações antrópicas, meio ambiente e parasitologia.
Orientador: PROF. DR. DANILO CICCONE MIGUEL
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DISSERTAÇÃO/TESE DEFENDIDA PELO
ALUNO DANILO CARLOS GUARNIER E
ORIENTADA PELO PROFESSOR DOUTOR DANILO CICCONE MIGUEL.
Campinas - SP 2017
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Danilo Ciccone Miguel
Prof(a). Dr(a). Fernanda Ramos Gadelha
Prof(a) Dr(a). Tarcila Corrente Borghesan
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa Biologia Animal da Unidade do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Carlos e Maria do Socorro, que sempre foram além das suas capacidades e dignamente me apresentaram à importância da família e o caminho da honestidade.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Dr. Danilo Ciccone Miguel, pela oportunidade e confiança depositada em mim, me permitindo trabalhar ao seu lado e me incentivar mesmo quando as dificuldades pareciam intransponíveis.
Dra. Flávia Alessandra Guarnier e Gláucia Helena Guarnier, que sempre fizeram o papel de irmãs mais velhas, assumindo muitas vezes o papel de conselheiras.
Ao Dr. Paulo Anselmo Nunes Felippe, que sem sua colaboração, tanto no âmbito profissional quanto no pessoal, os progressos seriam pequenos.
Aos membros da UVZ de Campinas, que se colocaram a disposição para todo o tipo de colaboração possível. Em especial, Claudio Castagna e Tosca de Lucca.
Aos colaboradores da Clínica Veterinária Ricardo, que disponibilizaram espaço e pessoal para a realização de coletas em inúmeras situações.
Aos colaboradores da Mata Santa Genebra (Fundação José Pedro de Oliveira), por me permitirem coletas e por sua colaboração em tempo integral, destacando-se Sabrina, Cris e Thomaz.
Às professoras Silmara Marques Allegretti e Marlene Tiduko Ueta, que sempre foram espelhos e me mostraram o norte até mesmo em conversas informais, poder escrever esse agradecimento à vocês é realmente especial pra mim.
Aos amigos Tiago, César, Vinícius, Maicon e André, que mesmo quando estavam apenas conversando ou trocando conhecimentos, se tornavam colaboradores.
Às colegas de laboratório Karen, Amanda, Marília e Nathália, que promoveram bons momentos de convivência e foram minhas mãos e olhos muitas vezes quando me ajudaram. Aos Professores Adriano Coelho, Fernanda Janku Cabral, Fernanda Ramos Gadelha, Patrícia Thyssen e Regina Maura, que cederam seu tempo e espaço pra que as coisas pudessem acontecer, sempre me instruindo com muito carinho.
Aos meus pacientes caninos, por serem os verdadeiros motivadores de tudo isso e por servirem de combustível pra que eu levantasse todos os dias pela manhã.
À Laís Ribeiro da Silva, pessoa pela qual possuo profunda admiração por saber como lidar comigo, por ter uma sensibilidade infinita com os animais e por sempre ver o lado positivo das coisas, me tornando uma pessoa mais positiva também. Ser seu namorado torna minha vida mais leve.
Aos meus pais, que me permitiram através de uma estrutura familiar segura, fazer as minhas escolhas e seguir os caminhos que escolhi.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Resumo
A importância e o papel dos cães domésticos como fonte de infecção de leishmaniose já é bastante conhecida, entretanto, sabe-se também que em regiões geográficas distintas, circulam agentes etiológicos diferentes, mesmo havendo proximidade com regiões endêmicas. O presente estudo visa identificar o agente etiológico da leishmaniose na Região Metropolitana de Campinas, São Paulo, em canídeos selvagens bem como em cães domésticos. Para essa avaliação, foi escolhida a técnica de PCR que, por sua especificidade, permite a identificação molecular com precisão até o nível específico de parasitos. Para a realização deste estudo, foram obtidas e analisadas 149 amostras sanguíneas de cães domiciliados na região de Campinas, além de tentativas de obtenção de amostras biológicas de canídeos selvagens. Os resultados obtidos a partir da análise de amostras coletadas mostram que não houve detecção de material genético de parasitos do gênero Leishmania. Além disso, foram colhidas amostras de fezes de 30 cães domésticos para realização de exames parasitológicos, sendo que 26,6% delas foram positivas para a presença de ancilostomatídeos e 6,6% para Toxocara sp. Estudos de inquéritos epidemiológicos a partir da detecção de parasitos por técnicas diagnósticas, como as técnicas moleculares, permitem o aprofundamento na compreensão de diversas parasitoses, a exemplo da Leishmaniose Visceral Canina, que podem auxiliar na busca de estratégias de prevenção e medidas públicas para restringir o avanço da doença.
Abstract
The critical role of domestic dogs as a source of leishmaniasis infection is well known. However, in different geographic regions, different etiological agents can circulate, even though there is some proximity to endemic regions. The aim of the present study is to identify the etiological agent of leishmaniasis in the Metropolitan Region of Campinas (SP) in wild canids and domestic dogs. For this purpose 149 blood samples from dogs domiciled in the municipality of Campinas were obtained and analyzed. Several attempts were performed in order to obtain biological samples from wild canids. PCR technique was chosen for its specificity, allowing the species level molecular identification. Our results show that our samples tested negative for the presence of Leishmania DNA. In addition to the blood, faeces samples from 30 domestic dogs were also collected for parasitological examination. Around 26% of these samples were positive for the presence of ancylostomatids, and 6.6% were positive for Toxocara sp. The study of epidemiological surveys from the detection of parasites by means of molecular diagnosis can provide a better understanding of a number of parasitosis, such as Visceral Canine Leishmaniasis. The results of the present study may assist in the identification and development of prophylactic public strategies to restrict the progress of the disease.
1. Introdução….………...11
1.1. Leishmania e a leishmaniose………...11
1.2. Canídeos e a leishmaniose………....………....15 1.3. Leishmaniose na Região Metropolitana de Campinas ………... 16 1.4. Diagnóstico……… 19 1.5. Tratamento e profilaxia da leishmaniose………20
2. Justificativa……….... 23
3. Objetivos………..24 4.
Material e métodos….………..25
4.1. Autorização para uso de animais e coleta de amostras biológicas……...25
4.2. Canídeos domésticos………..25
4.3. Processamento de amostras biológicas e catação de ectoparasitos……26
4.4. Canídeos silvestres………..26
4.5. Extração de DNA………...28
4.6. Reação em Cadeia da Polimerase………....30
4.7. Confecção de gel de agarose………....31
5. Resultados………...….32
6. Discussão………...37
7. Conclusão………...41
7.1 Coleta de material biológico………..………...……..41
7.2 PCR………..………..41
7.3 Coproparasitológico e ectoparasitoses………...…………41
Referências……….………..…...…..42
Anexos………..………...……...…...47
Universidade Estadual de Campinas - CEUA-UNICAMP... 54 Anexo IV - Declaração de direitos autorais ... 55
1. Introdução
1.1 Leishmania e a leishmaniose
Os protozoários causadores da leishmaniose são parasitos do gênero Leishmania, subgêneros Leishmania, Viannia e Sauroleishmania (Euglenozoa, Kinetoplastea, Trypanosomatida, Trypanosomatidae) que alternam seu ciclo biológico entre um hospedeiro vertebrado e outro invertebrado (LAINSON & SHAW, 1987; ADL et al., 2005; BATES, 2007; RAYMOND et al., 2012). Dentre os hospedeiros vertebrados conhecidos, destacam-se os mamíferos canídeos selvagens e domésticos, reconhecidos reservatórios de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi no Brasil. Canídeos domésticos podem ser hospedeiros acidentais, apresentando variadas manifestações clínicas a depender do status imunológico do indivíduo, da espécie do parasito e também da região geográfica (LAINSON & SHAW, 1987; HANDMAN, 2001; MURRAY et al., 2005). Estima-se que mais de 20 espécies de Leishmania causam a leishmaniose, sendo transmitidas por vetores flebotomíneos (Diptera, Psychodidae) principalmente dos gêneros Phlebotomus (Velho Mundo) e Lutzomyia (Novo Mundo) (LAINSON & SHAW, 1987; KILLICK-KENDRICK, 1999) abrangendo em seu ciclo, hospedeiros silvestres ou domésticos e também o ser humano (Figura 1). Apesar de sua maior ocorrência se dar em áreas de temperaturas mais elevadas, como as Américas Central e do Sul, sudeste europeu, Ásia, África e Austrália, os flebotomíneos também podem ser encontrados em latitudes superiores a 50°N no sudoeste canadense até próximo à latitude 40°S, justificando assim o caráter endêmico da leishmaniose em 98 países (KILLICK-KENDRICK, 1999; ALVAR et al., 2012).
