Associação entre status de cobre, perfil lipídico e capacidade funcional em pacientes com esclerose lateral amiotrófica

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO. ACSA NARA DE ARAÚJO BRITO BARROS. ASSOCIAÇÃO ENTRE STATUS DE COBRE, PERFIL LIPÍDICO E CAPACIDADE FUNCIONAL EM PACIENTES COM ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA. NATAL/RN 2017.

(2) 1. ACSA NARA DE ARAÚJO BRITO BARROS. ASSOCIAÇÃO ENTRE STATUS DE COBRE, PERFIL LIPÍDICO E CAPACIDADE FUNCIONAL EM PACIENTES COM ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição.. Orientadora: Profª. Drª. Lúcia Leite Lais Co-Orientadora: Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa. NATAL/RN 2017.

(3) 2. Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS. Barros, Acsa Nara de Araujo Brito. Associação entre status de cobre, perfil lipídico e capacidade funcional em pacientes com esclerose lateral amiotrófica / Acsa Nara de Araujo Brito Barros. - Natal, 2017. 59f.: il. Dissertação (Mestrado)-Programa de Pós-Graduação em Nutrição, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Leite Lais. Coorientadora: Profa. Dra. Lucia de Fátima Campos Pedrosa. 1. Esclerose lateral amiotrófica - Dissertação. 2. Cobre Dissertação. 3. Perfil lipídico - Dissertação. I. Lais, Lúcia Leite. II. Pedrosa, Lucia de Fátima Campos. III. Título. RN/UF/BSCCS. CDU 612.397:616.8.

(4) 3. ACSA NARA DE ARAÚJO BRITO BARROS. ASSOCIAÇÃO ENTRE STATUS DE COBRE, PERFIL LIPÍDICO E CAPACIDADE FUNCIONAL EM PACIENTES COM ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição.. Aprovada em ____ de _________________________ de __________.. Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Nutrição Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN. BANCA EXAMINADORA. Profª. Drª. Lúcia Leite Lais Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN Orientador. Profª. Drª. Sancha Helena de Lima Vale Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN Membro Interno. Profª. Drª. Débora Kurrle Rieger Venske Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC Membro Externo.

(5) 4. Aos meus pais, Lúcia e Giovanni..

(6) 5. AGRADECIMENTOS. A Deus, cuja existência precede a vida que agora tentamos desvendar. NEle, por Ele e para Ele está o sentido de tudo, ainda que pareça loucura. Aos meus pais, que abrindo mão de si em tantos momentos, são os maiores responsáveis por minha chegada até aqui. Difícil é saber que qualquer esforço não será capaz de recompensá-los. Ao meu marido, alívio e descanso, racionalidade e objetividade. É precioso, entre tantas outras coisas, poder partilhar e aprender com você o que é ser um verdadeiro cientista. Aos meus irmãos, exemplos no esforço e persistência, apoio e incentivo nos momentos mais necessários. A minha orientadora Profª. Drª. Lúcia Leite Lais, um verdadeiro diamante. Quão admirada você é por mim! Humildade e talento no ensino, na pesquisa, na orientação. Obrigada pelo acolhimento, compreensão, repreensão, direcionamento, apoio, ensino e exemplo. Como foi bom ter a graça de poder trilhar esse caminho sob sua orientação. A minha co-orientadora Profª. Drª. Lúcia de Fátima Campos Pedrosa, uma cientista nata cuja experiência e conhecimento contribuíram substancialmente para o aperfeiçoamento deste trabalho. À Micaela, verdadeira amiga e, não por acaso, colega de mestrado. Obrigada pela contribuição em todas as fases deste trabalho. Aos colegas de mestrado, pela companhia e compartilhamento na discussão de ideias que, direta ou indiretamente, agregaram à construção e finalização desta pesquisa. Aos pacientes, cuja presteza em se voluntariar, mesmo diante das dificuldades, fizeram este trabalho possível. Ao Programa de Pós-graduação em Nutrição da UFRN. Que cresça e frutifique, contribuindo relevantemente para o desenvolvimento da ciência. À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte (FAPERN) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior, pelo auxílio financeiro de incentivo decorrente do Edital FAPERN/CAPES 006/2014, que dispõe sobre o apoio aos Programas de Pós-Graduação das Instituições de Ensino Superior (IES) do Estado do Rio Grande do Norte..

(7) 6. Abandonar o trem que leva ao “País da Redundância Irrelevante” exige não um comportamento narcisista e egocêntrico, mas a simples compreensão de que ser relevante não o torna especial, apenas útil pelo que é capaz de realizar. Flávio Barros.

(8) 7. RESUMO. A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença caracterizada pela degeneração progressiva dos neurônios motores. O estresse oxidativo é um dos principais mecanismos associados à patogênese da ELA. O cobre é um mineral capaz de influenciar a oxidação celular e perfil lipídico. O objetivo do estudo foi avaliar a associação entre status de cobre, perfil lipídico e capacidade funcional em pacientes com ELA. Foi realizado um estudo transversal com 27 pacientes com ELA (grupo caso) e 26 indivíduos saudáveis (grupo controle). A avaliação do status do cobre foi realizada mediante consumo dietético, cobre no plasma e ceruloplasmina no soro. O perfil lipídico incluiu colesterol total (CT), LDL-colesterol (LDL-c), HDLcolesterol (HDL-c) e triglicerídeos (TGL). A capacidade funcional dos pacientes com ELA foi avaliada por meio da escala funcional revisada para ELA (ALSFRS-R). O Teste t de Student e o teste de Wilcoxon-Mann Whitney foram utilizados para a comparação de médias. A correlação entre o status do cobre e perfil lipídico foi realizada mediante o teste de correlação de Spearman. O efeito das variáveis para o desfecho escala funcional foi estimado mediante modelagem baseada na distribuição de Poisson. No grupo caso, os valores de cobre no plasma foram mais baixos comparados aos do grupo controle (133,9 vs. 164,1g/dL; p=0,0001) e se correlacionaram positivamente com o HDL-c (rs=0,398; p=0,044). No grupo controle, o cobre no plasma apresentou correlação positiva com ceruloplasmina no soro (rs=0,646; p<0,001), CT (rs=0,446; p=0,025), LDL-c (rs=0,445; p=0,029) e HDL-c (rs=0,479; p=0,015). Além disso, a ceruloplasmina foi positivamente correlacionada com LDL-c (rs=0,407; p=0,043). No grupo caso, o cobre dietético (p<0,001), o cobre no plasma (p=0,033) e o CT (p=0,001) foram inversamente associados com a capacidade funcional dos pacientes com ELA. Contrariamente, a ceruloplasmina no soro (p=0,044), o LDL-c (p=0,001), o HDL-c (p=0,001) e os TGL (p=0,001) foram positivamente associados com capacidade funcional dos mesmos. Em conclusão, esse estudo sugere uma alteração no status do cobre e na relação deste com o perfil lipídico em pacientes com ELA. Além disso, status do cobre e perfil lipídico podem influenciar a capacidade funcional dos pacientes com ELA, destacando-se como potenciais biomarcadores para avaliar a severidade dessa doença.. Palavras-Chave: esclerose lateral amiotrófica, cobre, perfil lipídico.

