UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
JULIANA CROTTI FRANCO
Clonagem, expressão, purificação e caracterização da proteína Hsp110 de sorgo visando a compreensão do sistema de desagregação de proteínas em
plantas
CAMPINAS 2018
JULIANA CROTTI FRANCO
Clonagem, expressão, purificação e caracterização da proteína Hsp110 de sorgo visando a compreensão do sistema de desagregação de proteínas em
plantas
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Química na área de Química Orgânica
Orientador: Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA JULIANA CROTTI FRANCO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. CARLOS HENRIQUE INÁCIO RAMOS.
CAMPINAS 2018
Ficha catalográfica
Agradecimentos
Gostaria de agradecer ao meu orientador Prof. Dr. Carlos Henrique Inácio Ramos por ter me aceito como aluna e pela dedicada orientação durante os dois anos de mestrado. Obrigada pelo conhecimento transmitido e por fornecer o necessário no laboratório de pesquisa para a realização deste projeto.
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo nº 2016/02137-1, pela bolsa concedida. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade do(s) autor(es) e não necessariamente refletem a visão da FAPESP. Agradeço também pelo apoio financeiro da CAPES e do CNPq.
Aos membros que estiveram presentes em minhas bancas de qualificação e de defesa, que contribuíram positivamente com correções e sugestões para enriquecer este trabalho.
Ao Instituto de Química, ao Instituto de Biologia e à UNICAMP por toda a infraestrutura fornecida, além da secretaria de pós-graduação e funcionários do IQ. Aos colegas de laboratório que me auxiliaram na adaptação ao mesmo e que contribuíram muito durante todo o desenvolvimento deste projeto.
A toda minha família pela paciência durante este período e principalmente pelo carinho e pelo apoio dados para que eu pudesse realizar mais esta etapa da minha vida.
Resumo
A chaperona Hsp100, que está presente desde bactérias até plantas, mas não em metazoários, tem a importante função de desagregase, auxiliando proteínas a serem recuperadas e reenoveladas. Estudos recentes sugeriram que, em células animais, a co-chaperona Hsp110 coopera com a Hsp70 em um eficiente sistema de desagregação. Como plantas expressam tanto a Hsp100 quanto a Hsp110, nos perguntamos se a Hsp110 poderia ser parte de um sistema de desagregação adicional neste organismo (no caso sorgo), uma vez que plantas enfrentam condições estressantes mais severas do que os animais. Tendo identificado o gene para esta proteína em sorgo utilizou-se o sistema pET de expressão em células de E. coli e purificação usando cromatografia de afinidade em níquel seguida de cromatografia de exclusão molecular. Uma combinação de técnicas espectroscópicas e hidrodinâmicas foi utilizada para a caracterização da conformação da proteína, enquanto que experimentos envolvendo proteção contra agregação e ensaios de reenovelamento e desagregação de substratos modelo foram utilizados para a caracterização funcional. O gene foi clonado e a proteína foi expressa solúvel, sendo que após purificação verificou-se que a mesma foi produzida enovelada (cerca de 40 % da sua cadeia polipeptídica encontra-se na forma de hélice ) e estável, mantendo estrutura secundária até 48 °C e aproximadamente 2 mol L-1 de ureia. Medidas hidrodinâmicas indicaram que a proteína é um monômero alongado com massa molecular de 98 kDa (sendo o valor esperado pela sequência de 95,23 kDa). A Hsp110 mostrou também ser funcional ao apresentar atividade chaperona e ser capaz de, em conjunto com outras proteínas do sistema Hsp70, reenovelar e desagregar o substrato modelo testado. Estes resultados apoiam a hipótese de que plantas possuem mais de um sistema capaz de atuar na desagregação de proteínas aumentando seu poder de tolerar os diversos tipos de estresse a que estão expostas.
Abstract
The Hsp100 chaperone, which is present from bacteria to plants, but is not found in metazoa, has the important function of disaggregase, aiding proteins to be recovered and refolded. Recent studies have suggested that in animal cells, the co-chaperone Hsp110 cooperates with Hsp70 in an efficient disaggregation system. As plants express both Hsp100 and Hsp110, we wondered whether Hsp110 could be part of an additional disaggregation system in this organism (sorghum in this case), since plants face more severe stressing conditions than animals. The hsp110 gene was identified in sorghum and the expression pET system was transformed in E. coli cells and the protein purified using nickel affinity chromatography followed by molecular exclusion chromatography. A combination of spectroscopic and hydrodynamic techniques was used to characterize protein conformation, while experiments involving protection against aggregation and assays of refolding and disaggregation of model substrates were used for the functional characterization. The protein was expressed soluble, and after purification it was found that it was produced folded (about 40 % of its polypeptide chain is in helix form) and stable, maintaining secondary structure up to 48 °C or in approximately 2 mole L-1 of urea. Hydrodynamic measurements indicated that the protein is an elongated monomer with a molecular mass of 98 kDa (expected value from sequence is 95.23 kDa). Hsp110 was also functional since it showed chaperone activity and was able, together with other proteins of the Hsp70 system, to refold and disaggregate a tested model substrate. These results support the hypothesis that plants have more than one system capable of acting in the disaggregation of proteins increasing their power to tolerate the different types of stress to which they are exposed.
Lista de Figuras
Figura 1. Representação da ligação peptídica. 16
Figura 2. Estruturas proteicas. 17
Figura 3. Homeostase proteica. 19
Figura 4. Ciclo da chaperona Hsp70. 22
Figura 5. Modelo de desagregação pelo complexo Hsp70/Hsp40/Hsp100. 23 Figura 6. Modelo de desagregação proposto para as proteínas Hsp70, Hsp40 e
Hsp110. 25
Figura 7. Modelo de desagregação das fibrilas de -sinucleína. 26
Figura 8. Mapa do vetor de expressão pET-28a(+). 30
Figura 9. Sistema de indução com IPTG e expressão da proteína. 31 Figura 10. Esquema do experimento realizado para avaliar a capacidade da proteína produzida em reenovelar e reativar a proteína-cliente luciferase. 46 Figura 11. Esquema do experimento realizado para avaliar a capacidade da proteína produzida em desagregar e reativar a proteína-cliente luciferase. 47 Figura 12. Sequência dos resíduos de aminoácidos da proteína Hsp110 de sorgo a
partir do sequenciamento de DNA. 49
Figura 13. Árvore filogenética com proteínas Hsp110s homólogas. 51 Figura 14. Teste de expressão da proteína Hsp110 de sorgo em BL21(DE3). 52 Figura 15. Cromatograma da cromatografia de afinidade em coluna de níquel referente ao precipitado de 0,5 litros de indução. 53 Figura 16. Gel de poliacrilamida com amostras da Hsp110 de sorgo após
cromatografia de afinidade em coluna de níquel. 54
Figura 17. Cromatograma da cromatografia de exclusão molecular referente ao precipitado de 1 litro de indução após cromatografia de afinidade em coluna de
níquel. 55
Figura 18. Gel de poliacrilamida com amostras da Hsp110 de sorgo após
cromatografia de exclusão molecular. 56
Figura 19. Espectro de dicroísmo circular da Hsp110 de sorgo. 57 Figura 20. Predição de estrutura secundária para a proteína Hsp110 de sorgo. 58 Figura 21. Desenovelamento induzido por aquecimento da proteína Hsp110 de
Figura 22. Desenovelamento induzido por aquecimento da proteína Hsp110 de
sorgo. 61
Figura 23. Resultados de desenovelamento induzidos por aquecimento da proteína
Hsp110 de sorgo. 62
Figura 24. Desenovelamento induzido pela ureia da proteína Hsp110 de sorgo. 63 Figura 25. Emissão de fluorescência intrínseca excitando em 280 nm. 65 Figura 26. Emissão de fluorescência intrínseca excitando em 295 nm. 66 Figura 27. Resultado de desenovelamento induzido por ureia da proteína Hsp110 de sorgo e variações do centro de massa do espectro com a concentração de ureia. 68 Figura 28. Gráfico obtido após experimento de DLS. 69
Figura 29. Gel filtração analítica. 70