Figura 1. Ciclo biológico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC). Nota-se a obrigatoriedade do flebotomíneo intercalado entre os possíveis hospedeiros. O ápice desse triângulo representa os humanos, o vértice esquerdo, canídeos domésticos e o vértice direito, roedores, marsupiais e canídeos selvagens, representando o elo silvestre do ciclo (ABREU et al., 2015).
onde são encontrados. Quando encontrados no tubo digestivo do vetor flebotomíneo, apresentam-se na forma promastigota, onde se pode visualizar o flagelo longo e corpo alongado. Quando parasitando o mamífero, o parasito apresenta-se com formato globoso e flagelo internalizado, denominado amastigota (SADLOVA e cols. 2017) (Figura 2).
Figura 2. Estágios promastigota e amastigota intracelular, respectivamente, formas encontradas em hospedeiros invertebrados e vertebrados de Leishmania sp.
Microscopias ópticas de cultura de Leishmania sp. e macrófago infectado com amastigotas de Leishmania sp.; cada amastigota apresenta de 2 a 4 micrômetros de diâmetro.
A leishmaniose é amplamente distribuída e classificada como doença negligenciada de destaque por causar, segundo estimativas recentes, até 40 mil mortes por ano, tendo a Índia o maior número de vítimas, seguida por Bangladesh, Sudão, Sudão do Sul, Etiópia e Brasil. No Brasil, cerca de 26 mil casos anuais da forma cutânea (LC) foram reportados entre 2003 e 2007 e, para esse mesmo período, aproximadamente 3.500 casos da forma visceral (LV) (OMS, 2010; ALVAR et al., 2012).
No Novo Mundo a LC está principalmente relacionada às espécies: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Leishmania) amazonensis, L. (L.) mexicana, L. (L.) peruviana, L. (V.) panamensis e L. (V.) guyanensis, diferindo do Velho Mundo, onde, principalmente na região do Mediterrâneo, Oriente Médio e Sul da Ásia, as principais espécies envolvidas são L. (L.) major, L. (L.) tropica, L. (L.) aethiopica. A espécie L. (L.) donovani é o agente etiológico da LV no Velho Mundo e, além de presente no Velho Mundo, L. (L.) infantum causa também LV no Novo Mundo (GRIMALDI & SCHOTTELIUS, 2001; SIRIWARDANA et al., 2007; HAMMAMI-GHORBEL et al., 2014).
A LV, em sua forma crônica e sistêmica, caracteriza-se por febre de longa duração, emagrecimento, anemia, hepatoesplenomegalia e hemorragias, sendo apenas L. (L.) infantum presente no continente americano (sinonímia = L. (L.) chagasi) (MAURÍCIO et al.,
2000). Acredita-se que o parasito foi trazido para as Américas pelos imigrantes europeus se espalhando rapidamente principalmente pelo Brasil, Venezuela, Paraguai, norte da Argentina, oeste da Bolívia e leste do Peru, além de focos menores ao norte dessas áreas (MILÁN et al., 2016).
O aumento do número de casos da forma clínica é um problema crescente de saúde pública no Brasil e em outras áreas do continente americano. São bastante preocupantes as estatísticas que apontam para sua reemergência e expansão de áreas de transmissão, evidenciando o aspecto recente de urbanização da leishmaniose que, até meados da década de 1980, acometia principalmente crianças em regiões rurais do Nordeste do Brasil (DVE-SVS, 2004; JERÔNIMO et al, 2004, MAIA-ELKHOURY et al., 2008; NASCIMENTO et al., 2008). Ainda, um fator importante a ser considerado é a incidência da LV associada a quadros de imunossupressão, como nos casos de indivíduos portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida e de pacientes transplantados (MACHADO et al., 2009; ALBUQUERQUE et al., 2014; MICALLEF & MALLIA AZZOPARDI, 2014). Trabalhos realizados no Brasil reportam o aumento na incidência da co-infecção Leishmania/HIV no Nordeste e Centro-Oeste, sendo a LV a primeira infecção oportunista em 60% dos casos de pacientes HIV-positivos no estado do Mato Grosso do Sul (BOTELHO & NATAL, 2009; ALEXANDRINO-DE-OLIVEIRA et al., 2010; NASCIMENTO et al., 2011). A conduta terapêutica neste caso é extremamente complexa, já que as taxas de recaída após tratamento podem alcançar até 100% dos casos na ausência de terapia antirretroviral eficaz (BERN et al., 2008). Herwaldt apontou que as tendências de invasão urbana da LV e da expansão da infecção pelo HIV para áreas rurais são fatores capazes de promover o aumento do número de casos de pacientes co-infectados por Leishmania/HIV em diferentes regiões do mundo (HERWALDT, 1999).
Jerônimo e cols. identificaram um padrão de distribuição urbana da LV em Natal, capital do Rio Grande do Norte, com aumento do número de casos de pacientes infectados por L. (L.) infantum no início da década de 1990. Nesse caso, a taxa de mortalidade foi de aproximadamente 10% (JERÔNIMO et al., 1994). Surtos de LV em outras áreas urbanizadas das regiões Sudeste e Centro-Oeste do país vêm sendo relatados. Um dos principais exemplos conhecidos é o da região metropolitana de Belo Horizonte, Minas Gerais, onde se observou a rápida dispersão da LV entre os municípios nos últimos 20 anos. Entre 1994 e 2005, cerca de 750 casos foram diagnosticados e, apesar de algumas medidas governamentais de vigilância para controle da doença terem sido propostas, o número de casos seguiu aumentando nos anos seguintes (revisado por OLIVEIRA et al. 2008a).
No início de 2000, membros de 46 famílias do município de Três Lagoas (Mato Grosso do Sul) foram diagnosticados com LV assintomática, contabilizando uma taxa de aproximadamente 36% de infecção (OLIVEIRA et al., 2008b). Barata e cols. conduziram um estudo na área urbana no município de Governador Valadares, Minas Gerais, que revelou uma taxa de mortalidade por LV próxima a 16% para 86 casos humanos investigados entre 2008 e 2011. A prevalência de LV em cães nessa mesma região variou entre 13,6 e 53,4% (BARATA et al., 2013). De fato, os cães são implicados como os principais reservatórios domésticos envolvidos na transmissão de L. (L.) infantum (revisado por DANTAS-TORRES & BRANDÃO-FILHO, 2006). Oliveira e cols. tentam esclarecer também o papel dos gatos como reservatórios das leishmanioses, uma vez que esse papel não é totalmente conhecido (OLIVEIRA et al., 2015). Em um trabalho de revisão sobre os desafios no controle da LV no Brasil, Oliveira e cols. apontam que os surtos de LV ocorrem subsequentemente à presença de cães infectados (OLIVEIRA et al., 2008a), a exemplo dos casos de LV registrados em Araçatuba, área endêmica localizada na região noroeste do estado de São Paulo (ANDRADE et al., 2008).