(9) 8. ABSTRACT. Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is disease characterized by a progressive degeneration of motor neurons. Oxidative stress is one of the main mechanisms associated with the pathogenesis of ALS. Copper is a mineral capable of influencing cellular oxidation and lipid profile. The aim of this study was to evaluate the association of copper status with lipid profile and functional status in patients with ALS. A cross-sectional study was carried out including 27 patients with ALS (case group) and 26 healthy individuals (control group). Copper status was evaluated by dietary copper intake, plasma copper and serum ceruloplasmin concentrations. The lipid profile included analysis of serum total cholesterol (TC), LDL-cholesterol (LDLc), HDL-cholesterol (HDL-c), and triglycerides (TGL). The functional status of patients with ALS was assessed by the revised ALS functional rating scale (ALSFRS-R). Student's t-test and Wilcoxon-Mann Whitney's test were used for comparison of means. Correlation between plasma copper and biochemical and dietary markers was made by Spearman's correlation test. The effect of the independent variables on the functional scale was estimated by model based on Poisson distribution. The case group had lower concentrations of plasma copper compared with the control group (133.9 vs. 164.1 µg/dL, p=0.0001). Also, in the case group, plasma copper was positively correlated with HDL-c (rs=0.398, p=0.044). However, in the control group, plasma copper was positively correlated with serum ceruloplasmin (rs=0.646, p<0.001), TC (rs=0.446, p=0.025), LDL-c (rs=0.445, p=0.029) and HDL-c (rs=0.479, p=0.015). Only in the control group ceruloplasmin was positively correlated with LDLc (rs=0.407, p=0.043). In the case group, dietary copper intake (p<0.001), plasma copper (p=0.033) and TC (p=0.001) were inversely associated with the functional status of patients with ALS. In contrast, serum ceruloplasmin (p=0.044), LDL-c (p=0.001), HDL-c (p=0.001) and TGL (p=0.001) were positively associated with their functional status. In conclusion, this study suggests a disturbance of copper status and its connection with the lipid profile in patients with ALS. Furthermore, copper status and lipid profile may influence the functional status of patients with ALS, standing out as potential biomarkers to evaluate the severity of the disease.. Key words: amyotrophic lateral sclerosis, copper, lipid profile.

(10) 9. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. ALSFRS-R. ALS Functional Rating Scale. CT. Colesterol total. EAR. Estimated Average Requirements. ELA. Esclerose lateral amiotrófica. ERO. Espécies reativas de oxigênio. FDA. Food and Drug Administration. GSH. Glutationa. GSH-Px. Glutationa Peroxidase. HDL-c. HDL-colesterol. HMG-CoA. 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A. HUOL. Hospital Universitário Onofre Lopes. IMC. Índice de massa corporal. LDL-c. LDL-colesterol. SOD1. Superóxido dismutase citosólica. SREBPs. Proteínas de ligação a elemento regulador de esterol. TDP-43. Transactive DNA binding protein 43. TGL. Triglicerídeos. UFRN. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

(11) 10. SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11 2 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA .................................................................. 12 3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 13 3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 13 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 13 4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 14 4.1 ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA ......................................................... 14 4.2 COBRE ............................................................................................................ 16 4.3 COBRE E PERFIL LIPÍDICO ........................................................................... 18 5 METODOLOGIA .................................................................................................... 21 5.1 DESENHO E POPULAÇÃO DO ESTUDO ...................................................... 21 5.2 CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA ......................................................................... 23 5.3 AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA ................................................................... 24 5.4 AVALIAÇÃO DO STATUS DO COBRE E PERFIL LIPÍDICO ........................... 24 5.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................. 25 6 ARTIGO CIENTÍFICO ............................................................................................ 27 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 44 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 45 ANEXOS ................................................................................................................... 52.

(12) 11. 1 INTRODUÇÃO A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença progressiva e fatal caracterizada pela degeneração dos neurônios motores no cérebro e na medula espinhal, levando a paralização dos músculos esqueléticos. 1 A etiologia da ELA ainda não é totalmente esclarecida. No entanto, dentre os mecanismos estudados na patogênese da ELA, o estresse oxidativo destaca-se como componente chave na progressão da doença.2 Nesse contexto, o cobre tem se destacado por desempenhar papel importante no sistema nervoso central e influenciar o estado de oxidação-redução celular.3 Alterações na homeostase do cobre podem catalisar a formação de espécies reativas de oxigênio e contribuir para o estresse oxidativo na ELA. 2 Tanto a deficiência como o excesso de cobre geram prejuízos funcionais no sistema nervoso central, incluindo sintomas de neurodegeneração severa devido sua atuação tanto como antioxidante quanto pró-oxidante e em seu papel estrutural em proteínas e enzimas essenciais para a função normal do cérebro.3 Em razão dos efeitos sobre o estresse oxidativo, o cobre também está associado a alterações nos marcadores do perfil lipídico, possivelmente por causar alterações nas estruturas das lipoproteínas, nos receptores de membrana e no metabolismo lipídico.4 Considerando a escassez de trabalhos avaliando essa temática na ELA, justifica-se a realização deste estudo, com o objetivo de avaliar a associação entre status de cobre, perfil lipídico e capacidade funcional em pacientes com ELA, atendidos no Ambulatório Multidisciplinar de ELA do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL), Natal/RN, Brasil..

(13) 12. 2 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA O desequilíbrio dos elementos traço nos pacientes com ELA pode ser decorrente de diversos fatores como desnutrição, prejuízo absortivo, aumento da excreção e competição entre micronutrientes em sítios de ligação.5 Na ELA, a enzima superóxido dismutase citosólica (SOD1) quando deficiente em cobre apresenta função alterada, passando a exercer função próoxidante ao invés de antioxidante.6 Em pacientes com SOD1 mutada, o grau de deficiência de cobre é proporcional à gravidade clínica da doença.7 Além disso, foi observada uma associação direta entre o cobre e a redução da capacidade funcional na ELA.8 Mecanismos relacionando o cobre à agregação da proteína transactive DNA binding protein 43 (TDP-43) e disfunção mitocondrial também têm sido apontados na patogenia da ELA.7 Embora não esteja claro se o estresse oxidativo é uma causa primária da ELA ou um resultado de algum outro evento tóxico, sabe-se que é um componente chave na progressão dessa doença.9 Tanto o excesso como a deficiência de cobre favorecem o estresse oxidativo. O cobre em excesso catalisa reações bioquímicas que produzem espécies reativas de oxigênio (ERO). A deficiência do cobre, por sua vez, leva a redução da atividade de enzimas antioxidantes, como SOD1, glutationa peroxidase (GSH-Px) e metalotioneína.10 Nesse contexto, estudos têm demonstrado a atuação do cobre como responsável por alterações no perfil lipídico. 4 As mudanças no estado redox causadas pelo cobre são apontadas como responsáveis por promover a atividade dos fatores de transcrição pertencentes à família das proteínas de ligação a elemento regulador de esterol (SREBPs), levando ao aumento da expressão de genes relacionados ao metabolismo lipídico e consequente aumento nas concentrações plasmáticas.11–13 Desse modo, considerando a importância do cobre e seu papel no contexto e progressão da ELA, bem como sua possível associação com o perfil lipídico, acredita-se que estudar a associação entre o status do cobre, o perfil lipídico e a capacidade funcional na ELA trará esclarecimentos a respeito do tema, elucidando aspectos importantes relacionados à fisiopatologia da doença..

(14) 13. 3 OBJETIVOS. 3.1 OBJETIVO GERAL Avaliar a associação entre status de cobre, perfil lipídico e capacidade funcional em pacientes com ELA, atendidos no Ambulatório Multidisciplinar de ELA/ HUOL, Natal/RN, Brasil.. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS . Caracterizar os pacientes com ELA quanto perfil clínico e capacidade funcional;. . Avaliar o estado nutricional antropométrico dos participantes;. . Avaliar o status de cobre por meio da análise da ingestão habitual de cobre na dieta, cobre no plasma e ceruloplasmina no soro dos participantes;. . Determinar o perfil lipídico dos participantes..

