TÍTULO: EFEITO APOPTÓTICO E DE REGULAÇÃO DE GENES DO CICLO CELULAR DO ÁCIDO CAURENÓICO EM CÉLULAS MCF-7
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): MONA STEFANY DE SOUZA CASTRO, THIAGO OLIMPIO DE SOUZA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): RAQUEL ALVES DOS SANTOS ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): ANDERSON ROBERTO DE SOUZA, SERGIO RICARDO AMBROSIO COLABORADOR(ES):
Resumo
Introdução: O câncer de mama é tipo de câncer mais comum entre as mulheres no
mundo e no Brasil, respondendo por cerca de 28% dos casos novos a cada ano. Relativamente raro antes dos 35 anos, acima desta idade sua incidência cresce progressivamente, especialmente após os 50 anos. Existem vários tipos de câncer de mama, sendo que a maioria dos casos tem bom prognóstico. Novas formas de tratamento que vem sendo desenvolvidas para o tratamento do câncer, sendo os produtos naturais uma opção interessante para obtenção de moléculas com essa finalidade. Entre eles está o ácido caurenóico (AC), sendo um dos vários diterpenos encontrados no óleo de copaíba, possuindo atividades biológicas como, por exemplo, antiparasitária e antimicrobiana, vasodilatadora, anti-inflamatória. Também é conhecido seu efeito genotóxico, onde alguns trabalhos indicam ser esse diterpeno um inibidor de topoisomerase-I. Objetivo: Avaliar o efeito apoptótico e a expressão de genes envolvidos na via de sinalização de danos no DNA de células MCF-7 tratadas com AC. Materiais e métodos: Para análise da apoptose as células MCF-7 foram semeadas e após 24 hs tratadas com as concentrações de 50 e 100 µM de AC. Após 24 hs foram colhidas e destinadas à análise de morte por meio de citometria de fluxo usando a conjugação de iodeto de propídio e anexina V. A análise de expressão gênica foi realizada apenas na concentração de 50 µM por meio de PCR em tempo real. Resultados: os resultados obtidos mostraram que as células MCF-7 tratadas com as concentrações de 50 µM e 100 µM de AC apresentaram um aumento significativo (37,38% e 52,25%, respectivamente, p < 0,0001) de apoptose inicial bem como de apoptose tardia (12,17% e 15,32%) nos tratamentos de 50 e 100 µM, respectivamente. A análise da expressão genica mostrou redução na expressão do gene CCNC em resposta ao tratamento com 50 µM de AC, indicando um efeito bloqueador sobre a transição G0-S do ciclo celular. Assim, os resultados aqui apresentados permitem concluir que o AC é capaz de induzir apoptose e ainda modular a expressão de genes envolvidos no controle do ciclo celular, o que confirma o seu potencial antitumoral.
Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de cem doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se para outras regiões do corpo. Dividindo-se rapidamente, estas células tendem a ser muito agressivas e incontroláveis, determinando a formação de tumores (acúmulo de células cancerosas) ou neoplasias malignas. Por outro lado, um tumor benigno significa simplesmente uma massa localizada de células que se multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu tecido original, raramente constituindo um risco de vida. Outras características que diferenciam os diversos tipos de cânceres entre si são a velocidade de multiplicação das células e a capacidade de invadir tecidos e órgãos vizinhos ou distantes (metástases) (O que é
o câncer?, 2016). O câncer de mama é tipo de câncer mais comum entre as
mulheres no mundo e no Brasil, respondendo por cerca de 28% dos casos novos a cada ano. Relativamente raro antes dos 35 anos, acima desta idade sua incidência cresce progressivamente, especialmente após os 50 anos. Estatísticas indicam aumento da sua incidência tanto nos países desenvolvidos quanto nos em desenvolvimento. Existem vários tipos de câncer de mama, sendo que a maioria dos
casos tem bom prognóstico (TIPOS DE CÂNCER - MAMA, 2016). Uma nova forma
de tratamento que vem sendo usado para combater o câncer são os produtos naturais. Os produtos naturais (PNs) e as estruturas derivadas de produtos naturais continuam a desempenhar um papel importante no processo de descobrimento e
desenvolvimento de novos fármacos (Newman e Cragg, 2014). Entre eles, pode-se
citar o ácido caurenóico, ácido caur-ent-16-en-19-oico, o qual é um dos vários diterpenos encontrados no óleo de copaíba e que apresenta diversas atividades biológicas como, por exemplo, parasitária e antimicrobiana, vasodilatadora, anti-inflamatória, alguns estudos descrevem também a ação inibitória do ácido caurenóico, sobre as contrações uterinas e a ação anti-proliferativa contra células tumorais. Como atividade antitumoral o ácido caurenóico foi capaz de inibir a proliferação celular tanto por apoptose quanto por necrose em células leucêmicas HL-60 (Cavalcanti et al., 2009) bem como apresentou atividade genotóxica significativa em fibroblastos de hamster Chinês V79 tratados por 3 horas com 30 e 60 µg/mL desse caurano (Cavalcanti et al., 2006).
Objetivo
Avaliar o efeito apoptótico e a expressão de genes envolvidos na via de sinalização de danos no DNA de células MCF-7(câncer de mama) tratadas com ácido caurenóico (AC).
Metodologia
As células MCF-7, obtidas do banco de células do Rio de Janeiro, foram cultivadas em meio de cultivo composto por meio HAM F10+DMEM (Sigma, St Louis, USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma, St Louis, USA) e mistura de
antibióticos penicilina/estreptomicina (10 mL.L-1, Sigma, St Louis, USA) acrescido de
sulfato de canamicina (10 mg. L-1) utilizando garrafas de cultivo de 25 mm2 (TPP,
Swizerland) ou placas de poços múltiplos quando necessário. Durante o tempo de
cultivo e tratamentos as células foram mantidas em estufa de CO2 à 37ºC.
Para análise de apoptose 1,5x105 células/poço foram semeadas em placas de 24
poços. Após 24h foram tratadas com as concentrações de 50 e 100 µM de AC por um período de 24h. O controle solvente foi tratado com DMSO a 1% e o controle positivo com doxorrubicina a 0,25 µM. Finalizado o tratamento as células foram tripsinizadas, transferidas para microtubos estéreis e centrifugadas por 10 minutos. As células foram lavadas com PBS e centrifugadas novamente. Para o ensaio da anexina V foi utilizado o kit de detecção de apoptose por Anexina-V marcada com FITC (BD Biosciences®). A seguir, as células foram ressuspendidas com 500 μL do tampão de ligação, 5 μL de anexina V conjugada com FITC e 5 μL de iodeto de propídio. A reação foi incubada por 5 minutos, a temperatura ambiente, sob abrigo da luz. A intensidade de fluorescência (FITC e iodeto de propidio) foi avaliada por citometria de fluxo no sistema Guava EasyCyte Mini System utilizando o programa Cytosoft Blue (Guava Technologies, Inc. – Hayaward, CA) com excitação do laser a 480 nm no Laboratório de Biologia Celular da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP.
A análise de expressão gênica foi feita por PCR em tempo real apenas para a
concentração de 50 µM. Foram semeadas 2,5x105 células/poço em placas de 6
poços. Após 24h as células receberam o tratamento com AC (50 µM) por mais 24h. Finalizado o tempo de tratamento teve início o processo de extração de RNA usando
Trizol Reagent® (Invitrogen) segundo as recomendações do fabricante. Em seguida o RNA foi purificado pelo Pure Link RNA Mini Kit (Ambion, Life Technologies). O próximo passo foi a transcrição reversa a partir de 80 ng de RNA total extraído previamente dos grupos de tratamento em questão, na presença de transcriptase reversa e do iniciador oligo (dt), conforme instruções do fabricante do kit Vilo (Life Technologies). As reações de qPCR em tempo real foram realizadas utilizando como
método de detecção sistema TaqManTM (Applied Biosystems, Foster City), que é
constituído de um par de primers relativos ao gene de interesse (CCNC) e uma sonda marcada com um fluoróforo (FAM), em um aparelho Step One Plus (Applied Biosystems, Foster City). Os níveis relativos de transcritos foram determinados utilizando-se o controle endógeno 18S como o gene constitutivo. A quantificação
relativa foi obtida pelo método -ΔΔCt a fim de realizar comparação relativa ao grupo
não tratado (calibrador) tendo como referência o gene de controle endógeno escolhido.