Fêmeas do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva, 1912) são os vetores responsáveis pela transmissão de L. (L.) infantum no Brasil e o primeiro registro de captura desse inseto no estado de São Paulo, em Araçatuba, data de 1997. Lu. longipalpis é altamente adaptada ao ambiente periurbano e urbano, sobrevivendo facilmente em áreas peridomiciliares (DA COSTA et al. 1997; JERÔNIMO et al., 2004). Há inúmeros estudos na literatura que descrevem espécies e os hábitos alimentares destes insetos cada vez mais adaptados às habitações humanas e suas imediações, o que tem permitido o contato mais próximo desse vetor com os seres humanos e seus animais domésticos, principalmente o cão, destacando este importante elo na cadeia epidemiológica da LV (AFONSO et al., 2012; CASANOVA et al., 2013).
Mais de 80 casos autóctones de LV em humanos já foram descritos em áreas periurbanas do estado do Rio de Janeiro (MARZOCHI et al., 2009). Contudo, dois casos autóctones de LV foram recentemente relatados em áreas urbanizadas no Rio de Janeiro, sendo um na capital fluminense (SILVA et al., 2014) e outro no município de Volta Redonda (SANGENIS et al., 2014). No primeiro caso, não houve investigação sorológica da população canina da região, mas a presença de cães nas proximidades, somada à presença do vetor Lu. longipalpis, podem sugerir uma possível explicação para a infecção humana. Já no segundo relato de caso, foram coletados espécimes de Lu. longipalpis próximos à residência do paciente e os cães daquela região passaram a ser examinados quanto a possibilidade de estarem infectados (SILVA et al., 2014; SANGENIS et al., 2014).
1.2 Canídeos e a leishmaniose
O cão doméstico (Canis familiaris) é uma espécie animal que apresenta grande importância para a LV. Os cães são os conhecidos reservatórios urbanos mais importantes (DANTAS-TORRES, 2007) e também apresentam grande susceptibilidade à L. (L.) infantum. Podem expressar uma grande variedade de sinais clínicos, como dermatites, alopecia, hiperqueratose, linfadenomegalia, enfermidades oftalmológicas, mucosas hipocoradas, esplenomegalia, hepatomegalia, febre e onicogrifose (BANETH et al., 2008). Há alterações nos exames bioquímicos, tais como uremia e hiperglobulinemia (FREITAS et al., 2012). É importante ressaltar que o aumento da carga parasitária em tecidos como linfonodos, medula óssea e baço, tem grande importância nesses sintomas (MANNA et al., 2009; REIS et al., 2006).
Além do cão doméstico, outras espécies de canídeos silvestres são importantes reservatórios deste parasito no Brasil e no mundo (ASHFORD, 1996; MAIA-ELKHOURY et al., 2008). Abreu e cols. relataram 6 casos autóctones de LV canina na cidade de Pedregulho no estado de São Paulo, área considerada não-endêmica e livre de flebotomíneos (ABREU et al., 2015) levantando a suspeita de que exista o trânsito do parasito independentemente de humanos e cães domésticos naquela região.
As dificuldades de um diagnóstico preciso facilitam esse trânsito de reservatórios quando se trata de cães domésticos. Em 2017, Albuquerque e cols. mostraram que reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta molecular que vêm ampliando horizontes no que tange à detecção de Leishmania spp. em diferentes amostras de tecidos e diferentes espécies, também servindo para identificar linhagens e genótipos dos parasitos. Atualmente, há um grande número de protocolos que se apresentam sensíveis e específicos, dependendo de diferentes fatores, como o método de extração de DNA, sequências de primers, reagentes e condições da reação (ALBUQUERQUE et al., 2017).
Em relação à investigação de infecções em canídeos silvestres, diferentes técnicas têm sido aplicadas por grupos de pesquisa em vários países. Na Croácia, por exemplo, foi constatada a infecção de um lobo cinza (Canis lupus) por L. (L.) infantum a partir da detecção do DNA do parasito de amostras de lesões típicas de leishmaniose canina (BECK et al., 2008). Estudos epizootiológicos de leishmaniose realizados com 67 raposas vermelhas (Lupis lupis) na Espanha detectaram DNA de L. (L.) infantum em 74% dos animais (CRIADO-FORNELIO et al., 2000) e ainda na península Ibérica, inquéritos sorológicos de populações de lobos (Canis lupus) mantidos em cativeiro mostraram que
esses animais possuíam, ainda que em baixos títulos, anticorpos contra esse parasito, além da presença de DNA do mesmo (SASTRE et al., 2008). Interessantemente, Mol e cols. comprovaram a capacidade de transmissão de L. (L.) infantum de lobos-guará (Chrysocyon brachyurus) e cachorros-vinagre (Speothos venaticus) infectados sem sintomatologia para hospedeiros invertebrados, sendo assim, capazes de manter o ciclo do parasito (MOL et al., 2015).
Conforme relatado por Mozos e cols. em 1999, é sabido que outras parasitoses acompanham casos de leishmaniose em cães, podendo ser endoparasitos ou ectoparasitos. Destacam-se as sarnas e as enteroparasitoses, reconhecendo-se a necessidade da investigação do motivo de coinfecções ou até mesmo busca da Leishmania em animais que apresentarem enfermidades já conhecidamente relacionadas e diagnosticadas (MOZOS et al., 1999).
Na América do Sul, especialmente no Brasil, a presença de L. (L.) infantum já foi descrita para marsupiais e roedores (revisado em QUINNELL & COURTENAY, 2009) e canídeos de ampla distribuição territorial, como cachorro-do-mato (Cerdocyon thous), raposa do campo (Lycalopex vetulus), cachorro-vinagre e lobo-guará (SILVEIRA et al., 1982; LUPPI et al., 2008). Apesar desses animais não serem originalmente sinantrópicos, fato que os colocaria como reservatórios de importância secundária na cadeia de transmissão da LV zoonótica (DANTAS-TORRES & BRANDÃO-FILHO, 2006), é possível que o papel destes canídeos silvestres como potenciais reservatórios para Leishmania seja ainda esclarecido. Tal fato pode ser explicado pelo aumento da interação do homem com os ambientes florestais – tanto por expansão das zonas urbanas e periurbanas com o avanço populacional, como pelo aumento das atividades de ecoturismo em áreas de mata – levando à sobreposição geográfica entre espécies silvestres e o homem, em muitos casos ainda acompanhados por seus animais de estimação.
Em 2015, Casanova e cols., através de levantamento epidemiológico, verificaram que no Estado de São Paulo ocorreram casos de Leishmaniose humana em períodos subseqüentes aos casos de LVC. Um avanço da doença no sentido oeste-leste do estado também foi observado. Nesse sentido, casos mais antigos foram relatados no oeste paulista e com o avanço dos anos, outros mais recentes foram observados em cidades ao leste das anteriormente citadas. Sendo assim, os casos caninos podem servir de sentinela para os casos humanos, quando bem monitorados e diagnosticados. (CASANOVA et al., 2015).
O município de Campinas (22°54’3” S, 47°3’26” W), localizado a 96 km da capital do estado de São Paulo, possui 1.173.370 de habitantes (IBGE, 2013) e faz parte da Região Metropolitana de Campinas (RMC) com cerca de 3 milhões de habitantes. A economia da RMC é centralizada no setor industrial e de prestação de serviços. A região tem clima tropical de altitude, com chuvas no verão e seca no inverno e temperatura média no mês mais quente superior a 22°C (Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas à Agricultura – CEPAGRI/UNICAMP). Seis distritos fazem parte do município, sendo eles: Barão Geraldo, Nova Aparecida, Campo Grande, Ouro Verde, Sousas e Joaquim Egídio. Os dois últimos estão localizados na região Leste do município, a cerca de 10 km de distância do centro de Campinas (Figura 3), em uma Área de Proteção Ambiental (APA) de 222 km² de extensão, contendo 60% da Mata Atlântica remanescente (Decreto Municipal nº 11.172 de 28/05/93).