(15) 14. 4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 4.1 ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA A ELA é uma doença neurodegenerativa fatal caracterizada pela perda progressiva dos neurônios motores do córtex motor primário, tronco cerebral e medula espinhal, levando à atrofia, paralisia dos músculos e morte.1 Apresenta uma incidência mundial de 2 casos por 100.000 habitantes e prevalência de 5 por 100.000,14 embora estudos epidemiológicos apontem para uma distribuição heterogênea na incidência e prevalência da doença em várias regiões do mundo.15 É mais frequente em homens, com uma proporção de 3:2 em relação às mulheres, e tem início entre os 56 e 70 anos de idade.14 Por ser uma doença progressivamente fatal, apresenta uma sobrevida média de 24 a 48 meses após o diagnóstico, apesar de 5% a 10% dos pacientes sobreviverem mais de 10 anos.16 A principal causa de morte é atribuída à deficiência respiratória, ocasionada pela degeneração neuromuscular.17 A etiologia da ELA ainda não é totalmente esclarecida. Apenas 10% dos casos possuem uma ligação familiar, enquanto 90% são de ocorrência esporádica. Evidências sugerem um processo multifatorial com complexas interações entre fatores genéticos e mecanismos moleculares vitais na etiologia da ELA.18 Fatores genéticos têm sido identificados em 20% dos casos de ELA esporádica e 60% dos casos de ELA familiar. Mais de 25 genes têm sido ligados à doença,18,19 dos quais, os principais são: SOD1 (codificador da enzima SOD1), ligado a 12 - 20% dos casos de ELA familiar e 1 - 2% dos casos esporádicos; TARDBP (codificador da proteína TDP-43); e C9orf72, cujas alterações são responsáveis por cerca de 30% dos casos de ELA familiar e 10% de ELA esporádica.14,18 Alteração do estado nutricional está presente nos pacientes que sofrem de ELA. A desnutrição é decorrente de vários fatores como disfagia, dificuldade de mastigação, dificuldade de mover as extremidades, ingestão calórica reduzida e hipermetabolismo.20 A perda de peso e a redução do índice de massa corporal (IMC) estão associados à menor capacidade funcional e consequente progressão da doença.21 Na ELA há degeneração dos neurônios motores superiores e inferiores do córtex motor, tronco cerebral e medula espinhal, afetando a função motora. A.

(16) 15. degeneração dos axônios corticoespinhais (neurônios motores superiores) provoca a formação de cicatrizes (esclerose) nas faces laterais da medula espinhal. Além disso, com a morte dos neurônios do tronco e da medula (neurônios motores inferiores), ocorre a atrofia dos músculos da língua, orofaringe e membros (amiotrofia). Os sinais associados ao neurônio motor superior incluem o movimento diminuído, espasticidade e hiperreflexia, enquanto aqueles relacionadas aos neurônios. motores. hiporreflexia.. inferiores. incluem. fraqueza,. atrofia,. fasciculações,. e. 1,22. De acordo com a apresentação clínica inicial, a ELA pode ser classificada em ELA bulbar (cerca de 25% dos casos) e ELA espinhal (cerca de 70% dos casos). Na primeira observa-se disartria e disfagia, enquanto na segunda observa-se atrofia e fraqueza nos membros superiores e/ou inferiores. Os sinais e sintomas pioram progressivamente e se espalham, afetando outras regiões do corpo.23 Cerca de 15% a 20% dos pacientes com ELA apresentam anormalidades cognitivas progressivas, caracterizadas por mudanças de comportamento que podem levar a uma condição de demência frontotemporal.1 O diagnóstico da ELA é definido pela evidência clínica, eletrofisiológica ou neuropatológica de degeneração dos neurônios motores inferiores, associada a evidência clínica de degeneração dos neurônios motores superiores e a evolução progressiva dos sinais de uma região para outras regiões do corpo (bulbar, cervical, torácica e lombar). Os critérios do El Escorial classificam a ELA em quatro subtipos: suspeita, possível, provável ou definitiva.24,25 Considerando que o mecanismo patogênico que provoca a degeneração dos neurônios ainda não foi totalmente desvendado, nenhum tratamento medicamentoso eficaz existe atualmente. O riluzol, medicamento aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da ELA, é um inibidor da liberação de glutamato pré-sináptico. Apresenta um modesto efeito, capaz de aumentar a sobrevida do paciente em 3 a 6 meses.26 Recentemente, a FDA aprovou um fármaco considerado potente eliminador de radicais livres,27 o edaravone, como uma nova opção terapêutica para a ELA. O medicamento já estava em uso desde 2015 no Japão e Coréia do Sul. Atualmente existem outros novos fármacos sendo investigados em ensaios clínicos para a ELA.28,29 Na ausência de terapias curativas, o tratamento da ELA permanece focado no controle dos sintomas para manutenção da qualidade de vida. A atuação.

(17) 16. de equipes multidisciplinares contendo neurologistas, nutricionistas, enfermeiros, psicólogos, fonoaudiólogos, assistentes sociais, fisioterapeutas e terapeutas ocupacionais, melhora os padrões de assistência aos pacientes com ELA e, consequentemente, a qualidade de vida.18 Alguns mecanismos têm sido associados à patogênese da ELA, como excitotoxicidade. do. glutamato,. disfunção. mitocondrial,. acumulação. de. neurofilamentos, alteração da função glial, infecção viral, desequilíbrio imunológico e estresse oxidativo. No entanto, seus mecanismos específicos na patogênese da doença ainda estão sendo esclarecidos.30 O estresse oxidativo tem se destacado como um componente chave na progressão da ELA. Entre outras consequências, pode levar à formação de agregados de proteína SOD1 e TDP-43, encontrados nos neurônios motores. Nesse contexto, o cobre tem sido estudado pela sua relação com o estresse oxidativo na ELA.2 A enzima SOD1 quando deficiente em cobre, apresenta atividade alterada, passando a exercer função pró-oxidante ao invés de antioxidante.6 Esse processo desencadeia perturbações na homeostase celular levando à morte seletiva de neurônios motores.7 Além disso, tem sido demonstrado que o cobre pode influenciar a agregação da proteína TDP-43. Ao mesmo tempo, a TDP-43 mutante também tem o poder de afetar a homeostase do cobre e provocar sintomas motores, demonstrando assim uma vulnerabilidade dos neurônios motores aos mecanismos homeostáticos do cobre.7 A participação do mineral no processo de progressão da doença também tem sido ligada a mecanismos relacionados à disfunção mitocondrial. Alterações em certas enzimas cobre-dependentes com papéis na função mitocondrial sustentam a visão de que o cobre mitocondrial está envolvido na fisiopatologia da ELA.7. 4.2 COBRE O cobre é um elemento traço presente no organismo humano, reconhecidamente importante por apresentar inúmeras funções como cofator para várias enzimas envolvidas nos processos de oxidação-redução, respiração celular, síntese de neurotransmissores, metabolismo do ferro, dentre outros.31 Nos sistemas biológicos, o cobre se apresenta em dois estados de oxidação: íon cúprico (Cu+2) e íon cuproso (Cu+1). Isso facilita sua capacidade de interconversão entre os estados de oxidação, tornando-o útil para várias enzimas.

