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TÍTULO: UTILIZAÇÃO DE SIMULADORES DE ESPECTROS DE RMN COMO AUXILIARES NA ELUCIDAÇÃO DE SINAIS DE RMN DE HIDROGÊNIO DE ALTA COMPLEXIDADE, VISANDO ESCLARECER A MULTIPLICIDADE E DETERMINAR OS VALORES DE CONSTANTES DE ACOPLAMENTO ENVOLVIDAS
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
ÁREA:
SUBÁREA: QUÍMICA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): ALEX RAFAEL PEDROSO DE ANDRADE
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): VLADIMIR CONSTANTINO GOMES HELENO
ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): ALEXSANDRO EURIPEDES FERREIRA, ANA CAROLINA FERREIRA SOARES
1. RESUMO
Neste trabalho está sendo apresentado o estudo sobre utilização de simuladores de espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de hidrogênio. São eles os programas FOMSC3 e SimEsp_NMR. Serão aplicados para proporcionar a completa atribuição do espectro de RMN de ¹H do éster metílico de ácido caurenóico (2), obtido por reação de esterificação do ácido caurenóico (1). O ácido caurenóico é um produto natural isolado a partir das folhas de Mikania glomerata (guaco), por métodos cromatográficos. A simulação de espectros se torna particularmente importante quando temos sinais de RMN que estão com muitos acoplamentos que não aparecem, por resolução ou por sobreposição. A medida das constantes é feita, então, em outros sinais e os valores são colocados na simulação para verificação. Para substâncias de importância biológica elevada, como estes diterpenos citados, é muito importante que se chegue a uma atribuição completa de dados de RMN, pois esta pode auxiliar na elucidação de vários outros análogos de importância em uma série de outros trabalhos.
2. INTRODUÇÃO
2.1. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
A ressonância magnética nuclear (RMN) pode ser classificada como uma importante ferramenta na elucidação estrutural de produtos naturais (PN) e de substâncias orgânicas sintéticas. Esta técnica proporciona a obtenção de um amplo conjunto de informações que permitem caracterizar rigorosamente a estrutura de compostos orgânicos (HELENO et al., 2008). Nos últimos anos, o acesso a uma instrumentação mais moderna e ao conjunto de técnicas tais como a RMN bidimensional (2D), disponibilizadas pela implementação de novas sequências de pulsos, levou a obtenção de uma gama ainda maior de informações sobre a estrutura. O desenvolvimento de novas sondas mais sensíveis e equipamentos com campos magnéticos mais intensos, faz com que menores quantidades de substância sejam suficientes para as análises. Tudo isso tem contribuído para que a RMN se destaque como uma das ferramentas analíticas mais importantes da química moderna (ELYASHBERG, 2015).
Algumas substâncias foram isoladas em épocas nas quais as técnicas espectrométricas estavam em fase de pouco desenvolvimento levando à publicação de dados ambíguos, imprecisos, incompletos ou até mesmo errôneos na literatura. Com isso, é comum a publicação de artigos na literatura contendo revisões de atribuições estruturais, com novos dados de RMN, não apenas de ¹H, mas de ¹³C como informações complementares e, às vezes, essenciais. Além disso, é frequente encontrar dados de RMN de ¹H apresentadas simplesmente como multipletos (m) devido ao não esclarecimento da multiplicidade, devido à dificuldade em medir os valores das constantes de acomplamento (J) envolvidas (HELENO et al., 2005). Desta forma, a elucidação de estruturas, por exemplo, de PN pode ser classificada como uma área que ainda precisa de certa dedicação nas correções e nas atribuições inequívocas de dados de RMN. Não é mais aceitável que os dados estruturais sejam confirmados apenas após a análise de raios X , que exige a cristalização do composto (VICHNEWSKI et al., 1976).
Esta necessidade tem estimulado o desenvolvimento de várias técnicas de RMN e hoje nos coloca à disposição algumas técnicas com medidas mais confiáveis e precisas, que podem ser aplicadas a uma quantidade bem menor de amostra com a vantagem ainda de não ser um método destrutivo (NICOLAOUT e SNYDER, 2005; RODRIGUES, 2010).
