O efeito da carboplatina e do piroxicam em duas linhas celulares humanas de cancro da bexiga

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

O efeito da carboplatina e do piroxicam em duas linhas celulares

humanas de cancro da bexiga

Jessica Eira Silva

Orientadora:

Professora Doutora Paula A. Oliveira

Co-Orientadora:

Doutora Regina Maria Rodrigues Arantes

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

O efeito da carboplatina e do piroxicam em duas linhas celulares

humanas de cancro da bexiga

Dissertação apresentada à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Biologia Clínica Laboratorial, realizada sob a orientação científica da Professora Doutora Paula Alexandra Martins de Oliveira e da Doutora Regina Maria Rodrigues Arantes.

Orientadores:

___________________________________________________

Professora Doutora Paula Alexandra Martins de Oliveira

___________________________________________________

Publicações decorrentes e relacionadas com o trabalho experimental

Sob a forma de abstract em revistas indexadas do ISI Silva J, Pinto-Leite R, Faustino-Rocha A, Colaço A, Arantes-Rodrigues R, Oliveira P (2014). Autophagy and apoptosis analysis on T24 and 5637 cells induced by carboplatin and piroxicam. Anticancer Research. 34 (10): 5901. Silva J, Pinto-Leite R, Faustino-Rocha A, Colaço A, Arantes-Rodrigues R, Oliveira P (2014). Carboplatin and piroxicam effects on human urinary bladder cancer cell lines. Anticancer Research. 34 (10): 5902. Sob a forma de painel em congressos internacionais Silva J, Pinto-Leite R, Faustino-Rocha A, Colaço A, Arantes-Rodrigues R, Oliveira P (2014). Autophagy and apoptosis analysis on T24 and 5637 cells induced by carboplatin and piroxicam. 9th _{International Conference of Anticancer Research, 6-10 outubro, Grécia.}

Silva J, Pinto-Leite R, Faustino-Rocha A, Colaço A, Arantes-Rodrigues R, Oliveira P (2014). Carboplatin and piroxicam effects on human urinary bladder cancer cell lines. 9th

International Conference of Anticancer Research, 6-10 outubro, Grécia. Silva J, Pinto-Leite R, Fidalgo-Gonçalves L, Costa RG, Colaço A, Arantes-RodriguesR, OliveiraP (2014). Combination of carboplatin and piroxicam leads to a synergistic interaction on two human urinary bladder cancer cell lines. 1st _{ASPIC International Congress.}

(Submetido). Sob a forma de painel em congressos nacionais Silva J, Pinto-Leite R, Faustino-Rocha A, Colaço A, Arantes-RodriguesR, OliveiraP (2014). O efeito do piroxicam em duas linhas celulares humanas de cancro da bexiga. V Fórum em Investigação Farmacológica. 23 de outubro, UTAD, Portugal. (Submetido) Deste trabalho experimental está em fase de conclusão um artigo científico que será oportunamente submetido a uma revista do ISI.

Agradecimentos

Nunca é demais agradecer àqueles que muito generosamente nos ajudam a enfrentar os desafios da vida. Assim sendo:

Agradeço à Professora Doutora Paula Oliveira por todo o apoio, atenção e disponibilidade demonstrados desde sempre. Não posso deixar de realçar o seu constante encorajamento e incentivo que me deram força para continuar.

À Doutora Regina Arantes quero agradecer pela paciência, conselhos, sugestões e esclarecimentos. Também quero agradecer todo o conhecimento e experiência que me transmitiu e pela crucial ajuda na revisão deste trabalho.

À Doutora Maria do Rosário Pinto Leite por me ter recebido no laboratório de genética do Centro Hospitalar de Trás-os-Montes. Foi para mim um grande prazer ter aprendido sob alçada da Doutora Rosário toda a metodologia da cultura de células. Um muito obrigado por todas as críticas e sugestões enriquecedoras e pelo permanente apoio e disponibilidade demonstrado.

À Doutora Marta Souto e ao Doutor Pedro Botelho agradeço por todo o companheirismo, amizade, disponibilidade e por todo o conhecimento transmitido ao longo da minha permanência no laboratório.

À Ana Faustino, pela sua grande vontade em ajudar o próximo e por todo o ensinamento transmitido.

Ao Professor Lio Gonçalves, um muito obrigado pelo contributo na análise da interação dos fármacos.

Aos meus pais, Paulo Silva e Suzete Silva, que sem dúvida são o meu pilar. Pela ajuda incondicional e por me apoiarem incessantemente neste meu sonho. À minha irmã Sandra Silva e cunhado Vitor Castanheiro por não se cansarem de ouvir as minhas lamentações e por todo o apoio e incentivo demonstrado.

Aos meus amigos de licenciatura, os quais receio esquecer-me de algum. Em especial ao Alberto Silva, Tiago Rodrigues, Joana Barbosa, Sofia Sousa, Catarina Valadares, Jessica Martins e Alfredo Barbosa, pelas conversas, desabafos e pela manifestação da sua amizade em todos os momentos bons e maus do meu percurso académico.

E por último mas não menos importante, quero agradecer à minha colega de casa Laurinda Alves pelo seu apoio absoluto e por me ajudar a ultrapassar os momentos menos bons.

Resumo

O cancro é uma das doenças mais temidas pelo Homem e de acordo com a Organização Mundial de Saúde uma em cada oito mortes é provocada por cancro. Em particular, o cancro da bexiga constitui uma doença frequente com elevado impacto socioeconómico em todo o mundo, é uma das neoplasias malignas mais comum do trato urinário, sendo precedido apenas pelo cancro da próstata. A combinação de fármacos antineoplásicos e anti-inflamatórios para o tratamento do cancro começa a ser uma abordagem cada vez mais aceite pela comunidade científica, e o uso de modelos pré-clínicos é considerada uma ferramenta fundamental em investigação oncológica.

Este estudo teve como objetivo avaliar in vitro a eficácia da carboplatina (fármaco antineoplásico) e do piroxicam (fármaco anti-inflamatório não esteroide), isoladamente e em combinado, nas linhas celulares humanas T24 e 5637 de cancro da bexiga.

O ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio foi utilizado para avaliar a viabilidade celular. Para tal, as células foram expostas a diferentes concentrações de carboplatina (0,05, 0,5 e 1 µM) e de piroxicam (167, 333 e 500 µM), isoladamente e em simultâneo. O tipo de interação existente na abordagem simultânea foi investigado pelo método de Chou e Talalay. A proliferação celular, apoptose, autofagia e alterações morfológicas celulares foram avaliados pelos métodos de imunocitoquímica, Terminal deoxynucleotidyl

transferase mediated dUTP nick end labelling (TUNEL), coloração de monodansilcadaverina

(MDC) e coloração de Leishman, respetivamente. Nestas metodologias foi utilizado 0,05 µM de carboplatina e 333 µM de piroxicam. Todas as metodologias foram realizadas após 72 horas de exposição aos fármacos. A análise estatística foi realizada com o programa SPSS, valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Isoladamente, nas concentrações mais elevadas testadas, obteve-se uma viabilidade celular de 56% e 61% (p<0,05) nas linhas T24 e 5637 após a exposição à carboplatina, enquanto na exposição ao piroxicam obteve-se valores de 54% (linha T24) e 51% (linha 5637) de viabilidade celular (p<0,05). No tratamento simultâneo obteve-se 7% de viabilidade celular na linha T24 e 8% na linha 5637 (p<0,05). A combinação dos fármacos resultou numa interação sinérgica, com valores inferiores a 1 na linha T24 (IC50=0,65) e na linha 5637 (IC50=0,17). Por

imunocitoquímica, verificou-se uma moderada expressão da proteína Ki-67 nas células tratadas com os fármacos isoladamente e uma diminuição acentuada no tratamento simultâneo. O ensaio do TUNEL revelou um efeito mínimo na obtenção de apoptose nas células tratadas com a

combinação da carboplatina e do piroxicam nas duas linhas celulares. Pela coloração de MDC observou-se um aumento notório da presença de vacúolos autofágicos quando as células foram expostas em simultâneo aos fármacos nas duas linhas celulares, quando comparado com os fármacos isoladamente. Através da coloração de Leishman observou-se uma maior incidência de corpos apoptóticos, citoplasma vacuolizado e células apoptóticas quando as células T24 e 5637 foram tratadas com ambos os fármacos.

