Universidade Federal de Ouro Preto
–
UFOP
Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas
–
NUPEB
Laboratório de Enzimologia e Proteômica - LEP
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Alterações hepatoesplênicas associadas à infecção por
Schistosoma
mansoni
no modelo murino: clínica, histopatologia e proteômica
Jonatan Marques Campos
Universidade Federal de Ouro Preto
–
UFOP
Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas
–
NUPEB
Laboratório de Enzimologia e Proteômica - LEP
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Alterações hepatoesplênicas associadas à infecção por
Schistosoma
mansoni
no modelo murino: clínica, histopatologia e proteômica
Ouro Preto
2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas (NUPEB) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia, Área de concentração - Genômica e Proteômica.
Orientador: Prof. Dr. William de Castro Borges
C198a Campos, Jonatan Marques.
Alterações hepatoesplênicas associadas à infecção por Schistosoma mansoni no modelo murino [manuscrito] : clínica, histopatologia e proteômica / Jonatan Marques Campos - 2012.
xv, 95f.: il., color; grafs.; tabs.; mapas.
Orientador: Prof. Dr. William de Castro Borges.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
Área de concentração: Genômica e Proteômica.
1. Proteômica - Teses. 2. Biotecnologia - Teses. 3. Schistosoma mansoni -
Teses. 4. Biomarcadores - Teses. 5. Esquistossomose - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 577.212:616.995.122
i
Colaboradores
Profa. Dra. Cláudia Martins CarneiroI
Prof. Dr. Vanderlei RodriguesII
Prof. Dr. Milton Hércules guerra de AndradeIII
Profa. Dra. Lizandra Guidi MagalhãesII
M.s. Nívia Carolina Nogueira PaivaI
Dra. Adriana Paes LemeVI
Mestranda Renata Alves de Oliveira e Castro IV
Mestranda Aline Costa LitalinoI
I – Laboratório de Imunpatologia NUPEB/UFOP
II – Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos FMRP/USP
III – Laboratório de Enzimologia e Proteômica NUPEB/UFOP
IV – Laboratório de Imunoparasitologia NUPEB/UFOP
ii Este trabalho é dedicado a todos meus familiares;
Meus pais, Raul Antônio e Ingrid Marques; Minha irmã, Jenifer Marques
iii
Agradecimentos
A Deus por me proporcionar paz, esperança e força durante toda minha caminhada.
Aos meus pais, irmã e familiares por serem o alicerce do meu crescimento.
Ao professor William de Castro Borges pela excelente orientação, aprendizado, confiança, incentivo e seriedade.
Ao professor Milton Hércules Guerra de Andrade pela co-orientação, incentivo e desenvolvimento de recursos técnicos no LEP.
Ao professor Vanderlei Rodrigues pela colaboração e oportunidade de desenvolvimento de parte deste trabalho em seu laboratório FMRP/USP.
A professora Cláudia Martins Carneiro pela colaboração e conselhos nos experimentos.
Aos professores Ieso de Miranda e Renata Guerra por terem disponibilizados seus laboratórios auxiliando no desenvolvimento deste trabalho.
A doutoranda Nívia Carolina pela excelente colaboração na realização da análise histológica presente neste trabalho.
A Profa. Dra Lizandra Guidi Magalhães pela ajuda nos experimentos realizados na FMRP/USP.
A mestranda Renata Alves de Oliveira e Castro pela ajuda nos experimentos.
Aos amigos do LEP pela amizade, apoio, aprendizado e momentos de diversão. Agradeço ao mestrando Leandro Xavier Neves pela ajuda nos experimentos.
Ao técnico do LEP José Henrique Braga Fortes pela experiência de laboratório, por proporcionar um ambiente de trabalho organizado e pela ajuda nos recursos técnicos.
Aos amigos da República 171 que me acolheram e foram meus parceiros de festas e futebol durante todo este tempo. Em especial ao Daniel Discaciate (Daniboy) e ao Paulo Renato (Marú).
Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/NUPEB/UFOP pela oportunidade do desenvolvimento desta dissertação.
A CAPES/REUNI pela bolsa de estudos fornecida durante a realização deste projeto.