Figura 30. Curva de calibração obtida pela gel filtração analítica. 71 Figura 31. Caracterização da massa molecular e do estado oligomérico da proteína
Hsp110 de sorgo. 72
Figura 32. Teste de atividade chaperona da Hsp110 contra o substrato modelo citrato sintase (2,5 mol L-1) a 42 ºC por 50 min. 74 Figura 33. Teste de atividade chaperona da Hsp110 contra o substrato modelo malato desidrogenase (2,5 mol L-1) a 42 ºC por 50 min. 76 Figura 34. Teste de atividade chaperona da Hsp110 contra o substrato modelo
luciferase. 77
Figura 35. Testes na presença de ATP na proporção 1:1. 78 Figura 36. Testes na presença de ATP na proporção 1:1. 79 Figura 37. Teste de atividade chaperona da Hsp110 contra o substrato modelo insulina (45 mol L-1) a 20 ºC por 50 minutos com DTT 25 mmol L-1. 80 Figura 38. Teste de atividade chaperona da Hsp110 contra o substrato modelo lisozima (25 mol L-1) a 25 ºC por 50 minutos com DTT 25 mmol L-1. 81 Figura 39. Teste de recuperação da atividade enzimática da proteína-cliente
luciferase. 83
Figura 40. Experimento de desagregação. 85
Lista de Tabelas
Tabela 1. Padrões utilizados para calibração 42
Tabela 2. Parâmetros físico-químicos da proteína Hsp110 de sorgo preditos pela análise de sua sequência primária pelo programa ProtParam 48 Tabela 3. Homólogos da Hsp110 de sorgo e identidade com relação à proteína de
estudo 50
Tabela 4. Parâmetros hidrodinâmicos medidos e preditos para uma esfera de mesma massa molecular e não hidratada da proteína Hsp110 de sorgo 72
Lista de abreviações e siglas
ADP: adenosina difosfato (Adenosine Di-Phosphate) ATP: adenosina trifosfato (Adenosine Tri-Phosphate) Au: Arbitrary unit
BD: Blue Dextran
BSA: albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumin) CD: dicroísmo circular (Circular Dichroism)
cDNA: DNA complementar
Cm: concentração de ureia no ponto médio da transição Cp: capacidade calorífica
CS: citrato sintase (Citrate Synthase) D: coeficiente de difusão
DLS: espalhamento dinâmico de luz (Dynamic Light Scattering) DNA: ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic Acid)
DSC: calorimetria diferencial de varredura (Differential Scanning Calorimetry) DTT: ditiotreitol
E. coli: Escherichia coli
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético (Ethylenediamine Tetraacetic Acid) GFA: gel filtração analítica
H: entalpia
Hsc: proteína de choque térmico expressa constitutivamente (Heat shock cognate) Hsp: proteína de choque térmico (Heat shock protein)
IPTG: isopropil -D-1-tiogalactopiranosídeo (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) LB: meio de cultura Luria-Bertani
MDH: malato desidrogenase (Malate Dehydrogenase) MM: massa molecular
mRNA: RNA mensageiro m/v: massa/volume
NBD: domínio de ligação ao nucleotídeo (Nucleotide Binding Domain)
NCBI: Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (National Center for Biotechnology Information)
PCR: reação em cadeia da polimerase (Polimerase Chain Reaction) pET: plasmídeos para expressão com T7 RNA polimerase
pH: potencial hidrogeniônico pI: ponto isoelétrico
PMSF: fluoreto de fenilmetilsulfonila (Phenyl Methylsulfonyl Fluoride) PQC: controle de qualidade proteico (Protein Quality Control)
RNA: ácido ribonucleico (Ribonucleic Acid) rpm: rotações por minuto
Rs: raio de Stokes ou raio hidrodinâmico
SBD: domínio de ligação ao substrato (Substrate Binding Domain) SDS: dodecil sulfato de sódio (Sodium Dodecyl Sulfate)
SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis)
SEC-MALS: cromatografia de exclusão molecular acoplada a um detector de espalhamento de luz multi-ângulo (Size Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering)
smHsp: proteína de choque térmico da família das small Tm: temperatura no ponto médio da transição
TEMED: tetrametiletilenodiamina (Tetramethylethylenediamine) u.a.: unidade arbitrária
Sumário 1. Introdução 15 1.1. Proteínas 15 1.2. Homeostase proteica 18 1.3. Chaperonas moleculares 19 1.4. O sistema Hsp70 20 1.5. O complexo desagregase Hsp70/Hsp40/Hsp110 23 1.6. Justificativa 26 2. Objetivos 28 2.1. Objetivos gerais 28 2.2. Objetivos específicos 28 3. Materiais e Métodos 29 3.1. Estratégia de clonagem 29
3.2. Linhagens celulares utilizadas 32
3.3. Meios de cultura utilizados 32
3.4. Transformação e expressão da proteína Hsp110 de sorgo 32
3.5. Eletroforese em gel de poliacrilamida 33
3.6. Lise bacteriana e purificação da proteína recombinante 34
3.6.1. Cromatografia de afinidade 34
3.6.2. Cromatografia de exclusão molecular 35
3.7. Determinação do grau de pureza da proteína recombinante 36
3.8. Determinação da concentração proteica 36
3.9. Caracterização conformacional 37
3.9.1. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD) 37 3.9.2. Calorimetria diferencial de varredura (DSC) 38
3.9.3. Emissão de fluorescência intrínseca 39
3.9.4. Espalhamento dinâmico de luz (DLS) 40
3.9.5. Gel filtração analítica (GFA) 42
3.9.6. Cromatografia de exclusão molecular acoplada a um detector de
espalhamento de luz multi-ângulo (SEC-MALS) 43
3.10. Caracterização funcional 44
3.10.1. Atividade chaperona 44
3.10.1.2. Agregação induzida por agente redutor 45 3.10.2. Reenovelamento e reativação da proteína-cliente luciferase 45 3.10.3. Desagregação e reativação da proteína-cliente luciferase 46
4. Resultados 48
4.1. Clonagem e análise inicial da sequência primária 48
4.2. Expressão 51
4.3. Purificação 52
4.4. Estrutura secundária 56
4.5. Desenovelamento induzido por aquecimento e monitorado pelo CD 58
4.6. DSC 60
4.7. Desenovelamento induzido por ureia 62
4.8. Emissão de fluorescência intrínseca 63
4.9. Comparação entre os desenovelamentos induzidos por ureia 67
4.10. DLS 68
4.11. GFA 69
4.12. SEC-MALS 71
4.13. Parâmetros preditos 72
4.14. Caracterização da atividade chaperona 73
4.14.1. Prevenção da agregação induzida por aquecimento 73 4.14.2. Prevenção da agregação induzida por agente redutor 79 4.15. Reenovelamento e reativação da proteína-cliente luciferase 82 4.16. Desagregação e reativação da proteína-cliente luciferase 84
5. Discussão 86
5.1. Hsp110 86
5.2. Expressão do gene hsp110 de sorgo e purificação da proteína 87 5.3. A Hsp110 de sorgo foi produzida enovelada e possui alta estabilidade 88 5.4. A Hsp110 de sorgo se comporta como um monômero alongado 90 5.5. A Hsp110 de sorgo é essencial para o funcionamento de sistemas envolvidos
com reenovelamento e desagregação de proteínas 91
6. Conclusão 94
7. Referências 95
8. Anexos 102
1. Introdução
1.1. Proteínas
Proteínas são macromoléculas encontradas em todas as células dos seres vivos. São de extrema importância devido a grande diversidade de funções biológicas por elas realizadas (Lehninger et al., 2004). As proteínas são formadas por unidades repetitivas chamadas de aminoácidos, e de acordo com as diferentes combinações possíveis entre esses aminoácidos, através de ligações peptídicas, podem ser produzidas proteínas com propriedades e atividades bem diferentes, como as enzimas (que participam de reações desenvolvidas no organismo, necessárias ao metabolismo), hormônios, anticorpos, e outras com funções reguladoras, sinalizadoras e estruturais (Nelson e Cox, 2002). A ligação peptídica ocorre entre o grupo amino de um aminoácido e o grupo carboxila de outro, e devido à possibilidade de ressonância ela tem caráter de dupla ligação, sendo planar, o que impede sua rotação e restringe o número de conformações da proteína. Já as ligações entre o grupo amino e o carbono (N-C) e entre o grupo carbonila e o carbono (C-C) são simples e podem rotacionar, o que permite que a proteína assuma diferentes conformações (Figura 1) (Stryer, 2004). A sequência dos resíduos de aminoácidos que constituem uma proteína é conhecida como sua sequência primária. Interações locais da cadeia principal, através de ligações de hidrogênio, dão origem às estruturas secundárias do tipo hélices α, folhas β, voltas e alças. A terciária é o enovelamento da estrutura secundária em uma unidade compacta, priorizando interações não locais envolvendo a cadeia polipeptídica completa, isto é, que envolvem também as cadeias laterais dos resíduos. A estrutura quaternária ocorre em algumas proteínas e trata da interação entre unidades, de mesma sequência ou não, para formar superestruturas (Figura 2) (Stryer, 2004; Atkins e Jones, 2007).
