Repercussões metabólicas em doenças hepáticas crônicas

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E FISIOLOGIA

Repercussões Metabólicas em Doenças

Hepáticas Crônicas

CAÍQUE SILVEIRA MARTINS DA FONSECA

Repercussões Metabólicas em Doenças

Hepáticas Crônicas

Tese apresentada como cumprimento parcial das exigências para obtenção do título de Doutor em Bioquímica e Fisiologia pela Universidade Federal de Pernambuco.

Orientadora: Profa. Dra. Vera Lúcia de Menezes Lima

Co-orientador: Prof. Dr. David Y. Hui

Catalogação na Fonte:

Bibliotecário Bruno Márcio Gouveia, CRB-4/1788

Fonseca, Caíque Silveira Martins da

Repercussões metabólicas em doenças hepáticas crônicas / Caíque Silveira Martins da Fonseca. – Recife: O Autor, 2015.

101 f.: il.

Orientadores: Vera Lúcia de Menezes Lima; David Y. Hui

Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Pós-graduação em Bioquímica e Fisiologia, 2015.

Inclui referências e apêndices

1. Fígado – Doenças 2. Esquistossomose 3. Obesidade I. Lima, Vera Lúcia de Menezes (orient.) II. Hui, Davi Y. (coorient.) III. Título.

Repercussões Metabólicas em Doenças Hepáticas

Crônicas

Banca Examinadora de Defesa de Tese:

APROVADO

Profa. Dra. Vera Lúcia de Menezes Lima (Presidente)

Profa. Dra. Bianka Santana dos Santos (Membro Externo)

Prof. Dr. Edmundo Pessoa Lopes (Membro Externo)

Profa. Dra. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho (Membro Interno)

Prof. Dr. Tiago Ferreira da Silva Araújo (Membro Externo)

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela oportunidade que me dá, em todas as suas infinitas formas, a cada instante da minha vida.

Aos voluntários, sem os quais nada seria possível. Causas e consequências deste trabalho.

Aos meus pais, Marcelo e Susana, por tudo. Por me ensinarem o verdadeiro valor da vida.

Aos meus irmãos Gastão Neto e Ana Júlia, por todo o amor, carinho e atenção.

À Profa. Dra. Vera Lúcia de Menezes Lima, pela confiança, pela oportunidade e pelos ensinamentos que construíram e ainda constroem a minha formação acadêmica e pessoal. Nunca me esquecerei de nenhum deles.

Ao Prof. David Hui, pela confiança, pelos ensinamentos, por renovar minha esperança na existência de uma ciência forte e ainda assim simples, por me abrir as portas para um novo mundo de possibilidades.

À Profa. Dra. Bianka Santana dos Santos, que primeiro me acolheu e me ensina tanto. Pelo exemplo de tão inspirada dedicação no trabalho competente e humano, comigo e com todos. A quem eu devo minha eterna gratidão.

Ao mestre e companheiro de jornada na pesquisa da esquistossomose, Dr. Adenor Almeida Pimenta Filho, muito obrigado por me ajudar a “colocar o pé no chão” e a enxergar a realidade dura dos pacientes.

Aos amigos irmãos do Laboratório de Lipídeos, Tiago Ferreira, Janaína Campos, Thaíse Brito, Tiago Gomes, Luciana Veloso, Ana Thereza, Luiz Arthur, Ilton Palmeira, Weber Melo e Pâmella Vital. O companheirismo que aprendi com vocês é muito maior do que qualquer um poderia esperar. Construí uma família no trabalho.

Aos meus colegas da University of Cincinnati, Patti Cox, Josh Basford, James Cash, David Kuhel, Colleen Goodin, Allyson Hamlin, Eddy Konanniah, Patrick Roe, Yan Ma, Meaghan Waltmann, exemplo de trabalho em equipe e companheirismo.

Aos meus amigos de todos os momentos, Mônica, Tairine, Priscila, Márcio, Marquinhos, Albérico, Shirley, Pedro, Renata, Ariane, Gabrielly, João e Alexsandra. Suas Palavras sempre me confortaram e me equilibraram para continuar na caminhada. Todos já fazem parte de mim.

A Djalma, João e Miron, cuja dedicação foi fundamental.

À Profa. Dra Ana Lúcia Coutinho Domingues e ao Prof. Dr. Edmundo Pessoa Lopes, pela colaboração fundamental e imprescindível nesta jornada.

A CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FACEPE (Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco), pela confiança nos nossos projetos.

Já se disse que as grandes ideias vêm ao mundo mansamente, como pombas. Talvez, então, se ouvirmos com atenção, escutaremos, em meio ao estrépito de impérios e nações, um discreto bater de asas, o suave acordar da vida e da esperança. Alguns dirão que tal esperança jaz numa nação; outros, num homem. Eu creio, ao contrário, que ela é despertada, revivificada, alimentada por milhões de indivíduos solitários, cujos atos e trabalho, diariamente, negam as fronteiras e as implicações mais cruas da história. Como resultado, brilha por um breve momento a verdade, sempre ameaçada, de que cada e todo homem, sobre a base de seus próprios sofrimentos e alegrias, constrói para todos.

RESUMO

O fígado é o centro executor metabólico mais importante do organismo, e, por esta razão, é alvo de uma miríade de agentes tóxicos, infecciosos ou não. Com isso, tanto distúrbios metabólicos externos ao órgão têm potencial para afetar o funcionamento do fígado, quanto injúria hepática pode afetar o metabolismo geral do organismo. Entretanto a forma como acontece esta interação de duas vias entre fígado é o resto do organismo não está clara sob diversos aspectos. A esquistossomose mansônica é uma doença infecto-parasitária crônica cujos efeitos mais graves têm gênese na injúria hepática, principalmente na fase hepatoesplênica. No entanto, sabe-se muito pouco sobre suas repercussões metabólicas. Do outro lado deste cenário, diversos distúrbios metabólicos crônicos, em boa parte relacionados ao equilíbrio energético do organismo, contribuem para o surgimento de doença hepática, das quais a mais prevalente é a Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar as repercussões metabólicas dos distúrbios hepáticos causados por esquistossomose mansônica hepatoesplênica e pela doença hepática gordurosa não alcoólica. Para tanto, duas linhas de ação foram utilizadas. A primeira baseou-se na investigação da influência do polimorfismo da apolipoproteína E sobre o metabolismo lipídico/ lipoproteico e pela investigação da resistência à insulina e sua relação com os distúrbios nos lipídios plasmáticos de sujeitos com esquistossomose hepatoesplênica. Pacientes tiveram os genótipos da apolipoproteína E identificados e lipídios plasmáticos medidos. Foi observado que o referido polimorfismo poderia influenciar no metabolismo lipídico e que as modificações causadas pelos alelos ε2 e ε4 são contundentes, porém suprimidas na avaliação geral da população devido à alta frequência do alelo ε3. Outro coorte de pacientes com esquistossomose mansônica hepatoesplênica teve insulina, glicose e lipídeos plasmáticos quantificados e o resultados demonstraram que, nestes sujeitos, há evidente desregulação na ação da insulina, pela hiperinsulinemia observada. Interessantemente, distúrbios no metabolismo geralmente associados com o quadro de resistência à insulina não foram observados. A segunda linha de ação utilizou diferentes dietas hiperlipídicas, ricas em ácidos graxos, colesterol e/ou sacarose, em camundongos para investigar a interação entre obesidade, resistência à insulina e inflamação, e o desenvolvimento e progressão da doença hepática gordurosa não alcoólica. Foram utilizadas medições antropométricas, quantificação de lipídeos, glicose e insulina plasmáticos, teste de tolerância à glicose, histologia de fígado e tecido adiposo e análise da expressão de diversos genes relacionados à inflamação e metabolismo de fígado e tecido adiposo de forma a obter um panorama das interações metabólicas e da maneira como os diferentes compostos poderiam influenciar nestes processos. Foi observado que a dieta rica em ácidos graxos causou maior desregulação do tecido adiposo e resistência à insulina, enquanto que a dieta rica em sacarose induziu maior inflamação hepática e a dieta rica em colesterol provocou fibrose no fígado, mas sem o mesmo grau de inflamação. Nas diferentes abordagens foi possível observar que o comprometimento do funcionamento hepático esteve relacionado com a desregulação do metabolismo energético, pela observação de modificações no metabolismo lipídico e resistência à insulina. No caso específico do estudo com modelo animal, foi possível observar, adicionalmente, que efeitos específicos podem ser gerados em decorrência da utilização de moléculas diferentes.