(18) 17. envolvidas em processos de oxidação-redução.32 Dessa forma, o papel do cobre no organismo está relacionado a ação de enzimas e proteínas cobre-dependentes. Dentre essas, destacam-se: citocromo c oxidase, enzima terminal da cadeia transportadora de elétrons na fosforilação oxidativa, na qual o cobre atua reduzindo o oxigênio; superóxido dismutase (SOD1), enzima antioxidante que detoxifica radicais superóxidos nos tecidos por meio de reações de oxidação-redução; lisil oxidase, enzima essencial na síntese de colágeno e elastina; tirosinase, enzima envolvida na conversão de tirosina em melanina;. dopamina. beta-hidroxilase,. enzima. atuante. na. conversão. de. norepinefrina a partir da dopamina; peptidilglicina monooxigenase α-amidação, enzima essencial na síntese de hormônios pituitários; e ceruloplasmina.3 A ceruloplasmina é uma proteína de transporte plasmático onde cerca de 90% do cobre no sangue é incorporado e carreado para os tecidos. Atua também como enzima catalisando a oxidação de minerais, sobretudo o ferro (transformando Fe2+ em Fe3+).33 Devido sua atuação como antioxidante na eliminação de radicais livres, a ceruloplasmina é considerada um dos principais agentes de proteção do sistema nervoso central contra os danos provocados pelo estresse oxidativo.34 Além da atuação como cofator enzimático, o cobre desempenha funções não enzimáticas na angiogênese, mielinização dos nervos e atividade da endorfina. Desempenha também um papel imprescindível no desenvolvimento do cérebro, como. demonstrado. na. doença. de. Menkes,. onde. há. desmielinização. e. neurodegeneração causadas pela deficiência congênita desse micronutriente. Ademais, esse mineral é essencial para reprodução, regulação da expressão gênica, crescimento e desenvolvimento.3 A ingestão de cobre pelos adultos varia de 0,6 a 1,6 mg/dia.35 É absorvido no estômago, no duodeno e em todo o intestino delgado, com predominância no íleo.3 A quantidade de cobre absorvida é proporcional a quantidade ingerida. Quando a ingestão é inferior a 1 mg/dia, mais de 50% do cobre dietético é absorvido. Por outro lado, quando a ingestão é superior a 5 mg/dia, menos de 20% é absorvido.35 A recomendação diária de ingestão de cobre para adultos é 0,7 mg e o limite superior de ingestão tolerável é 10mg36. Suas principais fontes alimentares são sementes, grãos, nozes, feijão, mariscos e fígado.37 O cobre é absorvido nos enterócitos principalmente pela proteína de transporte de cobre humana 1 (CTR1), e em menor escala pelo transportador de.

(19) 18. metal bivalente-1 (DMT1). No citosol, a metalotioneína realiza o transporte do cobre para a membrana basolateral. Em seguida, liga-se ao transportador ATP7A e chega a circulação portal, onde é transportado para o fígado principalmente pela albumina ou, em menor proporção, por outros compostos, como aminoácidos, peptídeos e ácidos graxos.3,35,37 Nos hepatócitos, o cobre é rapidamente absorvido via CTR1, seguindo três possíveis rotas: ser quelado pela metalotioneína para armazenamento; ligar-se à glutationa (GSH), que também desempenha papel na excreção biliar e na transferência de cobre para cuproproteínas, incluindo metalotioneínas; ou ligar-se às proteínas de transporte intracelular (chaperonas de cobre) para distribuição à proteínas específicas. Os níveis corporais totais de cobre também são controlados no fígado, principal local de armazenamento e regulação de sua excreção pela bile.35,37 De uma forma geral, distúrbios na homeostase do cobre levam a um desequilíbrio no sistema oxidação-redução, com efeitos pró-oxidantes.10 A deficiência de cobre é rara em indivíduos saudáveis, ocorrendo principalmente em pessoas com má absorção severa ou doença metabólica hereditária, como a doença de Wilson e a doença de Menkes, causadas por mutações nos genes ATP7B e ATP7A, respectivamente.37,38 Os sinais e sintomas da deficiência de cobre resultam da atividade diminuída de enzimas cobre-dependentes.35 Dentre esses, destacam-se defeitos no tecido conjuntivo, problemas vasculares e esqueléticos, alterações no metabolismo do colesterol, distúrbios do metabolismo de outros elementos traço como o ferro e disfunção do sistema nervoso central.37,39 A toxicidade do cobre como resultado da ingestão em excesso pela dieta não é preocupante, devido aos eficientes mecanismos homeostáticos que controlam a absorção e a excreção desse mineral.40 Apesar da inexistência de um biomarcador padrão-ouro em sensibilidade e especificidade para avaliação do estado de cobre no organismo, os ensaios clínicos têm utilizado dosagens de cobre e ceruloplasmina no soro e plasma, e atividade de cuproenzimas em diversos componentes sanguíneos.40. 4.3 COBRE E PERFIL LIPÍDICO Muitos estudos têm investigado o efeito da ingestão, suplementação e/ou concentração de cobre sobre o perfil lipídico (Tabela 1). Os resultados demonstram.

(20) 19. possível influência do cobre sobre o metabolismo lipídico.. Tabela 1: Estudos que avaliaram relação entre cobre e perfil lipídico. Autor, ano. População. Tipo de estudo. Variáveis de interesse. Resultado. Intervenção. Concentração de cobre extracelular e expressão de genes relacionados ao metabolismo lipídico. A concentração isofisiológica de cobre (2M) induziu expressão de genes envolvidos no metabolismo lipídico.. Alta ingestão de cobre (60mg/kg) promoveu aumento significativo de CT e LDL-c. A presença de diabetes aumentou a suscetibilidade à toxicidade do cobre, comprovada por dislipidemia, estresse oxidativo e disfunção renal.. Estudos in vitro GutiérrezGarcía et al., 201311. Linhagem de células sanguíneas Jurkat e THP-1. Estudos em animais Galhardi et al., 200441. Ratos Wistar machos. Intervenção. Ingestão de cobre, diabetes e perfil lipídico. Galhardi et al., 200542. Ratos Wistar machos. Intervenção. Ingestão de cobre Suplementação de cobre e perfil lipídico (6g/g) teve efeitos benéficos sobre os lipídios séricos, reduzindo os níveis de CT, LDL-c e TGL.. Estudos em humanos Lima et al., 200643. Crianças e adolescentes acima do peso. Associação. Cobre no plasma, eritrócitário e perfil lipídico. Foram observadas correlações negativas entre o cobre no plasma e CT, e cobre no plasma e LDL-c no grupo masculino obeso.. Bo et al., 200844. Adultos de 45 a 64 anos. Associação. Ingestão de cobre, cobre no soro e perfil lipídico. Alta ingestão de cobre induziu diminuição do LDLc e CT. Houve associação inversa entre o cobre no soro e os níveis de LDL-c e CT.. Rai et al., 201345. Adultos de 20 a 60 anos. Associação. Cobre no soro e perfil lipídico. Houve associação positiva entre cobre e os níveis de CT e TGL.. RojasSobarzo et al., 201346. Homens adultos saudáveis. Intervenção. Ingestão de cobre Não houve correlação e perfil lipídico significativa..