Figura 1. Representação da ligação peptídica. Destacada pelo contorno em verde encontra-se a ligação C-N planar. As setas em preto simbolizam a rotação das ligações N-C e C-C. Modificado de Petsko e Ringe (2004).
Figura 2. Estruturas proteicas. Modificado de Petsko e Ringe (2004).
Tem-se que a função da proteína está diretamente relacionada com a sua estrutura, isto é, para alcançar a sua forma funcional a proteína precisa se enovelar em uma estrutura tridimensional única que é estável o suficiente para manter a solubilidade da mesma, chamada de estado nativo. O estado nativo é aquele em que o sistema possui a menor energia livre de Gibbs (Anfinsen, 1973). No entanto, no meio celular as proteínas podem encontrar algumas dificuldades para se enovelarem corretamente ou para se manterem enoveladas, pois, este meio é altamente concentrado. Algumas condições podem se tornar mais drásticas devido ao estresse celular ou mesmo mutações. Uma proteína enovelada incorretamente
significa a perda de sua função e o acúmulo dessas proteínas mal enoveladas pode ocasionar a formação de indesejados agregados proteicos, como os amiloides e os príons, que são a base de muitas doenças degenerativas conhecidas até hoje (Ramos e Ferreira, 2005; Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011).
1.2. Homeostase proteica
Para evitar a formação de agregados proteicos sob condições celulares normais, existe um sistema de controle de qualidade proteico (PQC, em inglês, Protein Quality Control) que atua obtendo o correto enovelamento de proteínas e a recuperação ou eliminação por degradação de proteínas mal enoveladas, o que ajuda a manter a homeostase proteica (Figura 3; Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011). Este sistema é constituído de um complexo formado por chaperonas moleculares (sendo elas definidas como holders, enovelases e desagregases, segundo Figura 3) e o proteossoma. As chaperonas são proteínas que auxiliam no correto enovelamento de outras proteínas não enoveladas, reconhecendo superfícies hidrofóbicas expostas que deveriam estar protegidas no estado nativo, mas sem alterar a estrutura final da proteína-cliente (Borges e Ramos, 2005). Proteínas não reparadas pelas chaperonas são eliminadas por degradação no proteossoma, como resultado da atividade das proteases. Quando alguma proteína escapa desse controle de qualidade, não sendo reparada ou degradada, provavelmente contribuirá para a formação de agregados proteicos (Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011).
Figura 3. Homeostase proteica. Equilíbrio obtido entre o correto enovelamento de proteínas não enoveladas ou parcialmente enoveladas e a degradação no proteossoma de proteínas mal enoveladas. Figura modificada (Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011; Nogueira et al., 2018).
1.3. Chaperonas moleculares
As chaperonas moleculares são muitas vezes associadas às proteínas de choque térmico (Hsp, em inglês, Heat shock protein) devido ao fato de sua síntese ser muitas vezes intensificada em células sujeitas a estresse térmico. Contudo, muitas destas proteínas têm sua síntese induzida por uma variedade de outros estresses, como presença de etanol e certos íons metálicos pesados, além de muitas apresentarem expressão constitutiva, o que reforça a importância da sua função (Lindquist e Craig, 1988). Elas são conservadas em todos os organismos e são auxiliadas por co-chaperonas, as quais, por sua vez, aumentam de número e diversidade de acordo com a complexidade do organismo (Tiroli-Cepeda e Ramos,
2011). Esta informação demonstra que o estudo das co-chaperonas auxiliam também na compreensão dos diferentes mecanismos que ocorrem nas células de eucariotos e procariotos.
As chaperonas e algumas co-chaperonas podem ser classificadas de acordo com sua interação com o substrato, existindo três tipos gerais (destacados na Figura 3): as holders, que reconhecem e se ligam às proteínas-cliente sem consumo de ATP, impedindo que o substrato continue se enovelando incorretamente ou que ocorra a formação de agregados proteicos até a ação futura de outras chaperonas, normalmente de enovelases (Lee et al., 1997); as enovelases, que auxiliam o substrato a adquirir seu estado nativo utilizando energia através da hidrólise do ATP, sendo responsáveis também pelas atividades de reenovelamento do sistema; e as desagregases, que tem a habilidade de remover proteínas de agregados proteicos, solubilizando-os e reativando-os também com o uso de ATP (Mokry et al., 2015).
Existem pelo menos cinco famílias principais de chaperonas moleculares, e estas estão classificadas de acordo com a sua massa molecular, sendo elas: Hsp70, Hsp60/Hsp10, Hsp90, Hsp100 e smHsp (de small Hsp). As três primeiras famílias citadas agrupam proteínas que atuam como enovelases, enquanto que as smHsps agem como holders (Borges e Ramos, 2005; Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011). Já a Hsp100, constitui uma família de desagregases cuja principal proteína estudada é a desagregase Classe I de levedura (Hsp104), cuja função está na modificação e dissolução de agregados proteicos (Mokry et al., 2015).
1.4. O sistema Hsp70
O sistema Hsp70 é um dos mais importantes entre as chaperonas/Hsps. As Hsp70s, como mencionado no item 1.3., trabalham como enovelases e possuem importantes funções: previnem a formação de agregados e desnaturação irreversível, auxiliam no enovelamento e no transporte através das membranas, interagem com outras chaperonas, e também atuam em algumas atividades não completamente relacionadas ao enovelamento proteico (Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011; Borges e Ramos, 2005).
A principal co-chaperona da Hsp70 é a Hsp40, uma holder. A interação entre elas consiste da seguinte forma, a Hsp40 reconhece e se liga a proteínas não enoveladas ou parcialmente enoveladas e as entrega para a Hsp70, que está numa conformação aberta, com baixa afinidade por substratos (Figura 4). Essa co-chaperona possui um domínio J, sendo encontrado apenas um tipo em procariotos, e dois tipos, Tipo 1 e Tipo 2, dependendo da especificidade do substrato, em eucariotos mais simples, tais quais levedura, chegando a mais de 40 em humanos e plantas. O domínio J faz a interação com o N-terminal da Hsp70, onde fica o domínio de ligação ao nucleotídeo (NBD), em inglês, Nucleotide Binding Domain, e estimula a hidrólise do ATP. A energia liberada é usada para gerar mudanças conformacionais no C-terminal desta mesma proteína, onde fica o domínio de ligação ao substrato (SBD), em inglês, Substrate Binding Domain, aumentando a eficiência de interação da Hsp70 com a proteína a ser auxiliada, na qual a chaperona encontra-se numa conformação fechada (Figura 4) (Tiroli-Cepeda e Ramos, 2011). Em procariotos principalmente, a função da Hsp70 depende de trocadores de nucleotídeo como a GrpE. Em eucariotos, tal função não é estritamente necessária e quando é, as co-chaperonas Hsp110 e BAG, as quais são distintas da GrpE, auxiliam nesta função (Bracher e Verghese, 2015). Neste caso, a Hsp110 interage com a Hsp70 pelo NBD e facilita a troca do nucleotídeo ADP pelo ATP, o que faz com que a Hsp70 volte a sua conformação aberta e libere o substrato enovelado ou reenovelado (Figura 4), permitindo assim que um novo ciclo possa então ser iniciado.
Figura 4. Ciclo da chaperona Hsp70. O substrato é entregue pela Hsp40 a Hsp70, que está ligada ao ATP, portanto, encontra-se na conformação aberta e sem afinidade pelo substrato. A interação entre ambas as proteínas estimula a hidrólise do ATP e a Hsp70 passa para a conformação fechada, com alta afinidade pelo substrato. A Hsp40 é liberada e a Hsp110, interagindo com a Hsp70, promove a troca do nucleotídeo ADP pelo ATP novamente e o substrato é então liberado. Modificado de Shiber e Ravid (2014); Nogueira et al. (2018).