Estes resultados sugerem um possível efeito benéfico na conjugação da carboplatina com o piroxicam nas linhas celulares de cancro da bexiga T24 e 5637. Futuros estudos em modelos

in vivo são necessários para corroborar estes resultados.

Palavras-chave:

Abstract

Cancer is one of the most feared disease by Man and, according to the World Health Organization, one in eight deaths is caused by cancer. In particular, bladder cancer is one of the most common diseases with high social-economic impact worldwide, it is one of the most common malignant tumors in the urinary tract, only preceded by prostate cancer. The combination of antineoplastic and anti-inflammatory drugs for the treatment of cancer becoming an approach increasingly accepted by the scientific community, and the use of preclinical models is considered a key tool in research.

The purpose of this study was to evaluate the in vitro efficacy of carboplatin (an antineoplastic drug) and piroxicam (an anti-inflammatory non-steroidal drug), either in isolation or combined, in T24 and 5637 human bladder cancer cell lines.

The 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay was used to evaluate cell viability. For this purpose, cells were exposed to different concentrations of carboplatin (0.05, 0.5 and 1 µM) and piroxicam (167, 333 and 500 µM), separately or simultaneously. The kind of interaction of the simultaneous approach was investigated by the Chou and Talalay method. Cell proliferation, apoptosis, autophagy and cell morphological changes were evaluated by immunocytochemistry, terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling (TUNEL), monodansylcadaverine (MDC) staining and Leishman stain, respectively. In these methodologies 0.05 µM of carboplatin and 333 µM of piroxicam were used. All assays were carried out after 72 hours of drug exposure. Statistical analysis was performed using the SPSS program, values of p<0.05 were considered to be statistically significant.

At the highest concentrations tested in isolation, therewas obtained a cell viability of 56% and 61% (p<0.05) in the 5637 and T24 cell lines, after exposure to carboplatin, while exposure of piroxicam induced 54% (T24 cell line) and 51% (5637 cell line) of cell viability (p<0.05). In the combined treatment, it was obtained 7% of cell viability in T24 cell line and 8% in 5637 cell line (p<0.05). The combination of drugs resulted in a synergistic interaction with values smaller than 1 in T24 (IC50=0.65) and 5637 (IC50=0.17) cell lines. By immunocytochemistry,

there was a moderate expression of Ki-67 protein in cells treated with the drugs alone and a marked decrease in the combined treatment. The TUNEL assay revealed a minimal effect in obtaining apoptosis in cells treated with the combination of carboplatin and piroxicam in both cell lines. In MDC staining, we observed a markedly increase in the presence of autophagic

vacuoles when cells were exposed to drugs simultaneously, in both cell lines, and when compared to the drugs alone. Through Leishman stain higher incidence of apoptotic bodies, vacuolated cytoplasm and apoptotic cells were observed when the T24 and 5637 cells were treated with both drugs.

These results suggest a possible beneficial effect of carboplatin and piroxicam combination in T24 and 5637 bladder cancer cell lines. Future studies using in vivo models are necessary to confirm these results.

Keywords:

Índice

1. Introdução ... 1

1.1. Cancro ... 3

1.2. Cancro da Bexiga ... 4

1.2.1. Epidemiologia ... 5

1.2.2. Etiologia ... 5

1.2.2.1. Fatores de risco externos ... 5

1.2.2.2. Fatores de risco internos ... 7

1.2.3. Sintomas ... 7

1.2.4. Tratamento ... 8

1.3. Linhas celulares de cancro da bexiga ... 9

1.4. Fármacos ... 13 1.4.1. Carboplatina ... 13 1.4.2. Piroxicam ... 14 2. Objetivos ... 17 3. Material e métodos ... 21 3.1. Linhas celulares ... 23 3.2. Cultura de células ... 23

3.4. Brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT) ... 23

3.4.1. Exposição das células à carboplatina e ao piroxicam isoladamente ... 23

3.4.2. Exposição das células à carboplatina e ao piroxicam conjugadamente ... 24

3.5. Estudo da interação dos fármacos ... 24

3.6. Imunocitoquímica ... 25

3.7. Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) 25 3.8. Coloração de monodansilcadaverina (MDC) ... 26

3.9. Coloração de Leishman ... 26

3.10. Análise estatística ... 27

4. Resultados ... 29

4.1. MTT ... 31

4.1.1. Efeito da carboplatina e do piroxicam isoladamente ... 31

4.1.2. Efeito da carboplatina e do piroxicam conjugadamente ... 35

4.1.3. Interação dos fármacos ... 37

4.2. Imunocitoquímica ... 37 4.3. TUNEL ... 40 4.4. Coloração de MDC ... 42 4.5. Coloração de Leishman ... 44 5. Discussão ... 47 6. Conclusão ... 55 7. Referências bibliográficas ... 59 Anexos ... 71

Índice de Figuras

Figura 1 – Taxa de incidência e de mortalidade de cancro em Portugal no ano de 2012 e previsões para 2015, 2020 e 2025 (adaptado de Globocan, 2012). ... 3 Figura 2 – Taxa de incidência e de mortalidade de cancro da bexiga em Portugal no ano de 2012 e previsões para 2015, 2020 e 2025 (adaptado de Globocan, 2012). ... 4 Figura 3 – Esquema terapêutico utilizado no cancro da bexiga (adaptado de Anastasiadis e Reijke, 2012; Pashos et al., 2002). ... 8 Figura 4 – Vantagens, desvantagens e aplicações das linhas celulares (adaptado de Arantes-Rodrigues et al., 2013; Drell et al., 2012; Kashyap et al., 2011; Mager et al., 2009; Rogero et

al., 2003). ... 12

Figura 5 – Mecanismo de ação da carboplatina (adaptado de Cepeda et al., 2007; Kelland, 2007; Klein e Hambley, 2009; Wang e Lippard, 2005). ... 14 Figura 6 – Mecanismo de ação do piroxicam (adaptado de Stolfi et al., 2013; Vane e Botting, 1995). ... 15 Figura 7 – Observação das linhas celulares T24 e 5637 ao microscópio invertido após a exposição às diferentes concentrações de carboplatina durante 72 horas. As células do grupo controlo não foram expostas ao fármaco; ampliação de 40X. ... 32 Figura 8 – Observação das linhas celulares T24 e 5637 ao microscópio invertido após a exposição às diferentes concentrações de piroxicam durante 72 horas. As células do grupo controlo não foram expostas ao fármaco; ampliação de 40X. ... 33 Figura 9 – Viabilidade celular das linhas T24 e 5637 após a exposição da carboplatina isoladamente no ensaio do MTT. * p<0,05 versus grupo controlo. Os resultados apresentados representam valores médios ± SD (SD = desvio padrão). ... 34 Figura 10 – Viabilidade celular das linhas T24 e 5637 após a exposição ao piroxicam isoladamente no ensaio do MTT. * p<0,05 versus grupo controlo. Os resultados apresentados representam valores médios ± SD (SD = desvio padrão). ... 35 Figura 11 – Viabilidade celular da linha T24 após a exposição simultânea da carboplatina e do piroxicam no ensaio do MTT. * p<0,05 versus grupo controlo. Os resultados apresentados representam valores médios ± SD (SD = desvio padrão). ... 36 Figura 12 – Viabilidade celular da linha 5637 após a exposição simultânea da carboplatina e do piroxicam no ensaio do MTT. * p<0,05 versus grupo controlo. Os resultados apresentados representam valores médios ± SD (SD = desvio padrão). ... 36

