TÍTULO: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DO FRUTO DE PSIDIUM GUAJAVA SOBRE A INSTABILIDADE GENÔMICA
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: NUTRIÇÃO SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): GABRIEL NALINI BRANQUINHO AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): RICARDO ANDRADE FURTADO ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): SILVIO DE ALMEIDA JUNIOR COLABORADOR(ES):
1. RESUMO
O estudo de produtos naturais é de grande importância para o desenvolvimento de novos fármacos que possam ser empregados na medicina humana por fornecerem princípios ativos que beneficiam a saúde. Além disso, maior parte das substâncias utilizadas no tratamento contra câncer foi isolada a partir de compostos naturais. A goiaba é um fruto amplamente utilizado como alimento e é considerada planta medicinal em países tropicais e subtropicais em torno de todo o mundo. Em pesquisas científicas in vitro e in vivo, ela tem mostrado conter constituintes químicos com abrangente uso clínico. Especialmente os extratos e metabólitos encontrados nas folhas e frutos têm mostrado atividades farmacológicas de interesse. De acordo com pesquisas na literatura, a goiaba tem mostrado propriedades antiespasmódica, antimicrobiana, hepatoprotetora, anti-alérgica, antimicrobiana, antigenotóxica, antiespasmódica, cardioprotetora, antidiabético, anti-inflamatórias, no tratamento da diarreia e disenteria, além de também ser usado amplamente como um agente hipoglicemiante. Nesse sentido, o presente trabalho teve o objetivo avaliar o potencial protetor do fruto de Psidium guajava sobre a frequência de micronúcleos induzidos por doxorrubucina. Os resultados mostraram que o consumo do fruto diminuiu a frequência de eritrócitos micronúcleados, sendo capaz de proteger o DNA da instabilidade genômica. Além disso, foi observado que o consumo de goiaba não altera a razão de eritrócitos imaturos em relação ao total de eritrócitos, apresentando ausência de citotoxicidade.
Palavras chaves: Goiaba, eritrócitos micronucleados, doxorrubicina
2. INTRODUÇÃO
Os produtos naturais e, especialmente as plantas medicinais, possuem grande importância para o desenvolvimento de novos fármacos empregados na medicina humana. Historicamente, os produtos naturais são considerados excelentes fornecedores de princípios ativos para benefício da saúde. A investigação farmacológica de princípios ativos de plantas medicinais tem proporcionado importantes avanços na abordagem terapêutica de várias patologias, sendo que várias substâncias encontradas nas plantas têm sido utilizadas como
ferramentas úteis em estudos farmacológicos, fisiológicos e bioquímicos (Rates, 2001). Embora alguns dos compostos naturais possam ser bioativos para a promoção do desenvolvimento do câncer, a maioria das preparações comumente usadas é considerada como produto comercial saudável (Zhou et al., 2004). Além disso, mais de 50% das substâncias em triagem clínica para atividade anticancerígena foram isoladas de fontes naturais ou são relacionadas a elas, como os alcaloides vincristina e vinblastina (Leveque e Jehl, 2007).
Com isso, é visto que o câncer é uma doença na qual ocorre a perda do controle do crescimento celular em uma ou mais células, conduzindo para uma massa sólida de células conhecida como tumor ou para câncer liquido como leucemia. Nas últimas décadas, o câncer ganhou uma maior dimensão, tornando-se um evidente problema de saúde pública mundial. No Brasil, a partir dos anos 1960, as doenças infecciosas e parasitárias deixaram de serem as principais causas de morte, sendo substituídas pelas doenças do aparelho circulatório e pelas neoplasias (Da Silva, 2011).
2.1 - Psidium guajava
Nativa da América Tropical tendo se estendido por toda a América do Sul, Europa, África e Ásia (Rios et al., 1977), é uma espécie que se desenvolve em regiões tropicais e subtropicais sempre tendo como preferência o clima seco, mas se adaptando a diversas condições climáticas (Stone, 1970). É uma arvore relativamente pequena, com até 10 m de altura e contendo galhos finos, lisos e tortuosos (Fig. 1a). Suas folhas contêm cerca de 5 a 15 cm em formato oval, fina e discolor. As suas flores são formadas na primavera, solitárias e com pétalas esbranquiçadas contendo cerca de 2 cm de comprimento (Stone, 1970). Seu fruto, a goiaba, tem cerca de 7 cm de diâmetro em forma de globo amarelo com casca
rugosa, contendo uma polpa suculenta doce-acidulada e aromática com numerosas
sementes pequenas, brancas e duras em seu interior, contendo em sua composição 13,2% de carboidratos, 0,88% de proteínas, 0,53% de lipídeos e 84,9% de água (Medina e Pagano, 2003) (Fig. 1b).