A Hsp70 participa também de um complexo que auxilia eficazmente na solubilização e reativação de agregados proteicos e que envolve a Hsp40 e a Hsp100. Neste sistema, o complexo Hsp70/Hsp40 identifica e se associa ao agregado proteico. Neste caso, a Hsp100 interage diretamente por uma curta região de seu domínio M. A soma dessas interações causa uma transmissão de sinais do domínio M até o NBD1 da Hsp100, auxiliando na hidrólise do ATP e estimulando a atividade de desagregação (Mokry et al., 2015).
Segundo um modelo proposto por Rosenzweig et al. (2013), Figura 5, há inicialmente uma interação entre o complexo Hsp70/Hsp40 e o agregado proteico que inicia a exposição de polipeptídeos “estendidos” que são o ponto de partida para
a desagregação. Posteriormente, a interação direta entre o NBD da Hsp70 e a Hsp100 faz com que os polipeptídeos mencionados sejam entregues para o poro central da Hsp100, ativando esta desagregase. Com a hidrólise do ATP a desagregação se inicia e polipeptídeos individuais começam a emergir pelo outro lado da Hsp100, prontos para o reenovelamento.
Figura 5. Modelo de desagregação pelo complexo Hsp70/Hsp40/Hsp100. A interação entre Hsp70/Hsp40 e o agregado proteico inicia a exposição de polipeptídeos “estendidos”. Interação direta entre a Hsp70 e a Hsp100 entrega os polipeptídeos expostos ao poro central da Hsp100, ativando-a. Uma subsequente troca de nucleotídeos favorece o surgimento de polipeptídeos individuais pelo outro lado da Hsp100, prontos para serem reenovelados. Modificado de Rosenzweig et al. (2013); Nogueira et al. (2018).
1.5. O complexo desagregase Hsp70/Hsp40/Hsp110
Surpreendentemente, parece não haver um ortólogo da proteína Hsp100 em metazoários, e desta forma, a maneira como células animais reativam grandes agregados proteicos ainda não é completamente conhecida (Mokry et al., 2015). No entanto, foi observado que a co-chaperona Hsp110 possui um papel importante na
desagregação e reativação de agregados em mamíferos ao interagir com outras duas proteínas, a Hsp70 e a Hsp40. Este sistema é menos eficiente comparado às atividades realizadas pela Hsp100, contudo, parece preencher um subconjunto dessas atividades nos animais. Além disso, a interação entre Hsp110, Hsp70 e Hsp40, quando na presença da Hsp100, aumentou a eficiência da atividade desta desagregase em modificar e dissolver substratos amiloidogênicos, que estão relacionados às causas de muitas das doenças degenerativas conhecidas (Shorter, 2011).
Segundo um modelo proposto por Nillegoda e Bukau (2015), Figura 6, a co-chaperona Hsp40 se associa à superfície do agregado proteico e recruta a Hsp70. Posteriormente, há a formação de um heterodímero pela associação da Hsp110 com a Hsp70, na qual ambas as proteínas se encontram com seus NBDs e SBDs em diferentes estados de ligação, isto é, enquanto a Hsp70 está ligada ao ADP, ela está associada ao agregado proteico pelo SBD, e ao mesmo tempo, a Hsp110 se encontra ligada ao ATP e, portanto, numa conformação aberta, ou seja, sem afinidade pelo agregado. Com diversos ciclos de ligação aos nucleotídeos ADP/ATP por ambas as proteínas se inicia então o desenovelamento da estrutura do agregado em várias partes (setas vermelhas na Figura 6), favorecendo assim a liberação de polipeptídeos individuais prontos para o reenovelamento.
Figura 6. Modelo de desagregação proposto para as proteínas Hsp70, Hsp40 e Hsp110. A Hsp40 se associa à superfície do agregado proteico e recruta a Hsp70. Ocorre em seguida a formação de um heterodímero pela associação da Hsp110 com a Hsp70. Diversos ciclos de ligação aos nucleotídeos ATP e ADP por ambas as proteínas favorecem o desenovelamento do agregado em vários pontos (setas vermelhas) e ocorre a liberação de polipeptídeos individuais para o reenovelamento. Modificado de Nillegoda e Bukau (2015); Nogueira et al. (2018).
Recentemente foi descoberto um sistema desagregase em humanos que é capaz de desagregar fibrilas amiloides de -sinucleína, que estão relacionadas ao mal de Parkinson. Este sistema é formado pela Hsc70, pela proteína com domínio J de classe B, DNAJB1 (Hsp40), e pela Apg2 (Hsp110). Através de experimentos de interação e afinidade entre essas proteínas e as fibrilas, foi proposto um mecanismo combinado de fragmentação e despolimerização que gera em solução pequenos oligômeros e espécies monoméricas da -sinucleína, menos tóxicos para a célula (Figura 7). Resumidamente, a proteína DNAJB1 se liga à fibrila e recruta a Hsc70 estimulando a hidrólise do ATP, posteriormente, há o recrutamento da Apg2 pelo complexo Hsc70/DNAJB1 promovendo a troca de nucleotídeos, ADP por ATP, e dissociando as proteínas da superfície da fibrila. Isso gera mudanças estruturais que
favorecem a liberação de polipeptídeos individuais de -sinucleína nas pontas finais da fibrila (Gao et al., 2015).
Figura 7. Modelo de desagregação das fibrilas de -sinucleína. DNAJB1 em amarelo, Hsc70 em azul, Apg2 em roxo e fibrilas em marrom claro. DNAJB1 se liga com maior afinidade ao longo de toda a fibrila e recruta a Hsc70 no seu estado de ATP. Com a hidrólise do ATP, são formados complexos Hsc70/DNAJB1 na superfície da fibrila. A ligação da Apg2 ao complexo catalisa a liberação do ADP pela Hsc70, seguido da ligação de ATP novamente. Com isso ocorre a dissociação das proteínas da fibrila. Modificado de Gao et al. (2015); Nogueira et al. (2018).
1.6. Justificativa
Visando entender melhor como o sistema Hsp70 funciona e qual a importância de seus componentes, este projeto teve como objetivo estudar uma importante co-chaperona molecular, a Hsp110 de sorgo, através de sua clonagem, expressão, purificação, e caracterizações conformacional e funcional.
A Hsp110 parece atuar como uma enovelase que junto com a Hsp70 auxilia no correto enovelamento de proteínas-cliente se ligando a elas e utilizando energia através da hidrólise do ATP para tal atividade. Além disso, foi observado que a interação entre as proteínas Hsp110, Hsp70 e Hsp40 pode colaborar para a dissolução e reativação de alguns agregados proteicos em mamíferos, preenchendo um subconjunto de atividades realizadas pela importante desagregase Hsp100 em outros organismos (Shorter, 2011; Mattoo et al., 2013).
A motivação para o estudo desta proteína em plantas se deu ao fato de, apesar destes organismos possuírem uma Hsp100 bastante ativa, eles possuem também a Hsp110. Investigamos se Hsp110s de plantas possuem função desagregase e, neste caso, se há uma associação entre sistemas desagregases distintos para aumentar a eficiência do mesmo. Tal hipótese seria justificada pelo fato de, por serem sésseis, plantas experimentarem condições mais estressantes que animais.
2. Objetivos
2.1. Objetivos gerais
Caracterizar a conformação e a função chaperona da Hsp110 de sorgo no seu papel de desagregase para compreender como o sistema de controle de qualidade proteico nas células de planta lida com este fenômeno.
2.2. Objetivos específicos
- Clonagem e expressão da Hsp110 de sorgo, - Purificação,
- Caracterização conformacional, e
- Caracterização funcional da Hsp110 isolada e em conjunto com proteínas do sistema Hsp70.