Palavras-chave: Esquistossomose mansônica hepatoesplênica. Doença hepática

ABSTRACT

Liver is the most important metabolic executor center of the body, and, therefore, is the target of a myriad of toxic agents, infectious or not. In this scenario, the metabolic disorders outside of this organ have the potential to affect liver function. Similarly, but through the other way, liver injury can affect general metabolism of the organism. However, it is not clear in many aspects how this two-way interaction between liver is the rest of the body happens. Schistosomiasis mansoni is an infectious parasitic disease whose most serious chronic effects are generated by liver injury, especially in the hepatosplenic phase. Nevertheless, we know very little about its metabolic consequences. On the other side of this scenario, several chronic metabolic disorders, largely related to the energy balance of the body, contribute to the emergence of liver disease, of which the most prevalent is the non-alcoholic fatty liver disease. Thus, the aim of this study was to investigate the metabolic effects of chronic liver disorders caused by hepatosplenic mansonic schistosomiasis and for non-alcoholic fatty liver disease. For this, two lines of action were used. The first was based on the investigation of the influence of apolipoprotein E on lipid/lipoprotein metabolism and research of insulin resistance and its relation to the disturbances in plasma lipids of subjects with chronic hepatosplenic schistosomiasis. Patients had the apolipoprotein E genotypes identified and plasma lipid levels measured. It was observed that the referred polymorphism could influence lipid metabolism and that significant changes are caused by ε2 and ε4 alleles, but suppressed in the overall assessment of the population due to the high frequency of ε3 allele. Another cohort of patients with hepatosplenic mansonic schistosomiasis had insulin, glucose and lipid plasma levels quantified. The results showed that, in these subjects, there are obvious disruption in insulin action, by the observed hyperinsulinemia. Interestingly, metabolism disorders commonly associated with insulin resistance were not observed. The second line of action employed different hyperlipidemic diets, which were rich in fatty acids, cholesterol and / or sucrose, in mice to investigate the interaction between obesity, insulin resistance and inflammation and the development and progression of non- alcoholic fatty liver disease. Anthropometric measurements, quantification of lipids, glucose and insulin plasma levels, glucose tolerance test, histology of liver and adipose tissue, and analysis of the expression of various genes related to inflammation and metabolism on liver and adipose tissue were done in order to obtain an overview of the metabolic interactions and how the different compounds could influence these processes. It was observed that the diet rich in fatty acids caused more disruption of the adipose tissue metabolism and insulin resistance, while the sucrose-rich diet induced higher hepatic inflammation and the high cholesterol diet led to liver fibrosis, but without the same degree of inflammation. The different approaches showed that impaired liver function was related to the disruption of energy metabolism, by the observed changes in lipid metabolism and insulin resistance. In the specific case of the study with animal models, it was observed, additionally, specific effects that may be generated due to the use of different molecules.

Key-words: Hepatosplenic mansonic schistosomiasis. Non-alcoholic liver disease.

Sumário

1. Distúrbios Hepáticos Crônicos: Repercussões Metabólicas 11

2. Esquistossomose mansônica 13

2.1. Esquistossomose Crônica 17

2.2. Repercussões Metabólicas da Esquistossomose 18

3. Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica 27

4. Objetivos 37 4.1. Objetivo Geral 37 4.2. Objetivos Específicos 37 5. Referências 38 6. Artigo 1 48 7. Artigo 2 56 8. Artigo 3 73 9. Conclusões 100 Apêndices 101 Apêndice A 102 Apêndice B 107 Apêndice C 112 Apêndice D 122 Anexos 132 Anexo A 133 Anexo B 149

1. Repercussões Metabólicas em Doenças Hepáticas Crônicas

Ao longo da história do homem, o fígado aparece desde a antiguidade como órgão de extrema importância. A lenda grega de Prometeu sugere que os gregos já conheciam a capacidade de regeneração do fígado. Hipócrates (400 a.C.), descreve a existência de abcessos hepáticos. O anatomista romano Galen (aprox. 130-200 a.C) – que primeiro relatou as divisões do fígado em lóbulos – já acreditava que o fígado tinha grande importância na digestão, considerando o fígado o principal órgão do ser humano (RUTKAUSKAS et al., 2006).

“Por que o estômago é circundado pelo fígado? É por que o fígado pode aquecê-lo e tornar a comida quente? Esta é, certamente, a razão pela qual está abraçado pelos lobos do fígado, como se fossem dedos. ”

Galen, aprox. 200 a.C.

Com o passar dos séculos, as pesquisas caminharam no sentido do entendimento cada vez mais detalhado deste órgão. Com descrição de anatomia e fisiologia, identificação dos tipos celulares e das reações bioquímicas existentes.

O hepatócito, unidade celular formadora do fígado, representa 70% a 80% da massa citoplasmática hepática. Estas células estão envolvidas na síntese de proteínas, carboidratos e lipídeos como colesterol, sais biliares e fosfolipídeos. Os hepatócitos também são atores fundamentais na detoxificação, modificação e excreção de substâncias endógenas e exógenas. Além disso, os hepatócitos ainda têm a capacidade de sintetizar fatores de coagulação, proteínas complemento e tem participação na síntese de alguns hormônios (e.g. fator de crescimento semelhante à insulina, trombopoietina, eritropoietina) e estão diretamente envolvidos na imunidade inata, com produção de diversas interleucinas (LIM; OH; KOH, 2015).

Além de hepatócitos, outros tipos celulares coabitam o fígado: células imunes (principalmente macrófagos, chamados células de Kupffer), células estreladas e células endoteliais. Nos casos em que a capacidade de metabolização dos agentes tóxicos dos hepatócitos é superada, estas células entram em ação, muitas vezes provocando danos ao tecido na tentativa de eliminar os ativadores da disfunção (MCCLUSKY et al., 1997).

Em diversas enfermidades que acometem o fígado, observa-se um fluxo contínuo de componentes agressivos ao tecido hepático, durante períodos longos e

que são classificados como crônicos. Por outro lado, do ponto de vista imunológico, o processo de cronificação de uma doença passa pela modificação da forma de resposta inflamatória. Tendo em vista a importância do fígado em variados processos metabólicos, existe também um amplo espectro de possíveis agentes tóxicos que podem levar a distúrbios hepáticos crônicos. Estes agentes podem ter origem infecciosa ou não infecciosa. No contexto dos distúrbios hepáticos crônicos infecciosos destaca-se a forma hepatoesplênica da esquistossomose causada pelo parasita Schistosoma mansoni. Entre as afecções não infecciosas que atingem o fígado a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é a mais frequente, afeta de 20% a 30% da população mundial.

1. Esquistossomose mansônica

Esquistossomose (ou bilhardíase) é uma doença tropical causada pelos vermes digenéticos da classe Trematoda e do gênero Schistosoma. Diferentemente de outros trematódeos, o esquistossoma apresenta sexos separados. O macho é de cor esbranquiçada e mede de 6 a 13 mm de comprimento por 1,1 mm de largura. A fêmea é cilíndrica e mais fina e longa que o macho e mede de 10 a 20 mm de comprimento por 0,16 mm de largura. Como não apresentam órgão copulador, a cópula ocorre pela justaposição dos orifícios genitais feminino e masculino, quando a fêmea está alojada no canal ginecóforo (fenda longitudinal, no macho, para albergar a fêmea e fecundá- la). O casal permanece ligado ao longo de toda a vida do verme (GRYSEELS et al., 2006; ISNARD; CHEVILLARD, 2008).

Existem muitas espécies de vermes do gênero Schistosoma, a maior parte é parasita intestinal e infecta seres humanos apenas ocasionalmente. Entretanto, são conhecidas cinco espécies de valor clínico importante: S. mansoni, S. japonicum, S. haematobium, S. intercalatum e S. mekongi (GRYSEELS et al., 2006).

A esquistossomose está presente em 76 países, considerada endemia parasitária na América, África e Ásia. Estima-se que mais de 200 milhões de pessoas estejam infectadas pelos helmintos do gênero Schistosoma e aproximadamente 800 milhões estejam em áreas de risco de infecção, o que faz da esquistossomose a segunda doença parasitária de maior importância socioeconômica no mundo (FIGURA 1). Além das altas taxas de morbidade, estima-se que cerca de 280.000 pessoas morram por esquistossomose apenas na região da África subsaariana. (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 2002; VAN DER WERF, 2003; KING; DICKMAN; TISCH, 2005; STEINMANN et al., 2006).