2.2. DITERPENOS
Os diterpenóides possuem uma vasta gama de atividades ecológicas e biológicas. Atividades biológicas como antimicrobiana, antiparasitária, citotóxica com relativa seletividade para células cancerígenas, atividade anti-HIV, hipotensora, antiinflamatória, entre outras (GHISALBERTI, 1997). Visto que a classe dos diterpenos apresenta atividades biológicas relevantes e variadas, estas estruturas podem ser consideradas importantes em vários trabalhos. Com isso, torna-se importante um trabalho de elucidação completa de dados de RMN destes compostos. A maior dificuldade com estas substâncias é a grande sobreposição de sinais de seus
grupos CH2, quando temos moléculas pouco funcionalizadas. Além disso, é comum
encontrar na literatura o reisolamento de substâncias desta classe sem o total esclarecimento de seus dados. Estes são apenas comparados com os poucos dados
existentes na literatura (NASCIMENTO e OLIVEIRA, 2001; SILVA, 2012). Isso ressalta a necessidade de estudos estruturais detalhados a partir de dados de RMN.
3. OBJETIVOS
O trabalho tem como objetivo estudo da utilização de simuladores de espectros de RMN de ¹H, para a atribuição completa de dados de sinais sobrepostos e complexos dos espectros experimentais do éster metílico do ácido caurenóico, produzido em laboratório como derivado do ácido caurenóico, este isolado por métodos cromatográficos a partir das folhas de M. glomerata.
4. METODOLOGIA
4.1. OBTENÇÃO DO ÉSTER METÍLICO DO ÁCIDO CAURENÓICO
Foi planejado o isolamento de ácido caurenóico a partir do extrato diclorometânico de Mikania glomerata por métodos cromatográficos, conforme descrito anteriormente (ANDRADE et al., 2011). Em seguida, o seu éster metílico, substância alvo do trabalho, seria preparado a partir de uma reação de esterificação.
4.2. OBTENÇÃO DOS ESPECTROS DE RMN
Para a identificação do material de partida isolado e obtenção do material de estudo, utilizou-se de técnicas de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de ¹H), realizada no Departamento de Química da USP de Ribeirão Preto, com a frequência do espectrômetro em 400 MHz.
4.3. UTILIZAÇÃO DOS PROGRAMAS DE SIMULAÇÃO PARA ELUCIDAÇÃO
Para o esclarecimento de multiplicidade e determinação dos valores das constantes de acoplamento envolvidas nos sinais estudados foram aplicadas as simulações feitas através de dois programas diferentes, disponíveis gratuitamente: o programa FOMSC3, para sinais de primeira ordem e o SimEsp_NMR para os sinais de segunda ordem.
5. DESENVOLVIMENTO
5.1. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DO ÁCIDO CAURENÓICO
Para a obtenção do extrato bruto de M. glomerata, 515 g das folhas trituradas da planta, adquirido da empresa Nutri Comércio de Ervas (localizada na
cidade de São Paulo – Lote 11N – colheita: 01/05/2014), foram submetidas ao
ultrassom, dentro de béqueres contendo o solvente Acetato de Etila, durante 20 minutos, filtrando-se logo após o tempo. Esse procedimento foi repetido por mais duas vezes.
Em seguida, removeu-se o solvente através de um evaporador rotativo à pressão reduzida, obtendo-se 11,8 g de extrato bruto. Para a suspensão do extrato,
misturou-se o extrato bruto em uma solução de MeOH/H2O na proporção de 9:1 (v/v),
300 mL filtrando-a em papel de filtro. A fração filtrada, solúvel em MeOH/H2O, é
misturada com Hexano (5 x 200 mL) em um funil de decantação, agitada e em seguida, aguardou a separação completa das duas fases: orgânica (em Hexano) e
aquosa (em MeOH/H2O). A fração orgânica foi concentrada, obtendo-se ao final da
suspensão, 1,47 g de amostra contendo KA. A amostra foi purificada por cromatografia em coluna clássica com fase móvel Hex/AcOEt/DCM 7:2:1 (v/v).
5.2. PREPARAÇÃO DO ÉSTER METÍLICO DO ÁCIDO CAURENÓICO
Para a esterificação, em um balão de 15 mL, adiciona-se 02 mL de acetona anidra e em seguida, adiciona-se 32 mg de hidróxido de potássio em pó à solução sob agitação constante, e manteve o sistema sem aquecimento durante cinco minutos. Após o término do tempo de agitação, adicionou-se 50 mg do material de partida seguido do brometo de metila, deixando o sistema em agitação, acompanhando a reação através de CCDC, até verificar a formação completa do produto. Ao final da reação obteve-se 23 mg de éster metílico do ácido caurenóico (EM-KA) com 44% de rendimento, que foi enviado para análise de RMN de ¹H para o estudo.