Figura 3. Localização geográfica do município de Campinas e dos Distritos de Sousas e Joaquim Egídio. A. Município de Campinas em destaque no mapa do Estado de São
Paulo. B. Mapa do município de Campinas, divisão segundo as Grandes Regiões, indicando a localização dos Distritos de Sousas e Joaquim Egídio na região leste (Fonte: Mapas adaptados de Raphael Lorenzeto de Abreu_Maps of Brazil e Prefeitura Municipal de Campinas, 2014).
Em meados de 1990, o processo de conurbação metropolitana ou a metropolização de Campinas foi consolidado (FALEIROS & SCHICCHI, 2011) e o município passou a expandir com a implantação de grandes empreendimentos imobiliários, como shopping centers, conjuntos de escritórios, amplos loteamentos e condomínios fechados, sobretudo no entorno da Rodovia Dom Pedro I (CANO & BRANDÃO, 2002). Os distritos de Sousas e
Joaquim Egídio, predominantemente rurais, passaram a ser áreas de concentração de loteamentos e condomínios fechados justapostos a regiões de mata. As condições naturais existentes no município de Campinas, como as áreas de fragmentos florestais da APA, proporcionam a ocorrência de um ambiente adequado para manutenção de fauna de silvestres que podem constituir prováveis focos naturais para a transmissão da LV. De fato, diversas espécies de canídeos silvestres frequentes no território brasileiro podem ser encontradas também nessa região, incluindo o cachorro-do-mato, cachorro-vinagre e a raposa do campo (CURI & TALAMONI, 2006; BEISIEGEL, 2009; DE VIVO et al., 2011). A ocorrência de infecções por Leishmania em reservatórios silvestres não é conhecida para esta região, mas casos de cães domésticos infectados nos distritos de Sousas e Joaquim Egídio foram recentemente descritos VON ZUBEN, et al., 2014).
Em 2011, Savani e cols. reportaram um caso inédito de LV em um cão de uma família residente em um condomínio fechado entre os distritos de Sousas e Joaquim Egídio. Por meio de análises moleculares do DNA obtido de amostras do fígado e baço, os autores identificaram L. (L.) infantum como agente etiológico (SAVANI et al.,2011). Posteriormente, outro estudo compilou os dados de vigilância epidemiológica na mesma região realizada em 2009 pelo Departamento de Vigilância em Saúde da Secretaria de Saúde do município de Campinas. Naquela ocasião, amostras sanguíneas de 198 cães foram examinadas e 4 casos de LV canina confirmados, indicando prevalência de 2% de cães infectados por L. (L.) infantum na população investigada (VON ZUBEN et al., 2014).
Von Zuben e cols. realizaram ainda a coleta de flebotomíneos daquela mesma região, mostrando predominância das espécies Lutzomyia whitmani (69,5%) e Lutzomyia longipalpis (22,5%). No que diz respeito à pesquisa de mamíferos silvestres que poderiam participar da transmissão de LV, não foi verificada a presença de DNA do parasito em nenhum dos espécimes capturados, incluindo apenas uma espécie de roedor (Nectomys squamipes), uma de primata (Callithrix penicillata) e duas de marsupiais (Didelphis albiventris e Gracilinanus agilis) (VON ZUBEN et al., 2014). Os dados acima descritos foram fundamentais para que o município de Campinas fosse reclassificado em 2010 como uma área de transmissão canina de LV no estado de São Paulo, já que anteriormente era classificada como uma região não-vulnerável para LV (SES, COMITÊ DE LEISHMANIOSE VISCERAL AMERICANA, 2010).
Apesar dos casos autóctones de LV terem sido descritos na região apenas em cães a partir de 2009, um surto de LC humana ocorrido nos anos de 1993 e 1994 foi relatado nos distritos de Sousas e Joaquim Egídio envolvendo 25 casos de moradores das áreas rural, periurbana e urbana. Os autores observaram a mobilidade da ocorrência dos casos na
direção rural-urbana (CORTE et al., 1996). No caso deste trabalho, a identificação da(s) espécie(s) de Leishmania não foi realizada. Vale ressaltar que em 2007 foram descritos os dois primeiros casos de infecção canina por L. (L.) amazonensis no município de Araçatuba, considerado zona endêmica de LV no estado de São Paulo. A espécie identificada, nesse caso, está tipicamente associada a casos de LC em humanos e tem como roedores seus principais reservatórios silvestres (TOLEZANO et al., 2007).
1.4. Diagnóstico
Atualmente, o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) é rotineiramente realizado em laboratórios por exame parasitológico direto e/ou métodos sorológicos, que podem se apresentar menos precisos. Métodos mais sensíveis e específicos como ferramentas de diagnóstico molecular vêm sendo atualmente mais aplicados para detectar a infecção por Leishmania, tanto em cães clinicamente suspeitos como em cães assintomáticos, esses podendo servir como reservatórios, por ser eventual fonte de infecção para vetores flebotomíneos. Estudos clínicos recentemente realizados no Irã, mostram que a maioria dos cães infectados não apresentam sinais clínicos (FAKHAR et al., 2012).
O diagnóstico de LVC em cães pode ser considerado complexo para os veterinários pelos seguintes fatores: sinais clínicos são altamente variáveis em intensidade e outras patologias podem apresentar sinais semelhantes, como a erliquiose (TAFURI et al., 2001);análise histopatológica é relativamente invasiva, além de demandar tempo e custos; inexistência no mercado de um método diagnóstico altamente sensível e específico (FERRER, 1999). Nesse contexto, tem-se adotado uma pontuação clínica baseada em sintomas para auxiliar no diagnóstico LVC em regiões endêmicas. Na Itália, foi proposto um escore de gravidade baseado em sinais da doença (MANNA et al., 2009).
Uma vez identificados os sinais clínicos da LVC, a rotina clínica já instituída e o padrão ouro dos órgãos de saúde responsáveis faz com que sejam necessários os exames laboratoriais básicos para detecção da infecção, sendo realizada a pesquisa direta do parasito através de esfregaço de punção de linfonodo, medula óssea ou sangue, ou testes sorológicos como ELISA por kits rápido. Devemos atentar para a baixa especificidade desses testes, uma vez que estudos comprovam a ocorrência de reações cruzadas com outras hemoparasitoses. A falta de sensibilidade também deve ser destacada principalmente em casos de animais portadores de forma subclínica
(CASTELLANOSGONZALES et al., 2015). A reação em cadeia da polimerase (PCR) apresenta-se como um método sensível e específico, uma vez que, tem resultados mais confiáveis inclusive em animais saudáveis, ou seja, animais sem sintomatologia ou sinais clínicos da doença (ZHAO et al., 2016).
Através da técnica da PCR é possível amplificar sequências alvo no genoma onde o arranjo de DNA ribossomal (rDNA) têm sido muito utilizado na tipagem das espécies de Leishmania (AUWERA e DUJARDIN, 2015). As seqüências ribossomais apresentam vantagem por incluírem regiões conservadas e variáveis que permitem a identificação de gêneros e subgêneros (ULIANA et al., 1994). Em Leishmania, aproximadamente 10 a 20 cópias estão repetidas em tandem, aumentando a sensibilidade na análise de DNA de uma amostra clínica. Cada unidade repetida é constituída de vários genes e espaçadores como exemplificado na Figura 4 (AUWERA e DUJARDIN, 2015). Dentro desse arranjo, principalmente a região espaçadora contém uma variabilidade suficiente para a discriminação entre espécies, embora também tenham sido utilizados para a identificação de isolados em nível de subespécie (VAN DER AUWERA e DUJARDIN, 2015) (Figura 5).
Figura 4. Arranjo de rDNA. Figura ilustrando de forma simplificada um fragmento de DNA,
destacando os alvos utilizados no presente estudo e primers.