Figura 13 – Imagens representativas da expressão do Ki-67 nas linhas celulares T24 e 5637, expostas à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM) isoladamente e em combinado. A e F – controlo negativo; B e G – controlo positivo; C e H – carboplatina (0,05 µM); D e I – piroxicam (333 µM); E e J – carboplatina (0,05 µM) em simultâneo com o piroxicam (333 µM); ampliação de 200X. ... 39 Figura 14 – Índice apoptótico obtido nas linhas celulares T24 e 5637, pela técnica do TUNEL após 72 horas de exposição à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM) isoladamente e em combinado. Os resultados apresentados representam valores médios ± SD (SD = desvio padrão). ... 40 Figura 15 – Ensaio do TUNEL. Imagens representativas das linhas T24 e 5637 expostas à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM) isoladamente e em combinado. Os núcleos foram contrastados com DAPI e a fragmentação é detetada pela cor verde (FITC); ampliação original: 1000X. ... 41 Figura 16 – Coloração de MDC. Imagens representativas das células T24 e 5637 expostas à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM), isoladamente e em combinado. Os vacúolos autofágicos são representados pelas estruturas fluorescentes; ampliação original: 1000X. .... 43 Figura 17 – Coloração de Leishman. Efeitos morfológicos da carboplatina (0,05 µM) e do piroxicam (333 µM) isoladamente e em combinado nas linhas celulares T24 e 5637. Foram visualizadas características morfológicas de células em divisão (seta de cor cinza), células em apoptose (estrela), citoplasma vacuolizado (triângulo) e corpos apoptóticos (seta preta); ampliação original: 1000X. ... 45

Índice de Tabelas

Tabela 1 – Linhas celulares humanas de cancro da bexiga. ... 10 Tabela 2 – Estudo da interação dos fármacos pelo método de Chou e Talalay. ... 37 Tabela 3 – Expressão do Ki-67 nas linhas celulares T24 e 5637, após a exposição à carboplatina e ao piroxicam, isoladamente e em combinado. ... 38

Lista de Abreviaturas e Símbolos

AINEs – Fármacos anti-inflamatórios não esteroides COX – Ciclooxigenase

DAPI – 4’,6-diamidino-2-fenilindol

DAB – 3,3 diaminobenzidina tetrahidrocloreto DRI – Índice de redução da dose

IC – Índice de combinação MDC – Monodansilcadaverina

MTT – Brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio PBS – Solução tampão de fosfato

PG – Prostaglandina

RPMI – Roswell Park Memorial Institute SPSS – Statistical Program for Social Sciences

TUNEL – Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling ♀ – Mulher

1. Introdução

Capítulo 1

Introdução

1. Introdução

1.1. Cancro

O cancro é uma doença que continua a atingir milhares de pessoas todos os anos. Em 2012, o número de casos registados em todo o mundo rondou os 14 milhões e tende a aumentar com a previsão de mais de 17 milhões de novos casos estimados para 2020 (Globocan, 2012). Em 2012, morreram mais de 8 milhões de pessoas em todo o mundo com esta doença e a Globocan estima que em 2020 o número de mortes suba para os 10 milhões de pessoas (Globocan, 2012).

Em Portugal, o cancro é a segunda causa de morte a seguir às doenças cardiovasculares e os números continuam a ser preocupantes (Figura 1). Em 2012, mais de 49 mil pessoas foram diagnosticadas com cancro e cerca de 24 mil morreram desta doença. As previsões apontam para que o número de casos registados aumente para cerca de 57 mil e o número de mortes aumente para mais de 28 mil pessoas em 2025 (Globocan, 2012).

Figura 1 – Taxa de incidência e de mortalidade de cancro em Portugal no ano de 2012 e previsões para 2015, 2020 e 2025 (adaptado de Globocan, 2012).

O cancro é uma doença que está associada à divisão celular descontrolada. A divisão celular em células normais é extremamente bem regulada. Quando as células normais são expostas a irradiações, compostos carcinogénicos ou a vírus podem sofrer mutações que levam à alteração das mesmas, culminando na proliferação celular descontrolada (Lobo et al., 2007; Mitra et al., 2006). 0 10 20 30 40 50 60 2012 2015 2020 2025 Nº de ca so s/m o rt es (× 1000) Ano Incidência Mortalidade

As neoplasias podem ser classificadas como benignas ou malignas dependendo das suas características celulares. As células neoplásicas benignas exibem um crescimento lento e não perturbam o funcionamento normal do tecido, a não ser que estas comprimam estruturas vitais (Hanahan e Weinberg, 2000). Uma célula maligna apresenta alterações biológicas, prolifera e diferencia-se autonomamente, invade os tecidos adjacentes e metastiza em tecidos que não estão relacionados com a neoplasia primária (Oliveira et al., 2007). As células malignas adquirem um fenótipo que tem subjacente a autossuficiência em fatores de crescimento, insensibilidade a sinais inibidores do crescimento celular, escape à apoptose, replicação ilimitada, angiogénese e capacidade de invasão e metastização. O termo cancro é utilizado com o intuito de designar todos os tumores malignos (Hanahan e Weinberg, 2000) e é um processo que afeta os seres humanos desde os tempos pré-históricos.

1.2. Cancro da Bexiga

O cancro da bexiga é a 6ª neoplasia maligna mais frequente em todo o mundo. É o 7º mais comum nos homens e o 17º mais comum nas mulheres (Burger et al., 2013). Só em 2012, foram registados mais de 429 mil casos em todo o mundo e destes, 2876 foram registados em Portugal (Figura 2) (Globocan, 2012).

Figura 2 – Taxa de incidência e de mortalidade de cancro da bexiga em Portugal no ano de 2012 e previsões para 2015, 2020 e 2025 (adaptado de Globocan, 2012).

Em 1552, Ferri descreveu o primeiro caso de cancro da bexiga e mais tarde em 1775, Percival Pott referiu a elevada suscetibilidade que os limpadores de chaminés londrinos

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 2012 2015 2020 2025 Nº de ca so s/ m o rt es Ano Incidência Mortalidade

tinham em desenvolver cancro do escroto, em consequência da sua exposição à fuligem e ao alcatrão do carvão. Pela primeira vez foi assim estabelecida uma relação entre a exposição a substâncias químicas e o desenvolvimento de neoplasias (Guttiérrez e Salsamendi, 2001; Hayes, 1995).

1.2.1. Epidemiologia

Ao nível do trato urinário, o cancro da bexiga é a doença mais comum (Babjuk et al., 2011). A sua incidência é maior nos países industrializados, como na Europa, no Norte de África, na América do Norte e no Médio Oriente. A exceção ocorre no continente africano, onde o parasita Schistosoma haematobium é endémico (Abdulamir et al., 2009).

1.2.2. Etiologia

Existem vários fatores de risco conhecidos como potenciais ativadores da iniciação do processo neoplásico da bexiga (Pashos et al., 2002). Os fatores de risco podem ser considerados externos e internos. Externamente, as causas mais prováveis são a exposição ao tabaco, a exposição ocupacional a anilinas, aminas aromáticas e compostos cíclicos, o estilo de vida, o consumo de certos alimentos e bebidas como o café, adoçantes e bebidas alcoólicas, a exposição a agentes virais, bacterianos e parasitários. São considerados fatores de risco internos as hormonas, a condição imune, mutações que ocorrem através do metabolismo e mutações herdadas (Janković e Radosavljević, 2007).

1.2.2.1. Fatores de risco externos ○Tabaco

O tabagismo é considerado um dos principais fatores de risco associados ao desenvolvimento de cancro da bexiga, sendo responsável por 50 e 30% dos casos que ocorrem no homem e na mulher, respetivamente (Janković e Radosavljević, 2007). Estima-se que, o risco de um fumador desenvolver este cancro, é duas a seis vezes maior que a de um não fumador. O risco aumenta com o aumento do número de anos decorrentes desta prática e com o aumento do número de cigarros consumidos por dia (Castelão et al., 2001). Os fumadores de tabaco negro forte apresentam 2 a 3 vezes maior probabilidade de virem a sofrer desta neoplasia. A inalação do fumo de cigarro e o tempo de exposição ao mesmo também aumentam o risco, sendo mais frequente esta associação no sexo feminino (Burger et al., 2013;

Kunze et al., 1992). Os agentes causadores da associação entre o consumo de tabaco e o desenvolvimento de cancro da bexiga são os hidrocarbonetos aromáticos, as aminas aromáticas e os aldeídos insaturados (Negri e Vecchia, 2001; Pashos et al., 2002). Tem sido dado particular destaque às aminas aromáticas, uma vez que estas não são apenas encontradas no fumo do tabaco, mas também em vários produtos químicos. Um potencial mecanismo pelo qual as aminas induzem o processo carcinogénico consiste na formação de aductos no ácido desoxirribonucleico (ADN) que resultam em mutações (Negri e Vecchia, 2001; Pashos et al., 2002).