FIGURA 1. Distribuição global da esquistossomose

Fonte: Adaptado de GRYSEELS et al., 2006.

No Brasil, a esquistossomose está presente em 18 estados (Região Nordeste, Espírito Santo, Goiás, Mato Grosso, Minas Gerais, Pará, Paraná, Rio de Janeiro, Santa Catarina e São Paulo) e no Distrito Federal, com as mais altas prevalências nos estados de Pernambuco, Alagoas, Sergipe e Minas Gerais. A existência de focos de esquistossomose mansônica em estados fora da região Nordeste tem sido justificada pela mobilidade populacional a partir de zonas endêmicas existentes dentro do país. Estima-se que entre 4 e 6 milhões de pessoas estejam infectadas no Brasil e que 25 milhões residam em zona de risco de infecção, fazendo do Brasil o país com maior número de casos das Américas (CANTANHEDE; FERREIRA; MATOS, 2011).

Existe apenas uma espécie de Schistosoma no Brasil, o S. mansoni, cujos hospedeiros intermediários são os caramujos do gênero Biomphalaria: B. straminea, B. glabrata e B. tenagophila. O ciclo evolutivo do S. mansoni é complexo, pois é formado por duas fases parasitárias: uma no hospedeiro intermediário (caramujo) e outra no hospedeiro definitivo (homem). Há ainda duas passagens larvárias no meio aquático, entre as fases parasitárias. O homem doente elimina os ovos do verme através de suas fezes. A postura ocorre nos vasos capilares intestinais, de onde os ovos atingem a luz do intestino e finalmente são liberados. Uma fêmea é capaz de liberar de 300 até 1000 ovos por dia, os quais amadurecem em uma semana (JORDAN, 1998; DA SILVA; CHIEFFIB; CARRILHO, 2005).

Em contato com a água, os ovos maduros incham, eclodem e liberam larvas ciliadas, os miracídios, os quais se locomovem rapidamente em busca do caramujo, seu hospedeiro intermediário. Neste estágio, a larva tem em média até 8 horas de vida. Durante a penetração no caramujo, o miracídio perde parte de suas estruturas. As partes remanescentes se juntam em até 48 horas, formando um saco alongado repleto de células germinativas, o esporocisto primário. Após este processo, há um segundo ciclo de transformação, desta vez em esporocisto secundário, os quais migram até o fígado e pâncreas do caramujo e se dividem em milhares de larvas chamadas de cercárias. O processo de desenvolvimento no interior do caramujo dura cerca de 40 dias (KATZ; ALMEIDA, 2003).

Após este período, as cercárias são liberadas na água, principalmente nos momentos de maior incidência solar. Cada caramujo pode liberar milhares de cercárias em um único dia. Uma vez dispersas na água, as cercárias nadam avidamente até encontrar a pele ou alguma mucosa do hospedeiro definitivo, por onde penetram. A penetração é consumada pela ação lítica de enzimas sobre proteínas da pele e pela ação mecânica da cauda da larva, que move intensamente (LAMBERTUCCI, 2010).

Durante este processo, o miracídio perde a cauda e se transforma em esquistossômulo, o qual é adaptado ao meio interno isotônico do hospedeiro. Os esquistossômulos permanecem na pele do homem por cerca de dois dias, quando penetram nos vasos sanguíneos ou linfáticos. O sistema imune do hospedeiro consegue eliminar boa parte dos vermes nesta fase, no entanto, alguns conseguem chegar até coração e pulmões, onde passam por modificações adicionais no desenvolvimento. Após isto, seguem para o fígado, onde completam seu amadurecimento sexual e onde ocorre o pareamento para acasalamento, em seguida seguem até o intestino para oviposição. Vermes adultos geralmente vivem 3 a 5 anos, muito embora possam permanecer até 20 anos no corpo humano (ISNARD; CHEVILLARD, 2008) (FIGURA 2).

FIGURA 2. Ciclo biológico dos vermes do gênero Schistosoma

Fonte: Adaptado de GRAHAM et al., 2010.

Todos estes passos do desenvolvimento do verme no organismo do hospedeiro são caracterizados por reações específicas. A penetração da cercária pela pele pode gerar lesões com bastante prurido no local, chamada dermatite cercariana, principalmente em indivíduos em contato com o verme pela primeira vez, em sua maioria imigrantes e turistas. Esta reação pode permanecer por até uma semana, como lesões pápulo pruriginosas (BOTTIEAU et al., 2006; BOURÉE; CAUMES, 2010). Após a penetração da cercária, agora como esquistossômulo, inicia-se a forma aguda da esquistossomose. Caracteriza-se por uma reação de hipersensibilidade sistêmica contra o esquistossômulo e ocorre poucas semanas após a infecção, no entanto frequentemente não é observada em indivíduos residentes em áreas endêmicas e sua intensidade pode variar de acordo com a intensidade da infecção e a resposta imune do indivíduo (ROCHA et al., 1996; DA SILVA; CHIEFFIB; CARRILHO, 2005).

2.1. Esquistossomose Crônica

Após as manifestações agudas da esquistossomose, a infecção geralmente progride para a forma crônica. Este é o estágio frequentemente observado em áreas endêmicas. As principais lesões não são provocadas pelos vermes adultos, mas sim pelos ovos que ficam presos nos tecidos. Os ovos secretam diversas moléculas, dentre as quais, enzimas proteolíticas que provocam forte atração de eosinófilos com reações inflamatórias e granulomatosas típicas, as quais são progressivamente substituídas por tecido fibrótico (CHEEVER; HOFFMANN; WYNN, 2000).

A esquistossomose mansônica crônica inicia-se no intestino, a migração dos ovos através da parede intestinal provoca uma intensa inflamação granulomatosa na mucosa, pseudopolipose, microulceração e sangramento superficial no intestino grosso distal. O paciente geralmente apresenta fraqueza, dor abdominal e trânsito intestinal irregular. Estas lesões são inespecíficas e podem ser confundidas com outras afecções do intestino, como as doenças inflamatórias do intestino, como Colite Ulcerativa e Doença de Chron (CHEEVER, 1968; CAO et al., 2010).

Contudo, parte dos ovos liberados nos vasos mesentéricos não atinge a luz do intestino, alguns são levados pela corrente sanguínea até outros órgãos, na maioria das vezes o fígado. Neste órgão, o ovo acaba preso no espaço periportal presinusoidal, local em que desencadeia uma forte reação inflamatória granulomatosa assim como no intestino (GRYSEELS; POLDERMAN, 1991; GRYSEELS et al., 2006). Os mesmos mecanismos utilizados pelo sistema imune do hospedeiro para combater a infecção são os responsáveis pelas principais complicações da esquistossomose crônica. A reação granulomatosa completa-se com a criação de uma região de fibrose ao redor do ovo, os quais estão localizados nos vasos do fígado. Ao longo do tempo, a deposição de colágeno nos espaços periportais leva à fibrose de Symmers ou periportal. A qual pode ser observada por ultrassonografia, tomografia computadorizada ou ressonância magnética nuclear. Ultrassonografia tem sido utilizada associada ao exame clínico na detecção do grau e padrão de fibrose hepática baseado em critérios da organização mundial de saúde (SYMMERS, 1904 apud ISNARD; CHEVILLARD, 2008; HATZ; MURAKAMI; JENKINS, 1992; VOIETA et al., 2010).

A fibrose hepática periportal, por sua vez, resulta no aumento da resistência ao fluxo local e consequente hipertensão. Contudo, a circulação portal não apenas envolve intestino e fígado, também estão bastante próximos baço e esôfago. Com a progressão da doença, a hipertensão portal passa também a atingir o baço, o que provoca um aumento considerável no seu volume, a chamada esplenomegalia. Além disso, a hipertensão portal está associada ao surgimento de varizes esofágicas, cujo rompimento e sangramento são as principais causas de morte por S. mansoni. Além disso, continuados sangramentos ocultos podem levar à anemia, hipoalbuminemia e até mesmo ascite, quando associado à hipertensão portal (KING; DICKMAN; TISCH, 2005; WILSON et al., 2007).