3. Materiais e Métodos
3.1. Estratégia de clonagem
Para obtenção do clone inicialmente foi realizada estratégia de clonagem na qual a sequência de nucleotídeos do mRNA da hsp110 de Sorghum bicolor (sorgo) foi obtida usando a sequência de mRNA da hsp110 de Arabidopsis thaliana através de alinhamento realizado pelo banco de dados do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), do inglês National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional de Informações Biotecnológicas). Com a sequência de nucleotídeos utilizou-se o programa OPTIMIZER (disponível em http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/) para substituição de códons raros em E. coli por aqueles utilizados com mais frequência pela bactéria, sendo a otimização avaliada posteriormente pelo uso do programa Rare Codon Analyzer (disponível em http://www.biologicscorp.com/tools/RareCodonAnalyzer#.VumaGuIrLcc/), que verificou a substituição dos códons e a quantidade de bases CG existentes. Utilizou-se em seguida o programa NEBcutter (disponível em http://nc2.neb.com/NEBcutter2/) para obter o mapa de enzimas de restrição que clivavam a sequência de nucleotídeos, de modo que essa análise permitiu escolher para a inserção do gene as enzimas NdeI e XhoI que não apresentaram sítios de clivagem na sequência de interesse.
Para a clonagem foi utilizado o vetor de expressão pET-28a(+), na qual o gene que codifica a proteína de interesse foi inserido entre os sítios de restrição das enzimas NdeI (5’ - CATATG - 3’) e XhoI (5’ - CTCGAG - 3’) já mencionadas, destacadas em vermelho na Figura 8. O uso deste plasmídeo permite a expressão da proteína fusionada a uma cauda de poli-histidina, chamada de His-tag, no amino-terminal, sendo verificado na sequência de aminoácidos pelo programa PeptideCutter (disponível em http://web.expasy.org/peptide_cutter/) se a proteína possuía sítios de clivagem para a trombina, enzima normalmente utilizada para a remoção desta cauda.
Figura 8. Mapa do vetor de expressão pET-28a(+). Em destaque vermelho encontram-se os sítios de restrição das enzimas utilizadas na estratégia de clonagem para a inserção do gene de interesse.
A expressão da proteína de interesse (esquema apresentado na Figura 9) é regulada pelo promotor T7 presente no vetor pET escolhido, de modo que a expressão ocorre apenas na presença da enzima T7 RNA polimerase, específica para este promotor (Studier e Moffatt, 1986; Studier et al., 1990). A cepa de E. coli utilizada nesta etapa, BL21(DE3), possui em seu DNA genômico o gene que codifica a T7 RNA polimerase, que no caso tem sua expressão regulada pelo promotor lac bacteriano. A transcrição dos genes de interesse e da T7 RNA polimerase encontra-se normalmente inibida pela preencontra-sença da proteína repressora lac que encontra-se liga ao operador lac impedindo esta ação, e no caso da Figura 9 há ainda a inibição da T7 RNA polimerase pela enzima lisozima T7 quando utilizada a cepa BL21(DE3)pLysS/E. Com a adição do indutor IPTG, do inglês Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (isopropil -D-1-tiogalactopiranosídeo), composto análogo ao indutor natural 1,6-alolactose, a proteína repressora por afinidade ao IPTG se desliga do operador lac, o que ocasiona inicialmente a transcrição do gene da T7 RNA polimerase e sua expressão, permitindo assim, que a proteína de interesse seja expressa em seguida.
Figura 9. Sistema de indução com IPTG e expressão da proteína. Figura retirada de Sambrook et al. (1989).
A partir da construção teórica da estratégia de clonagem, a empresa Epoch Life Science foi contratada para a síntese do clone. As técnicas de biologia molecular empregadas estão descritas em Sambrook et al. (1989). Após obtenção, foi realizado sequenciamento de DNA pela empresa Helixxa para confirmação da sequência de interesse, sendo para tal utilizados os oligonucleotídeos T7 promoter e T7 terminator presentes no vetor de expressão pET-28a(+), cujas sequências encontram-se abaixo:
T7 promoter (forward): 5’ - TAATACGACTCACTATAGGG - 3’ T7 terminator (reverse): 5’ - GCTAGTTATTGCTCAGCGG - 3’
3.2. Linhagens celulares utilizadas
Duas linhagens de E. coli foram utilizadas, a DH5α (Invitrogen), para manutenção e replicação do DNA plasmidial (Hanahan, 1983), e a BL21(DE3) (Stratagene), para expressão da proteína de interesse. A presença do gene DE3 nesta linhagem é responsável pela síntese da enzima T7 RNA polimerase (Studier e Moffatt, 1986).
3.3. Meios de cultura utilizados
Foi utilizado para o crescimento das bactérias o meio de cultura LB (Luria-Bertani) composto por 10 g L-1 de triptona, 5 g L-1 de extrato de levedura e 10 g L-1 de NaCl, preparado em água desmineralizada com pH 7,0 e autoclavado a 121 ºC por 20 minutos. Para as placas de cultura foi usado o meio de cultura LB suplementado com ágar (1,5 % (m/v)), sendo distribuídos 15 mL por placa em câmara de fluxo laminar. Na etapa de transformação utilizou-se ainda o meio de cultura SOC composto por 20 g L-1 de peptona, 5 g L-1 de extrato de levedura, 0,5 g L-1 de NaCl, 2,5 mmol L-1 de KCl, 0,01 mmol L-1 de MgCl2 e 0,02 mmol L-1 de glicose.
3.4. Transformação e expressão da proteína Hsp110 de sorgo
Primeiramente foi utilizada a técnica de choque térmico (Sambrook e Russell, 2001) para que a bactéria fosse transformada com o plasmídeo contendo o gene de
interesse, feito isso, foi realizado plaqueamento em meio de cultura LB sólido contendo o antibiótico específico (canamicina a 30 µg mL-1) e incubou-se por 18 h a 37 °C para o crescimento de colônias isoladas da bactéria. Posteriormente, 3 colônias isoladas foram diluídas (pré-inóculo) em meio de cultura LB líquido contendo o antibiótico e o conjunto foi mantido a 37 °C por 18 h sob agitação constante de 200 rpm. Logo após, 25 mL do pré-inóculo foram diluídos (inóculo) em 500 mL de meio de cultura LB, também contendo o antibiótico (37 °C sob agitação constante de 200 rpm por aproximadamente 150 min). Quando a absorbância a 600 nm do inóculo atingiu valores entre 0,6 - 0,8 (fase log de crescimento da bactéria) foi adicionado o indutor IPTG em uma concentração final de 1 mmol L-1 de modo a induzir a expressão da proteína. Neste caso mudou-se a temperatura do meio para 18 °C mantendo a agitação constante e incubou-se por 18 h. Após expressão, a amostra foi centrifugada e removeu-se o meio de cultura (15 min, 4 °C, 2.496 g) ficando apenas com o precipitado, sendo o mesmo armazenado em freezer a - 20 °C e estando pronto para a etapa seguinte de lise. As técnicas de biologia molecular empregadas na expressão da proteína estão melhor descritas em Sambrook et al. (1989). A expressão da proteína foi averiguada através da técnica de SDS-PAGE, do inglês Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio), correndo-se um gel de poliacrilamida da amostra e comparando-se com um padrão de massa molecular (ver item 3.5.).
3.5. Eletroforese em gel de poliacrilamida
Nesta técnica as proteínas podem ser separadas pelas suas respectivas massas moleculares quando na presença do detergente SDS, que é capaz de desnaturar as proteínas e se ligar a elas numa razão constante, com isso, a separação ocorre através da migração em gel de poliacrilamida ao se aplicar diferença de potencial, uma vez que as macromoléculas estarão carregadas negativamente (Laemmli, 1970).
As amostras foram diluídas para aplicação no gel numa proporção 1:2 em tampão contendo Tris-HCl 100 mmol L-1 pH 6,8, glicerol 20 % (v/v), azul de bromofenol 0,2 % (m/v), SDS 4 % (m/v) e DTT 200 mmol L-1. O gel é constituído de duas partes, sendo preparados o gel de empacotamento 5 % contendo mistura
acrilamida/bis-acrilamida 5 % (m/v), Tris 130 mmol L-1 pH 6,8, SDS 0,1 % (m/v), persulfato de amônio 0,1 % (m/v) e TEMED, e o gel de separação (no caso 10 %) contendo mistura acrilamida/bis-acrilamida 10 % (m/v), Tris 390 mmol L-1 pH 8,8, SDS 0,1 % (m/v), persulfato de amônio 0,1 % (m/v) e TEMED. A eletroforese foi efetuada em cuba Mini-PROTEAN® Tetra System (BIO-RAD) usando a fonte Electrophoresis Power Supply – EPS 301 (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Os géis foram corados por aproximadamente 15 minutos em solução contendo etanol 30 % (v/v), ácido acético 10 % (v/v), água 60 % (v/v) e corante Coomassie Brilliant Blue R250 0,25 % (m/v), e descorados em solução contendo etanol 10 % (v/v), ácido acético 10 % (v/v) e água 80 % (v/v).