Desenvolvimento
Os experimentos realizados foram desenvolvidos no laboratório de Genética e Biologia Molecular (LAGBIM) na Universidade de Franca, SP e no Laboratório de Biologia Celular da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP.
Resultados
Os resultados obtidos mostraram que as células MCF-7 tratadas com as concentrações de 50 µM e 100 µM de AC apresentaram um aumento significativo (37,38% e 52,25%, respectivamente, p < 0,0001) de apoptose inicial bem como de apoptose tardia (12,17% e 15,32%) nos tratamentos de 50 e 100 µM, respectivamente. Para a análise de expressão gênica, foi realizada a extração de RNA total após 24 hs de tratamento com 50 µM de AC seguida da síntese de cDNA. Após o procedimento de PCR em tempo real, na qual foi analisada a expressão transcricional no gene CCNC, verificou-se que, os grupos tratados com AC apresentaram uma redução em aproximadamente 30% da transcrição desse gene. A proteína codificada pelo gene CCNC é uma ciclina que atua junto com uma quinase
e cuja expressão é bastante elevada na fase G1 do ciclo celular. A literatura é controversa no que diz respeito ao papel da ciclina C na tumorigênese. Há relatos de que a redução na expressão de CCNC pode contribuir com a progressão tumoral (Aleem e Arceci, 2015). Por outro lado, quando complexada à quinase 3 (CDK3) ela é responsável pela transição G0-S, determinando assim a saída do estado G0, sendo então um alvo terapêutico interessante, uma vez que o bloquei de sua transcrição pode levar à permanência em um estado de quiescência celular (Rajender et al., 2010).
Considerações Finais
Considerando os dados aqui apresentados, pode-se concluir que o AC induz morte celular por apoptose e ainda pode induzir uma parada no ciclo celular por meio da regulação do gene CCNC. No entanto, experimentos adicionais precisam ser realizados para comprovar o papel do gene CCNC na ação antiproliferativa do AC. Fontes Consultadas
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CAVALCANTI, B. C.; BEZERRA, D. P.; MAGALHÃES; H. I. F., MORAES, M. O.; LIMA, M. A. S.; SILVEIRA, E. R.; CÂMARA, C. A. G.; RAO, V. S.; PESSOA, C.; COSTA-LOTUFO, L. V. Kauren-19-oic acid induces DNA damage followed by apoptosis in human leukemia cells. J. Appl. Toxicol. v. 29, p. 560–568, 2009.
Eiman Aleem1,2,* and Robert J. Arceci1 Front Cell Dev Biol. Targeting cell cycle
regulators in hematologic malignancies, 2015; 3: 16.
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Selective inhibition of proteins regulating CDK/cyclin complexes: strategy against cancer—a review Sarita Rajender. P, Ramasree. D, Bhargavi. K, Vasavi. M, and Uma. V* Journal of Receptors and Signal Transduction, 2010; 30(4): 206–213.
O que é o câncer? (2016). acesso em 11 de 08 de 2017, disponível em INSTITUTO
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http://www1.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=322
TIPOS DE CANCER - MAMA. (2016). Acesso em 03 de 08 de 2017, disponível em INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER - INCA JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA: http://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/tiposdecancer/site/home/mama/cancer_m ama+