2.2. Repercussões Metabólicas da Esquistossomose

Tendo em vista o papel central do fígado para o metabolismo humano, a esquistossomose tem a capacidade de promover graves manifestações, principalmente quando se consideram os longos períodos de infecção e reinfecção. Dois efeitos fundamentais devem ser considerados no entendimento da patologia hepática: inflamação e fibrose. Ambas causadas em resposta à deposição dos ovos de S. mansoni.

A inflamação na região provoca, ao longo do tempo, dano hepático tecidual, com morte de hepatócitos e diminuição da capacidade de síntese e secreção pelo fígado. Isto se reflete na avaliação laboratorial da função hepática no indivíduo com esquistossomose: Geralmente há aumento plasmático das enzimas alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST), devido aos danos hepatocelulares, os quais também provocam diminuição da síntese de proteínas, refletidas na diminuição da albumina e de fatores de coagulação. A fibrose, consequência da inflamação crônica, provoca ainda aumento de gamma-glutamil transferase (GGT) e fosfatase alcalina (ALP) devido ao desenvolvimento de compressão biliar causada pela formação de granuloma na área ao redor do ovo. Além disso, ambas inflamação e fibrose podem provocar aumento da bilirrubina indireta, pelo aumento da hemólise (PEREIRA et al., 2010; LEITE et al., 2013, 2015). Pesquisas utilizando modelos de experimentação animal observaram relação entre a esquistossomose com algumas alterações no metabolismo de lipídios e

lipoproteínas. Estudos com camundongos infectados relatam redução nos níveis plasmáticos de colesterol esterificado e elevação dos fosfolipídios plasmáticos. Experimentos, utilizando sagüis (Callithrix jacchus) como modelo de infecção em primatas, demonstraram haver alterações na composição das membranas lipídicas de eritrócitos dos animais que desenvolveram a infecção crônica e redução na atividade da enzima LCAT estando relacionada com alterações no metabolismo do colesterol, interferindo no seu transporte reverso. Outros estudos também relataram alterações no metabolismo de triglicerídeos e VLDL tendo sido observados níveis elevados em camundongos, que desenvolveram a infecção por S. mansoni (FEINGOLD et al.,1989; DIMENSTEIN, et al., 1992; LIMA et al.,1998; DOENHOFF et al., 2002, RAMOS et al., 2004; LA FLAMME et al., 2007).

Alguns poucos estudos realizados em humanos também reportaram que a esquistossomose crônica promove alterações no metabolismo lipídico como, por exemplo, a peroxidação de lipídios de membrana em eritrócitos e diminuição da atividade da LCAT, redução dos níveis plasmáticos de colesterol total, LDL-C, HDL- C, VLDL-C e triglicerídeos. Desta forma pode-se evidenciar que as alterações metabólicas observadas nestes trabalhos diferem de acordo com o tipo de hospedeiro e isto pode ser explicado pelas diferenças e peculiaridades existentes entre o metabolismo das espécies estudadas. (SILVA et al., 2002; FACUNDO et al., 2004).

Por outro lado, tanto os distúrbios na síntese de proteínas quanto as diversas interleucinas liberadas durante a inflamação independentemente do dano hepático podem provocar efeitos sobre o metabolismo de lipoproteínas. Como tem sido reportado em alguns estudos com relação aos níveis de apolipoproteína A, principal componente proteico da HDL, e a Apolipoproteína B, o principal constituinte proteico da VLDL, IDL e LDL (KHOVIDHUNKIT et al., 2000).

Além de ApoA e ApoB, diversas outras apolipoproteínas participam no metabolismo de lipídeos. Cada lipoproteína está associada a apolipoproteínas específicas que exercem diversas funções, como ativação/inibição das enzimas envolvidas no metabolismo lipídico e na ligação das lipoproteínas a receptores da superfície celular. Neste contexto, a ApoE apresenta função crucial, desde que intermedeia o reconhecimento e internalização hepática de lipoproteínas ricas em triglicerídeos, quilomícrons e VLDLs e seus remanescentes através de sua ação como

ligante de LDLR, LRP e HSPG (MAHLEY; HUANG, 1999; HAGBERG; WILUND; FERREL, 2000; HARRIS; EVANS; OWEN, 2006).

Além disso, a APOE também tem papel fundamental no metabolismo das lipoproteínas ricas em colesterol, como LDL, em que atua na distribuição de colesterol para os tecidos periféricos, ou ainda como constituinte de algumas frações de HDL, contribuindo com o transporte reverso de colesterol através da participação na internalização hepática destas lipoproteínas (MAHLEY, 1982; MAHLEY; INNERARITY, 1983).

Além de atuar como ligante de receptores, a ApoE ainda participa na ativação de diversas enzimas envolvidas no metabolismo de lipoproteínas, dentre as quais, pode-se mencionar as lipases hepáticas, a Proteína de Transferência de Colesterol Éster (CETP) e a LCAT (GREENOW; PEARCE; RAMJI, 2005).

A ApoE não se apresenta de maneira idêntica em todos os seres humanos, com consequentes repercussões metabólicas. De fato, apenas suas diferentes isoformas são responsáveis por 10% da variação dos níveis de colesterol plasmático na população geral. Estas isoformas existem devido a uma variação chamada de polimorfismo genético ou gênico, no qual um mesmo sítio apresenta diferentes versões ou alelos, neste caso, do tipo polimorfismo de único nucleotídeo (SNP, do inglês: single nucleotide polymorphism), em que a alteração de apenas um único nucleotídeo provoca modificação na sequência da proteína (MAHLEY; RALL, 2000; LI et al., 2011; FONSECA et al., 2014).

As três principais isoformas da ApoE, chamadas E2, E3 e E4, são produtos dos três alelos ɛ2 (lê-se épsilon), ɛ3, ɛ4. Três genótipos homozigotos (ɛ2/ɛ2, ɛ3/ɛ3 e ɛ4/ɛ4) e três heterozigotos (ɛ2/ɛ3, ɛ2/ɛ4, ɛ3/ɛ4) provêm da expressão de dois destes três alelos. As modificações que dão origem a estes três alelos acontecem em dois nucleotídeos presentes no éxon 3 e formam proteínas que diferem nos aminoácidos 112 e/ou 158. A ApoE3 possui um resíduo de cisteína na posição 112 e um resíduo de arginina na posição 158, enquanto a ApoE2 contém duas cisteínas (Arg158Cys) e a ApoE4 contém duas argininas em ambos os sítios (Cys112Arg) (UTERMANN et al., 1980; MAHLEY, 1988; MAHLEY; RALL, 2000).

Tem sido observado que o alelo ɛ3 é o mais comum, com frequências numa faixa de aproximadamente 51% a 80%. O alelo ɛ4 geralmente apresenta frequência maior do que ɛ2 variando entre 12% e 29%, enquanto que frequências do alelo ɛ2 têm sido encontradas variando entre 1% e 19%. Devido a prevalência majoritária do alelo ɛ3,

este tem sido utilizado como referência para a avaliação das diferenças entre as isoformas (MASEMOLA; ALBERTS; URDAL, 2007; MENDES-LANA et al., 2007).

Desde as primeiras investigações tem-se associado o alelo ɛ2 com a existência de disbetalipoproteinemia (ou hiperlipoproteinemia do tipo III, segundo classificação de Fredrickson) em que o indivíduo possui níveis muito elevados de triglicerídeos, frequentemente próximos e maiores do que 300 mg/dL. A hiperlipidemia é causada pelo acúmulo de quilomícrons remanescentes provenientes de lipídeos exógenos e de remanescentes de VLDL derivados do fígado, ambas chamadas de β-VLDL. Virtualmente todos os indivíduos com disbetalipoproteinemia são homozigóticos para o alelo ɛ2. A presença do alelo ɛ2 em heterozigose, entretanto, apresenta um efeito benéfico, pela associação com níveis diminuídos de colesterol e ApoB e níveis elevados de HDL e ApoA-I (DONG et al., 1996; MAHLEY; JI, 1999; FRIKKE-SCHMIDT et al., 2000).

Um perfil lipídico-lipoprotéico diferente, no entanto, tem sido observado na presença do alelo ɛ4. Indivíduos portadores do alelo ɛ4 apresentam níveis aumentados de colesterol e ApoB enquanto apresentam valores bem menores de HDL e ApoA-I. Os níveis elevados de LDL-C presentes nos indivíduos portadores de ApoE4 estão fortemente associados com o desenvolvimento de aterosclerose e o aumento do risco de DCVs (DONG; WEISGRABER, 1996; GYLLING et al., 1997; GÓMEZ-CORONADO, 1999; HAAN; MAYEDA, 2010).