(21) 20. Al-khateeb Idosos et al., 201447. Associação. Cobre no soro, perfil lipídico e declínio cognitivo. Não houve correlação significativa.. Choi et al., 201448. Adultos de 18 a 27 anos. Associação. Ingestão de cobre, cobre no soro e lipídios séricos. Houve correlação negativa entre cobre no soro e LDLc.. Tsuboi et al., 201449. Mulheres idosas. Associação. Cobre no soro e perfil lipídico. Houve correlação positiva entre cobre no soro e CT, e cobre no soro e colesterol não HDL-c.. Tasić et al., 201550. Adultos com aterosclerose carotídea. Associação. Cobre no soro e perfil lipídico. Houve correlação positiva entre cobre no soro e LDL no grupo controle. Não houve correlações no grupo caso.. HDL-c, HDL-colesterol; LDL-c, LDL-colesterol; TGL, triglicerídeos. Tanto a deficiência quanto o excesso de cobre geram efeitos sobre o perfil lipídico. A relação entre cobre e perfil lipídico ocorre pela natureza reativa dos íons cobre, capazes de produzir ERO e causar estresse oxidativo quando sua concentração. foge. ao. controle. homeostático. celular,. demonstrado. por. biomarcadores como malonaldeído e capacidade antioxidante total.44,45 Os lipídios de membrana e as lipoproteínas são extremamente afetados pelo estresse oxidativo. Consequentemente, a peroxidação lipídica induzida por ERO provoca alterações prejudiciais na organização e modificação da membrana celular, e perda funcional de proteínas.41,45 Na deficiência de cobre, o estresse oxidativo, causado em parte pela diminuição da atividade da SOD1, é capaz de aumentar as concentrações de colesterol. plasmático. e. contribuir. para. o. acúmulo. arterial. de. peróxidos. lipídicos.44,51,52 Adicionalmente, a hipercolesterolemia causada pela deficiência de cobre pode ser decorrente da diminuição da atividade das enzimas lipoproteína lipase, lipase hepática e lecitina-colesterol aciltransferase (LCAT),52 aumento do clearance de colesterol,44 e aumento da atividade da 3-hidroxi-3-metilglutarilcoenzima A redutase (HMG-CoA redutase), enzima participante da síntese do colesterol.4,53 Outro mecanismo apontado está relacionado às ERO produzidas na deficiência de cobre, que promovem dano oxidativo em lipoproteínas e enzimas contendo tiol, causando alterações nos lipídios plasmáticos. Nesse caso, as ERO.

(22) 21. reagem com a porção tiol da proteína gerando oxidação do enxofre, alterando os receptores de lipoproteínas e inibindo a captação celular de triglicerídeos (TGL) do sangue. Quando a relação LDL-colesterol (LDL-c)/TGL sérica é baixa, partículas LDL-c ricas em TGL são produzidas, sendo mais susceptíveis à oxidação por serem pequenas e densas.42 A deficiência de cobre também tem sido relacionada a modificações no tamanho, número e composição das lipoproteínas. As alterações na composição dessas lipoproteínas podem ser causadas pelo aumento dos níveis plasmáticos de apolipoproteínas (ApoA, ApoB e ApoE), alterando assim o colesterol plasmático. 4 O aumento na síntese hepática da ApoB parece contribuir significantemente para o aumento das concentrações plasmáticas de LDL-c contendo essencialmente ApoB100.54 Além disso, o acúmulo de HDL contendo ApoE tem sido observado na deficiência de cobre. Essas mudanças na síntese, propriedades de ligação e redistribuição de lipoproteínas sugerem alguns mecanismos por meio dos quais a deficiência de cobre afeta as concentrações séricas de colesterol.4 O excesso de íons cobre também gera ERO e estresse oxidativo. Nesse processo, ERO como ânion superóxido (O2), radicais hidroxila (OH) e peróxido de hidrogênio (H2O2) causam danos a moléculas e constituintes celulares, como ácidos nucleicos, proteínas e lipídios.35,55 Em estudo experimental, a alta ingestão de cobre em ratos induziu ao aumento das concentrações de LDL-c e colesterol total (CT). Essa alteração foi associada ao aumento do estresse oxidativo, com elevação sérica de hidroperóxidos lipídicos e redução de atividade da GSH-Px e SOD1.41 Um pequeno incremento de cobre intracelular pode também induzir a expressão de genes associados ao metabolismo dos lipídios por meio de mudanças no estado redox. Essas mudanças podem promover a atividade dos fatores de transcrição pertencentes à família SREBPs, envolvidos no metabolismo lipídico.11 Os genes relacionados ao metabolismo lipídico que tiveram sua expressão aumentada diante da exposição ao cobre foram o HMGCS1, HMGCR (codificador da HMG-CoA redutase), FDFT1, envolvidos na síntese de colesterol; FASN, envolvidos na síntese de ácidos graxos; e LDLR, incorporação de colesterol exógeno.11–13. 5 METODOLOGIA. 5.1 DESENHO E POPULAÇÃO DO ESTUDO.

(23) 22. O estudo realizado foi do tipo transversal, tendo sido aprovado pelo Comitê de Ética do HUOL (CEP-HUOL), sob CAAE 40467214.0.0000.5292 (Anexo 1). Todos os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. A amostra foi composta por pacientes com ELA atendidos no Ambulatório Multidisciplinar de ELA/HUOL, Natal/RN, Brasil, no período de março/2016 a dezembro/2016. Foram incluídos no estudo pacientes adultos e idosos, de ambos os sexos, com diagnóstico de ELA provável ou definida, em assistência médica ambulatorial e sob responsabilidade de um familiar ou cuidador alfabetizado. Foram excluídos indivíduos com diagnóstico de ELA suspeita ou possível, em uso de suplementos de micronutrientes, estrógeno (anticoncepcionais ou reposição hormonal), com presença de outra doença neurológica, doenças inflamatórias intestinais, disfunção na tireoide, diabetes mellitus e doenças renal, hepática e biliar, devido possível interferência dessas variáveis no status do cobre. Para efeitos de comparação, foi estabelecido um grupo controle composto por indivíduos adultos e idosos sem ELA. A triagem desse grupo ocorreu mediante divulgação em mídia social à comunidade. Foi realizado pareamento por sexo e idade em relação ao grupo caso, como método de controle de qualidade dos dados. Foram excluídos indivíduos em uso de suplementos de micronutrientes, de estrógenos (anticoncepcionais ou reposição hormonal), indivíduos com doença neurológica, dislipidemia familiar, disfunção na tireoide, diabetes mellitus e doenças renal, hepática e biliar. O estudo transcorreu de acordo com as etapas descritas no fluxograma a seguir (Figura 1)..

(24) 23. Figura 1: Fluxograma de delineamento do estudo.. 5.2 CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA Os pacientes com ELA foram caracterizados quanto ao início dos sintomas (bulbar ou espinhal), tempo dos sintomas (em meses), via de alimentação (oral e/ou enteral) e capacidade funcional mediante a escala funcional revisada para ELA (ALS Functional Rating Scale-Revised, ALSFRS-R)56 adaptada à língua portuguesa (Anexo 2).57 Esse instrumento avalia a progressão da incapacidade dos pacientes e a severidade da doença por meio de um questionário de 12 itens abrangendo. aspectos. relacionados. a. disfagia,. atividades. da. vida. diária,. deambulação e respiração. O escore total da ALSFRS-R pode variar de 48 a 0, onde 48 representa uma capacidade funcional normal e 0 o pior estágio de incapacidade. Na apresentação dos resultados, os pacientes foram distribuídos em dois grupos a partir do ponto médio do escore da escala funcional..