Figura 5. Alvos para tipagem de Leishmania. Para cada ensaio, os grupos de espécie que puderam ser discriminados são indicados por diferentes cores e a ausência de cor onde não foi possível fazer a identificação. O primeiro número indica o número de cepas testadas e o segundo número os diferentes países de onde as cepas se originaram. Abreviações: aet, L. aethiopica; tro,L. tropica(inclui L. killicki); maj,L. major; don,L. donovani (inclui L. archibaldi); inf, L. infantum (inclui L. chagasi); mex,L. mexicana (exclui L. pifanoi); ama, L. amazonensis (inclui L. garnhami, exclui L. pifanoi); lai,L. lainsoni; nai,L. naiffi; bra-O, L. braziliensis outliers (Adaptado de Auwera & Dujardin, 2015).
1.5 Tratamento e profilaxia da leishmaniose
Dada a proibição de tratamento da LVC com o uso de fármacos que coincidiam aos de uso humano pelos órgãos responsáveis pela saúde no Brasil, havia grande controvérsia na medicina veterinária, além de recomendações de eutanásia de animais soropositivos, não houve grande eficácia em controle da doença. Recentemente, os estudos sobre fármacos que podem atuar contra a leishmaniose evoluíram e hoje já é realidade o uso da miltefosina (Milteforan®), que aliado à imunomoduladores (Domperidona), vêm apresentando bons resultados. A liberação do produto citado tem forte relação com o caráter exclusivamente zoonótico que a doença apresenta no Brasil, diferentemente de outras localidades, onde é constatado o caráter antroponótico como, por exemplo, na Índia. É importante ressaltar que existe a necessidade de uma vigilância intensiva, pois a pressão de seleção sobre o parasito pode, em um primeiro momento, provocar ocorrência de tolerância e em um segundo momento, resistência ao fármaco, uma vez que todos os elos da cadeia epidemiológica estarão expostos ao mesmo fármaco.
A profilaxia da leishmaniose está intimamente relacionada à interrupção da transmissão do parasito entre os elos da cadeia epidemiológica. Até pouco tempo era recomendada como medida profilática a eutanásia de animais com sorologia positiva, mas essa medida mostrou-se ineficaz por existirem reservatórios selvagens com grande proximidade com os cães e os humanos, por exemplo, canídeos selvagens. Estratégias para atuação profilática no flebotomíneo são as que têm apresentado melhores resultados. O uso de telas protetoras e coleiras repelentes, além de inseticidas, são usados amplamente para a interrupção da transmissão, uma vez que não é possível, até o momento, confiar em vacinas para a profilaxia, pois o animal, após vacinado, apresentará sorologia positiva e, em caso de mudança de proprietário do animal, ou animal sem histórico, isso significaria sua condenação (ROWLAND et al., 2015; DUARTE et al., 2016; KARAKUS et al., 2016),diferentemente de medicina humana, onde não há vacinas atualmente disponíveis para uso.
Com base nas informações expostas, é essencial reconhecer a complexidade da cadeia epidemiológica da LV para que sejam consolidadas políticas públicas de controle da mesma, mesmo já sendo conhecidas as dificuldades de suas aplicações, como citado em recente revisão, onde foram expostas todas as dificuldades de execução do Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose, trabalho que incluiu o município de Campinas em seus dados (VON ZUBEN e DONALÍSIO, 2016). Apenas com o estabelecimento de uma série de medidas relativas ao diagnóstico precoce dos animais por meio de: i. inquéritos
sorológicos e utilização de ferramentas moleculares eficientes; ii. educação da população sobre a epidemiologia da doença e iii. combate aos vetores flebotomíneos (RIBEIRO et al., 2013), será possível evitar a propagação da doença canina e a transmissão para a população humana. Para isso, é fundamental que os elos da cadeia epidemiológica sejam estabelecidos para cada área de estudo, levando-se em consideração suas particularidades.
2. Justificativa
O presente trabalho se justifica, portanto, pela necessidade de se estabelecer o diagnóstico molecular de espécie(s) de Leishmania circulante(s) na região de Campinas, com o intuito de identificar possíveis reservatórios silvestres e também casos de infecção por Leishmania em cães domésticos, dada a relevância destes animais na transmissão do protozoário ao ser humano.
3. Objetivos
Os dados da literatura mostram que os agentes etiológicos da leishmaniose estão presentes no município de Campinas, São Paulo, principalmente em áreas de crescente ocupação por loteamentos e condomínios que adentram áreas florestais remanescentes na região. Contudo, pouco se compreende acerca do papel dos canídeos silvestres na epidemiologia da LV circulantes nessa área. Dessa forma, o presente projeto tem como objetivo geral a identificação de potenciais reservatórios canídeos envolvidos na cadeia de transmissão da leishmaniose no município de Campinas, São Paulo.
Os objetivos específicos são listados a seguir:
1. Coletar e processar amostras de sangue e fezes, além de ectoparasitos, de cães domésticos inscritos em campanhas de castração municipal de bairros do município de Campinas para detecção de DNA de parasitos do gênero Leishmania;
2. Coletar amostras biológicas (sangue, punção de linfonodo e biópsia de pele) de canídeos silvestres capturados em distritos do município de Campinas para detecção de DNA de parasitos do gênero Leishmania;
3. A partir de detecção de DNA em amostras de canídeos silvestres e/ou domésticos. Identificar em nível molecular a(s) espécie(s) de Leishmania circulantes.
4. Material e Métodos
4.1. Autorização para uso de animais e coleta de amostras biológicas
Os protocolos experimentais desenvolvidos no presente projeto foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Campinas (CEUAUNICAMP, nº 4005-1) e pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade do Ministério do Meio Ambiente (SisBio, nº 50219-1) (Anexos I e II).É importante ressaltar que para poder se cadastrar na campanha de castração, o proprietário necessitava declarar que o(s) animal(is) estavam com vacinação e controle parasitário em dia, sendo todos os animais declarados como domiciliados. Entretanto, é de conhecimento até mesmo do departamento responsável, que muitos dos animais não estavam totalmente cobertos por todos os pré requisitos.
4.2. Canídeos domésticos
As amostras de sangue dos cães domésticos foram coletadas a partir de cães submetidos à cirurgia em programa de controle de natalidade promovida pela Prefeitura do município de Campinas, SP. A autorização por parte da Prefeitura foi concedida a partir de uma colaboração estabelecida com o Prof. Dr. Paulo Anselmo Nunes Felippe da Universidade Paulista, também médico veterinário da Prefeitura Municipal de Campinas e Coordenador do Departamento de Proteção e Bem-Estar Animal (DPBEA). Os proprietários foram questionados sobre a possibilidade de cederem as amostras dos seus cães e os que assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido autorizaram a utilização das amostras coletadas (Anexo III). O procedimento anestésico consistiu na administração de medicação pré-anestésica contendo morfina, xilazina e acepromazina até tranquilização do animal, seguida de anestesia com cetamina e diazepam. A coleta dos materiais ocorreu no momento pós-cirúrgico (Figura 6), aproveitando a baixa ou inexistente sensibilidade ao procedimento realizado com agulha 25 x 0,7 mm em veia cefálica ou safena lateral. As coletas foram realizadas com o uso de seringas de 3 mL, sendo coletados apenas os volumes necessários (2 – 4 mL) para realização da técnica estabelecida no projeto. O material coletado foi acondicionado em tubos tipo eppendorf devidamente identificados ou tubos tipo vacutainer (BD) seco ou com EDTA e posteriormente congelados a -20°C até o processamento.
Figura 6. Período pós-operatório de cães participantes de campanha de esterilização. Período no qual foram coletados ectoparasitos, fezes, sangue e, quando havia lesão característica, fragmento de pele (Fonte: Paulo Anselmo Nunes Felippe).
Todos os animais que participaram da campanha de castração foram identificados com um microchip, para que caso houvesse ocorrência de resultado positivo, o proprietário e órgãos responsáveis pela vigilância de zoonoses fossem comunicados.