A FAPEMIG pelo apoio financeiro para execução deste projeto.
v
Sumário
Lista de Figuras...vii
Lista de Tabelas...ix
Lista de Abreviaturas e Símbolos...x
Resumo...xii
Abstract...xiv
1 – Introdução...2
1.1 – Aspectos gerais...2
1.2 - O ciclo biológico do Schistosoma mansoni...6
1.3 – Diagnóstico e Tratamento...9
1.4 – Proteômica...10
1.5 – Modelo murino de infecção por S. mansoni...13
2 - Objetivos...15
2.1 - Objetivo geral...15
2.2 - Objetivos específicos...15
3 - Metodologia...17
3.1 - Manutenção do ciclo do S. mansoni...17
3.2 - Delineamento Experimental...17
3.3 - Exame parasitológico de fezes...19
3.4 - Obtenção do material biológico...19
3.5 - Razão peso do órgão e peso corporal...19
3.6 - Leucograma...20
3.7 - Dosagens enzimáticas para ALT, AST e Albumina Sérica...20
3.8 - Análise histológica...20
3.9 - Extração de proteínas...21
3.10 - Eletroforese unidimensional (1D SDS-PAGE)...22
3.11 - Eletroforese bidimensional (2-D SDS-PAGE)...23
vi
3.13 - Identificação das proteínas por espectrometria de massas...26
4 - Resultados...30
4.1 - Exame parasitológico de fezes - acompanhamento da ovoposição nos animais infectados...30
4.2 - Avaliação de esplenomegalia e hepatomegalia nos animais dos grupos I e II...31
4.3 - Análises hematológicas e dosagens bioquímicas...32
4.4 - Análises histológicas de fígado e baço...36
4.5 - Análise proteômica comparativa de fígado e baço dos animais dos grupos I e II...40
4.6 - Perfil eletroforético unidimensional e análise densitométrica...40
4.7 - Perfil proteico em eletroforese bidimensional (SDS-PAGE) da fração solúvel de fígado...41
4.8 - Perfil proteico em eletroforese bidimensional (SDS-PAGE) da fração solúvel do baço...48
5 - Discussão...53
6 - Conclusões...64
7 - Referências...65
vii
Lista de Figuras
Figura 1: Distribuição da Esquistossomose no mundo...3
Figura 2: As 10 principais causas de DALYs...3
Figura 3: Distribuição da população que requer quimioterapia preventiva...5
Figura 4: Ciclo de vida do S. mansoni...8
Figura 5: Géis de eletroforese bidimensional (2-DE)...11
Figura 6: Métodos de ionização “soft” para análise de peptídeos e proteínas...12
Figura 7: Representação do método de infecção pelo anel...18
Figura 8: Diagrama esquemático para obtenção de proteínas solúveis...22
Figura 9: Ilustração das etapas de produção do gel bidimensional (2-DE)...24
Figura 10: Etapas do processo de digestão in gel...26
Figura 11: Delineamento experimental ilustrando a identificação dos peptídeos obtidos por digestão in gel...28
Figura 12: Gráfico demonstrando a evolução da ovoposição nos animais infectados entre o 35º e o 50º dia de infecção...30
Figura 13: Relação peso do órgão e peso corporal dos grupos I e II...31
Figura14: Análise global e diferencial de leucócitos do grupo I com 5 semanas de infecção...33
Figura15: Análise global e diferencial de leucócitos do grupo II com 7 semanas de infecção...34
Figura 16: Fotomicrografias de fígado de camundongos infectados com Schistosoma mansoni e necropsiados com 5 e 7 semanas após a infecção...37
Figura 17: Gráfico do número de células inflamatórias na região perivascular de fígado...38
Figura 18: Fotomicrografias de baço de camundongos infectados com Schistosoma mansoni e necropsiados com 5 e 7 semanas após a infecção...39
Figura 19: Gráfico comparando a área do folículo nodular do baço...39
Figura 20: Perfil eletroforético representativo de proteínas solúveis de fígado e baço...41
viii Figura 22: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de fígado de animais do
grupo II (7 semanas de infecção)...44