(25) 24. 5.3 AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA O estado nutricional antropométrico dos participantes foi avaliado por meio do índice de massa corporal (IMC), que consiste na relação entre massa corporal e altura (kg/m²).58 O peso corporal foi aferido em balança calibrada de plataforma eletrônica Knwaagen®, capacidade de 500kg. A estatura foi mensurada mediante estadiômetro compacto Medjet®. A altura dos indivíduos impossibilitados de deambular foi estimada de acordo com Chumlea.59,60. 5.4 AVALIAÇÃO DO STATUS DO COBRE E PERFIL LIPÍDICO. Ingestão dietética de cobre O consumo dietético habitual de cobre foi obtido mediante Recordatório Alimentar de 24h (R24h) de dois dias de semana não consecutivos, considerando intervalo de 30 a 45 dias entre eles, seguindo recomendações da literatura.61 Cada R24h foi respondido pelo próprio paciente ou seu cuidador responsável. Os dados foram analisados por meio do software Virtual Nutri Plus® 2.0. Os alimentos que não compunham o banco de dados do programa foram inseridos com base nos rótulos nutricionais. Em virtude da variabilidade dos dados dietéticos, o consumo habitual de cobre dietético foi obtido após remoção da variabilidade intrapessoal, de acordo com o método desenvolvido por Nusser et al.,62 e ajuste pela energia, através do método de resíduo.63 Os valores da ingestão de cobre foram comparados à recomendação do Institute of Medicine (IOM),36 cuja Necessidade Média Estimada (Estimated Average Requirements, EAR) para cobre é de 0,7mg/d para adultos de ambos os sexos.. Cobre no plasma, ceruloplasmina no soro e perfil lipídico Após jejum noturno, amostras de sangue dos participantes foram coletadas em tubos específicos para realização de todas as análises hematológicas. Para avaliação do cobre no plasma, amostras de sangue foram coletadas em tubo desmineralizado contento 100µL de citrato de sódio a 30%. Para avaliação da ceruloplasmina no soro, amostras de sangue foram coletadas em tubos com gel clot activator (BD Vacutainer® SST™ II Advance, BD, UK). Para o perfil lipídico, amostras de sangue foram coletadas em tubos com gel clot activator (VacuTube, Biocon, BR)..

(26) 25. A determinação de cobre no plasma foi realizada por meio de espectrofotometria de absorção atômica, utilizando-se o equipamento Spectra Varian AA-240 (Varian®, US), no Núcleo de Ensino e Pesquisa em Petróleo e Gás (NUPEG) da UFRN. As amostras foram centrifugadas à 3.000rpm por 15min à 4°C. A curva padrão foi preparada com uma solução de cobre Tritisol® (Merck, Darmstadt, DE), diluída em água deionizada com glicerol a 5%, nas concentrações 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 e 1,0 µg/mL. Alíquotas de 600µL de plasma foram diluídas em água deionizada na proporção 1:5 e, após leitura, os resultados foram expressos em µg/dL. As análises foram feitas em duplicata, considerando um coeficiente de variação inferior a 10%. Foram considerados os valores de referência de 70140µg/dL de cobre no plasma para ambos os sexos.64 As análises de ceruloplasmina no soro e perfil lipídico foram realizadas em laboratório particular certificado. O método de nefelometria foi usado para mensurar a ceruloplasmina no soro e considerado como valor de referência 2153mg/dL para ambos os sexos. As dosagens de CT, HDL-c e TGL foram realizadas pelo método enzimático colorimétrico. Os valores de LDL-c foram calculados através da fórmula de Friedewald.65. 5.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA Foi realizada análise descritiva através de medidas de tendência central e dispersão, de acordo o tipo de dado. Utilizou-se o teste de normalidade Shapiro-Wilk para verificação da normalidade dos dados. Para testar diferenças entre as variáveis contínuas foi utilizado o teste t de Student e Wilcoxon-Mann-Whitney. A análise inferencial foi desenvolvida através da estimação da correlação entre os marcadores do status de cobre e perfil lipídico. Para isso, foi utilizado o teste de correlação de Spearman. Após. a. análise. univariada,. estimou-se. o. efeito. das. variáveis. independentes para o desfecho escore da ALSFRS-R (discreto). As variáveis independentes consideradas no estudo foram: cobre dietético, cobre no plasma, ceruloplasmina no soro, CT, LDL-c, HDL-c e TGL. Foi utilizada uma modelagem bruta e ajustada baseada na distribuição de Poisson, ideal para desfechos discretos em desenhos transversais. O ponto de corte considerado foi de p<0,30 para a inclusão das variáveis no modelo final ajustado. Para aceitar o modelo final, avaliouse a significância do mesmo por meio do teste qui-quadrado da razão de.

(27) 26. verossimilhança, e das variáveis separadamente pelo teste qui-quadrado de Wald para estimação de coeficientes de regressão. A distribuição de normalidade foi testada para os resíduos como forma de garantir a validade do modelo. Os dados foram organizados e analisados no IBM SPSS, versão 22. Adotou-se um nível de significância de 5%..

(28) 27. 6 ARTIGO CIENTÍFICO 6.1 O artigo intitulado “Association of copper status with lipid profile and functional status in patients with amyotrophic lateral sclerosis” foi submetido para publicação no periódico “Journal of Trace Elements in Medicine and Biology”, que possui fator de impacto 3.225 (2016) e Qualis B1 da CAPES para área de Nutrição..

(29) 28. Association of copper status with lipid profile and functional status in patients with amyotrophic lateral sclerosis. ABSTRACT Oxidative stress is one of the main mechanisms associated with the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Copper can affect cellular oxidation and lipid metabolism. The aim of this study was to evaluate the association of copper status with lipid profile and functional status in patients with ALS. A cross-sectional study was carried out including 27 patients with ALS (case group) and 26 healthy individuals (control group). Copper status was evaluated by habitual dietary copper intake, plasma copper and serum ceruloplasmin concentrations. The lipid profile included analysis of serum total cholesterol (TC), LDL-cholesterol (LDL-c), HDLcholesterol (HDL-c), and triglycerides (TGL). The functional status of patients with ALS was assessed by the revised ALS functional rating scale (ALSFRS-R). In the case group, plasma copper was lower compared to the control group (133.9 vs. 164.1 g/dL, p=0.0001) and was positively correlated with HDL-c (rs=0.398, p=0.044). In the control group, plasma copper was positively correlated with serum ceruloplasmin (rs=0.646, p<0.001), TC (rs=0.446, p=0.025), LDL-c (rs=0.445, p=0.029) and HDL-c (rs=0.479, p=0.015), and serum ceruloplasmin was positively correlated only with LDL-c (rs=0.407, p=0.043). In the case group, dietary copper intake (B=-0.373, p<0.001), plasma copper (B=-0.005, p=0.033) and TC (B=-0.312; p=0.001) were inversely associated with the functional status of patients with ALS. In contrast, serum ceruloplasmin (B=0.016, p=0.044), LDL-c (B=0.314, p=0.001), HDL-c (B=0.308, p=0.001) and TGL (B=0.062; p=0.001) were positively associated with their functional status. In conclusion, this study suggests a disturbance of copper status and its connection with the lipid profile in patients with ALS. Furthermore, copper status and lipid profile may influence the functional status of patients with ALS, standing out as potential biomarkers of disease severity.. Key words: amyotrophic lateral sclerosis, copper, lipid profile. INTRODUCTION Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive and fatal disease characterized by degeneration of motor neurons in the brain and spinal cord, leading.