3
Figura 1 - Fruto goiaba Pedro Sato lisa (a) e árvore goiabeira (b).
O uso tradicional da goiabeira é relatado historicamente dentro do sistema indígena na América (Lara and Marquez, 1996), como medicamento no tratamento contra diarreia, além de utilizado para tratar gastroenterite, disenteria, problemas estomacais, cólica de intestino e como antibacteriano para germes patogênicos (Heinrich et al., 1998). No Brasil, os frutos e as folhas tem uma aplicabilidade medicinal para tratamento de diarreia, cólera, disenteria, laringite e problemas digestivos, a partir da ingestão da fruta ou então do chá feito pela infusão das folhas em água fervente (Holetz et al., 2002). De acordo com estudos realizados, a goiabeira apresenta diversas atividades biológicas como: antidiarreico (Coutiño et al., 2001); antimicrobiana (Prabu et al., 2006; Arima and Danno, 2002); hepatoprotetor (Roy et al., 2006; Gao et al., 2006); antioxidante (Ojan and Nihorimbere, 2004; Abreu et al., 2006); antigenotóxico e antitumoral (Bartolome et al., 2006); anti-alérgicos (Seo et al., 2005); antihiperglicêmico (Mukhtar et al., 2006; Mukhtar et al., 2004; Hsieh et al., 2005); anti-inflamatório/analgésico (Ojewole, 2006; Muruganandan et al., 2001; Kavimani et al., 1997) e cicatrização (Chah et al., 2006).
Nesse sentido a busca por novas fontes de produtos naturais que possam auxiliar no tratamento de doenças e consequentemente na melhoria da saúde humana se torna mandatório. Além disso, a goiaba é uma fruta amplamente consumida no Brasil e suas atividades biológicas tem sido bem correlacionadas com efeitos quimiopreventivos como, atividades antitumoral, anti-inflamatória e hepatoprotetora.
Baseados no conhecimento popular, o presente trabalho teve como objetivos avaliar o potencial protetor do fruto de Psidium guajava sobre a frequência de micronúcleos induzidos por doxorrubucina em camundongos Swiss.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção da Goiaba
Os frutos da goiabeira da variedade Pedro Sato lisa foram adquiridos na companhia de entrepostos e armazéns gerais do estado de São Paulo (CEAGESP) na cidade de Franca, São Paulo, Brasil.
Para a realização dos experimentos foram selecionadas goiabas com ponto de amadurecimento médio. As mesmas foram processadas e liofilizadas. O pó obtido foi mantido armazenado em freezer até o momento do tratamento.
4.2 Animais
Camundongos Swiss machos (Mus musculus) pesando aproximadamente 30g foram obtidos do biotério central da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto (São Paulo, Brasil) e aclimatados por um período de uma semana antes do início dos experimentos. Os animais foram mantidos em caixas plásticas em uma sala experimental, sob condições controladas de temperatura (23 ± 2º C), 12 horas de ciclo claro-escuro, com acesso ad libitum à ração e água. Os protocolos de tratamentos realizados neste trabalho foram submetidos à Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade de Franca.
5. DESENVOLVIMENTO
5.1 Teste do micronúcleo em sangue periférico.
Os animais foram divididos em 6 grupos de tratamento, sendo que cada grupo foi composto de 5 animais. Foram ainda incluídos os grupos controle negativo (água) e controle positivo (DXR, 10 mg/kg p.c., injeção intraperitoneal 10 mL/kg p.c.).