Figura 23: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de fígado de animais do grupo II (7 semanas de infecção) pH 4-7...45
Figura 24: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de baço de animais do grupo I (5 semanas de infecção)...49
Figura 25: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de baço de animais do grupo II (7 semanas de infecção)...50
Figura Suplementar 1...91
Figura Suplementar 2...92
ix
Lista de Tabelas
Tabela 1: Prevalência das Principais Doenças Tropicais Negligenciadas...4
Tabela 2: Principais metabólitos alterados em urina de camundongos infectados com S. mansoni e em hamsters infectados com S. japonicum...14
Tabela 3: Amostragem de animais...18
Tabela 4: Tabela de dosagens bioquímicas...35
Tabela 5: Dosagens de proteínas solúveis de fígado e de baço...40
Tabela 6: Proteínas de fígado identificadas por espectrometria de massas...46
Tabela 7: Proteínas de baço identificadas por espectrometria de massas...51
Tabela Suplementar 1: Proteínas de Fígado...76
x
Lista de Abreviaturas e Símbolos
% - Percentual °C –Graus Celsius µA - Microampere µg –Micrograma µL - Microlitro ACN – Acetonitrila
ADP– Adenosina difosfato ALT– Alanino aminotrasferase
AMBIC - Bicarbonato de Amônio
AST– Aspartato aminotrasferase ATP – Adenosina trifosfato BCA - bicinchoninic acid
BIP - Binding immunoglobulin protein CCA– Centro de ciência animal
CHAPS – (3-[(3-Cholamidopropil) dimetilamônio]-1- propanosulfonato) cm– Centímetro
Da - Dalton
DNA– Ácido desoxirribonucleico DTT - Ditiotreitol
EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid EF-Tu - Elongation factor thermo unstable
ELISA –Enzyme Linked Immunosorbent Assay
emPAI–Exponentially modified protein abundance index FDR–False discovery rate
FMRP– Faculdade de medicina de Ribeirão Preto g - Gramas
HCL– Ácido Clorídrico HE – Hematoxilina e Eosina
HSP –Proteína de Choque Térmico IAA - Iodoacetamida
IEF - Isoeletrofocalização kDa – Kilodálton
Kg – Kilograma
LEP– Laboratório de Enzimologia e Proteômica M – Molar
m/z– Massa sobre carga mA -Miliampere Mb – Megabase mg– Miligrama min– Minutos mm – Milímetro mM – Milimolar Mr– Massa relativa N - Número
NaCl– Cloreto de Sódio
NCBI–National Center for Biotechnology Information nL– Nanolitro
xi p:v– Peso por volume
pb – Pares de bases
PBS –Phosphate buffered saline
PCR– Reação em cadeia da polimerase pH– Potencial hidrogeniônico
ROS -Reactive oxygen species SDS– Dodecil Sulfato de Sódio
SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS TCA– Ácido tricloroacético
TFA– Ácido trifluoracético
Tris - tris(hidroximetil)aminometano
UFOP –Universidade Federal de Ouro Preto USP– Universidade de São Paulo
V - Volts
v:v –Volume/volume
xii
Resumo
A Esquistossomose é uma doença endêmica em vários países, afligindo mais de 207 milhões de pessoas no mundo. É considerada a segunda infecção parasitária mais importante em termos de saúde pública devido ao impacto socio-econômico, podendo ocasionar cerca de 200 mil mortes anualmente. A caracterização do genoma e transcriptoma do Schistosoma mansoni
xiv
Abstract
2
1
-
Introdução
1.1 – Aspectos gerais
O gênero Schistosoma é constituído por organismos da família Schistosomatidae, classe Trematoda e filo Platelminto. Os representantes deste gênero possuem sexos separados e um ciclo de vida heteroxeno. As principais espécies de Schistosoma que parasitam os seres humanos são: Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum,
3
Figura 2: As 10 principais causas de DALYs (Disability-Adjusted Life Years) no mundo. Adaptado de (Hotez et al., 2007).
Figura 1: Distribuição da Esquistossomose no mundo. Geneva, World Health Organization, 2010.