○Consumo de café

A possível relação entre o risco de desenvolver cancro da bexiga e o consumo de café tem vindo a ser investigada, existindo já alguns estudos que sugerem uma associação direta entre o consumo de café e a incidência de cancro da bexiga (Howe et al., 1980; Sala et al., 2000). Em contradição, estão descritos outros estudos que sugerem não existir qualquer tipo de associação entre o consumo de café e o desenvolvimento de cancro da bexiga (Morgan e Jain, 1974; Stensvold e Jacobsen, 1994). De acordo com Kirkali e seus colaboradores (2005), provavelmente ainda não foi possível obter resultados fidedignos para provar esta associação, uma vez que o consumo de café está fortemente relacionado com o consumo de tabaco.

○Exposição ocupacional

São várias as atividades que têm sido associadas com o aumento do risco de desenvolver cancro da bexiga. Estima-se que, a exposição constante e prolongada a agentes químicos usados na indústria como as aminas aromáticas, corantes, borrachas, pinturas, alumínios e couro, sejam responsáveis por mais de 20% dos casos (Negri e Vecchia, 2001). A exposição a estas substâncias está associada a zonas industriais de transformação de produtos de pinturas, manuseamento de metais e petróleos, entre outros. Estas substâncias são acumuladas no organismo durante vários anos, contribuindo deste modo para os longos períodos de latência anteriores ao desenvolvimento do tumor urinário (Burger et al., 2013).

○Fatores dietéticos

Ainda existe uma grande controvérsia no que diz respeito à relação do desenvolvimento de cancro da bexiga e a alimentação. No entanto, sabe-se que muitos dos compostos contidos nos alimentos e os seus metabolitos são excretados através da urina (Negri e Vecchia, 2001).

São vários os estudos publicados que apoiam a hipótese de que a ingestão de vegetais e frutas reduz o risco de desenvolver cancro da bexiga (Stenzl et al., 2012; Tanaka et al., 2011).

○Variabilidade genética

A raça é também considerada um fator de risco, indivíduos de raça branca têm uma maior predisposição para desenvolver cancro da bexiga do que os indivíduos de raça negra. Este facto ainda não é totalmente bem compreendido (Lee et al., 2006).

○Idade e género

O cancro da bexiga é predominantemente uma doença de homens idosos. A incidência aumenta em regra geral com a idade, sendo frequente após os 60 anos e raro antes dos 40. Este tipo de tumor é mais frequente nos homens do que nas mulheres, numa proporção de 3:1 (Pashos et al., 2002).

1.2.2.2. Fatores de risco internos

McGrath e seus colaboradores (2005), sugerem que as diferenças hormonais entre homens e mulheres têm efeitos fisiológicos importantes capazes de alterar a sintomatologia e o funcionamento do trato urinário. Estudos efetuados em modelos animais com cancro da bexiga quimicamente induzido, demonstraram que a manipulação hormonal alterou o curso natural dos tumores, e a supressão androgénica aumentou a taxa de sobrevivência. Estes estudos apoiam a hipótese de que os androgénios podem influenciar o aparecimento e o crescimento destes tumores (Nam et al., 2014; Tuygun et al., 2011).

Além das várias associações entre hormonas sexuais e o cancro da bexiga, não existem dados suficientes para afirmar que, estas estão realmente envolvidas no desenvolvimento desta doença (Cantwell et al., 2006; Tuygun et al., 2011).

1.2.3. Sintomas

São vários os sintomas descritos associados ao desenvolvimento de cancro da bexiga. A hematúria é o sintoma mais frequente e ocorre em cerca de 85% dos doentes (Anastasiadis e Reijke, 2012). Outros sintomas associados são a polaquiúria (aumento do número de micções), a irritação vesical, a disúria (dificuldade ao urinar), dores lombares associadas à obstrução uretral, edema nas extremidades inferiores e massa pélvica palpável (Pashos et al.,

2002). Sinais de doença avançada são considerados raros, dado que nunca ocorrem sem historial prévio de hematúria.

1.2.4. Tratamento

Cerca de 75% dos doentes diagnosticados com cancro da bexiga apresentam carcinomas superficiais. Os restantes 25% dos casos são diagnosticados como carcinomas invasivos (Burger et al., 2013; Cheung et al., 2013). Os tumores invasivos são os mais preocupantes, uma vez que até ao momento do tratamento do tumor primário apenas um terço dos doentes não têm metástases nodais ou distantes (Cohen, 2002).

○Tumores superficiais

Quando o tumor é diagnosticado como superficial e com pequena dimensão, a ressecção transuretral é o principal tratamento aplicado (Figura 3), trata-se de uma técnica cirúrgica bem tolerada e cuja morbilidade é mínima. Esta técnica remove a neoplasia e preserva a funcionalidade da bexiga (Oliveira et al., 2006; Pasin et al., 2008). Contudo, a taxa elevada de recidivas e de progressão implica uma monitorização frequente, sendo usualmente efetuada uma terapia adjuvante com fármacos antineoplásicos instilados intravesicalmente (Oliveira et

al., 2006). A imunoterapia com Bacillus Calmette-Guerín e a quimioterapia com a mitomicina

C são os tratamentos mais frequentes (Shen et al., 2008).

Urotélio Normal

TUMOR SUPERFICIAL

(Carcinoma papilar) TUMOR INVASIVO

Metastização Cistectomia Radical Quimioterapia Radioterapia Risco de recidiva Quimioterapia intravesical Imunoterapia intravesical Ressecção Transuretral

Figura 3 – Esquema terapêutico utilizado no cancro da bexiga (adaptado de Anastasiadis e Reijke, 2012; Pashos et al., 2002).

○Tumores invasivos

O prognóstico dos tumores invasivos é pior do que o observado nos tumores superficiais. O tratamento padrão é a cistectomia radical (Oliveira et al., 2006; Pasin et al., 2008). No entanto, devido às complicações que possam surgir e para obter taxas de sobrevivência maiores, é ainda realizada quimioterapia neoadjuvante (pré-operatório) e/ou adjuvante (pós-operatório), à base de fármacos platinantes (Dall’Era et al., 2012). Quando o tumor invade a cavidade pélvica ou se verifica a existência de nódulos noutros órgãos (metástases) o tratamento padrão utilizado é a quimioterapia oncológica (Pasin et al., 2008). Nestes casos, o tratamento consiste frequentemente na administração do metotrexato, vinblastina, adriamicina e cisplatina ou da gencitabina e cisplatina (Fletcher et al., 2011).

Os protocolos de quimioterapia disponíveis para o tratamento de cancro da bexiga não são suficientes para reduzir a taxa de mortalidade, sendo assim necessário estudar novas abordagens terapêuticas. Nesse sentido, a investigação biomédica tem procurado investigar a aplicação de novos fármacos, e de fármacos já utilizados como outros objetivos, com o recurso a modelos in vivo e in vitro.

1.3. Linhas celulares de cancro da bexiga

Até à data, as culturas celulares de cancro da bexiga representam o modelo in vitro mais utilizado no estudo desta neoplasia. Este modelo tem sido estabelecido como uma ferramenta importante e válida para o estudo dos mecanismos envolvidos na biologia molecular de cancro da bexiga, assim como para avaliar a eficácia de novos fármacos, sendo por isso considerado um modelo essencial para a realização de ensaios pré-clínicos (Arantes-Rodrigues et al., 2013; Gabriel et al., 2007).

A primeira linha celular de cancro da bexiga descrita foi a RT4, por Rigby e Franks em 1970. Desde então, mais de 50 linhas celulares humanas de cancro da bexiga foram estabelecidas e caracterizadas de acordo com a sua origem, o grau e o estadio. Algumas dessas linhas celulares encontram-se descritas na Tabela 1 (Hatina et al., 2008; Masters e Palsson, 1999).

Tabela 1 – Linhas celulares humanas de cancro da bexiga.