COOH COOMe
Acetona CH3Br , KOH
2h
Ácido Caurenóico (1) Éster Metílico do Ácido Caurenóico (2) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 20 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1 2 3 4 5 6 7 8 9 20 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21
Figura 1 – Reação de – Reação de esterificação, com adição de um grupo metil,
com o ácido caurenóico.
5.2. ESTUDO DE RMN DO ÉSTER METÍLICO DO ÁCIDO CAURENÓICO
O trabalho foi desenvolvido em parceria com os alunos de pós-graduação Alexsandro E. Ferreira e Ana Carolina F. Soares, em busca de um estudo detalhado do espectro de RMN de ¹H do éster metílico do ácido caurenóico (2). Como ferramentas, utilizou-se os softwares FOMSC3 e SimEsp_NMR para simular os valores das constantes de acoplamento (J) propostos para alguns dos sinais.
O programa FOMSC3 é capaz de simular sinais considerando apenas os valores de J e deslocamento químico (δ), no entanto, não considera as interferências e distorções causadas por sinais próximos de hidrogênios acoplados. Este programa calcula apenas sinais de primeira ordem. O SimEsp_NMR, por sua vez, considera todas as distorções, pois foi elaborado para calcular espectros com sinais de segunda ordem.
Para o presente trabalho, foram analisadas duas diferentes regiões do espectro de RMN de ¹H de 2, numa das quais existe severa sobreposição de sinais. O intuito é obter os dados completos para ambas as regiões de sinais.
6. RESULTADOS
Para o alvo do estudo, selecionaram-se duas regiões do espectro de RMN de ¹H de 2: uma que diz respeito ao sinal do hidrogênio da posição 3 (figura 2); outra onde se encontram os dois hidrogênios do carbono 15 (Figura 4).
Como o hidrogênio H3 encontra-se isolado no espectro, não existem acoplamentos de segunda ordem na região, caso onde o software FOMSC3 (First Order Multiplet Simulator/Checker) atua muito bem, fornecendo valiosas informações sobre o sinal. Uma simulação ideal da região, com precisão e rapidez, pode ser obtida, uma vez que o programa exige apenas os dados daquele sinal, como os seus valores de J e de deslocamento químico. Neste caso, utiliza-se valores de deslocamento químico medidos no espectro experimental e valores de constantes de acoplamento envolvidas. Normalmente estes valores são obtidos medindo o J nos demais sinais, uma vez que a complexidade deste não permite chegar a estas medidas. Neste ponto, faz-se a simulação com esses valores e a concordância dos deslocamentos de cada pico simulado com o experimental atesta a veracidade dos dados.
Figura 2 – Sinal do hidrogênio H3a no espectro de RMN de ¹H de 2.
SpinW orks 2.5: Hz 882.0 880.0 878.0 876.0 874.0 872.0 870.0 868.0 866.0 864.0 862.0 860.0 858.0 856.0 854.0 879.1 84 877.5 20 875.3 83 873.0 71 871.2 07 865.8 79 863.0 12 861.5 59 859.7 60 857.9 23
file: C:\Users\Alex\Desktop\Trabalho Elucidação do KA\EM-KA em Clorofórmio-d (2D)\¹H\fid expt: <zg> transmitter freq.: 400.210225 MHz
time domain size: 65536 points width: 4401.41 Hz = 10.997741 ppm = 0.067160 Hz/pt number of scans: 16
freq. of 0 ppm: 400.208434 MHz processed size: 32768 complex points LB: 0.000 GB: 0.0000
Figura 3 – Simulado em FOMSC3 para o hidrogênio H3a.
Nota-se que um sinal de RMN de alta complexidade pode ter sua multiplicidade elucidada e suas medidas de J determinadas por este recurso.
Como o FOMSC3 considera simulações de acoplamentos de primeira ordem, em regiões como a da figura 4, seu resultado se tornaria impreciso, como mostra a figura 5. Isto ocorre porque este programa não considera distorções do sinal como os de espectros de segunda ordem. Para sistemas como esse, a utilização do SimEsp_NMR é mais adequada. Nota-se que como os sinais dos hidrogênios da posição 15 estão muito próximos em deslocamento químico e acoplam entre si, isto leva a um sinal de segunda ordem. Desta forma, a simulação pelo FOMSC3 não gera o sinal correto, como pode ser verificado na figura 5.
J1 = 13,5 Hz J2 = 3,9 Hz J3 = 2,9 Hz J4 = 1,7 Hz 8 7 9 ,4 8 7 7 ,7 8 7 5 ,2 8 7 2 ,8 8 7 1 ,1 8 6 5 ,9 8 6 4 ,2 8 6 1 ,8 8 5 9 ,3 8 5 7 ,6
Resolution = 0,1 Hz Width at half height = 1,4 Hz 44% Gaussian + 56% Lorentzian First Order Multiplet Simulator / Checker - LSO
3a
Simulado em FOMSC3
Figura 4 – Sinais dos hidrogênios H15 no espectro de RMN de ¹H de 2.