Estes diferentes padrões lipídico-lipoprotéicos observados entre os alelos da APOE são frequentemente justificados pelas diferenças estruturais causadas pelas modificações dos aminoácidos. A substituição do resíduo de cisteína (ApoE3) por Arginina (ApoE4) na posição 112 provoca modificações na região de ligação aos lipídeos de forma a fortalecer a afinidade da ApoE pelos mesmos. Com isso há maior concentração de ApoE nas lipoproteínas ricas em ApoB, como VLDL e LDL, do que na HDL. Por causa desta modificação na distribuição de ApoE há maior quantidade de ApoE ligando-se aos receptores de LDL (LDLR) e internalização de colesterol. Este processo, associado ao aumento da absorção de colesterol intestinal observada em indivíduos com APOE4, pode aumentar o conteúdo intra-hepático de colesterol e, consequentemente, diminuir a expressão de LDLR, levando ao aumento dos níveis de LDL-C observados em indivíduos com APOE4. Outros estudos ainda reportam que parte destas alterações pode ser justificada pela rápida depuração de quilomícrons remanescentes contendo APOE4 em relação aqueles contendo APOE3

(WEINTRAUB; EISENBERG; BRESLOW, 1987; KESÄNIEMI; EHNHOLM; MIETTINEN, 1987; DREON et al., 1995).

Por outro lado, a substituição do resíduo de arginina (ApoE3) por cisteína (ApoE2) na posição 154 provoca modificações na região de ligação a receptores, provocando uma afinidade de apenas 2% em comparação com ApoE3 ou ApoE4. Assim, há uma diminuição acentuada da depuração hepática de lipoproteínas e consequente hiperlipidemia (WEISGRABER, INNERARITY & MAHLEY, 1982; WEINTRAUB, EISENBERG & BRESLOW, 1987) (FIGURA 3).

FIGURA 3: Diferenças observadas nas estruturas de ApoE3, ApoE4 e ApoE2.

Fonte: Adaptado de MAHLEY e RALL, 2000.

Desta forma, o polimorfismo da ApoE poderia estar relacionado às dislipidemias observadas durante a esquistossomose mansônica tanto pelas diferenças intrínsecas das isoformas, quanto pelas disfunções hepáticas, que poderiam provocar mudanças na síntese, secreção e depuração de ApoE, e consequentemente de lipoproteínas, pelo fígado.

Por outro lado, as inter-relações de ApoE e esquistossomose mansônica poderiam se dar devido à influência da ApoE sobre processos imunológicos. Embora ainda escassos em relação a ampla quantidade de possibilidades de ação, alguns estudos têm observado efeitos da ApoE em diferentes situações. Há evidências de que as isoformas da APOE podem ter um papel importante na infecção e desenvolvimento de doenças causadas por bactérias, vírus, protozoários e fungos (WOZNIAK, 2007; TURSEN et al., 2004; BURT et al., 2008; WANG et al., 2009).

Tem sido relatado que a progressão de infecções bacterianas pode ser influenciada pelo genótipo presente em cada caso. Camundongos expressando

ApoE3 humana apresentaram maior sobrevivência à sepse do que aqueles expressando ApoE4. Resultados semelhantes também foram observados em humanos, portadores do alelo ɛ3 apresentaram menor incidência de sepse severa e menor duração em Unidade de Terapia Intensiva após cirurgia do que aqueles com o alelo ɛ4 (MORETTI et al., 2005; WANG et al., 2009).

As infecções virais também têm sido alvo de estudos em que se avalia a influência do polimorfismo da APOE. Tem sido observado que a presença do genótipo ɛ4/ɛ4 está associada a um curso mais rápido da doença e progressão para morte em portadores do Vírus da Imunodeficiência Humana, ao menos parcialmente explicado pela inibição da expressão da proteína Tat – um transativador de expressão do gene do HIV – e consequente inibição da formação do sarcoma de Kaposi, pela APOE3 (BROWNING et al., 1994; BURT et al., 2008).

O alelo ɛ4 também tem sido associado ao herpes labial, provocado pelo Herpes Simplex Vírus (HSV) tipo I. O HSV-I está presente no cérebro de um alto percentual da população e quando associado com a APOE4 confere um risco de desenvolvimento de doença de Alzheimer muito maior do que o alelo ɛ4 de maneira isolada. No entanto, o alelo ɛ4 conferiu proteção em indivíduos infectados com o vírus tipo C da Hepatite (HCV) contra doença hepática severa. Ademais, indivíduos portadores de APOE2 apresentaram um maior risco de desenvolvimento de encefalite causada por HSV-I (ITZHAKI et al., 1997; LIN et al., 2001; WOZNIAK et al., 2002; TONIUTTO et al., 2004).

A importância da APOE durante a infecção não se limita a vírus ou bactérias, foi observado que o genótipo ɛ2/ɛ2 esteve associado a uma infecção precoce pelo protozoário causador da malária, o Plasmodium falciparum. O parasita utiliza, através de proteínas de superfície, moléculas HSPG/LRP para invadir os hepatócitos. De certo que outras proteínas, como a ApoE, utilizam esta rota de internalização celular, pode existir competição por estes receptores. Além disso, foi relatado maior risco de desenvolvimento de micoses superficiais, principalmente por fungos dermatófitos, em indivíduos com o genótipo ɛ3/ɛ2, ou mesmo na ausência de ɛ3/ɛ3 (SHAKIBAEI; FREVERT, 1996; SINNIS et al., 1995; WOZNIAK et al., 2007; TURSEN et al., 2004).

Estes patógenos (vírus, bactérias, protozoários e fungos) e a ApoE utilizam-se das mesmas moléculas para se ligar e penetrar na célula, receptores da família do LDLR e HSPG. Como a afinidade de ligação é específica para cada isoforma, a ApoE poderia determinar o grau de competição pelo receptor e consequentemente a entrada

do patógeno na célula e sua subsequente propagação e doença. As afinidades de ligação das isoformas da APOE podem resultar em uma proteção específica de um alelo para uma doença e conferir risco para outra (ITZHAKI et al, 1997).

Em adição à influência das isoformas da ApoE sobre a infecção em si, a ApoE poderia influenciar a resposta imune do hospedeiro. Estudos com modelos animais observaram que a ApoE pode atuar como um inibidor da resposta Th1, provocando uma modificação do balanço Th1/Th2 na direção do padrão Th2. Também foi observado que camundongos APOE-/- _{apresentavam inibição da resposta inflamatória}

Th2 após administração de peptídeo derivado da ApoE. Em humanos foi observado que o a presença do alelo ɛ4 aumenta consideravelmente o risco de desenvolvimento de Colite Ulcerativa (ZHENG et al, 2003; LI et al, 2009).

Interessantemente, os efeitos da ApoE sobre o metabolismo lipídico e sobre a resposta imune do indivíduo infectado por S. mansoni poderiam estar associados. Acredita-se que o verme, que não sintetiza lipídeos, os absorve através da ligação de partículas de LDL a uma proteína de seu tegumento semelhante ao LDLR. Este processo de ligação à LDL, assim como a outras moléculas, teria um papel secundário muito importante como um mecanismo de evasão do verme à resposta imune do hospedeiro, no qual o parasita camufla-se com as lipoproteínas e passa a não ser mais detectado pelo sistema imune do indivíduo infectado (SMITHERS; TERRY; HOCKEY, 1969; RUMJANEK; CAMPOS; AFONSO, 1988; TEMPONE et al., 1997).

Enfim, a investigação das dislipidemias no contexto da esquistossomose se torna ainda mais importante pelo reconhecimento da participação de lipídeos e lipoproteínas na gênese de diversos distúrbios associados às doenças crônicas não- transmissíveis (DCNTs), como aterosclerose, obesidade, resistência à insulina e hipertensão arterial sistêmica. Estes distúrbios são fortemente associados entre si e observados concomitantemente na síndrome metabólica, a qual é considerada um transtorno complexo formado por um conjunto de fatores de risco cardiovascular. Tais fatores são usualmente relacionados à resistência à insulina (DOENHOFF et al., 2002; SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2005).