Linha celular Grau histológico (Idade, Raça, Sexo) Ano Referência

MGH-U3 (RN) Grau I 76 anos, caucasiano, ♂ 1977 Lin et al., 1985

SW780 Grau I 80 anos, caucasiano, ♀ 1974 Kyriazis et al., 1984

751G Grau I 63 anos, ♂ 1975 Elliott et al., 1977

RT4 Grau I 63 anos, caucasiano, ♂ 1970 Lin et al., 1985; Masters et al., 1986; Nayak et al., 1977

5637 Grau II 68 anos, caucasiano, ♂ 1974 Bruch et al., 1999

647-V Grau II 59 anos, ♂ 1974 Elliott et al., 1977

RT112 Grau II Caucasiano, ♀ 1973 Gabriel et al., 2007; Masters et al., 1986

HT1376 Grau III 58 anos, caucasiano, ♀ 1977 Gabriel et al., 2007

J82 Grau III 58 anos, caucasiano, ♂ 1972 Masters et al., 1986; O’tootle et al., 1978

MCR Grau III 51 anos, ♂ 2001 Zoli et al., 2004

SW1710 Grau III 84 anos, caucasiano, ♀ 1977 Kyriazis et al., 1984

T24 Grau III 81 anos, caucasiano, ♀ 1970 Masters et al., 1986; Nayak et al., 1977

U-BLC-1 Grau III 84 anos, ♀ 1998 Bruch et al., 1999; Gabriel et al., 2007

575A Grau III 59 anos, ♂ 1974 Elliott et al., 1977

639V Grau III 69 anos, ♂ 1973 Elliott et al., 1977

BC-3C Grau IV 82 anos, caucasiano, ♀ 1998 Gabriel et al., 2007; Pratsinis et al., 1998

CAL-29 Grau IV 80 anos, ♀ 1985 Cattan et al., 2001

HT1197 Grau IV 44 anos, caucasiano, ♂ 1977 Gabriel et al., 2007; Masters et al., 1986

SW800 Grau IV 54 anos, caucasiano, ♂ 1974 Kyriazis et al., 1984

TCCSUP Grau IV 67 anos, ♀ 1974 Gabriel et al., 2007; Masters et al., 1986; Nayak et al., 1977

486P Grau IV 61 anos, ♂ 1974 Elliott et al., 1977

Atualmente, as culturas celulares são usadas para vários fins científicos, possuem várias vantagens e desvantagens relativamente aos modelos in vivo. Na fase inicial da avaliação da eficácia antitumoral de um determinado fármaco são efetuados ensaios in vitro e posteriormente ensaios in vivo. São diversas as metodologias descritas que se podem realizar com as linhas celulares tornando-as, cada vez mais, um modelo experimental indicado para o estudo de neoplasias (Figura 4).

Existem limitações nos modelos in vitro que são facilmente ultrapassáveis através do recurso à utilização de modelos in vivo. Por exemplo, nos modelos in vitro é impossível compreender e estudar a angiogénese tumoral, uma vez que é um processo complexo com vários mecanismos envolvidos (Drell et al., 2012).

Os tumores são compostos por células neoplásicas, estroma e células inflamatórias que dão ao tumor uma estrutura tridimensional. Nos modelos in vitro, nomeadamente na cultura de células em monocamada, o estudo é restrito a um ou no máximo a dois tipos de células, limitando neste sentido este modelo experimental (Varley e Southgale, 2011).

Até à data, não foi possível identificar um modelo experimental ideal para o estudo e investigação de cancro da bexiga. Todos os modelos apresentam os seus prós e contras, sendo que, um estudo não invalida o outro. Neste sentido, sugere-se que são necessários estudos complementares para melhor compreender os mecanismos envolvidos no cancro da bexiga (Drell et al., 2012).

Possibilidade de limitar o número

de variáveis experimentais.

Método reprodutível e sensível e custo significativamente menor comparativamente com os testes in

vivo.

Possibilidade de estudo de

fenómenos inacessíveis em tecidos

intactos.

Obtenção de resultados num

menor espaço de tempo.

Conhecimento do comportamento e função de uma determinada população isolada de células.

Possibilidade de usar grandes

quantidades e volumes de células para efetuar estudos de alta produtividade.

Versatilidade ao nível da

diversidade de estudos que se

podem efetuar.

Possibilidade de serem injetadas

em animais para formar modelos de xenotransplante de progressão de tumores.

Extrapolação dos resultados obtidos

in vitropara a aplicação clínica.

Não representam a heterogeneidade

do microambiente do tumor.

Estão sujeitas a alterações genéticas

que podem alterar o seu fenótipo ao longo de uma experiência.

Impossível verificar se outros

órgãos são afetados.

Vant

agens

D

esvant

agens

• Avaliação e eficácia de fármacos

• Citometria de fluxo

• Western blot

Aplicações

• Modelos xenógrafos

• Citogenética clássica e molecular

• Microscopia eletrónica

• Microdissecção de cromossomas

• Análise do secretoma celular

Figura 4 – Vantagens, desvantagens e aplicações das linhas celulares (adaptado de Arantes-Rodrigues et al., 2013; Drell et al., 2012; Kashyap et al., 2011; Mager et al., 2009; Rogero et al., 2003).

1.4. Fármacos

1.4.1. Carboplatina

A carboplatina caracteriza-se por ser um fármaco antineoplásico, análogo da cisplatina, com uma menor toxicidade celular e um menor potencial mutagénico (Barefoot, 2001). Existem outros exemplos de substâncias análogas à cisplatina como a oxiliplatina, a nedaplatina, a lobaplatina e a heptaplatina que têm sido alvo de estudos experimentais incidentes na análise da sua citotoxicidade e potencial uso para o tratamento clínico de doentes oncológicos (Wong e Giandomenico, 1999). Clinicamente, a carboplatina é melhor tolerada pelos doentes: causa menos náuseas, neurotoxicidade, ototoxicidade e nefrotoxicidade do que a cisplatina (Pasetto

et al., 2006).

○ Mecanismo de ação

O mecanismo de ação da carboplatina é em tudo semelhante ao da cisplatina (Figura 5). A carboplatina entra na célula por difusão passiva ou através de transportadores ativos (Pasetto

et al., 2006). Após a sua entrada, sofre sucessivas reações de hidrólise dando origem a espécies

ativas que reagem com alvos celulares. No núcleo da célula, os fragmentos resultantes da hidrólise da carboplatina ligam-se ao ADN através de ligações cruzadas (Klein e Hambley, 2009). Estas ligações provocam a ativação de vias de transdução de sinais, como por exemplo: ativação dos mecanismos envolvidos no reconhecimento e reparação de zonas danificadas no ADN; paragem do ciclo celular e morte celular programada/apoptose (Kelland, 2007).

A sua eliminação ocorre por via renal (Etienne et al., 2003). Segundo van Warmerdam e seus colaboradores (1996), a carboplatina é indicada no tratamento de carcinomas do ovário, dos testículos e da mama.

Figura 5 – Mecanismo de ação da carboplatina (adaptado de Cepeda et al., 2007; Kelland, 2007; Klein e Hambley, 2009; Wang e Lippard, 2005).

1.4.2. Piroxicam

O piroxicam é um medicamento com propriedades anti-inflamatórias, antipiréticas e analgésicas incluindo-se assim, no grupo dos fármacos anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) (Mohammed et al., 2006). Segundo Leppert e seus colaboradores, o uso regular de AINEs pode reduzir em cerca de 20% o risco de desenvolver cancro da bexiga (Leppert et al., 2006). O piroxicam tem uma absorção lenta e gradual por via oral, resultando numa ação terapêutica prolongada (Prabhu et al., 2005).

Mecanismo de ação

O principal efeito do piroxicam incide na inibição da produção da enzima ciclooxigenase (COX) e consequente redução da conversão do ácido araquidónico na prostaglandina (PG) G2

(Alkan et al., 2012; Deshpande e Naik, 2012; Parisotto et al., 2005). Esta PG é reduzida em PGH2 que, por sua vez, é transformada através de um mecanismo enzimático e não enzimático,

na PGE2, PGF2, PGD2, PGI2 e no tromboxano A2 (Figura 6) (Vane et al., 1998). As PGs estão

envolvidas nos mecanismos da dor e na resposta inflamatória. O uso prolongado de piroxicam provoca problemas gástricos pois este fármaco inibe a produção de PGE2 responsável pela

Figura 6 – Mecanismo de ação do piroxicam (adaptado de Stolfi et al., 2013; Vane e Botting, 1995).