Os diferentes tratamentos foram administrados aos animais por via oral, gavage (10 mL/kg p.c.) por dois dias consecutivos. Para obtenção dos eritrócitos em sangue periférico foi utilizada a técnica de MacGregor e colaboradores (1980). No terceiro dia, o sangue foi coletado de um pequeno corte feito na ponta da cauda do
5
animal, de forma a ser gotejado em lâminas limpas e secas, sendo realizado em seguida um esfregaço. O material foi seco à temperatura ambiente e fixado em metanol absoluto por 10 minutos. Após ter sido aguardado um período para secagem, as lâminas foram coradas com solução de Giemsa (Giemsa/tampão fosfato pH 7,0, na proporção 1:10) durante 20 minutos.
A fim de se verificar as frequências de eritrócitos imaturos micronucleados (EIM-MN), foram analisados em microscópio de campo claro 5000 eritrócitos imaturos (EIM) por animal. A citotoxicidade dos tratamentos também foi avaliada a partir da razão de EIM sobre o total de eritrócitos (EIM/(EIM+EM [eritrócitos maduros])), onde foram analisados 2000 eritrócitos por animal (OECD 474, 2016). As mesmas lâminas empregadas no teste do micronúcleo foram utilizadas para avaliação da citotoxicidade.
Ao fim dos ensaios os animais foram eutanasiados com tiopental sódico (0,83 g/kg pc) para o descarte. Os animais foram congelados até o descarte apropriado pelo setor responsável da Universidade de Franca.
5.2 Análise Estatística
Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente por análise de variância (ANOVA) para experimentos randomizados, com cálculo estatístico F e respectivo valor p. Nos casos em que p < 0,05 os tratamentos foram comparados
pelo método de Tukey e a diferença mínima significante será calculada para α =
0,05.
6. RESULTADOS
Na figura 2 estão expressos os resultados da frequência de EIM-MN (a) e a razão de EIM pelo total de eritrócitos (b) do tratamento com goiaba e/ou DXR e seus respectivos controles. Os resultados mostram que não houve diferença estatisticamente significativa na frequência de MN em células de sangue periférico entre o grupo controle negativo e o grupo tratado com goiaba na dose de 2,5 mg/kg isolada, o que demonstra a ausência de efeito mutagênico. O grupo controle positivo (DXR) apresentou diferença estatisticamente significativa do grupo controle negativo, como esperado, por outro lado a administração da goiaba na dose de 0,625 mg/kg concomitante com DXR reduziu de forma estatisticamente significativa
a frequência de EIM-MN, revelando atividade antigenotóxica do fruto da goiabeira. A ausência de citotoxicidade foi observada pela razão de EIM pelo total de eritrócitos, uma vez que os diferentes grupos de tratamento não apresentaram diferença estatística em relação ao controle negativo.
F r e q u e n c ia d e E IM -M N CN Go iab a 2 ,5 CP DX R + G oia ba 0,6 25 DX R + Go iab a 1 ,25 DX R + G oia ba 2,5 0 5 0 1 0 0 1 5 0 * a R a z ã o E IM / T o ta l d e e r it r ó c it o s CN Go iab a 2 ,5 CP DX R + Go iab a 0 ,62 5 DX R + Go iab a 1 ,25 DX R + G oia ba 2,5 0 .0 0 0 .0 2 0 .0 4 0 .0 6 b
Figura 2 – Frequências de EIM-MN (a) e razão EIM/ total de eritrócitos (b) obtidos
em sangue periférico de camundongos Swiss tratados com as diferentes doses de
Goiaba associadas ou/não a doxorrubicina (DXR), e seus respectivos controles.
EIM-MN – eritrócitos imaturos micronucleados; Goiaba 0,625, 1,25 e 2,5 – goiaba liofilizada nas doses de 0,625, 1,25 e 2,5 mg/kg; Controle Negativo – água filtrada; Controle Positivo – cloridrato de doxorrubicina (DXR, 10 mg/kg); *Significantemente diferente do controle positivo
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) 9 (nove) milhões de pessoas desenvolvem algum tipo de câncer ao ano, causando a morte de cerca de 5 (cinco) milhões, de modo a ser considerada atualmente a segunda maior causa de morte na maior parte dos países, incluindo o Brasil (CUPPARI, 2005). Os hábitos alimentares estão relacionados a uma suposta ação preventiva ou desencadeadora de tumores (LESER E SOARES, 2001) e como visto em pesquisas realizadas pela The Life Extension Foundation, foi mostrado grandes benefícios da terapia nutricional no tratamento oncológico, diminuindo adversos efeitos produzidos pelo tratamento antineoplásico e promovendo melhora no estado de saúde do paciente (SANTOS E CRUZ, 2001), fazendo-se necessário estudos relacionados a alimentos com efeitos antitumorais.