4.3. Processamento de amostras biológicas e catação de ectoparasitos
Foram coletadas 30 amostras de fezes através de busca direta em ampola retal com espátula fina dos canídeos domésticos. As amostras foram acondicionadas em frascos coletores de plástico estéreis e mantidas a 4°C por até 6 horas. A seguir, foram processadas
a partir dos métodos de Willis-Mollay (flutuação) e de Hoffman-Pons-Janer (sedimentação
espontânea) para serem analisadas em microscopia óptica quanto à presença de formas
parasitárias e possível identificação (REZENDE et al., 2015). Tal etapa do projeto foi
realizada em colaboração com a equipe do Laboratório de Helmintologia do Departamento de Biologia Animal do IB-UNICAMP. Ectoparasitos (pulgas e carrapatos) foram recolhidos por catação em pele dos cães e acondicionados em tubos tipo eppendorf contendo etanol 70% a 4°C.
4.4. Canídeos silvestres
Nesta etapa do projeto foi elaborada uma proposta para captura de animais silvestres em áreas de expansão urbana e de proteção ambiental dos distritos de Sousas, Joaquim Egídio e Mata Santa Genebra. Foram montadas armadilhas aramadas e com gatilho de acionamento podal (Gabrisa Aramados), gentilmente cedidas pela Unidade de Vigilância de Zoonoses (UVZ) da Prefeitura do município de Campinas, sendo 5 armadilhas de tamanho grande (1,0 m x 0,5 m x 0,5 m) e 3 de tamanho menor (0,5 m x 0,5 m x 0,5 m) distribuídas nas áreas de mata (COURTENAY et al., 1994) (Figura 7). As mesmas foram
armadas com frequência de acordo com as disponibilidades das áreas estudadas bem como ambientais, inicialmente em período diurno e posteriormente em período noturno durante os meses de março e abril de 2017, sendo vistoriadas a cada 4 horas, com a finalidade de se evitar lesões nos animais vinculadas ao estresse da captura. Para atrair os animais para as armadilhas, fez-se uso de iscas para animais onívoros, como abacates, goiabas, mangas, bananas, carne bovina e carne suína, além de ovos de codorna. O posicionamento das armadilhas foi determinado de acordo com os locais onde já havia visualização prévia de animais por moradores da região, estudiosos de fauna silvestre e rastreamento por pegadas e câmeras trap. As armadilhas foram posicionadas previamente para que fossem observadas as iscas que mais interessavam aos animais e também para determinar locais com maior intensidade de tráfego dos animais desejados, minimizando, assim, a captura de animais que não fossem de interesse do estudo.
A contenção química aprovada para utilização segundo protocolo experimental consiste na aplicação, por intermédio de dardo e zarabatana e/ou seringa e agulha, de cloridrato de cetamina (anestésico dissociativo) e cloridrato de xilazina (miorrelaxante de ação central), após medicação pré-anestésica com sulfato de atropina (quando possível) (MASSONE, 2011). Além disso, foi aprovada a utilização de colírio de "lágrimas artificiais" em ambas as retinas para evitar o ressecamento ocular dos animais (DIETZ, 1984; GOMES, 2007; MASSONE, 2011). Após os procedimentos de coleta de material biológico o animal deve ser acompanhado até se recuperar por completo da contenção química, ocasião em que pode ser liberado no mesmo local de captura. Os indivíduos capturados devem passar por um exame clínico e os dados obtidos apontados em formulário próprio. Quando a captura é bem sucedida, coleta-se o tecido sanguíneo, através da punção venosa da ponta da orelha (três gotas) e veias safena ou radial ou jugular (10 mL). A punção da orelha e de outras veias é comumente realizada com agulha descartável estéril (30 x 0,8, 25 x 0,8, 40 x 1,2 mm; na dependência do porte do animal capturado), puncionando e acondicionando o volume em tubos com anticoagulante, após prévia assepsia do local com álcool iodado. Através de agulha de punch de tamanho compatível ao da espécie capturada podem ser coletados fragmentos de pele para biópsia (BIRGEL, 1982; GOMES, 2006) e acondicionados em tubos Falcon (BD) estéreis para adição de meio de cultura 199 (GIBCOBRL) contendo coquetel de antibióticos e antifúngicos em laboratório.. A identificação de cada animal capturado é relacionada ao seu local de captura, para que, em caso de resultado positivo, seja possível ter o maior número de dados do animal para nova captura e encaminhar para tratamento por órgão responsável, sendo uma responsabilidade
dos órgãos de vigilância do município de Campinas, os quais, por sua colaboração no projeto, serão informados e terão acesso aos dados da pesquisa.
Figura 7. Exemplo de armadilha utilizada nos pontos de captura de canídeos silvestre
4.5. Extração de DNA
A extração do DNA foi realizada utilizando-se UltraClean®BloodSpin®DNA Isolation Kit (QIAGEN Company, USA). Seguindo-se as recomendações do fabricante, foi adicionado em tubos tipo eppendorf 200 µL da amostra sanguínea com 10 µL de proteinase K e 200 µL da solução B1 que se trata de um sal caotrópico e detergente (nesse momento ocorre a quebra da parede celular e lise celular), homogeneizando com auxílio de agitador tipo vórtex por 15 segundos potencializando a lise devido à ação física. Para desnaturação e finalização da lise, incubou-se a amostra em banho-maria (65°C) por 10 minutos. Os tubos foram centrifugados a 13.000 x g por 30 segundos para posterior coleta do lisado. Adicionou-se 200 µL da solução B2 (etanol) e homogeneizou-se com auxílio de agitador tipo vórtex por 15 segundos para nova centrifugação a 13.000 x g por 30 segundos. Transferiu-se o conteúdo para spin filter fornecido pelo fabricante e a amostra foi submetida a centrifugação por 1 minuto a 13.000 x g, nesse momento o DNA se liga à membrana de sílica contida no spin filter. Transferiu-se o spin filter para um novo tubo tipo eppendorf para adição de 500 µL da solução B3, que se trata de uma solução de lavagem a base de sal, e posterior centrifugação a 13.000 x g por 30 segundos. Removeu-se o spin filter e o filtrado foi descartado, recolocando-se o spin filter no mesmo tubo. Adicionou-se 500 µL da solução B4 (solução de lavagem contendo etanol que auxilia na remoção de sal residual). Após esse processo, a amostra foi centrifugada por 30 segundos a 13.000 x g. Removeu-se o spin filter e o filtrado foi descartado, recolocando-se o spin filter no mesmo tubo. A amostra foi submetida a nova centrifugação por 30 segundos a 13.000 x g. Cuidadosamente, o spin
filter foi removido e transferido para um novo tubo onde foi adicionado 100 µL da solução B5 (Tris 10 mM e EDTA 1 mM). A amostra foi incubada por 5 minutos em banho-maria (65°C) e submetida a nova centrifugação a 13.000 x g 30 segundos . Descartou-se o spin filter e o filtrado obtido foi armazenado 4°C.Com o produto da amostra obtido após extração, deu-se a quantificação da concentração de DNA por unidade final. Para isso, alíquotas 1 µL de amostra foram quantificadas em espectrofotômetro Nanodrop 2000c (Thermo Scientific).