Estão descritas três formas estruturais distintas da COX (COX-1, COX-2 e COX-3) (Vos

et al., 2005). A atividade da COX é inibida pelos fármacos AINEs. O piroxicam é considerado

um inibidor não seletivo da COX, ou seja, pode inibir a COX-1 e a COX-2 (Mohammed et al., 2006).

A COX-1 está presente nos vasos sanguíneos, estômago, intestino e rins sendo designada de enzima constitutiva (Hilário et al., 2006). A COX-1 está associada à síntese de PGs e controla diversos efeitos fisiológicos, nomeadamente proteção gástrica, agregação plaquetária, homeostase vascular e manutenção do fluxo sanguíneo renal (Peskar, 2001).

A COX-2 está presente em locais inflamados, sendo por isso denominada de enzima indutiva (Komhoff et al., 2000). É expressa primeiramente pelas células envolvidas no processo inflamatório sendo induzida pelas citocinas, fatores de crescimento e endotoxinas

COX-1 constitutiva

COX-2 induzida

Tromboxano Prostaglandinas Proteases Prostaglandinas Outros mediadores inflamatórios Piroxicam Estímulo fisiológico Estímulo inflamatório

Proteção da mucosa gástrica. Recrutamento de células inflamatórias; Regulação da temperatura corporal; Sensibilização dos recetores da dor.

(Borzacchiello et al., 2003). Também se expressa no sistema nervoso central tendo como função a mediação da dor e da febre (Hilário et al., 2006).

A COX-3 está presente principalmente no córtex cerebral e é inibida seletivamente por fármacos analgésicos e antipiréticos e com baixa atividade anti-inflamatória (Chandrasekharan

et al., 2002; Willoughby et al., 2000).

Estas três enzimas diferem substancialmente na regulação da expressão da atividade das PGs (Arantes-Rodrigues et al., 2013). As PGs participam na génese da doença e promovem a inflamação, a qual, quando sob a forma de inflamação crónica pode levar ao desenvolvimento de neoplasias (Mohammed et al., 2006).

Inúmeros estudos experimentais sugerem que os fármacos AINEs têm efeito antineoplásico e que, pessoas que tomam frequentemente este tipo de medicação estão mais protegidas relativamente ao desenvolvimento de determinados tumores (Alkan et al., 2012; Mohammed et al., 2006; Thun et al., 2002). Segundo Mizutani e seus colaboradores (2004), os fármacos antineoplásicos e os fármacos inibidores da COX, podem ter um efeito sinérgico quando testados em simultâneo, tanto em testes in vitro como in vivo.

2. Objetivos

Capítulo 2

Objetivos

2. Objetivos

O cancro da bexiga continua a ser um dos carcinomas mais letais. A resistência às atuais terapias e a elevada taxa de recorrência continuam a ser um problema. Deste modo é fundamental continuar a investigar novas terapêuticas que possam ser benéficas para o seu tratamento.

Recorrendo ao uso de duas linhas celulares humanas de cancro da bexiga, a presente dissertação de mestrado, tem como objetivos avaliar a eficácia de um fármaco antineoplásico (carboplatina) e de um anti-inflamatório (piroxicam), nomeadamente:

 Avaliar a eficácia da carboplatina e do piroxicam tanto isoladamente como em combinado em duas linhas celulares humanas de cancro da bexiga (T24 e 5637);  Determinar o tipo de interação (sinérgica, aditiva ou antagónica) existente aquando da utilização dos dois fármacos conjugadamente.

3. Material e métodos

Capítulo 3

Material e métodos

3. Material e métodos

3.1. Linhas celulares

Para a realização deste trabalho, foi utilizada a linha celular músculo-invasivo T24 e a linha celular superficial 5637. A linha celular T24 foi adquirida à empresa DSMZ, Düsseldorf, Alemanha. A linha celular 5637 foi gentilmente cedida pela Doutora Paula Videira, da Universidade Nova de Lisboa, Lisboa, Portugal.

3.2. Cultura de células

As linhas celulares humanas de cancro de bexiga foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 (PAA, Pasching, Austria), suplementado com 10% de soro bovino fetal desnaturado (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel), 2 mM de L-glutamina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 100 U/ml de penicilina (Biological Industries) e 100 µg/ml de estreptomicina (Biological Industries). As células foram mantidas em monocamada e a 37ºC numa atmosfera húmida de 5% de dióxido de carbono (CO2). Quando as células atingiram a

confluência de aproximadamente 70-80% foram libertadas enzimaticamente (tripsina-EDTA 0,05%, Biological Industries). O manuseamento das células foi realizado numa câmara de fluxo laminar em condições de total assepsia, de forma a evitar qualquer tipo de contaminação.

3.3. Preparação da carboplatina e do piroxicam

A carboplatina foi adquirida à empresa TEVA, na concentração de 10 mg/ml e as várias diluições necessárias foram preparadas a partir de uma solução stock diluída em água bidestilada. O piroxicam foi adquirido à empresa Menarini, na concentração de 20 mg/ml e as várias diluições necessárias foram igualmente preparadas a partir de uma solução stock diluída em água bidestilada.

3.4. Brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT)

3.4.1. Exposição das células à carboplatina e ao piroxicam isoladamente

As duas linhas celulares foram semeadas em placas de cultura de 96 poços (Sarstedt, Newton, NC) na concentração de 2×104 _{células/ml por poço e colocadas na estufa overnight.}

dos fármacos isoladamente. Foram avaliadas três concentrações da carboplatina (0,05, 0,5 e 1 µM) e três concentrações do piroxicam (167, 333 e 500 µM). Após 72 horas de incubação foram adicionados 10 µL de MTT (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) por poço na concentração de 5 mg/ml. As placas de culturas foram colocadas a 37ºC durante 4 horas. De seguida, o meio existente nos poços foi removido e os cristais de formazan foram dissolvidos com a adição de 100 µL de dimetilsulfóxido (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) por poço. As absorvâncias foram determinadas num leitor de placas (Multiskan EX, Labsystems) a um comprimento de onda de 492 nm. Cada concentração foi avaliada em octuplicado e o ensaio foi realizado em duplicado. A percentagem da viabilidade celular foi calculada baseada na fórmula: (absorvância das células expostas aos fármacos/absorvância das células controlo) x 100 (Pinto-Leite et al., 2013). Em cada ensaio foi utilizado um grupo controlo de células, isto é, um grupo de células que não foi exposto aos fármacos.

3.4.2. Exposição das células à carboplatina e ao piroxicam conjugadamente

Após a avaliação dos fármacos isoladamente procedeu-se à avaliação da viabilidade celular dos dois fármacos em simultâneo, também pelo método do MTT. Foram testadas as mesmas concentrações e o protocolo seguido foi idêntico ao descrito no ponto 3.4.1.

3.5. Estudo da interação dos fármacos

Os dados obtidos da combinação dos fármacos pelo ensaio do MTT foram analisados com o intuito de determinar o tipo de interação existente entre a carboplatina e o piroxicam. Para tal, foi utilizado o método de Chou e Talalay (1984) que se baseia na seguinte fórmula: IC = (D)1/ (Dx)1 + (D)2 / (Dx)2 + (D)1 (D)2 / (Dx)1 (Dx)2 (Chou e Talalay, 1984). O IC representa

o índice de combinação e o (D)1 e (D)2 são as doses de carboplatina e piroxicam que obtiveram

um determinado efeito quando administradas em conjunto às linhas celulares. (Dx)1 e (Dx)2

representam as doses de um mesmo fármaco com o mesmo efeito específico quando adicionados às células isoladamente. Quando o IC é inferior a 1 a interação é sinérgica, quando é igual a 1 o efeito é considerado aditivo e quando é superior a 1 considera-se que tem um efeito antagónico. A inibição da viabilidade celular nos tratamentos efetuados com ambos os fármacos é denominada por fração afetada.

3.6. Imunocitoquímica

As células foram semeadas em lamelas de vidro previamente esterilizadas na concentração de 2×104 _{células/ml e incubadas overnight. No dia seguinte, o meio de cultura foi}

removido e substituído por novo meio de cultura com os dois fármacos a testar, isoladamente (0,05 µM de carboplatina e 333 µM de piroxicam) e em combinado (0,05 µM de carboplatina com 333 µM de piroxicam), durante 72 horas. Após o período de exposição, o meio foi removido, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4%, permeabilizadas com 1% Triton X-100% e as peroxidases internas foram bloqueadas com peróxido de hidrogénio (H2O2) a 3%.