(30) 29. to skeletal muscles paralysis.[1] Oxidative stress is one of the most studied mechanisms related to the pathogenesis of ALS and appears to be a key component of its progression.[2] In this sense, copper has been extensively studied and plays an important role in the central nervous system (CNS) and influences the state of cellular oxidation. Copper is a key component in angiogenesis, myelination, neurotransmission, cellular respiration and antioxidant defense. Disturbances in copper homeostasis generate functional impairments in the CNS, including symptoms of neurodegeneration.[3] Both copper excess and deficiency contribute to oxidative stress. Copper excess catalyzes biochemical reactions that produce reactive oxygen species. Copper deficiency, in turn, leads to poor activity of antioxidant enzymes, such as superoxide. dismutase. (SOD),. glutathione. peroxidase. (GSH-Px). and. metallothionein.[4] Copper-mediated oxidative stress is associated with changes in genes expression, lipoprotein structure, membrane receptors, and consequently, lipid profile.[5] Considering the scarcity of studies on this subject, the present study aimed to evaluate the association of copper status with lipid profile and functional status in patients with ALS.. MATERIALS AND METHODS Participants and Study Design This cross-sectional study was reviewed and approved by the ethics committee of the Onofre Lopes University Hospital in Natal, Brazil (CAAE 40467214.0.0000.5292). All subjects provided written, informed consent before enrollment. The case group consisted of patients with ALS treated at the multidisciplinary outpatient facility at Onofre Lopes University Hospital in Natal, Brazil, between March 2016 and December 2016. Inclusion criteria were patients of both sexes with probable or definite ALS diagnosis and under the care of a literate family member or caregiver. Exclusion criteria were patients with suspected or possible ALS diagnosis, taking micronutrients supplements, undergoing estrogen treatment, with another neurological disease, inflammatory bowel disease, biliary diseases, thyroid dysfunction, diabetes mellitus, renal and hepatic diseases. These exclusion criteria were adopted due to their possible influence on copper status. For comparison.

(31) 30. purposes, healthy adults and elderly individuals were recruited as the control group. The recruitment of the control group occurred through social media invitations sent to the local community. A matching based on age and sex was adopted to improve the quality of the data. The same exclusion criteria were adopted to the control group.. Clinical Characterization Patients with ALS were characterized by the onset site of symptoms (bulbar or spinal), time of symptoms (in months), feeding route (oral and/or enteral), and functional status using the ALS Functional Rating Scale-Revised (ALSFRS-R)[6] and validated to the Portuguese language.[7] This instrument evaluates the progression of patients' disability and the severity of the disease through a 12-item questionnaire, covering aspects related to dysphagia, daily life activities, and respiratory function. The overall ALSFRS-R score ranged from 48 to 0, where 48 represents normal functional status and 0 represents the worst stage of disability.. Anthropometric Assessment The anthropometric assessment was performed utilizing the body mass index (BMI).[8] The body weight was measured in a calibrated digital Knwaagen® scale with maximum capacity of 500kg. The height was measured using a Medjet® stadiometer. For wheelchair patients, the height was estimated according to Chumlea et al.[9,10]. Copper Status and Lipid Profile Evaluation Dietary Copper Intake Habitual dietary copper intake was investigated using two non-consecutive 24hour recalls for each participant, obtained from weekdays, 30 to 45 days apart.[11] Food intake data was calculated using Virtual Nutri Plus® 2.0 software. Food items or preparations that were not found in the software’s databank were added based on the nutrition labels of industrialized products. Habitual dietary copper intake was estimated after adjustments of interpersonal variability, according to Nusser et al.[12] Next, copper intake was adjusted for energy, applying the residual method described by Willet et al.[13] The Estimated Average Requirement (EAR) for copper (0.7mg/day)[14] was used as a parameter to assess copper intake..

(32) 31. Plasma Copper, Serum Ceruloplasmin and Lipid Profile After an overnight fast, blood samples were collected from participants in specific tubes to perform all hematological analysis. For plasma copper evaluation, blood samples were collected in metal free tubes with 100µL of 30% sodium citrate anticoagulant. For serum ceruloplasmin evaluation, blood samples were collected in tubes with gel clot activator (BD Vacutainer® SST™ II Advance, BD, UK). For lipid profile evaluation, blood samples were collected in tubes with gel clot activator (VacuTube, Biocon, BR). Plasma copper concentrations were determined by atomic absorption spectrophotometry (SpectrAA200, Varian, Victoria, Australia). The samples were centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes at 4ºC, and the plasma was separated and stored in a freezer at -20ºC until analysis. The calibration curves were prepared with Titrisol® standard solution (Merck, Germany), at the following concentrations: 0.00, 0.10, 0.20, 0.30, 0.50 and 1.00µg/mL. Aliquots of 600μL of plasma were diluted in deionized water at 1:5 ratio. After reading, the results were expressed as μg/dL. Analysis was conducted in duplicate and the results were calculated from the average of the readings, establishing a coefficient of variation of less than 10%. A range of 70-140 µg/dL was considered as reference value for plasma copper for both sexes.[15] Serum ceruloplasmin and lipid profile analysis were performed in a private certified laboratory.. The nephelometry method was used to measure serum. ceruloplasmin and 21-53 mg/dL was considered as reference range for both sexes. Serum total cholesterol (TC), HDL-cholesterol (HDL-c) and triglyceride (TGL) were measured by the colorimetric enzymatic method. The LDL-cholesterol values (LDL-c) were calculated using the Friedewald formula.[16]. Statistical Analysis The descriptive analysis was performed using measures of central tendency and dispersion, according to the data type. The Shapiro-Wilk test was applied to verify the normality of the data. To verify differences between the continuous variables, Student's t-test and Wilcoxon-Mann-Whitney test were used. The inferential analysis was performed by estimating the correlation between copper status and the lipid profile by Spearman correlation test. The effect of independent variables on the outcome (discrete), measured by.

(33) 32. the ALSFRS-R score, was estimated after the univariate analysis. An adjusted model based on the Poisson distribution was used, as recommended for discrete outcomes in transversal studies. Dietary copper, plasma copper, serum ceruloplasmin, TC, LDL-c, HDL-c, and TGL were considered independent variables. The cutoff point for the inclusion of the variables in the adjusted final model was p <0.30. In order to accept the final model, its significance was assessed using the chi-square test phrased as likelihood ratio. The variables were assessed separately by Wald chi-square test to estimate the regression coefficients. The presence of normality was tested for residues to guarantee the validity of the model. Statistical analysis was performed using SPSS v.22 and a significance level of 5% was adopted for all analyses.. RESULTS Of the 53 subjects enrolled in the study, 27 comprised the case group, and 26 the control group. The mean age of the participants in the case and control group was 56 (12.6) and 55.4 (12.5) years, respectively. The case group presented a significantly lower BMI (p <0.0001) compared to the control group. The case group had a disease time of 46 (22-72) months and 60% of the patients had ≤ 24 points in the ALSFRS-R functional scale score (Table 1). Dietary copper intake did not differ significantly between the groups (p=0.4122). The values of copper biomarkers and lipid profile were similar between the groups. However, plasma copper concentrations in the case group were significantly lower in the control group (133.9 vs. 164.1 g/dL, p=0.0001) (Table 1). In the case group, plasma copper was positively correlated only with HDL-c (rs=0.398, p=0.044). In the control group, plasma copper was positively correlated not only with HDL-c (rs=0.479, p=0.015), but also with serum ceruloplasmin (rs=0.646, p<0.001), TC (rs=0.446, p=0.025), and LDL-c (rs=0.445, p=0.029). Serum ceruloplasmin was positively correlated only with the LDL-c in the control group (rs=0.407, p=0.043). Neither plasma copper nor serum ceruloplasmin were correlated with dietary copper (Table 2). In the case group, dietary copper (B=-0.373, p<0.001), plasma copper (B=0.005, p=0.033) and TC (B=-0.312, p=0.001) were inversely associated with the ALSFRS-R score, especially dietary copper which had the strongest association. On the other hand, serum ceruloplasmin (B=0.016, p=0.044), LDL-c (B=0.314, p=0.001),.