A resistência insulínica é um distúrbio metabólico, caracterizado pela diminuição da capacidade dos receptores de insulina teciduais em interagir com a insulina, e consequente diminuição na captação da glicose plasmática. Com isso há um aumento na concentração de glicose no sangue, o qual reforça o estímulo de secreção de insulina – comumente chamada compensatória – levando à hiperinsulinemia. A

resistência à insulina pode promover várias repercussões metabólicas, tais como hiperglicemia/diabetes mellitus do tipo 2, dislipidemias/ dislipoproteinemias, obesidade/obesidade visceral, hiperuricemia, aumento dos fatores pró-trombóticos e antifibrinolíticos, elevação do fator de necrose tumoral (TNF-α) e de algumas interleucinas, bem como hipertensão arterial sistêmica. Os principais órgãos e tecidos afetados são o tecido adiposo, o tecido muscular, o fígado e os rins (SIMONE et al., 2003).

No metabolismo lipídico/lipoproteico, a resistência insulínica está relacionada com a diminuição dos níveis de HDL-C, na formação de uma LDL pequena e densa (mais aterogênica), aumento nos níveis plasmáticos de triglicerídeos e de VLDL-C. Estas alterações lipídicas e lipoprotéicas podem ocorrer devido à estimulação da lipase lipoprotéica nos capilares do tecido adiposo, liberando com isso, grandes quantidades de ácidos graxos livres provenientes das VLDLs, que seguem pela circulação para o fígado, aumentando a síntese hepática de triglicerídeos e que pode provocar, consequentemente, desordens metabólicas como a esteatose hepática (HOLZL et al., 1998; OLIVEIRA; MIRABEAU; LIMA, 2004; CUSSONS; BRONWYN; GERALD, 2005).

As LDLs são afetadas em sua composição, pois são produzidas a partir de VLDLs anormais, incorporando em suas moléculas grandes quantidades de triglicerídeos, tornando-se desse modo, mais suscetíveis a hidrólises pelas lipases hepáticas e lipoprotéicas, resultando em LDLs de partículas menores, mais densas e aterogênicas, que são fagocitadas pelos macrófagos dando origem às “células espumosas”, que são as principais responsáveis pelo conteúdo de colesterol das placas de ateroma (BORGGREVE et al., 2003).

Paralelamente, ocorre uma redução na concentração das HDLs, por mecanismos que ainda não estão bem elucidados, tais como: o bloqueio da transferência de apolipoproteínas e de fosfolipídios das lipoproteínas ricas em triglicerídeos para a HDL; a troca entre colesterol que foi esterificado pela atuação da LCAT na HDL e o conteúdo triglicerídico na VLDL; elevada atividade da lipase hepática, a qual facilita a depuração da HDL e alterações na função hepática, tais como a inibição da produção da Apo A-I, a principal apolipoproteína da HDL, e/ou a inibição da secreção de HDL nascente (GINSBERG; ZHANG; HERNANDEZ-ONO, 2005).

Nos últimos anos, a resistência à insulina – frequentemente associada à obesidade e, consequentemente, a dietas hipercalóricas – passou a atingir também populações de menor poder econômico, as quais classicamente apresentavam maiores prevalências de doenças parasitárias, como a esquistossomose mansônica. A intercessão destas duas enfermidades promoveu um fenômeno muito interessante do ponto de vista imunológico. Enquanto a esquistossomose promove uma forte reação inflamatória do tipo Th2, obesidade e resistência à insulina estão relacionados à resposta do tipo Th1.

A forma como estas interações acontecem ainda parece longe de ser elucidada. No entanto, recentemente foi observado que os ovos do verme produzem antígenos solúveis contendo glicoproteínas e glicanos com a capacidade de promover a melhora da tolerância à glicose e da sensibilidade à insulina. Este efeito se daria através da estimulação de macrófagos no tecido adiposo para produzirem interleucina-10, a qual promoveria diminuição da inflamação e melhora da captação de glicose no tecido adiposo. Além disso, o composto lacto-N-fucopentaose III, especificamente, tem a capacidade de promover a diminuição da síntese de lipídeos no fígado (BHARGAVA et al., 2012; CHEN et al., 2013).

Assim, é possível perceber as várias comunicações entre o distúrbio hepático provocado pela esquistossomose mansônica e diversas rotas metabólicas que, integralmente, levam ao comprometimento geral do organismo do indivíduo afetado. Contudo, além dos problemas hepáticos advindos das infecções, representados aqui pela esquistossomose mansônica crônica, diversos distúrbios não infecciosos podem provocar sério comprometimento da função hepática. Entre eles se destaca a Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (DHGNA).

2. Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica

A DHGNA é definida por alterações hepáticas que se assemelham a doença hepática induzida por álcool, mas que ocorre em pacientes que não apresentem consumo de álcool significativo. A doença inclui amplo espectro de alterações histológicas desde esteatose simples, passando pela esteato-hepatite podendo evoluir até fibrose e cirrose, para o diagnóstico é necessária correlação anátomo- clínica e exclusão de causas secundárias. A definição pressupõe a abstenção de álcool, existindo grande discussão na literatura sobre qual seria o ponto de corte aceitável para não considerar o álcool como o responsável por este processo. A maioria dos autores fala em consumo de até 20g de álcool para homens e 10g para mulheres (ASSOCIAÇÃO AMERICANA DE GASTROENTEROLOGIA, 2002).

A definição patológica da presença de esteatose é gordura hepática excedendo 5% do total do peso do órgão. Quando em avaliação microscópica, o critério é usualmente a presença de gordura em mais de 5% dos hepatócitos. A presença de esteato- hepatite não alcoólica (EHNA) é definida pela concomitância de processo inflamatório, que costuma ser misto, envolvendo tanto células mononucleares como polimorfonucleares. Outros achados característicos em humanos são a degeneração dos hepatócitos em balão (balonamento) e o aparecimento dos corpos de Mallory- Denk; posteriormente, ocorre o aparecimento de fibrose, que inicialmente é perivenular, mas depois envolve outras regiões (OH; WINN; POODARD, 2008) (FIGURA 4).

E

Figura 4: Cortes histológicos de fígado de camundongo corados com hematoxilina e eosina (A-E) ou

Tricromo de Masson (F) demonstrando o desenvolvimento de DHGNA. A: Fígado Normal; B: Esteatose de grau 1 (5% a 33%); C: Esteatose de grau 2 (34% a 66%); D: Esteatose de grau 3 (67% a 100%). E: Esteato-hepatite; F: Esteato-hepatite com fibrose. Círculos destacam células em balonamento e setas destacam Corpos de Mallory-Denk.

FONTE: Adaptado de OH; WINN; POODARD, 2008 e HIJONA et al., 2010.

O entendimento da patogênese da DHGNA passa pelo reconhecimento da interação metabólica que o fígado mantém com os diversos tecidos corporais. De maneira que o acúmulo de lipídeos no fígado, característica conceitual da DHGNA,

deriva-se fundamentalmente do excesso de energia disponível no organismo. Este excesso é frequentemente causado por ingestão excessiva de calorias, as quais causam obesidade e outros distúrbios associados.

Dietas ricas em gordura têm sido utilizadas muito eficazmente em modelos animais, principalmente camundongos, como forma de mimetizar os efeitos observados em humanos – obesidade, dislipidemias, resistência insulínica etc – apesar das diferenças metabólicas existentes. Camundongos não expressam CETP, enzima responsável pela transferência de éster de colesterol da HDL para a LDL. Além disso, camundongos também produzem ApoB-48 no fígado, a qual apresenta uma maior depuração hepática que a ApoB-100 em humanos. Roedores em geral apresentam, ainda, maior taxa metabólica, a qual influencia nos níveis de ácidos graxos circulantes e desenvolvimento de obesidade. Por estas diferenças, há aumento considerável de HDL-c em relação aos níveis de LDL-c em camundongos, diferentemente dos humanos, nos quais há bem mais colesterol nas partículas de LDL. (KIM; YOUNG, 1998; LIMA et al., 1998).

Inúmeros modelos animais de investigação de obesidade e morbidades associadas têm sido desenvolvidos ao longo das últimas décadas. Como resultado, três classes de modelos animais são utilizadas hoje: modelos dietéticos, modelos genéticos e modelos que utilizam tanto modificações genéticas quanto na dieta. Nos modelos dietéticos, são utilizadas dietas hipercalóricas, a maioria baseada em lipídeos. Neste campo há uma ampla gama de formulações, com vasta variação nas fontes animais (banha de porco, pele de frango, manteiga, gema de ovo e cérebro bovino) ou diferentes óleos vegetais. Os modelos genéticos se baseiam no silenciamento ou mutação de genes reguladores metabólicos, como o modelo ob/ob para a leptina (ARAÚJO et al., 2011, 2012).