As células foram expostas ao anticorpo Ki-67, clone MIB-1 (DAKO) na diluição de 1:100 e durante uma hora à temperatura ambiente. A revelação foi efetuada com 3,3 diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB) durante 5 minutos. Para parar a ação e remover os excessos de DAB, foram realizadas sucessivas lavagens com água corrente. O contraste foi realizado com hematoxilina. As células foram observadas ao microscópio ótico e analisadas qualitativamente (Leica DM750) (Pinto-Leite et al., 2013).

3.7. Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end

labelling (TUNEL)

As células foram semeadas em placas de 24 poços na concentração de 2×104 _células/ml

e incubadas overnight. No dia seguinte, o meio de cultura foi removido e foi adicionado novo meio de cultura com os fármacos a testar, isoladamente (0,05 µM de carboplatina e 333 µM de piroxicam) e em combinado (0,05 µM de carboplatina com 333 µM de piroxicam), durante 72 horas. De seguida as células foram processadas de acordo com as instruções do kit In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche Diagnostics, Alemanha). Após a tripsinização, as células foram lavadas com 1xPBS e de seguida centrifugadas 10 minutos a 1200 rotações por minuto. A fixação celular foi realizada com a adição de paraformaldeído a 4%, durante uma hora à temperatura ambiente. Com o intuito de remover a solução fixadora, as células foram centrifugadas a 500g, durante 10 minutos. Posteriormente foram efetuadas duas lavagens com 1xPBS suplementado com 1% de soro fetal de bovino e as amostras foram divididas em três alíquotas (controlo negativo, controlo positivo e células expostas aos fármacos). As células foram incubadas com 12,5 µL de solução de reação TUNEL e colocadas a 37°C no escuro por uma hora. No caso dos controlos positivos foi feito um tratamento adicional com 50 µL de DNAse I recombinante, durante 20 minutos a 37°C antes da reação de TUNEL. No caso dos

controlos negativos as células foram incubadas apenas com 1xPBS. Após decorrida a reação foram realizadas duas lavagens com 1xPBS suplementado com 1% de BSA e centrifugadas durante 10 minutos a 500g. Em seguida as células foram suspensas em 10 µL de 1xPBS, colocou-se uma gota da suspensão celular numa lâmina e deixou-se secar. As células foram coradas com 5 µL de 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (VECTASHIELD – Mounting Medium With DAPI, Vector Laboratories), cobertas com uma lamela e incubadas a 5°C pelo menos durante 15 minutos. Após a estabilização da fluorescência as células foram observadas ao microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse E400). Foram avaliadas 200 células e em duplicado. As células foram classificadas como TUNEL negativo (sem fragmentação) quando apresentavam fluorescência azul e TUNEL positivo (com fragmentação) quando apresentavam fluorescência verde. O índice de apoptose foi calculado baseado na fórmula: (número de células fragmentados/200) ×100 (Pinto-Leite et al., 2013).

3.8. Coloração de monodansilcadaverina (MDC)

As células foram semeadas em lamelas de vidro previamente esterilizadas na concentração de 2×104 _{células/ml e incubadas overnight. No dia seguinte, o meio de cultura foi}

removido e substituído por novo meio de cultura com os vários fármacos, isoladamente (0,05 µM de carboplatina e 333 µM de piroxicam) e em combinado (0,05 µM de carboplatina com 333 µM de piroxicam), durante 72 horas. No final do tempo de incubação, foi removido o meio de cultura e efetuada uma lavagem com 1xPBS. De seguida, as células foram incubadas com o corante MDC (Sigma, Karlsruhe, Alemanha), na concentração de 25 µM, durante uma hora e a 37ºC. O MDC foi removido e foi efetuada uma lavagem com 1×PBS. As lamelas foram cuidadosamente retiradas das placas e colocadas em lâminas, as quais foram de imediato observadas num microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse E400, Tóquio, Japão).

3.9. Coloração de Leishman

As células foram semeadas na concentração de 2×104 _{células/ml em lamelas de vidro}

previamente esterilizadas e incubadas overnight. No dia seguinte, o meio de cultura foi removido e foi adicionado novo meio de cultura com os diferentes fármacos a testar, isoladamente (0,05 µM de carboplatina e 333 µM de piroxicam) e em combinado (0,05 µM de carboplatina com 333 µM de piroxicam) durante 72 horas. No final do tempo de exposição aos fármacos, o meio foi cuidadosamente removido e adicionou-se 200 µL de 1×PBS previamente

aquecido a 37ºC. Para fixar as células à lamela, foi utilizado metanol à temperatura ambiente. Após 30 minutos de fixação, o metanol foi removido e foram efetuadas duas lavagens com 1xPBS, de 5 minutos cada. As células foram de seguida coradas com o corante Leishman, no escuro e durante 30 minutos. Foram realizadas duas lavagens com água para remover os vestígios de corante e procedeu-se de seguida à montagem das lamelas em lâminas, as quais foram visualizadas ao microscópio ótico (Leica DM750).

3.10. Análise estatística

A análise estatística foi efetuada com o programa Statistical Program for Social Sciences (SPSS) 17.0 (SPSS Inc. USA). A igualdade de variâncias foi testada pelo teste de Levene F. A significância estatística das diferenças entre os grupos controlo e os grupos tratados com os fármacos foram determinadas pelo teste post-hoc de comparações múltiplas de Dunnet para o ensaio do MTT. Os valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

4. Resultados

Capítulo 4

Resultados

4. Resultados

4.1. MTT

Através do ensaio do MTT foi avaliada a viabilidade celular nas linhas celulares T24 e 5637 após a aplicação das diferentes concentrações dos fármacos tanto isoladamente como em combinado.

4.1.1. Efeito da carboplatina e do piroxicam isoladamente

A carboplatina foi testada isoladamente nas concentrações de 0,05, 0,5 e 1 µM e o piroxicam foi testado isoladamente nas concentrações de 167, 333 e 500 µM.

Após as 72 horas de exposição aos fármacos e antes de adicionarmos o MTT, as placas de cultura foram observadas ao microscópio invertido para observar o seu aspeto, confluência e morfologia. Observou-se uma notória diminuição do número de células por campo de visualização com o aumento da concentração de fármaco aplicado nas duas linhas celulares (Figura 7 e 8). No entanto, esta diminuição foi mais evidente no tratamento com a carboplatina.

Carboplatina T24 5637 Controlo 0,05 µM 0,5 µM 1 µM

Figura 7 – Observação das linhas celulares T24 e 5637 ao microscópio invertido após a exposição às diferentes concentrações de carboplatina durante 72 horas. As células do grupo controlo não foram expostas ao fármaco;

Piroxicam T24 5637 Controlo 167 µM 333 µM 500 µM

Figura 8 – Observação das linhas celulares T24 e 5637 ao microscópio invertido após a exposição às diferentes concentrações de piroxicam durante 72 horas. As células do grupo controlo não foram expostas ao fármaco; ampliação de 40X.

Com o aumento da concentração da carboplatina observou-se uma menor percentagem de viabilidade celular nas duas linhas celulares (Figura 9).

Na linha celular T24, na concentração mais baixa testada (0,05 μM), obtiveram-se valores de viabilidade celular na ordem dos 75% (estatisticamente significativo quando comparado com o grupo controlo, p=7,2×10-5_{) e na concentração mais elevada testada (1 μM),}

obtiveram-se valores na ordem dos 56% (estatisticamente significativo quando comparado com o grupo controlo, p=5,7×10-8_).

Na linha celular 5637, a viabilidade celular obtida na concentração mais baixa foi superior à da T24 (94%, p>0,05), assim como a viabilidade celular obtida na concentração mais elevada (61%), estatisticamente significativa quando comparado com o grupo controlo, p=1,4×10-4_.

Figura 9 – Viabilidade celular das linhas T24 e 5637 após a exposição da carboplatina isoladamente no ensaio do MTT. * p<0,05 versus grupo controlo. Os resultados apresentados representam valores médios ± SD (SD = desvio padrão).