7
A goiaba é um fruto muito consumido no país, devido a boa adaptação da goiabeira ao clima tropical e ao seu fácil acesso e bom preço ( MARQUES; PRADO; FREIRE, 2009). Além de apresentar vitaminas A e C, também é encontrada uma grande quantidade de bioativos, como os flavonoides, polifenóis e antocianinas, que são compostos com atividade antioxidante comprovada (DEMBITSKY et al., 2011). A coloração rosada deste fruto é devido à grande quantidade de carotenoides, na qual 80% é representado pelo licopeno, um importante composto com ação preventiva em relação a alguns tipos de câncer (PRATTI et al., 2009; FERNANDES et al., 2007). Devido a todas as qualidades nutricionais encontradas na goiaba e ao seu alto consumo, fez com que ela merecesse uma maior atenção em seu consumo
in natura, como também na possibilidade do desenvolvimento de novos produtos a
partir de estudos que comprovem seus afeitos positivos (DURIGAN et al., 2009; MORGADO et al., 2010).
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O ensaio de micronúcleo é utilizado para comprovação do potencial mutagênico e de genotoxicidade em testes in vivo. No presente estudo foram realizados ensaios do teste do micronúcleo em células de sangue periférico, que já é parâmetro bem definido através de protocolos experimentais (HAYASHI, 1991). A goiaba mostrou ser capaz de diminuir significativamente estatistic amente a instabilidade genômica causada pela doxorrubicina. Neste contexto, é possível afirmar que o fruto de Psidium guajava apresentou neste trabalho uma ação quimiopreventiva. Além disso, não foram observados efeitos citotóxicos associados ao consumo de goiaba.
8. FONTES CONSULTADAS
Abreu, P.R., Almeida, M.C., Bernardo, R.M., Bernardo, L.C., Brito, L.C., Garcia, E.A., et al., 2006. Guava extract (Psidium guajava) alters the labelling of blood constituents with technetium-99m. Journal of Science 7, 429–435.
Bartolome, A., Mandap, K., David, K.J., Sevilla, F., Villanueva, J., 2006. SOS -red fluorescent protein (RFP) bioassay system for monitoring of antigenotoxic activity in plant extracts. Biosensors and Bioelectronics 21, 2114–2120.
Bazo, A. P., Rodrigues, M. A. M., Sforcin, J. M., Camargo, J. L. V., Ribeiro, L. R., and Salvadori, D. M. F., 2002. Protective action of propolis on the rat colon carcinogenesis. Teratog Carcinog Mutagen 22, 183–194.
Bird, R. P., 1987. Observation and qualification of aberrant crypts in the murine colon treated with a colon carcinogen: preliminary findings. Cancer Lett 37, 147–151.
Coutino, R.R., Herñandez, C.P., Giles, R.H., 2001. Lectins in fruits having gas - ´ trointestinal activity: their participation in the hemagglutinating property of Escherichia coli O157:H7. Archives of Medical Research 32, 251–257.
Da Silva APR, Noronha CP, Silva JLO, Ferreira JMO, Oliveira JFP, Santos MO, Rebelo MS, Reis RS, Da Silva SRV, 2011. Estimativa/2012 Incidência de Câncer no Brasil. Ministério da Saúde. Instituto Nacional do Câncer José de Alencar Gomes da Silva (INCA).
Gao, J., Chen, J., Tang, X., Pan, L., Xu, L., Zhao, L., Xu, Q., 2006. Mechanism underlying mitochondrial protection of asiatic acid against hepatotoxicity in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology 58, 227–233.
Heinrich, M., Ankli, A., Frei, B., Weimann, C., Sticher, O., 1998. Medicinal plants in Mexico: healers consensus and cultural importance. Social Science and Medicine 47, 1859–1871.
Holetz, F.B., Pessini, G.L., Sanches, N.R., Cortez, D.A., Nakamura, C.V., Filho, B.P., 2002. Screening of some plants used in the Brazilian folk medicine for the treatment of infectious diseases. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz ´ 97, 1027–1031.