Além disso, nos últimos anos, tem-se aumentado o número de modelos que buscam investigar o efeito de componentes específicos nas dietas. Como as dietas deficientes em metionina e colina, ricas em sacarose ou frutose, ou ainda, ricas em colesterol. Estes modelos, assim como os mais tradicionais, apresentam vantagens e desvantagens que devem ser levados em consideração de acordo com o objetivo de investigação. Além disso, variações como arcabouço genético dos animais, tempo de

dieta, idade de início e sexo dos animais também podem levar a diferentes respostas (BUETTNER et al., 2007; PIERCE et al., 2015).

A obesidade é caracterizada pela presença de maior peso do que é considerado saudável para a altura do indivíduo, geralmente avaliado pelo índice de massa corpórea (IMC), o qual é calculado utilizando o peso corporal em quilogramas dividido pela altura em metros, ao quadrado (Peso [Kg] / Altura2 _{[m]). Valores elevados de IMC}

geralmente refletem expansão do tecido adiposo corporal. Esta avaliação pode ser traduzida para os modelos experimentais pela medição da razão entre o peso e o tamanho do animal, ou mais eficientemente, pela determinação da gordura corporal (KUHEL et al., 2013).

A principal função do tecido adiposo é armazenar e liberar ácidos graxos, os quais são incorporados nos triglicerídeos de adipócitos de acordo com demandas de energia a todo o organismo. A massa adiposa corporal é determinada pelo equilíbrio entre armazenamento e remoção de triglicerídeos em adipócitos. A expansão do tecido adiposo em resposta ao excesso de ingestão calórica é uma resposta sistêmica importante para evitar os efeitos colaterais lipotóxicos exercidos pelo excesso de deposição de lipídeos em outras células (ASTERHOLM et al., 2014).

Nos estados de aumento da demanda de ácidos graxos, como nas dietas hiperlipídicas, o tecido adiposo responde primeiramente com aumento do número de células – devido à multiplicação e diferenciação de pré-adipócitos, angiogênese e remodelamento da matriz extracelular. Diversos fatores parecem estar envolvidos neste processo. No entanto, tem sido observado que a expressão de diversos genes envolvidos na maturação é dependente da ativação do peroxisome proliferator- activator receptor gamma (PPARy), um fator de transcrição ativado por ácidos graxos. Entretanto, a continuidade do influxo aumentado de ácidos graxos sobrecarrega o adipócito e gera dano ao tecido, provavelmente causado pela incapacidade tecidual de manter um aporte adequado de oxigênio. (KUBOTA et al., 1999; ARNER et al., 2010; CUMMINS et al., 2014; SHULMAN, 2014).

O estresse celular no tecido adiposo provoca então apoptose de adipócitos e infiltração de macrófagos. Este processo de sobrecarga de ácidos graxos, estresse, apoptose e inflamação no tecido adiposo se torna contínuo. Este estado é conhecido como inflamação crônica de baixo grau. Contudo, é importante salientar que o termo

“crônica” se reflete ao tempo prolongado e caráter persistente da inflamação e não a uma inflamação do tipo Th2, como comumente descrita em imunologia.

Muitos fatores pró-inflamatórios são produzidos no tecido adiposo do indivíduo obeso. Há aumento da expressão de TNF-α, interleucina-6, interleucina 1 beta (IL-1β), proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1), sintase de óxido nítrico induzível (iNOS), fator de crescimento transformante beta 1 (TGF-β1), etc. Boa parte destes fatores é produzido por macrófagos infiltrados no tecido adiposo, os quais atuam em conjunto na fagocitose de adipócitos mortos, formando estruturas com formato semelhante ao de uma coroa, chamadas crown-like structures (GREENBERG; OBIN, 2006) (FIGURA 5).

FIGURA 5: Adipócitos rodeados por macrófagos identificados por imuno-histoquímica de CD68.

FONTE: Adaptado de BIGORNIA et al., 2012.

Durante a expansão do tecido adiposo, observada na obesidade, a função endócrina dos adipócitos também entra em desequilíbrio. No estado normal de funcionamento, tanto adipócitos quanto outras células do tecido produzem diversas substâncias com atividade endócrina, como leptina e adiponectina.

A leptina é produzida proporcionalmente ao volume do tecido adiposo e em resposta a uma miríade de fatores estimulatórios como insulina, glicocorticoides, ativadores de PPARy e hormônio do crescimento. Os principais efeitos da leptina estão envolvidos com a homeostase energética, em que atua em nível hipotalâmico e também periférico na regulação do apetite e do gasto energético. Este hormônio atua

como um termômetro do nível de reserva energética do organismo, em que reduz rapidamente quando há diminuição das reservas de forma a induzir aumento do apetite e redução do gasto energético corporal. Por outro lado, durante a obesidade há desequilíbrio desse sistema, apesar dos níveis elevados de leptina é observada resistência aos seus efeitos. A adiponectina, diferentemente da leptina, apresenta secreção relacionada com o número de adipócitos diferenciados e não com o volume do tecido adiposo. Receptores para adiponectina são encontrados principalmente em músculos e no fígado e atuam de maneira a melhorar a eficiência do uso de ácidos graxos nestes tecidos (YAMAUCHI et al., 2001; KERSHAW; FLIER, 2004).

A partir do funcionamento endócrino do tecido adiposo é possível compreender como este órgão atua de maneira a proteger o organismo da lipotoxicidade. Entretanto, na expansão descontrolada observada durante a obesidade, este mesmo tecido não consegue mais proteger os outros órgãos do excesso de ácidos graxos e acaba por se tornar fonte de produção de diversos fatores deletérios para o funcionamento normal do organismo. Enfim, a obesidade pode ser vista como um desequilíbrio metabólico do tecido adiposo (incapacidade de absorção adicional dos ácidos graxos ingeridos, desenvolvimento de processos inflamatórios e desregulação endócrina) que repercutem no funcionamento geral do organismo. Neste ponto, a obesidade, através das dislipidemias e da resistência à insulina, pode ser considerada o elo entre as dietas hiperlipídicas e a DHGNA.

No final dos anos 1990 foi desenvolvida a primeira teoria para o desenvolvimento de DHGNA, baseada na hipótese de que primeiro haveria acúmulo hepático de triglicerídeos (esteatose), o qual aumentaria a susceptibilidade para um segundo passo ou “golpe” (hit, em inglês) o qual desencadearia a cascata de progressão da DHGNA. Este efeito seria mediado por citocinas e adipocinas inflamatórias, disfunção mitocondrial e estresse oxidativo, que promoveriam inflamação no fígado. A progressão do processo inflamatório levaria à fibrose, perda de função hepática e, nos casos mais graves, poderia levar à cirrose e carcinoma hepatocelular. Por causa da organização em dois passos, acúmulo de lipídeos e depois inflamação, esta hipótese foi chamada de two-hit theory (DAY; JAMES, 1998; DAY, 2006).

O acúmulo de triglicerídeos no fígado acontece, basicamente, pelo aumento do influxo de triglicerídeos e/ou diminuição da capacidade de metabolizá-los. Isto pode

acontecer devido ao aumento do fornecimento de ácidos graxos livres provenientes do tecido adiposo, aumento da lipogênese de novo, diminuição da oxidação de ácidos graxos, ou ainda pela diminuição da secreção de triglicerídeos através das VLDLs (BROWNING; HORTON, 2004; ANSTEE; GOLDIN, 2006; MALAGUARNERA et al., 2009).

A teoria desenvolvida pelos pesquisadores britânicos Day e James em 1998 foi muito importante pois possibilitou uma estratificação e classificação das fases do ponto de vista do tempo da doença. Entretanto, com o passar dos anos foi sendo observado que o acúmulo de triglicerídeos hepáticos não detinha uma correlação fisiopatológica com a progressão da DHGNA. Alguns estudos demonstraram que, pelo contrário, pacientes com maior capacidade de armazenar lipídeos no fígado na forma de triglicerídeos teriam relativa proteção para o desenvolvimento de EHNA. Outros estudos também observaram que a inflamação grave poderia acontecer mesmo com esteatose moderada ou leve (DAY; JAMES, 1998; FELDSTEIN et al., 2004; YAMAGUCHI et al., 2007; TILG; MOSCHEN, 2010; TINIAKOS et al., 2010).