3.6. Lise bacteriana e purificação da proteína recombinante
Para a purificação, o precipitado obtido (descrito no item 3.4.) foi dissolvido em tampão de lise (15 mL por precipitado) composto por Tris-HCl 50 mmol L-1 pH 8,0, KCl 100 mmol L-1 e EDTA 1 mmol L-1 pH 8,0, além da adição de outros reagentes como a enzima lisozima (30 g mL-1), que atua rompendo a parede celular da bactéria e liberando seu conteúdo, DNAse (5 U) e PMSF (1 mmol L-1), que atua inativando serino proteases. Posteriormente, a mistura foi mantida em gelo por aproximadamente 30 minutos e em seguida submetida a pulsos de ultrassom (150 s - por precipitado - de processo total, com pulsos de 5 s e tempo de descanso de 75 s, com amplitude de 30 W). Feito isso, o lisado foi centrifugado (30 min, 4 °C, 15.871 g) e o sobrenadante coletado e filtrado (filtro com membrana de 0,45 m), estando pronto para purificação.
3.6.1. Cromatografia de afinidade
Nesta primeira etapa foi usado o método de cromatografia de afinidade em coluna de níquel, pois, a proteína de interesse foi expressa fusionada a uma cauda de poli-histidina (Hengen, 1995). O gene foi clonado no vetor de expressão pET-28a(+) e a cauda em sua porção N-terminal possui 20 resíduos de aminoácidos (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH), sendo seis resíduos de histidina consecutivos. Neste caso a proteína de interesse se liga à coluna, pois, o nitrogênio das histidinas se coordena ao níquel presente na fase estacionária da coluna. A maioria das
demais proteínas são eluídas enquanto que a proteína com a cauda é eluída somente após adicionar o reagente imidazol ao tampão de corrida. O imidazol é um composto que possui estrutura semelhante à cadeia lateral da histidina o que faz com que o mesmo se coordene ao níquel permitindo que a proteína inicialmente ligada seja eluída.
Foi utilizado o tampão de corrida Tris-HCl 20 mmol L-1, NaCl 100 mmol L-1, pH 7,5 (A) e o tampão para eluição Tris-HCl 20 mmol L-1, NaCl 100 mmol L-1, imidazol 500 mmol L-1, pH 7,5. Após injeção da amostra foram feitas lavagens com o tampão A para remoção das proteínas que não se ligaram à coluna, depois foram feitas etapas de eluição com quantidades de 7-8 %, 30 % e 100 % de imidazol pela adição crescente do tampão de eluição, para a remoção de proteínas com ligações inespecíficas à coluna, para a eluição da proteína de interesse, e para a limpeza da coluna, respectivamente. Foi utilizada uma coluna His-trap de 5 mL contendo a resina Ni Sepharose (GE Life Sciences) e o procedimento foi realizado no equipamento Äkta FPLC (Amersham Pharmacia Biotech) com vazão máxima de 3 mL min-1, pressão limite de 0,3 MPa e frações monitoradas pela absorbância a 280 nm.
3.6.2. Cromatografia de exclusão molecular
Na segunda etapa de purificação foi aplicada a cromatografia de exclusão molecular para aumentar o grau de pureza da proteína. Esta é uma técnica que separa por formato/tamanho de amostra, sendo que as proteínas de maior tamanho percorrem um caminho menor, pois, não migram para os poros da fase estacionária da coluna, eluindo mais rapidamente, enquanto que as proteínas de menor tamanho percorrem um caminho maior, pois, migram para os poros da fase estacionária da coluna, eluindo mais lentamente (Barth et al., 1994).
Nesta etapa a amostra obtida após a cromatografia de afinidade foi filtrada (filtro com membrana de 0,22 m) e utilizou-se a coluna XK 26/60 de 320 mL totais empacotada com a resina Superdex 200. O tampão de corrida utilizado foi o tampão A. O procedimento foi realizado no equipamento Äkta PRIME (GE Life Sciences) com vazão máxima de 1,5 mL min-1, pressão limite de 0,5 MPa e frações monitoradas pela absorbância a 280 nm. As técnicas de purificação utilizadas estão descritas em Sambrook et al. (1989).
3.7. Determinação do grau de pureza da proteína recombinante
A pureza final da proteína obtida foi avaliada pela técnica de SDS-PAGE e o grau de pureza foi determinado através do programa ImageJ, utilizado para processamento de imagens (disponível para download em https://imagej.nih.gov/ij/download.html). No caso, ele foi aplicado em fotos dos géis de poliacrilamida com amostras finais da purificação, de modo a avaliar a contribuição de cada banda presente nas frações coletadas, sendo possível então obter a porcentagem de pureza da proteína obtida com relação aos seus contaminantes.
3.8. Determinação da concentração proteica
A concentração da proteína foi determinada através do método de Edelhock (Edelhock, 1967) junto com Pace et al. (1995). O coeficiente de absortividade molar foi obtido por meio do cálculo utilizando a Equação 1.
ε 280 = n Trp . (5.690) + n Tyr . (1.280) + n cistina . (125) Equação 1, onde:
ε 280 é o coeficiente de absortividade molar da proteína a 280 nm (mol-1 Lcm-1), n Trp é o número de resíduos de triptofano da proteína, n Tyr é o número de resíduos de tirosina e n cistina é o número de ligações cistinas formadas.
Com o valor de ε 280 a concentração foi calculada utilizando-se a Lei de Beer-Lambert (Equação 2) ao medir a absorbância da amostra em 280 nm. Foi utilizado o espectrofotômetro GENESYS 10uv Scanning (Thermo SCIENTIFIC) e a amostra foi diluída em tampão com composição final de fosfato de sódio 20 mmol L-1 pH 6,5 e cloreto de guanidina 6 mol L-1.
A = ε 280 . l . C Equação 2, onde:
A é a absorbância, ε 280 é o coeficiente de absortividade molar da proteína a 280 nm (mol-1 L cm-1), l é o caminho óptico (cm) e C é a concentração molar (mol L-1), Grimsley e Pace (2004).
3.9. Caracterização conformacional
Os métodos foram empregados para avaliar o enovelamento da proteína produzida e para caracterizar o seu estado nativo. As principais ferramentas utilizadas são descritas a seguir. Para a realização das técnicas de DLS, GFA e SEC-MALS, as amostras foram previamente centrifugadas (10 min, 4 °C, 17.949 g) e a discussão sobre as equações pode ser encontrada em Borges e Ramos (2011) (ver itens específicos). As amostras foram diluídas no tampão A quando necessário.
3.9.1. Espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD)
A espectropolarimetria de dicroísmo circular se baseia na interação da luz circularmente polarizada com macromoléculas assimétricas, isto é, que apresentam quiralidade, unidades opticamente ativas que interagem com a luz incidente. A técnica mede especificamente a diferença de absorção dessa luz circularmente polarizada à esquerda e à direita após interação com a amostra. As proteínas, que apresentam assimetria devido às ligações peptídicas, são capazes de interagir com a luz mencionada sendo, portanto, esta técnica bastante utilizada para investigar sua estrutura secundária (Ramos, 2008; Correa e Ramos, 2009; Woody, 1995). Os espectros de CD apresentam diferenças entre si de acordo com a estrutura secundária presente, sendo possível diferir entre voltas, hélices e folhas , que possuem características específicas nos espectros, como bandas positivas em ~ 190 nm e negativas em torno de 222 nm e 208 nm para hélices , e bandas positivas em ~ 198 nm e negativas em ~ 217 nm para folhas (Correa e Ramos, 2009). A técnica foi utilizada principalmente na avaliação do enovelamento e estabilidade da proteína após adotar seu estado nativo.