Hsieh, C.L., Lin, Y.C., Ko, W.S., Peng, C.H., Huang, C.N., Peng, R.Y., 2005. Inhibitory effect of some selected nutraceutic herbs on LDL glycation induced by glucose and glyoxal. Journal of Ethnopharmacology 102, 357–363.
Lara, O.F., Marquez, A.C., 1996. Plantas Medicinales de Mexico. Composicion. Usos y Actividad Biologica. UNAM, México, D.F, pp. 137–139.
9
Leveque D, Jehl F. Molecular pharmacokinetics of Catharanthus (vinca) alkaloids.
Journal of Clinical Pharmacoly, 2007, 47: 579-588.
Macgregor JT, Wehr CM, Gould DH., 1980. Clastogen-induced micronuclei in peripheral blood erythrocytes: the basis of an improved micronucleus test.
Environmental Mutagenesis 509-514.
Medina, M.L., Pagano, F.G., 2003. Characterization of Psidium guajava pulp “criolla roja”. Revista de la Facultad de Agronom´ıa de La Universidad del Zulia, (LUZ) 20, 72–76.
Mukhtar, H.M., Ansari, S.H., Ali, M., Naved, T., Bhat, Z.A., 2004. Effect of water extract of Psidium guajava on alloxan-induced diabetic rats. Pharmazie 59, 734–735. Mukhtar, H.M., Ansari, S.H., Bhat, Z.A., Naved, T., Singh, P., 2006. Antidiabetic activity of an ethanol extract obtained from the stem bark of Psidium guajava (Myrtaceae). Pharmazie 61, 725–727.
Muruganandan, S., Srinivasan, K., Tandan, S.K., Jawahar, L., Suresh, C., Raviprakash, V., 2001. Anti-inflammatory and analgesic activities of some medicinal plants. Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences 22/23, 4A/1A, 56–58.
OECD. 2016. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. No. 474: Mammalian
Erythrocyte Micronucleus Test.
Ojan, H., Nihorimbere, V., 2004. Antioxidant power of phytochemicals from Psidium guajava. Journal of Zhejiang University of Science 5, 676–683.
Ojewole, J.A., 2006. Antiinflamatory and analgesic effects of Psidium guajava Linn (Myrtaceae) leaf aqueous extract in rats and mice. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 28, 441–446.
Prabu, G.R., Gnanamani, A., Sadulla, S., 2006. Guaijaverin a plant flavonoid as potential antiplaque agent against Streptococcus mutans. Journal of Applied Microbiology 101, 487–495.
Rios, C.D., Salazar, C.R., Cardona, C., Victoria, K., Torres M., 1977. Guayaba. En: Instituto Colombiano Agropecuario. Bogota (Colombia), second ed. ´ Frutales. Manual de Asistencia Tecnica No. 4., pp. 221–248.
ROEDER, E. Medicinal plants in China containing pyrrolizidine alkaloids. Pharmazle, v. 55, p. 711-726, 2000
Roy, C.K., Kamath, J.V., Asad, M., 2006. Hepatoprotective activity of Psidium
guajava Linn. Indian Journal of Experimental Biology 44, 305–311.
Seo, N., Ito, T., Wang, N., Yao, X., Tokura, Y., Furukawa, F., Takigawa, M., Kinataka, S., 2005. Anti-allergic Psidium guajava extracts exert an antitumor effect inhibition of T regulatory cells and resultant augmentation of Th1 cells. Anticancer Research 25, 3763–3770.
Stone, B., 1970. The flora of Guam. Micronesica 6, 454–455.
Takahashi, S., Hasegawa, R., Masui, T., Mizoguchi, M., Fukushima, S., and Ito, N., 1992. Establishment of multiorgan carcinogenesis bioassay using rats treated with a combination of five different carcinogens. Toxicol Pathol 5, 151–156.
Tona, L., Kambu, K., Mesia, K., Cimanga, K., Apers, S., de Bruyne, T., Pieters, L., Totte, J., Vlietinck, A.J., 1999. Biological screening of traditional preparations from some medicinal plants used as antidiarrhoeal in Kinshasa, Congo. Phytomedicine 6, 59–66.
Zhou S, Hoh HL, Gao Y. Herbal, 2004. Bioactivation: The good, the bad and the ugly.