4.6. Reação em cadeia de polimerase (PCR)
Extraído o DNA, a amplificação de fragmentos de interesse para detecção de DNA de Leishmania foi realizada fazendo uso de 200 ng por amostra, a partir de protocolo estabelecido por Schönian e colaboradores (SCHÖNIAN et al., 2003). Neste caso, foi realizada amplificação de parte do espaçador transcrito interno 1 (ITS1) utilizando as sequências iniciadoras LITSR (5'-CTGGATCATTTTCCGATG-3') e L5.8S (5'TAGTACCACTTATCGCACTT-3'). A diluição dos primers seguiu recomendação do manual fornecido pela empresa Exxtend, adicionando em cada primer, o volume especificado para a obtenção de concentração final igual a 10 pmol/µmol e separou-se alíquota de uso de 50 µL. As reações de PCR foram padronizadas em 50 µL, onde os volumes de água e DNA foram ajustados para cada amostra. As condições da reação de PCR foram: 1- Aquecimento a 95°C por 5 minutos, 2- Desnaturação a 95°C por 1 minuto, 3- Anelamento a 58°C por 30 segundos, 4- extensão a 72°C por 1 minuto e 30 segundos e 5- extensão final a 72°C por 5 minutos, sendo repetidos os passos 2, 3 e 4, 35 vezes. Após ciclos completos, os produtos da amplificação foram mantidos a 4°C em termociclador Eppendorff para posterior eletroforese em gel de agarose. A análise do tamanho do fragmento de restrição (RFLP) do fragmento ITS1 amplificado foi proposta para ser realizada apenas com amostras positivas para amplificação de DNA de Leishmania, após digestão pela enzima HaeIII. As amostras obtidas após a reação de PCR e digeridas com a enzima de restrição devem resultar em um produto de 300-350 pb, visualizados em gel de agarose a 1,5% (SCHÖNIAN et al, 2003). DNAs de cepas padrão de L. (L). amazonensis, L. (L.) infantum e
L. (V.) braziliensis mantidas no Laboratório de Estudos de Biologia da Infecção por Leishmania (LEBIL) foram utilizados como controles positivos. A amplificação de outro alvo,
SSU-rDNA, também foi realizada utilizando as sequências iniciadoras R221 (5’GGTTCCTTTCCTGATTTACG-3’) e R332 (5’-GGCCGGTAAAGGCCGAATAG-3’), com as seguintes condições da PCR: anelamento a 56°C por 60 segundos, extensão a 72°C por 2 minutos, repetindo os ciclos de desnaturação, anelamento e extensão 38 vezes. Os produtos obtidos após a reação de controle positivo possuem tamanho de 603 pb (SCHÖNIAN et al., 2003).
4.7. Eletroforese
A confecção de gel de agarose foi realizada pesando-se em erlenmeyer 2,25 g de agarose, adicionando 150 mL de TAE 1X (Tris-Acetato-EDTA), sendo o mesmo confeccionado no próprio laboratório conforme descrito (OGDEN & ADAMS, 1987). Após breve resfriamento do gel, foi adicionado o corante GelRed (1,5 µL/gel; BIOTIUM), dispensando-se a solução no molde e foi respeitado o tempo de polimerização (aproximadamente 30 minutos). Após confecção do gel de 40 poços, foram montadas soluções com volume final de 12 µL, sendo destes, 10 µL do produto da PCR (~10 ng) e 2 µL do tampão da amostra (loading buffer: 900 µL de azul de bromofenol 0,25%, 3 mL Glicerol/Glicerina e 3,6 mL água ultrapura). Suspensões de 12 µL foram aplicadas nos poços do gel de agarose a 1,5% em cuba com TAE 1X (Tris-acetato-EDTA) para separação a 100 Volts, 400 Amperes por 60 minutos. Os géis obtidos após procedimento descrito foram avaliados em câmera escura comercial com incidência de luz ultravioleta (UV) e fotografados com câmera para posterior análise das imagens obtidas.
5. Resultados
As coletas de materiais biológicos de canídeos domésticos inscritos em campanha de castração no município de Campinas – SP foram eficientes, mostrando-se pouco invasivas e seguras. O processamento das amostras de fragmento de pele, punção de medula óssea, fragmentos de baço e fígado (em casos de animais que vieram a óbito) apresentaram-se como um desafio, dada a elevada taxa de contaminação de meio de cultura, uma vez que, mesmo quando as amostras foram acondicionadas em meios suplementados com antibióticos (penicilina e estreptomicina), houve contaminação bacteriana persistente. Não foram, portanto, obtidas culturas de promastigotas diferenciadas de amostras de animais domésticos. Os dados dos animais estão compilados no ANEXO IV.
Foram realizadas primeiramente extrações de DNA total de amostras sanguíneas coletadas de animais domésticos. Após extração, foi realizada eletroforese para observação do padrão de banda do DNA total, conforme mostrado na Figura 8 (n = 37 amostras).
Figura 8. DNA genômico obtido após extração de amostras de sangue de cães domésticos. Eletroforese em gel de agarose a 0,8%, corado com GelRed para visualização
de extratos de DNA. As amostras identificadas como Balb são amostras de sangue de camundongos BALB/c sadios (Balb Sadio) e infectados com L. (L.) amazonensis sem e com lesão aparente lesão nas patas traseiras (Balb s/lesão e Balb c/lesão, respectivamente). Os códigos apresentados correspondem às amostras sanguíneas de canídeos coletadas em
campanha de castração. As setas pretas apontam para padrão de migração equivalente a 10.000 pares de base.
Dentre as amostras analisadas, não foi detectada banda de DNA total para os animais registrados como C123A, C90A, X174, X175, X152, X130 e X164. A seguir, alíquotas dessas amostras foram utilizadas como DNA-molde em reações de PCR para amplificação de ITS-1. Para isso, foi incluído o controle positivo de DNA genômico extraído de cultura de promastigotas de L. (L.) infantum chagasi. Na Figura 9 é apresentada a imagem de gel de agarose com as amostras oriundas da reação de amplificação com os produtos separados por eletroforese. Como é possível notar, para as amostras testadas de canídeos, não houve amplificação da região de interesse de ITS-1.
Figura 9. Eletroforese em gel de agarose para detecção de amplificação de ITS-1. Gel
de agarose a 1,5%, corado com GelRed para visualização de produtos de PCR deITS-1 de Leishmania, onde “C+”: ITS-1 amplificado de promastigotas de L. (L.) infantum chagasi mantidos em cultura (300 pb). Para as amostras codificadas obtidas de cães domésticos não foi detectada amplificação após PCR de ITS-1. “C-”: controle negativo da reação. “Ladder”: 100 pb.
Tornou-se necessário, então, avaliar a sensibilidade da reação utilizando diferentes diluições das amostras de DNA já extraídos de culturas de L. (L.) infantum chagasi (controle
positivo da reação; 1, 0,5 e 0,25%), porém, realizando as reações de amplificação tanto para SSU-rDNA quanto ITS-1 (Figura 10).
Figura 10. Eletroforese em gel de agarose para detecção de amplificação de SSUrDNA e ITS-1 a partir de DNA L. (L.) infantum chagasi de cultura. Foi realizado o gradiente de
diluição de DNA de culturas de L. (L.) infantum chagasi (L.i.) para 1,0,5 e 0,25% da amostra original para utilização em reações de PCR. É possível observar à esquerda (“SSU-rDNA”) que houve a amplificação nas amostras de DNA de L. (L.) infantum chagasiem todas as diluições testadas (aproximadamente 600 pb), bem como em ITS-1, à direita. Para “A7”, foi possível observar sucesso da reação apenas em ITS-1, já para as outras amostras, mesmo a reação de ITS-1 sendo subsequente à SSU-rDNA, não foi verificada amplificação. Amostras de DNA controle foram adicionados para efeito comparativo em amostras de DNA de extração negativas (C85P e A7’). A amostra 142PIt foi obtida de um cão suspeito clinicamente com a possibilidade de apresentar leishmaniose.
“C-”:controle negative;“Ladder”: 100 pb.
A aplicação da técnica de nested-PCR (ITS-1 após a reação de amplificação de SSUrDNA) foi realizada com amostras de cães, mas não foram amplificados os fragmentos esperados em nenhum dos casos (dados não mostrados).
Além de extração de sangue, foram obtidas amostras fezes dos cães domésticos no período pós-operatório. Os resultados dos exames coproparasitológicos realizados nas amostras obtidas são apresentados na Tabela I. 26,6% das amostras foram positivas para a presença de ovos de ancilostamatídeos e 6,6% para Toxocara sp. (n = 30; sendo uma delas positiva para ambos) (Figura 11). As amostras de sangue dos animais positivos no coproparasitológico foram submetidas à extração e posterior PCR para comparação de
resultados, porém, os resultados obtidos na PCR foram negativos, impedindo que fosse estabelecida qualquer correlação entre infecção por Leishmania e a presença de nematoides intestinais. Quanto à presença de ectoparasitos, foram colhidas 87 amostras de carrapatos dos cães. Todas elas foram identificadas como Rhipicephalus sanguineus.