Para as caracterizações de estrutura secundária e experimentos de desenovelamento induzidos por aquecimento e por ureia, foi utilizado o espectropolarímetro JASCO, modelo J-720, e cubetas de quartzo com 1 ou 2 mm de caminho óptico, dependendo da concentração da proteína. Todos os dados foram coletados respeitando-se o valor limite de 700 V, uma vez que valores maiores de voltagem podem causar danos ao equipamento e prejudicar as medidas. Para avaliar a estrutura secundária foram feitas medidas em triplicata (16 acumulações
cada) na faixa de 260 a 202 nm utilizando a cubeta de 1 mm, velocidade de 20 nm min-1 e resposta de 1,0 nm. Para o desenovelamento induzido por aquecimento foram feitas medidas no comprimento de onda na região de 222 nm e variou-se a temperatura de 20 a 90 °C, e posteriormente de 90 a 20 °C utilizando uma velocidade de 1 °C min-1. No desenovelamento induzido por ureia também foi monitorado o comprimento de onda na região de 222 nm e foram feitas medidas com 1 minuto de duração (leituras de 10 em 10 s) a 25 °C variando a concentração de ureia de 0 a 8 mol L-1 e posteriormente de 8,0 a 0,5 mol L-1. Foram feitas incubações de 35 minutos.
Os dados brutos obtidos pelo equipamento foram gerados em miligraus (mdeg) e foram tratados para obtenção do valor de elipticidade molar residual, [], em deg cm2 dmol-1, segundo a Equação 3.
Equação 3, onde:
é a elipticidade em graus (mdeg), MM é a massa molecular da proteína (kDa), C é a concentração da proteína (mg mL-1), l é o caminho óptico (cm) e n é o número de resíduos de aminoácidos da proteína.
Com o resultado de elipticidade molar residual em 222 nm ([]222) foi possível calcular o conteúdo em % de hélice (fH) neste comprimento de onda específico pela Equação 4.
Equação 4
3.9.2. Calorimetria diferencial de varredura (DSC)
A calorimetria diferencial de varredura tem como função gerar informações sobre a termodinâmica do desenovelamento proteico (Batista et al., 2015). A técnica mede a mudança de calor referente ao desenovelamento induzido por aquecimento da proteína quando aquecida a uma taxa constante. Especificamente, é medida a
quantidade de calor necessário que é fornecido à amostra de modo a se igualar a temperatura com a cela de referência, no caso tampão, também aquecida a uma taxa constante durante o experimento. Este calor pode ser associado à capacidade calorífica (Cp) da proteína e também à entalpia (H) de desenovelamento. Com estes resultados pode-se ainda avaliar os fatores que contribuem para o enovelamento e a estabilidade proteica. A técnica foi utilizada principalmente na avaliação da estabilidade da proteína em solução. Foram feitos três experimentos utilizando o equipamento MicroCal VP-DSC da GE Life Sciences com programação de temperatura de dois ciclos de 20 a 30 °C iniciais e em seguida de dois ciclos de 20 a 90 °C com velocidade de 60 °C h-1.
3.9.3. Emissão de fluorescência intrínseca
Foi avaliada a emissão de fluorescência usando sondas intrínsecas, no caso os resíduos de aminoácidos triptofano, W, e tirosina, Y, que apresentam diferentes espectros dependendo da polaridade do meio em que estão (Ramos, 2004). Quando esses resíduos se encontram no interior das proteínas, no caso sem exposição ao solvente, eles fluorescem em comprimentos de onda menores, enquanto que quando se encontram expostos ao solvente na superfície da proteína, portanto em ambiente polar, eles passam a fluorescer em comprimentos de onda maiores (Lakowicz, 1999). Esta técnica foi então utilizada para avaliar o enovelamento da proteína produzida ao monitorar a posição dos resíduos mencionados na conformação da mesma, utilizando no caso diferentes concentrações de ureia numa faixa de 0 a 8 mol L-1.
As medidas foram feitas no equipamento Varian Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer utilizando cubeta de quartzo com 10 mm x 2 mm de caminho óptico, faixa de comprimento de onda de emissão de 300 a 400 nm, e 4 acumulações por espectro. Foram utilizados dois comprimentos de onda de excitação: 280 nm (capaz de excitar os resíduos de triptofano e de tirosina) e 295 nm (capaz de excitar somente o triptofano). Os dados brutos obtidos de fluorescência foram trabalhados para calcular, através da Equação 5, o valor de centro de massa do espectro em nm, <>, em cada caso.
Equação 5, onde:
i é o comprimento de onda (nm) e Fi é a intensidade do sinal de fluorescência em cada comprimento de onda.
3.9.4. Espalhamento dinâmico de luz (DLS)
A partir desta técnica foi possível obter o coeficiente de difusão (D) da proteína de estudo. Tem-se que as partículas em solução se encontram em constante movimentação, e esse movimento ocorre com diferentes velocidades de acordo com o seu tamanho, sendo que partículas maiores se movimentam mais lentamente, enquanto que partículas menores se movimentam mais rapidamente. Os experimentos foram feitos no equipamento ZETASIZER Nano series da Malvern a 25 °C com diferentes concentrações da proteína. Para cada experimento foram feitas 20 medidas. O equipamento mede especificamente essa flutuação do movimento Browniano em solução e o relaciona com o tamanho das partículas para se obter o valor de D (Jachimska et al., 2008). A partir do valor de D obtido foi possível calcular pela Equação 6, de Stokes-Einstein, o raio de Stokes ou raio hidrodinâmico (Rs) (Edward, 1970) e pela Equação 7 a massa molecular (MM) para a proteína, ambos os resultados considerando uma esfera não hidratada de mesma massa molecular.
Equação 6, onde:
kB é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta (K), n é a viscosidade do tampão utilizado (1,2876 x 10-3 Pa s, obtida pelo software Sednterp - http://www.jphilo.mailway.com/download.htm/) e Rs é o raio de Stokes ou raio hidrodinâmico (m).
Equação 7, onde:
MM é a massa molecular da proteína (Da), Vbar é o volume parcial específico da água (0,7269 cm3 g-1) e N é o número de Avogadro.
A partir do valor de D obtido pôde-se ainda calcular o coeficiente friccional, f, pela Equação 8.
Equação 8, onde:
kB é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta (K) e D é o coeficiente de difusão medido (m2 s-1).
Tem-se que o coeficiente friccional f pode ser comparado com aquele de uma esfera não hidratada de mesma massa molecular, f0, calculado pela Equação 9.
Equação 9, onde:
n é a viscosidade do tampão utilizado (1,2876 x 10-3 Pa s), MM é a massa molecular da proteína (Da), Vbar é o volume parcial específico da água (0,7269 cm3 g-1), N é o número de Avogadro e Rs é o raio de Stokes ou raio hidrodinâmico (m) predito para uma esfera não hidratada de mesma massa molecular.
Os valores de f e f0 foram então utilizados para o cálculo do fator de Perrin, descrito pela Equação 10. Este parâmetro é capaz de dar informações sobre a forma proteica, isto é, se a proteína é mais parecida com uma esfera ou se é mais alongada (Borges e Ramos, 2011). Isso é amplamente utilizado para se obter informações sobre interações entre proteínas, uma vez que estas interações fortes em geral afetam os parâmetros acima mencionados.
Equação 10, onde:
f é o coeficiente friccional medido (kg s-1)e f0 é o coeficiente friccional predito para uma esfera não hidratada de mesma massa molecular (kg s-1).
3.9.5. Gel filtração analítica (GFA)
Esta técnica foi empregada para determinar o raio de Stokes ou raio hidrodinâmico da proteína. Para tal foi utilizada uma coluna com resina Superdex 200 10/300 GL de 24 mL conectada ao equipamento Äkta FPLC (Amersham Pharmacia Biotech), na qual foi monitorada a absorbância a 280 nm. Essa resina possui faixa de separação de 10 a 660 kDa e para a calibração da coluna foram utilizados padrões de proteínas globulares com valores de Rs conhecidos (GE®), Tabela 1. Como a técnica de exclusão molecular separa por diferentes formatos/tamanhos, é possível calcular a partir dos diferentes volumes de eluição das proteínas padrões e da proteína de estudo os seus respectivos coeficientes de partição (Kav) através da Equação 11.
Tabela 1. Padrões utilizados para calibração
Proteínas MM (kDa) Rs (Å) Tiroglobulina 669 85,0 Ferritina 440 61,0 Aldolase 158 48,1 Conalbumina 75 36,4 Ovoalbumina 44 30,5 Equação 11, onde:
Ve é o volume de eluição de cada proteína, V0 é o volume morto da coluna (obtido pelo volume de eluição do reagente Blue Dextran, BD) e Vc é o volume total da coluna.