4 O S. mansoni é endêmico no nordeste do Brasil, na Venezuela, Suriname, Caribe e Egito. O S. japonicum é endêmico na China, Filipinas e Indonésia. O S. mekongi é encontrado no Camboja (Chitsulo et al., 2004). No Brasil a esquistossomose mansônica ocorre de forma endêmica nos seguintes estados: Alagoas, Maranhão, Bahia, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Paraíba, Sergipe, Espírito Santo e Minas Gerais (predominantemente no norte e nordeste do Estado), Pará, Piauí, Ceará, Rio de Janeiro, São Paulo, Santa Catarina, Paraná, Rio Grande do Sul, Goiás e no Distrito Federal (SES/MS, 2010, World Health, 2010). Aproximadamente 25 milhões de pessoas vivendo nas zonas rurais estão expostas ao risco de contrair a doença (de Oliveira et al., 2004). O S. mansoni, é dentre as espécies causadoras da
5 esquistossomose, a mais estudada no mundo. Acredita-se que a doença chegou às Américas através do comércio de escravos africanos no período colonial (Campbell et al., 2000). No Brasil, a esquistossomose foi detectada pela primeira vez em 1908, pelo médico brasileiro Pirajá da Silva, através de exames de fezes e de vermes coletados a partir de necropsias (Katz, 2008). A transmissão da doença depende da existência de hospedeiros intermediários, e as três principais espécies envolvidas na transmissão para o homem são: Biomphalaria glabrata,
Biomphalaria straminea e Biomphalaria tenagophila.
Clinicamente, a esquistossomose pode ser classificada em doença de fase aguda e fase crônica. A fase aguda corresponde à etapa de penetração das cercárias através da pele, variando desde um quadro assintomático até apresentação de um quadro clínico sintomático. Nos seres humanos, a fase crônica inicia-se a partir do sexto mês após a infecção, podendo durar vários anos. Está associada à postura de ovos, lesões no fígado e baço, hipertensão portal, varizes esofagianas e hemorragias, podendo levar à morte (SES/MS, 2010, Ferrari and Moreira, 2011, World Health, 2010).
A Assembléia Mundial de Saúde, através da resolução (WHA54. 19) realizada em maio de 2001, recomendou aos países membros a desenvolverem atividades de controle sustentável, garantindo o acesso à medicação e promovendo medidas preventivas para o controle da esquistossomose. A meta mínima era a administração de quimioterapia para pelo menos 75% de todas as crianças em risco de morbidade até 2010 (Favre et al., 2009). Porém estimativas indicam que menos de 10% da população em risco de morbidade recebe quimioterapia preventiva, demonstrando que a cobertura estabelecida em 2001 está longe de ser alcançada, Figura 3.
Figura 3: Distribuição da população que requer quimioterapia preventiva. AFR– África / AMR–
Américas / EMR – leste do Mediterrâneo / SEAR – Sul e leste da Ásia / WPR – Oeste do pacífico.
6 1.2 - O ciclo biológico do Schistosoma mansoni
O S. mansoni é o agente etiológico da esquistossomose mansônica, uma doença inicialmente assintomática, podendo evoluir para formas clínicas extremamente graves e levar o paciente à morte. A fêmea do S. mansoni mede aproximadamente de 1,2 a 1,6 cm, apresenta corpo cilíndrico e encontra-se alojada em uma fenda do corpo do macho denominada de canal ginecóforo. O macho mede cerca de 1 cm, apresenta cor mais clara que a fêmea e corpo achatado (Loverde and Chen, 1991). O sexo do S. mansoni é determinado no zigoto, este possui 8 pares de cromossomos (2n=16), sendo 7 pares autossômicos e 1 par sexual. A fêmea é heterozigótica ZW e o macho é homozigoto ZZ. (Berriman et al., 2009). O genoma do
Schistosoma contém mais de 380 milhões de pares de bases divididos entre os setes pares autossomais e o par sexual. A versão mais recente proposta para o genoma do S. mansoni
contabiliza cerca de 10.852 genes (Protasio et al., 2012).