Tabela I. Detecção de parasitos por microscopia óptica, provenientes de amostras de fezes de cães domésticos processadas a partir da técnica de flutuação (Willis-Mollay) ou método de sedimentação (Hoffman-Pons-Janer) (n=30).
Amostras positivas*(%) Amostras negativas (%)
Ancilostomatídeo 8 (26,6) 22 (73,3) Toxocara spp.
2 (6,6) 28 (93,3)
* Dentre os resultados positivos, deve ser considerada uma amostra positiva para coinfecção.
Figura 11. Fotomicrografias de ovos de ancilistomatídeo (A; barra = 20 µm) e
Toxocara spp. (B; barra = 25 µm). As estruturas foram identificadas após processamento de amostras de fezes provenientes de cães domésticos do município de Campinas, utlizando-se a técnica de flutuação (Willis-Mollay).
Em outro momento do trabalho, foram realizadas extensivas tentativas de captura de canídeos selvagens na região de Campinas. Uma das ferramentas utilizadas foram as câmeras trap, que se mostraram úteis de diversas formas, uma vez que se comprovou a presença dos animais nas áreas de interesse e através delas, pôde-se entender quais eram as iscas que se mostravam mais interessantes para os canídeos alvo do estudo (Figura
12). Pôde-se observar em testes sem as armadilhas, o maior interesse por proteína animal
fresca (músculo bovino), sendo seguido esse interesse por: abacate, goiaba e manga. Uso de ovos de codorna não mostrou resultado conclusivo, pois houve variação de interesse dos animais, sendo consumidos em certas ocasiões e não sendo em outras. Em um novo
momento do estudo, as iscas foram colocadas dentro das armadilhas, porém, o gatilho não foi instalado para que houvesse uma familiarização inicial dos animais com o objeto “estranho” a eles. O número de animais que adentrou nas armadilhas reduziu drasticamente, demonstrando assim relutância dos animais na busca de alimentos em local de dimensões restritas. A presença de outros animais, como o gambá (Didelphis marsupialis) foi uma ocorrência constante nos estudos, quando não registrados em câmeras, por consumirem iscas ou até mesmo ativarem as armadilhas.
Figura 12. Captura realizada com câmera trap na APA de Sousas, um dos locais escolhidos para captura. No momento da foto, os animais estavam sendo condicionados
a encontrar alimento no ponto de interesse e era buscado pelo pesquisador o entendimento do interesse dos alvos em determinadas iscas. Dois espécimes de Cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) foram fotografados se alimentando de frutas goiaba e abacate) no período noturno. Fonte: Giselda Person.
Após todos procedimentos supracitados realizados, partiu-se para a captura nas áreas de interesse e os resultados não foram satisfatórios, ou seja, nenhum canídeo silvestre foi capturado.
6. Discussão
Todos os métodos aplicados para a coleta de materiais biológicos em cães domésticos, mesmo sendo em grande variedade de tecidos, mostraram-se eficientes. A condição pós-operatória dos animais em questão facilitou bastante as coletas e tornaram o procedimento fácil para o pesquisador. O foco do trabalho se mostra bem sucedido no que tange a população canina atingida, pois, a partir dos animais de campanha de castração em uma cidade com grande número de animais como Campinas, foi possível obter um número significativo de amostras biológicas.
O objetivo desse estudo foi realizar o diagnóstico de leishmaniose canina em nível específico através do uso de uma técnica molecular já conhecida e estabelecer as espécies circulantes na região de Campinas – SP, bem como esclarecer o papel dos canídeos selvagens na cadeia epidemiológica da LVC. Tanto a sensibilidade quanto a especificidade da PCR são amplamente conhecidas e foram comprovadas no presente estudo a partir dos controles positivos e suas diluições. Ao buscar os motivos das amostras obtidas não se apresentarem como positivos, mesmo em se tratando de uma região com casos conhecidos, devemos considerar que provavelmente nas condições estabelecidas não se alcançou sensibilidade adequada para detecção de DNA do parasita, que sabidamente pode ser bastante reduzida dada a baixa carga parasitária circulante.
O diagnóstico da leishmaniose é usualmente fornecido sem a identificação da espécie de Leishmania envolvida no caso. Porém, essa identificação é importante para a realização de avaliações coepidemiológicas e para o monitoramento da entrada/presença de novas espécies em determinadas áreas. Pensando nisso, Pinto e colaboradores (2005) identificaram em Rincão, no interior de São Paulo, sete casos de leishmaniose e sabendo da necessidade de identificação da espécie, identificaram o agente etiológico como sendo Leishmania (V.) braziliensis (PINTO et al., 2005).Em um estudo realizado por Tolezano e colaboradores (2007), foram reportados, pela primeira vez, dois casos em cães domésticos de Leishmania (L.) amazonensis, no município de Araçatuba/SP, apresentando condições clínicas similares a leishmaniose visceral causada por Leishmania (L.) infantum chagasi, que também está presente na área (TOLEZANO et al., 2007). Já em 2008, no município de Ribeirão Preto/SP, foi confirmado o envolvimento da Leishmania (L.) amazonensis em casos humanos de leishmaniose tegumentar (MEDEIROS et al., 2008).
Ferreira et al. (2015) realizaram a caracterização do genótipo de Leishmania (V.) braziliensis através de biópsias humanas e caninas de indivíduos com leishmaniose cutânea americana, sendo a maioria das amostras do município de Sorocaba (n=30) e as demais foram provenientes de outros municípios da região de Sorocaba (n=14) (FERREIRA et al., 2015).
Com a constatação de casos em diferentes regiões supracitadas do estado de São Paulo, foi priorizada a necessidade da identificação na região de estudo, uma vez que a literatura comprova que existe uma diversidade de espécies do parasito circulando no estado, provocando diferentes quadros clínicos. Em se sabendo da importância dos cães domésticos ou selvagens no ciclo da doença, o levantamento das espécies envolvidas nos casos humanos devem ser diretamente relacionados aos casos de canídeos, sendo eles reservatórios ou animais que apresentam sintomatologia da patologia.
Ao confrontarmos os resultados obtidos pelo estudo e analisando a literatura, levantamos hipóteses para os resultados negativos obtidos pelo presente estudo: primeira hipótese a ser considerada deve ser a estatística: como não dispomos de um levantamento da prevalência da doença em canídeos na região estudada, fazendo o uso de técnicas moleculares, esbarra-se na dificuldade de mensurar o número de amostras/indivíduos a serem estudados. Outra hipótese a ser levada em conta é a dificuldade de obtenção de amostras mais adequadas para esse diagnóstico, considerando assim, sangue como uma amostra menos adequada quando comparada a outros tecidos de maior dificuldade de obtenção por conta da invasividade, como por exemplo: fragmento de baço, punção de linfonodo e punção de medula óssea, tecidos esses, que podem apresentar maiores números de parasitos.
A escolha da PCR para diagnóstico, conhecidamente representa um método de alta sensibilidade e especificidade, porém, em 2017, Albuquerque e cols. compararam a sensibilidade frente à utilização de diferentes marcadores moleculares (ITS1-PCR, MCPCR e Uni21/Lmj4-PCR) além de SSU-rDNA (positividade de 37,6%), essa última se mostrando a mais adequada por ser mais sensível que as outras, contrastando com ITS-1PCR (positividade de 25,3%), que se mostrou a menos sensível entre todas as estudadas, sendo todas as 229 amostras submetidas às análises (ALBUQUERQUE et al., 2017).
Apesar de a literatura não detalhar muito a respeito, é conhecida a relação de outras enfermidades cutâneas interagindo com leishmaniose em coinfecção, principalmente àquelas relacionadas fortemente relacionadas à imunidade, como por exemplo