Quanto ao efeito do piroxicam, verificou-se que na linha celular T24, na concentração mais baixa (167 μM) se obteve uma viabilidade celular de 86% (p>0,05) e com a concentração mais elevada (500 μM) obteve-se uma viabilidade celular de 54% (estatisticamente significativa quando comparada com o grupo controlo, p=5,1×10-6_{) (Figura 10).}

Na linha celular 5637, com a concentração mais baixa de piroxicam, obteve-se valores de viabilidade celular na ordem dos 92% (p>0,05) e com a concentração mais elevada na ordem dos 51% (estatisticamente significativa quando comparada com o grupo controlo, p=4,4×10-6_).

0 20 40 60 80 100 120 0 0,05 0,5 1 Via bil ida de ce lul a r (%) Concentrações (μM)

Carboplatina

Em geral, a resposta das duas linhas celulares quando expostas ao piroxicam foi muito semelhante.

Figura 10 – Viabilidade celular das linhas T24 e 5637 após a exposição ao piroxicam isoladamente no ensaio do MTT. * p<0,05 versus grupo controlo. Os resultados apresentados representam valores médios ± SD (SD = desvio padrão).

4.1.2. Efeito da carboplatina e do piroxicam conjugadamente

De modo a avaliar o efeito simultâneo da aplicação dos dois fármacos na viabilidade celular, foram utilizadas as concentrações anteriormente referidas. A combinação da carboplatina e do piroxicam resultou numa maior inibição da viabilidade celular em ambas as linhas celulares, quando comparado com os fármacos isoladamente e com resultados estatisticamente significativos (p<0,05).

Na linha celular T24, verificou-se a progressiva diminuição da viabilidade celular com o aumento das concentrações dos fármacos (Figura 11). Quando conjugamos as duas concentrações mais baixas de ambos os fármacos, 0,05 µM de carboplatina com 167 μM de piroxicam, obteve-se uma percentagem de viabilidade celular de 60% (p=0,04). Da combinação das concentrações mais altas dos dois fármacos, 1 µM de carboplatina com 500 μM de piroxicam, resultou uma viabilidade celular de apenas 7% (p=0,17).

0 20 40 60 80 100 120 0 167 333 500 Viabil id a d e celu la r (%) Concentrações (µM)

Piroxicam

Figura 11 – Viabilidade celular da linha T24 após a exposição simultânea da carboplatina e do piroxicam no ensaio do MTT. * p<0,05 versus grupo controlo. Os resultados apresentados representam valores médios ± SD (SD = desvio padrão).

Na linha celular 5637, a combinação dos dois fármacos resultou numa diminuição da viabilidade celular muito significativa comparativamente com a carboplatina isolada (Figura 12). Com a utilização simultânea de 0,05 µM de carboplatina com 167 µM de piroxicam observou-se uma viabilidade celular de 24% (p=3,3×10-8_{). As duas concentrações mais}

elevadas de carboplatina e piroxicam resultaram numa viabilidade celular na ordem dos 8% (p=2,7×10-8_).

Figura 12 – Viabilidade celular da linha 5637 após a exposição simultânea da carboplatina e do piroxicam no ensaio do MTT. * p<0,05 versus grupo controlo. Os resultados apresentados representam valores médios ± SD (SD = desvio padrão). 0 20 40 60 80 100 120 0 0,05 0,5 1 Via bil ida de ce lul a r (%) Carboplatina (µM)

T24

5637

4.1.3. Interação dos fármacos

No sentido de avaliar o tipo de interação (sinérgica, aditiva ou antagónica) resultante da combinação da carboplatina e do piroxicam, foi implementado no programa Matlab o método descrito por Chou e Talalay (1984). O tipo de interação entre os fármacos é avaliado através do IC. Os resultados obtidos pelo ensaio do MTT sugerem que, a interação entre os dois fármacos é nitidamente sinérgica na linha T24 (IC50=0,65) e na linha 5637 (IC50=0,17) com valores de

IC inferiores a 1 (Tabela 2). O índice de redução da dose (DRI50) representa a magnitude da

redução da dose obtida para 50% do efeito inibidor de crescimento da combinação dos fármacos comparando com os resultados em isolado. O DRI50 da carboplatina e do piroxicam na linha

celular T24 foi de 20 e 1,8 respetivamente. Na linha celular 5637 o DRI50 foi de 20 na

carboplatina e 8,6 no piroxicam.

Tabela 2 – Estudo da interação dos fármacos pelo método de Chou e Talalay.

Linhas celulares

Carboplatina (IC50 µM)

Piroxicam

(IC50 µM) IC50 DRI50 Interpretação

T24 1 500 0,65 Carboplatina = 20 _{Piroxicam = 1,8} Sinérgico

5637 1 500 0,17 Carboplatina = 20 _{Piroxicam = 8,6} Sinérgico

IC50 – índice de combinação; DRI50 – índice de redução da dose.

4.2. Imunocitoquímica

Com o intuito de avaliar a expressão da proteína Ki-67 nas linhas celulares T24 e 5637, expostas aos dois fármacos estudados, realizou-se a técnica de imunocitoquímica. Os resultados foram analisados qualitativamente, utilizando para tal, uma escala em que – indica sem marcação; + indica marcação muito fraca; ++ indica marcação fraca; +++ indica marcação moderada e ++++ indica marcação elevada.

Os controlos positivos (células não expostas aos fármacos e expostas ao Ki-67) apresentaram uma elevada expressão do Ki-67. Os controlos negativos (células não expostas aos fármacos e sem exposição ao Ki-67) não apresentaram qualquer tipo de marcação. Nas células tratadas com os fármacos isoladamente verificou-se uma expressão moderada do Ki-67 nas duas linhas celulares. No entanto, nas células tratadas com a carboplatina e o piroxicam em

combinado verificou-se uma redução da expressão do Ki-67, assim como uma diminuição da densidade das células por campo de visualização (Tabela 3; Figura 13).

Tabela 3 – Expressão do Ki-67 nas linhas celulares T24 e 5637, após a exposição à carboplatina e ao piroxicam, isoladamente e em combinado. Linhas celulares Controlo positivo Controlo negativo Carboplatina (0,05 μM) Piroxicam (333 μM) Carboplatina (0,05 μM) + Piroxicam (333 μM) T24 ++++ - +++ +++ ++ 5637 ++++ - +++ +++ ++

Figura 13 – Imagens representativas da expressão do Ki-67 nas linhas celulares T24 e 5637, expostas à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM) isoladamente e em combinado. A e F

– controlo negativo; B e G – controlo positivo; C e H –

carboplatina (0,05 µM); D e I – piroxicam (333 µM); E e J – carboplatina (0,05 µM) em simultâneo com o piroxicam (333 µM); ampliação de 200X.

4.3. TUNEL

O ensaio do TUNEL foi realizado para avaliar a indução de apoptose pelos fármacos testados. As duas linhas celulares tiveram índices de apoptose elevados no controlo positivo. No controlo negativo (células não expostas aos fármacos) obteve-se valores inferiores a 10% sendo estas células consideradas não apoptóticas (Figura 14). Nas células expostas à carboplatina e ao piroxicam isoladamente não se verificaram alterações quanto ao índice de apoptose quando comparado com o controlo negativo. No entanto, quando conjugamos a carboplatina (0,05 µM) e o piroxicam (333 µM), verificou-se um efeito mínimo na apoptose nas duas linhas celulares, com aproximadamente três células positivas por campo de visualização (Figura 15).

Figura 14 – Índice apoptótico obtido nas linhas celulares T24 e 5637, pela técnica do TUNEL após 72 horas de exposição à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM) isoladamente e em combinado. Os resultados apresentados representam valores médios ± SD (SD = desvio padrão).

0 10 20 30 40 50 60 70

Controlo + Controlo - Carboplatina

(0,05 μM) Piroxicam (333μM) Carboplatina (0,05μM) + Piroxicam (333μM) Índ ice a po ptó tico ( %) T24 5637

Figura 15 – Ensaio do TUNEL. Imagens representativas das linhas T24 e 5637 expostas à carboplatina (0,05 µM) e ao piroxicam (333 µM) isoladamente e em combinado. Os núcleos foram contrastados com DAPI e a fragmentação é detetada pela cor verde (FITC); ampliação original: 1000X.