Dessa forma, a pesquisa da DHGNA progrediu para a identificação de agentes responsáveis pela progressão da doença. Diversas moléculas lipídicas se mostraram capazes de induzir inflamação no tecido hepático: diferentes tipos de ácidos graxos, ceramidas, diacilglicerois, lisofosfatidilcolina, colesterol e seus metabólitos oxidados atuam como indutores da formação de espécies reativas de oxigênio (PEVERILL; POWELL; SKOIEN, 2014).

Além de lipídeos, carboidratos também têm sido associados ao desenvolvimento de DHGNA. Sacarose tem a capacidade de induzir lipogênese de novo e provocar rápida progressão pra EHNA em animais submetidos à dieta deficiente em metionina e colina, sendo a frutose mais citotóxica do que a glicose para este modelo. Adicionalmente, alto consumo de frutose causa esteatose hepática acompanhada de depleção de fosfato intracelular. A frutose é metabolizada principalmente por frutocinase, que existe em duas isoformas: frutocinase C e A. A frutocinase C é a principal isoforma no fígado e metaboliza frutose a frutose-1-fosfato rapidamente, resultando na depleção de fosfato e adenosina trifosfato (ATP) intracelular temporariamente. Em contraste, a frutocinase A metaboliza frutose lentamente, sem consumo de ATP significativo. Estudos utilizando comundongos knockout têm

mostrado que a atividade de frutocinase C é responsável pela esteatose hepática. Adicionalmente, animais knockout para a frutocinase A apresentaram aumento dos níveis de lipídeos hepáticos devido ao aumento do metabolismo da frutose através da frutocinase C. O metabolismo de frutose resulta no aumento da rotatividade de nucleotídeos e geração de ácido úrico que podem ter um papel na indução de estresse oxidativo mitocondrial e acumulação de gordura (PICKENS et al., 2009; ISHIMOTO et al., 2012).

Entretanto, os mecanismos pelos quais tais compostos, lipídeos e carboidratos, induziriam a inflamação ainda não são completamente conhecidos. Parte da dificuldade acontece por que a maioria dos estudos têm se dedicado à investigação de uma molécula ou processo por vez. Como muitas destas moléculas apresentam lipotoxicidade, têm-se a ideia de que há um efeito redundante sobre a progressão da DHGNA, no entanto, com o aprofundamento do conhecimento das vias mecanísticas envolvidas tem sido observado meios de atuação diferentes. Por outro lado, há ainda a possibilidade de que os diferentes processos convirjam para uma mesma rota, ainda não esclarecida.

A inflamação característica da EHNA causada por dietas ricas em gorduras ou carboidratos é desencadeada, em parte, pela ativação das vias NF-κB, o qual está associada a uma elevada expressão de citocinas inflamatórias, como TNF-α, IL-6, IL- 1β e ativação das células de Kupffer. No paciente com EHNA, os níveis séricos e hepáticos de TNF-α e IL-6 estão elevados e se correlacionam com a severidade histológica, além de promover a resistência à insulina (CRESPO et al., 2001; YUAN et al., 2001; HUI et al., 2004; KLOVER; CLEMENTI; MOONEY; 2005; CAI et al., 2005). Por causa do dano hepático, o sistema de reparo tecidual é ativado. Células mortas são substituídas por matriz extracelular e subsequentemente por novos hepatócitos, através da proliferação das células sobreviventes ou de células progenitoras. Entretanto, com o prolongamento da injúria, como observado na DHGNA, a formação de matriz extracelular é mais rápida do que a capacidade do tecido de regeneração. Isto provoca uma distorção na arquitetura tecidual que culmina maior dano tecidual. Histologicamente, é observada a formação das chamadas “pontes” de fibrose entre a veia central e a tríade portal no lóbulo hepático. O processo de reparo tecidual / fibrose como um todo é promovido pela atuação de diversas

citocinas sintetizadas localmente em resposta ao dano celular, como TGF-β, TNF-α, fator de crescimento derivado de plaquetas beta e fator de crescimento semelhante à insulina 1 (RAMADORI; SAILE, 2004; RAMADORI et al., 2007).

O dano fibrótico acumulado pode levar a cirrose. Caracterizada pela formação de nódulos regenerativos no parênquima hepático separados pelo septo fibrótico, resultado de morte celular, deposição de matriz extracelular desregulada e reorganização vascular. Neste estágio observa-se frequentemente insuficiência hepática e hipertensão portal. Ciclos sustentados de destruição hepatocelular e proliferação compensatória em resposta a toxicidade metabólica e oxidativa, inflamação, imunidade inata e adaptativa, e fibrose criar um ambiente propício à carcinogênese. Aberrações cromossômicas acumulam com a evolução da DHGNA através de cirrose em HCC. Inicialmente, mecanismos epigenéticos podem levar a hipo- ou hipermetilação aberrante de DNA em grupos de CpG nas regiões de promotores e outros segmentos cromossômicos além de induzir cis- e de transativação e acetilação da cromatina. Posteriormente, estas modificações epigenéticas podem levar a lesões genômicas estruturais, tais como mutações pontuais, deleções alélicas múltiplas, ganhos cromossômicos, a erosão dos telômeros e reativação da telomerase. Um passo crítico nestes processos é a seleção de populações monoclonais de hepatócitos pré-malignas ou células progenitoras a partir da qual emergem HCC (PARADIS et al., 1998; KONDO et al., 2000; THORGEIRSSON; GRISHAM, 2002; BAFFY; BRUNT; CALDWELL, 2012).

A complexidade da DHGNA tem se mostrado um desafio instigante para os pesquisadores do mundo todo. Inúmeros fatores estão presentes e o entendimento da maneira como cada um atua é um alvo difícil de ser atingido, principalmente pela grande interação existente. A DHGNA surge como face hepática de obesidade, resistência insulínica e dislipidemias em uma indissociável relação de causa e efeito simultâneos e progressivos. Neste cenário, a inflamação atua de maneira muito importante e adiciona ainda mais complexidade ao esclarecimento dos mecanismos envolvidos. Deste modo, é de fundamental importância para o entendimento da DHGNA que sejam feitas pesquisas que investiguem de maneira integrada os distúrbios metabólicos envolvidos de maneira a formar um quadro mais completo da fisiopatologia da doença. Ademais, para que isso aconteça, é necessária uma clara

delimitação dos processos iniciais da doença, o que inclui a identificação dos mecanismos pelos quais as moléculas causadoras da sobrecarga metabólica atuam. Por outro lado, a identificação destes diversos processos envolvidos com a doença hepática transporta a problemática da investigação para outras doenças causadoras de distúrbios no fígado e, neste caso, promove o retorno para o ponto inicial da discussão, a esquistossomose mansônica. Deste modo, as diferenças evidentes entre esquistossomose e DHGNA do ponto de vista imunopatológico podem, ao invés de serem ponto negativo, proverem um ponto de conexão para o entendimento de possíveis distúrbios metabólicos presentes na esquistossomose, como dislipidemias e resistência à insulina (FIGURA 6).

FIGURA 6: Representação esquemática do estudo.

4. Objetivos 4.1 Objetivo Geral

Investigar as repercussões metabólicas dos Distúrbios Hepáticos Crônicos causados por Esquistossomose Mansônica Hepatoesplênica e pela Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica.

4.2 Objetivos Específicos

 Avaliar as repercussões da esquistossomose mansônica hepatoesplênica sobre os níveis de lipídeos plasmáticos e sua relação com o polimorfismo de ApoE.

 Investigar a influência dos genótipos de ApoE sobre a chance de infecção e o desenvolvimento de esquistossomose mansônica hepatoesplênica.

 Pesquisar a existência de resistência à insulina em pacientes com esquistossomose mansônica hepatoesplênica.

 Correlacionar os níveis de lipídeos plasmáticos e índices lipídicos com a resistência à insulina em sujeitos com esquistossomose mansônica hepatoesplênica.

 Investigar a influência de dietas ricas em ácidos graxos, colesterol e sacarose sobre o desenvolvimento de obesidade, resistência à insulina, inflamação e dislipidemias.

 Avaliar a influência de dietas ricas em ácidos graxos, colesterol e sacarose sobre o desenvolvimento de Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica.