Todos os métodos aplicados para a coleta de materiais biológicos em cães domésticos, mesmo sendo em grande variedade de tecidos, mostraram-se eficientes. A condição pós-operatória dos animais em questão facilitou bastante as coletas e tornaram o procedimento fácil para o pesquisador. O foco do trabalho se mostra bem sucedido no que tange a população canina atingida, pois, a partir dos animais de campanha de castração em uma cidade com grande número de animais como Campinas, foi possível obter um número significativo de amostras biológicas.
O objetivo desse estudo foi realizar o diagnóstico de leishmaniose canina em nível específico através do uso de uma técnica molecular já conhecida e estabelecer as espécies circulantes na região de Campinas – SP, bem como esclarecer o papel dos canídeos selvagens na cadeia epidemiológica da LVC. Tanto a sensibilidade quanto a especificidade da PCR são amplamente conhecidas e foram comprovadas no presente estudo a partir dos controles positivos e suas diluições. Ao buscar os motivos das amostras obtidas não se apresentarem como positivos, mesmo em se tratando de uma região com casos conhecidos, devemos considerar que provavelmente nas condições estabelecidas não se alcançou sensibilidade adequada para detecção de DNA do parasita, que sabidamente pode ser bastante reduzida dada a baixa carga parasitária circulante.
O diagnóstico da leishmaniose é usualmente fornecido sem a identificação da espécie de Leishmania envolvida no caso. Porém, essa identificação é importante para a realização de avaliações coepidemiológicas e para o monitoramento da entrada/presença de novas espécies em determinadas áreas. Pensando nisso, Pinto e colaboradores (2005) identificaram em Rincão, no interior de São Paulo, sete casos de leishmaniose e sabendo da necessidade de identificação da espécie, identificaram o agente etiológico como sendo Leishmania (V.) braziliensis (PINTO et al., 2005).Em um estudo realizado por Tolezano e colaboradores (2007), foram reportados, pela primeira vez, dois casos em cães domésticos de Leishmania (L.) amazonensis, no município de Araçatuba/SP, apresentando condições clínicas similares a leishmaniose visceral causada por Leishmania (L.) infantum chagasi, que também está presente na área (TOLEZANO et al., 2007). Já em 2008, no município de Ribeirão Preto/SP, foi confirmado o envolvimento da Leishmania (L.) amazonensis em casos humanos de leishmaniose tegumentar (MEDEIROS et al., 2008).
Ferreira et al. (2015) realizaram a caracterização do genótipo de Leishmania (V.) braziliensis através de biópsias humanas e caninas de indivíduos com leishmaniose cutânea americana, sendo a maioria das amostras do município de Sorocaba (n=30) e as demais foram provenientes de outros municípios da região de Sorocaba (n=14) (FERREIRA et al., 2015).
Com a constatação de casos em diferentes regiões supracitadas do estado de São Paulo, foi priorizada a necessidade da identificação na região de estudo, uma vez que a literatura comprova que existe uma diversidade de espécies do parasito circulando no estado, provocando diferentes quadros clínicos. Em se sabendo da importância dos cães domésticos ou selvagens no ciclo da doença, o levantamento das espécies envolvidas nos casos humanos devem ser diretamente relacionados aos casos de canídeos, sendo eles reservatórios ou animais que apresentam sintomatologia da patologia.
Ao confrontarmos os resultados obtidos pelo estudo e analisando a literatura, levantamos hipóteses para os resultados negativos obtidos pelo presente estudo: primeira hipótese a ser considerada deve ser a estatística: como não dispomos de um levantamento da prevalência da doença em canídeos na região estudada, fazendo o uso de técnicas moleculares, esbarra-se na dificuldade de mensurar o número de amostras/indivíduos a serem estudados. Outra hipótese a ser levada em conta é a dificuldade de obtenção de amostras mais adequadas para esse diagnóstico, considerando assim, sangue como uma amostra menos adequada quando comparada a outros tecidos de maior dificuldade de obtenção por conta da invasividade, como por exemplo: fragmento de baço, punção de linfonodo e punção de medula óssea, tecidos esses, que podem apresentar maiores números de parasitos.
A escolha da PCR para diagnóstico, conhecidamente representa um método de alta sensibilidade e especificidade, porém, em 2017, Albuquerque e cols. compararam a sensibilidade frente à utilização de diferentes marcadores moleculares (ITS1-PCR, MCPCR e Uni21/Lmj4-PCR) além de SSU-rDNA (positividade de 37,6%), essa última se mostrando a mais adequada por ser mais sensível que as outras, contrastando com ITS-1PCR (positividade de 25,3%), que se mostrou a menos sensível entre todas as estudadas, sendo todas as 229 amostras submetidas às análises (ALBUQUERQUE et al., 2017).
Apesar de a literatura não detalhar muito a respeito, é conhecida a relação de outras enfermidades cutâneas interagindo com leishmaniose em coinfecção, principalmente àquelas relacionadas fortemente relacionadas à imunidade, como por exemplo
demodicose. Em 2016, Morgado e cols. descreveram a ocorrência em 4 cães eutanasiados com LVC coinfecção com Hepatozoon canis, inicialmente detectados por métodos sorológicos e posteriormente por técnicas moleculares (ITS-1 PCR-RFLP). Esse trabalho aumenta ainda mais o interesse de pesquisas envolvendo ectoparasitas, como os carrapatos (Rhipicephalus sanguineus e Amblyoma spp.), uma vez que estão relacionados ao Hepatozoon canis. Em 2013, no Mediterrâneo, um estudo realizado por Tabar e outros mostraram correlação entre infecções por Dirofilaria immitis, Wolbachia e Leishmania spp., porém, a presença da bactéria era mais frequente em animais que não apresentavam resultados positivo para LVC, gerando assim grande interesse para futuros estudos na área (MORGADO et al., 2016; TABAR et al., 2013).
Em relação à captura de canídeos selvagens, a mesma apresentou-se bastante desafiadora. A primeira dificuldade encontrada por nossa pesquisa já se apresentou no início do projeto por encontrarmos dificuldades nos prazos e preenchimentos das requisições das licenças necessárias, levando a um atraso de ao menos 8 meses para início das capturas. Em seguida, o processo de obtenção de armadilhas que fossem eficientes foi uma barreira ainda mais complexa de ser suplantada. O alto custo do material e a indisponibilidade das mesmas em outras instituições foram determinantes para mais um atraso nas ações da pesquisa. As tentativas iniciais foram realizadas com uma única armadilha, diminuindo assim a eficiência das coletas. Em um novo momento, com a colaboração da Unidade de Vigilância de Zoonoses de Campinas, foi possível a obtenção por empréstimo de 8 armadilhas conforme necessitávamos e a partir desse momento, foi possível realizar as tentativas de captura nos locais de interesse de maneira mais eficiente. As regiões de Sousas e Joaquim Egídio, após 4 dias de tentativas, mostrou-se com um grau de periculosidade razoável para a realização das capturas, por não se tratar de uma área fechada, com acesso de população e trânsito de pessoas alheias à pesquisa dentro da mata e risco de furto das armadilhas. Assim, foi proposta a transferência do local de coleta para a Mata Santa Genebra, região de menor interesse, porém ainda com ocorrência dos canídeos relacionados à essa pesquisa.
Os horários escolhidos para a captura não puderam ser respeitados em primeiro momento devido às dificuldades logísticas da instituição Mata Santa Genebra. Em primeiro momento, as tentativas de coletas foram realizadas durante o dia, respeitando o horário de funcionamento da instituição (8 - 18h), porém, não houve sucesso. Em segundo momento, foram realizadas capturas em horário noturno, respeitando-se os intervalos de verificação
das armadilhas, e mesmo sendo registrados canídeos silvestres pelas câmeras trap da própria Mata Santa Genebra, não houve captura dos animais de interesse desse estudo. Devem ser levantadas hipóteses para o insucesso nas capturas dos canídeos silvestres: a sazonalidade deve ser levada em conta, pois a farta disponibilidade de alimento na mata durante a época de captura pode diminuir o interesse dos animais pelas iscas; o tempo de verificação das armadilhas pode interferir negativamente, tendo em vista a possibilidade de odores e barulhos espantarem as espécies em questão; o acesso de outros animais às armadilhas pode provocar o acionamento da mesma, ficando esta sem poder realizar a captura do animal correto até próxima verificação. Destaca-se nesse último tópico a captura de quatro gambás nas armadilhas em dias que foram visualizadas pegadas dos animais de interesse nas proximidades dos pontos de coleta.
Considerando os aspectos que tangem os exames coproparasitológicos e seus resultados, devemos considerar que apesar de encontrarmos no estudo uma prevalência menor do que a literatura levanta, como por exemplo Chieffi e Ferreira em 2008, que através de um estudo de longo prazo com acilostomose, detectou uma diminuição dos casos no decorrer do ano, podendo atribuir a diversos fatores a diminuição desses casos em humanos. Devemos considerar que com o aumento do acesso à calçados, melhoras das condições de higiene, e até mesmo aumento das temperaturas dos solos em grandes cidades, provocam a diminuição das transmissões para humanos e consequentemente, uma diminuição de casos caninos também. Devemos porém ressaltar, que os animais submetidos ao estudo, foram declarados por seus tutores como animais que passaram pelo processo de controle parasitário, fato que justificaria a baixa incidência encontrada no grupo estudado.