Com este parâmetro foi construída uma curva de calibração Rs versus (- log Kav)1/2 para se estimar o raio da proteína de estudo (Tiroli e Ramos, 2007). A partir deste raio foi possível calcular pelas Equações 6 e 7, respectivamente, os valores de D e de MM para uma proteína esférica de mesma massa molecular e não hidratada.
3.9.6. Cromatografia de exclusão molecular acoplada a um detector de espalhamento de luz multi-ângulo (SEC-MALS)
Esta técnica permite a obtenção da massa molecular da proteína e seu estado oligomérico em solução a partir da medida do espalhamento de luz multi-ângulo e do índice de refração (Gava et al., 2011; da Silva et al., 2013; Zanphorlin et al., 2014). Tem-se que a radiação eletromagnética possui campo elétrico oscilante que ao interagir com uma macromolécula induz variação dipolar também oscilante na mesma, fazendo com que a luz incidente seja espalhada. Quanto mais polarizável for a macromolécula maior a magnitude deste dipolo oscilante e maior a intensidade da luz espalhada, que será proporcional à massa molecular. Quando se deseja avaliar o espalhamento provocado por uma solução contendo tais macromoléculas, é necessário conhecer a polarizabilidade das mesmas com relação ao meio em que se encontram, no caso o solvente, e isso pode ser determinado pelo índice de refração da solução. Portanto, tendo informações sobre o espalhamento de luz (intensidade, ângulo), concentração conhecida da amostra, viscosidade e índice de refração da solução, torna-se possível determinar o valor de massa molecular e consequentemente o estado oligomérico da proteína em solução (Wyatt, 1993).
Para a caracterização foi utilizada a coluna de gel filtração analítica acoplada ao FPLC (como descrito no item 3.9.5.), o detector de espalhamento de luz mini-DAWN TREOS (Wyatt®) com 3 fotodetectores (ângulos variando entre 45° e 135°) e o detector de índice de refração Optilab T-rEX (Wyatt®). O tratamento de dados foi realizado através do software ASTRA (Wyatt®) para a determinação da massa molecular. A partir da massa obtida foi possível calcular os valores de D e de Rs pelas Equações 6 e 7, respectivamente, considerando uma esfera de mesma massa não hidratada. Este valor de Rs predito foi utilizado para o cálculo do f0 mencionado no item 3.9.4. (Equação 9).
3.10. Caracterização funcional
Para avaliar se a proteína Hsp110 de sorgo estava funcional, foram realizados experimentos para verificar a capacidade desta co-chaperona em proteger substratos modelo contra agregação, tanto induzida por aquecimento quanto por agente redutor, além de sua capacidade em recuperar substratos após reenovelamento e desagregação de agregados proteicos ao interagir com demais proteínas do sistema Hsp70. Os experimentos realizados são descritos a seguir. As amostras foram diluídas no tampão A quando necessário.
3.10.1. Atividade chaperona
Para a realização dos experimentos foi utilizado o equipamento Varian Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer para medir o espalhamento de luz monitorado durante 50 minutos no comprimento de onda de 320 nm, e utilizou-se cubeta de quartzo com 10 mm x 2 mm de caminho óptico. A porcentagem de proteção da atividade chaperona foi obtida pela Equação 12.
çã Equação 12, onde:
e e ech representam o máximo de espalhamento de luz no tempo final do experimento, na ausência e na presença da co-chaperona, respectivamente.
3.10.1.1. Agregação induzida por aquecimento
Para verificar a atividade chaperona da proteína produzida, que consiste em proteger contra a agregação, foram realizados inicialmente experimentos para avaliar sua capacidade em proteger substratos modelo contra a agregação induzida por aquecimento. Foram utilizadas como modelo as proteínas-cliente malato desidrogenase (MDH), citrato sintase (CS) e luciferase (normalmente utilizadas pelos pesquisadores envolvidos com o estudo das chaperonas, como o nosso, ver exemplos em Borges et al., 2005; Tiroli e Ramos, 2007 e outras publicações do grupo). Os experimentos foram realizados a 42 °C com diferentes proporções
Hsp110:substrato modelo, sendo conduzidos também na ausência da Hsp110 como controle positivo do experimento, e ainda conduzidos nas mesmas condições substituindo a co-chaperona pela proteína padrão BSA, do inglês Bovine Serum Albumin (albumina de soro bovino), em uma das proporções em que houve proteção como controle negativo do experimento. Especificamente para a MDH e a luciferase foram também realizados experimentos em algumas das proporções na presença de ATP, utilizando nestes casos incubação inicial de 1 minuto no gelo com o nucleotídeo.
3.10.1.2. Agregação induzida por agente redutor
Realizou-se posteriormente experimentos para avaliar a capacidade da proteína Hsp110 de sorgo em proteger substratos modelo contra a agregação induzida por agente redutor, utilizando neste caso como modelo as proteínas-cliente insulina e lisozima. Os experimentos foram realizados com adição de DTT a 25 mmol L-1, que é um agente redutor capaz de reduzir ligações dissulfeto, sendo conduzidos a 20 °C com a insulina e a 25 °C com a lisozima. Com ambos os substratos modelo foi realizada incubação inicial de 30 minutos no gelo com o DTT, e assim como para a agregação induzida por aquecimento, foram feitos experimentos com diferentes proporções Hsp110:substrato modelo, sendo também realizados os controles positivo e negativo dos experimentos, neste último caso utilizando a proteína padrão aldolase para a substituição da co-chaperona.
3.10.2. Reenovelamento e reativação da proteína-cliente luciferase
Foram realizados experimentos para avaliar a capacidade da proteína produzida em reenovelar e reativar a proteína-cliente luciferase após tratamento com o desnaturante químico cloreto de guanidina. Realizou-se incubação da luciferase desenovelada com ATP e a Hsp110 em conjunto com outras chaperonas e co-chaperonas, dentre elas a Hsc70 e a Hsp40 (Tipo 2) humanas, sendo então testadas combinações entre elas e avaliada a recuperação da atividade enzimática da luciferase em comparação com a atividade da enzima tratada pelo mesmo processo mas na ausência do desnaturante (Tzankov et al., 2008; Baaklini et al., 2012). A luminescência emitida após reação com a luciferina, substrato da luciferase, foi
medida usando o equipamento Biotek Synergy HT e placa branca de 96 poços. O controle negativo do experimento foi realizado nas mesmas condições substituindo as chaperonas/co-chaperonas pela proteína padrão BSA na mesma concentração final que a soma de todas as proteínas substituídas. O esquema do experimento realizado está mostrado na Figura 10.
Figura 10. Esquema do experimento realizado para avaliar a capacidade da proteína produzida em reenovelar e reativar a proteína-cliente luciferase. Tampões utilizados para as diluições: KOAc 1 mol L-1, Hepes-KOH 200 mmol L-1, pH 7,5, Mg(OAc)2 50 mmol L-1 (denominado tampão 10X) e o respectivo tampão 1X. Incubações realizadas à temperatura ambiente.
3.10.3. Desagregação e reativação da proteína-cliente luciferase
Foram realizados também experimentos para avaliar a capacidade da proteína produzida em desagregar agregados proteicos e reativar a proteína-cliente luciferase após agregação induzida por aquecimento na presença da HspB1 3D GPG. A adição desta proteína é necessária uma vez que sua ausência gera a formação de agregados proteicos de luciferase não recuperáveis pelas chaperonas/co-chaperonas (comunicação pessoal). Realizou-se incubação da luciferase previamente agregada com ATP e a Hsp110 em conjunto com outras chaperonas e co-chaperonas, dentre elas a Hsc70 e a Hsp40 (Tipo 2) humanas, sendo então testadas combinações entre elas e avaliada a recuperação da atividade
enzimática da luciferase em comparação com a atividade da enzima tratada pelo mesmo processo mas sem a etapa de agregação com o aquecimento (Nillegoda et al., 2015; Rampelt et al., 2012). A luminescência emitida após reação com a luciferina foi também medida usando o equipamento Biotek Synergy HT e placa branca de 96 poços. O controle negativo do experimento foi realizado como no item 3.10.2.. O esquema do experimento realizado está mostrado na Figura 11.
Figura 11. Esquema do experimento realizado para avaliar a capacidade da proteína produzida em desagregar e reativar a proteína-cliente luciferase.