(34) 33. HDL-c (B=0.308, p=0.001), and TGL (B=0.062, p=0.001) were positively associated with the ALSFRS-R score (Table 3).. DISCUSSION The case group presented a mean BMI significantly lower compared to the control group. Malnutrition is common in ALS due to dysphagia and low food intake. Weight loss and reduced BMI are associated with accelerated disease progression and lower survival rate.[17] Hypermetabolism in ALS can be explained by the presence of fasciculations, mitochondrial damage and respiratory failure, and may contribute to weight loss and malnutrition.[18] Spinal onset ALS, as found in most patients of this study, has less impairment in the swallowing ability than bulbar onset ALS. This explains the use of enteral nutrition by the minority of the patients studied. In our protocol, previously published [19], enteral nutrition is indicated in cases of BMI below 18.5 kg/m 2 or body weight loss above 10%. The majority of patients presented low ALSFRS-R score, representing high disability and disease severity. Authors have shown that BMI is significantly lower in patients in the lowest tertile of ALSFRS-R.[20] However, in our study, there was no significant association between BMI and ALSFRS-R scores (data not shown). Our results showed that there was no difference in dietary copper intake between the groups. In addition, the median dietary copper intake in the case and control group was in agreement with the recommendations adopted.[14] Park et al.,[20] found the dietary copper intake among patients with ALS ranged from 0.9 mg/day to 1.2 mg/day. In our study, this variation was broader (Table 1), demonstrating a greater copper supply by the diet. Contrary to our results and using mass spectrometry method, Forte et al.[21] found a significant higher concentration of blood copper in patients with ALS (103.5 g/dL) compared to the control group (95.4 g/dL). In addition, these authors found a positive association between blood copper with the variables age, duration of disease and BMI of the patients. Other studies found no significant difference in plasma copper. concentrations. between ALS. patients. and. healthy. subjects.[22,23]. Considering the clinical heterogeneity among ALS patients, reference range for blood copper concentrations in subjects with and without ALS should be reviewed.[21] Mineral metabolism disturbances in patients with ALS may be due to several.

(35) 34. factors, such as malnutrition, malabsorption, increased excretion and competition between minerals at binding sites.[22] In addition, oxidative stress in patients with ALS may alter copper homeostasis[4,24] and contribute to neurodegeneration.[25] At the same time, copper-deficient SOD1 has loss of antioxidant function and exerts a pro-oxidant function.[26] Interestingly, the level of copper deficiency seems to be proportional to the clinical severity of ALS.[27] In agreement with our results, some authors also did not observe significant differences. in. the. lipid. profile. between. patients. with. ALS. and. healthy. individuals.[28,29] However, other authors found significantly higher concentrations of TC, LDL-c and TGL in female patients with ALS compared to male ones.[30] Nevertheless, significant lower concentrations of TGL have already been found in male individuals with ALS compared to the control group.[31] In our study, there was no difference of serum lipids between males and females, in both groups (data not shown). No correlation of dietary copper with plasma copper and serum ceruloplasmin was observed in both groups studied. In a recent review, Bost et al.[32] found that biomarkers of copper not necessary respond to changes in dietary copper intake, probably due to homeostatic mechanisms controlling the absorption and excretion of this mineral. There was no correlation between plasma copper and serum ceruloplasmin in the case group, but this correlation was positive in the control group. Ceruloplasmin is the main copper binding protein in blood, carrying 90% of copper in blood and providing copper to other tissues. Moreover, ceruloplasmin exhibits a copperdependent oxidase activity, which is associated with the oxidation of iron.[33] Due to of its antioxidant role, ceruloplasmin is considered one of the main protective agents against the damage caused by oxidative stress in the CNS. [34] Conti et al.[34] observed that patients with ALS had increased expression of ceruloplasmin in the cerebrospinal fluid. Moreover, there was functional impairment of this protein in ALS patients compared to healthy individuals. Disturbances of ceruloplasmin activity, observed in ALS, may contribute to the death of motor neurons.[35] In addition, lack of copper incorporation during ceruloplasmin biosynthesis results in secretion of an unstable polypeptide that is rapidly degraded in plasma.[36] Both. copper excess. and. copper. deficiency may alter. serum. lipid.

(36) 35. concentrations.[5] However, this relationship was not investigated in ALS patients in previous studies. In our study, the only correlation found between the copper biomarkers and the lipid profile in the case group was a positive correlation between plasma copper and HDL-c. It is possible that changes in serum lipids, oxidative stress and alterations in copper metabolism in ALS are responsible for the absence of correlation between copper and serum lipids, differing from what was found in the control group. Some studies have shown different associations between serum copper and lipids depending on the population studied. In elderly Japanese women, serum copper was positively associated with non HDL-c.[37] In patients with carotid atherosclerosis, serum copper was positively associated with LDL-c.[38] Also, in healthy adults, serum copper was inversely associated with HDL-c and TGL.[39] Moreover, serum and plasma copper was inversely associated with TC and LDL-c in asymptomatic adults[40] and obese male children and adolescents,[41] respectively. Divergently, no correlation was found between serum copper and lipid profile in elderly Jordanians.[42] Despite great phenotypic heterogeneity among individuals, the influence of copper on the lipid profile is influenced by oxidative stress. Changes in the redox state are responsible for activate transcription factors belonging to the sterol regulatory element-binding protein family (SREBPs), upregulating the expression of genes related to lipid metabolism and, consequently, increasing the levels of serum lipids concentrations.[43-45] We observed that patients with worst functional status had higher dietary copper intake, higher plasma copper concentrations, and lower serum ceruloplasmin concentrations. These findings reinforce the need for further investigation about the incorporation and transport of copper by ceruloplasmin in patients with ALS. In disagreement with our results, authors have found positive association between concentration of copper in nails of patients with ALS and functional status assessed by ALSFRS-R.[46] However, Peter et al.[22] found no association between the ALSFRS-R score and concentrations of plasma copper. Copper is indirectly involved with motor neuron degeneration mechanisms in ALS by mutation of the copper-dependent enzyme SOD-1, TDP-43 protein aggregation, and mitochondrial dysfunction.[27] The lipid profile as well as the copper status biomarkers presented distinct.

(37) 36. associations with the ALSFRS-R (Table 3). This fact may occur due to possible oxidation of cholesterol mediated by the copper as the disease progresses. The positive association found between functional status and serum lipids as LDL-c, HDLc, and TGL, corroborates with the possible protective effect of hyperlipidemia in the survival of patients with ALS demonstrated in some studies.[28,47-49]. CONCLUSION This study suggests a disturbance of copper status and its connection with the lipid profile in patients with ALS. Furthermore, copper status and lipid profile may influence the functional status of patients with ALS, standing out as potential biomarkers of disease severity. These findings demonstrate the need for further studies on this topic, considering larger samples and including other biomarkers of copper status and oxidative stress.. CONFLICT OF INTERESTS The authors declare that they have no competing interests.. ACKNOWLEDGMENTS This work was supported in part by the Foundation for research support from the state of Rio Grande do Norte (FAPERN) and Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES), grant number 006/2014.. REFERENCES [1]. R.H. Brown, A. Al-Chalabi, Amyotrophic lateral sclerosis, N. Engl. J. Med. 377 (2017) 162-172.. [2]. F. Bozzo, A. Mirra, M.T. Carrì, Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: New perspectives, Neurosci. Lett. 636 (2017) 3-8.. [3]. G. Crisponi, V.M. Nurchi, D. Fanni, C. Gerosa, S. Nemolato, G. Faa, Copperrelated diseases: From chemistry to molecular pathology, Coord. Chem. Rev. 254 (2010) 876-889.. [4]. J.Y. Uriu-Adams, C.L. Keen, Copper, oxidative stress, and human health, Mol. Aspects. Med. 26 (2005) 268-298.. [5]. J.L. Burkhead, S. Lutsenko, The Role of Copper as a Modifier of Lipid Metabolism, in: R.V. Baez (Ed), Lipid Metabolism, InTech, Croatia, 201, pp. 39-.

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