Figura 5 – Simulado em FOMSC3 para os hidrogênios H15 de 2.
A simulação destes sinais de segunda ordem feitos pelo SimEsp_NMR é realmente muito mais adequada. Nota-se, ao avaliar a figura 6, que uma semelhança muito maior com o espectro experimental foi obtida. A semelhança entre os valores de deslocamento de cada pico individualmente entre experimental e simulado atesta o verdadeiro valor deste simulador de espectros de segunda ordem.
SpinW orks 2.5:
Hz 844.0 840.0 836.0 832.0 828.0 824.0 820.0 816.0 812.0 808.0 804.0 800.0
842.095 840.291 838.249 837.460 823.418 821.338 820.034 817.422 814.820 803.257 800.643 798.072
file: C:\Users\Alex\Desktop\Trabalho Elucidação do KA\EM-KA em Clorofórmio-d (2D)\¹H\fid expt: <zg> transmitter freq.: 400.210225 MHz
time domain size: 65536 points width: 4401.41 Hz = 10.997741 ppm = 0.067160 Hz/pt number of scans: 16
freq. of 0 ppm: 400.208434 MHz processed size: 32768 complex points LB: 0.000 GB: 0.0000 J1 = 16,8 Hz J2 = 2,2 Hz J3 = 2,2 Hz J4 = 1,8 Hz J1 = 16,8 Hz J2 = 2,6 Hz J3 = 2,6 Hz 8 4 2 ,4 8 4 0 ,4 8 3 8 ,4 8 3 6 ,4 8 2 5 ,6 8 2 3 ,5 8 2 1 ,5 8 2 0 ,0 81 7 ,5 8 1 4 ,9 8 0 3 ,2 8 0 0 ,7 7 9 8 ,0
Resolution = 0,1 Hz Width at half height = 1,5 Hz 50% Gaussian + 50% Lorentzian First Order Multiplet Simulator / Checker - LSO 15b
15a
Simulado em FOMSC3 Sim ulated Spectrum (1234)
Figura 6 – Simulado em SimESP para os hidrogênios H15 de 2.
.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Em suma, os simuladores são excelentes ferramentas para auxiliar na elucidação estrutural de compostos orgânicos com base no espectro de RMN de ¹H, pois permitem verificar se os valores de J propostos com base em observações no modelo teórico e análises no próprio espectro estão coerentes. Em regiões em que temos acoplamentos de primeira ordem, o FOMSC3 é uma ferramenta eficiente e rápida, pois não exige do analista o conhecimento detalhado de todos os sinais que acoplam com o que está simulando, porém sua capacidade é limitada quando simulado regiões onde há acoplamentos de segunda ordem. O SimEsp_NMR, por sua vez, é uma ferramenta precisa para tais sistemas, porém necessita de conhecimentos mais amplos para a simulação de um único sinal, levando em consideração todos os detalhes das possíveis distorções.
Assim, tem-se que a utilização das duas ferramentas em conjunto é de grande auxilio para elucidação de estruturas orgânicas com base nos espectros de RMN de ¹H. 8 4 2 ,4 8 4 0 ,3 8 3 8 ,8 8 3 6 ,6 8 2 5 ,6 8 2 3 ,5 8 2 2 8 2 0 ,2 8 1 7 ,8 8 1 5 ,2 8 0 3 ,5 800 ,9 7 9 8 ,4 H1 H2 H3 H4 H5
Espe ctr o Sim ula do Curv a Combinada: 50% Lorentziana + 50% GaussianaS imEsp_NMR (LS O - FFCLRP - USP)
(H1) = 827,16 (H2) = 813,3 (H3) = 1916 (H4) = 1897 (H5) = 452
Freqüênc ia: 400 MHz Largura a meia altura: 1,3 H z Intensidade mí nima: 0,00001 Tí tulo: H 17b X(H)= 2 3 4 5 J(1,X)= J(2,X)= J(3,X)= J(4,X)= +16,80 +2,20 +2,20 +1,70 +2,60 +2,60 0,00 +1,50 0,00 0,00
8. FONTES CONSULTADAS
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anticariogenic activity. Natural Product Communications 2011; 6:777-780.
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VICHNEWSKI, W. et al. 15-Deoxygoyazensolide, a new heliangolide from