O ser humano é o principal hospedeiro definitivo do S. mansoni. Nele, o parasito apresenta a forma adulta, reproduz-se sexuadamente e, por meio da eliminação dos ovos, ocasiona a contaminação das coleções hídricas. A infecção no hospedeiro vertebrado se dá através do contato com água doce contendo cercárias, as quais são capazes de penetrar ativamente na pele do hospedeiro, orientadas por estímulos químicos e utilizando-se do conteúdo proteico das glândulas pré e pós acetabulares. (Collins et al., 2011, Curwen et al., 2006). Proteínas presentes nas secreções das glândulas cercarianas possuem funções proteolíticas e imunomoduladoras. Uma variedade de isoformas para elastase, além de outras enzimas proteolíticas (dipeptidil peptidase e invadolisinas), constitui as secreções utilizadas no processo de penetração. Outra proteína encontrada em secreções de cercárias é a SmKK7, por apresentar homologia com toxinas de escorpião, acredita-se que possua a capacidade de bloquear canais de K+, auxiliando na modulação do sistema imune (Curwen et al., 2006). O processo de penetração das cercárias pode levar em média de 4 a 6 minutos, porém algumas cercárias levam apenas 1.5 minutos para passar pela barreira física da pele (Haas and Haeberlein, 2009).
7 proteínas e moléculas do hospedeiro como CD44 e glicolipídeos provenientes de eritrócitos, favorecendo-o na evasão do sistema imune (Castro-Borges et al., 2011a). O tegumento também funciona como uma barreira física protegendo os componentes enzimáticos, transportadores, canais iônicos da membrana plasmática e ainda apresenta capacidade de renovação a cada 5 dias (Saunders et al., 1987, Braschi and Wilson, 2006).
Os esquistossômulos permanecem neste estágio por 2 a 3 dias, antes de migrarem, através do sistema linfático e vênulas presente na derme, para o sistema circulatório. Ao atingir a corrente sanguínea, passam pelo coração e eventualmente pelos pulmões, até alcançarem o sistema porta-hepático. Após o 28° dia de infecção, os vermes presentes no sistema porta-hepático se acasalam e dão início à migração até as vênulas mesentéricas para o início da ovoposição. Através do pareamento, o macho libera os espermatozóides dentro do canal ginecóforo, estes fecundam os ovócitos dando origem ao zigoto (Dewalick et al., 2011). O desenvolvimento sexual da fêmea e, consequentemente, o início da ovoposição, são dependentes do acasalamento com o macho. Acredita-se que através de vias de sinalização envolvendo o fator de crescimento TGF-β, o macho ativa e regula a expressão gênica na fêmea (Freitas et al., 2007, Beckmann et al., 2010).
A produção de aproximadamente 300 ovos por dia, e a consequente presença destes ovos no tecido hepático, promove a liberação de antígenos solúveis (SEA), induzindo o aparecimento de reações inflamatórias periovulares, originando os granulomas e, em seguida, o processo de fibrose (Manzella et al., 2008). As glicoproteínas Omega-1 e IPSE/alpha-1 juntas constituem a fração mais abundante dos antígenos solúveis de ovos (SEA). Estas proteínas são hepatotóxicas e imunogênicas, possuem a capacidade de estimular a liberação de IL-4, induzindo uma resposta inflamatória do tipo Th2 no hospedeiro (Abdulla et al., 2011, Mathieson and Wilson, 2010). Os ovos depositados no endotélio da parede das vênulas induzem uma reação inflamatória periovular, a qual provavelmente facilita a passagem dos mesmos pela musculatura até atingirem a luz intestinal (Lenzi et al., 1991). Ao serem liberados juntamente com as fezes, os ovos alcançam as coleções hídricas e, em contato com a água doce, eclodem liberando os miracídios. Os miracídios são formas larvais ciliadas, capazes de nadar em busca do hospedeiro invertebrado, moluscos do gênero Biomphalaria. No hepatopâncreas do molusco, as larvas transformam-se em esporocistos primários, os quais se desenvolvem em esporocistos secundários. Estes últimos, por meio de reprodução assexuada, dão origem às cercárias. Análises recentes de transcrição gênica por microarray
8 hospedeiro vertebrado, ocorre no interior do molusco durante os estágios de diferenciação em cercárias (Parker-Manuel et al., 2011), Figura 4.
Figura 4: Ciclo de vida do S. mansoni. O S. mansoni possui um ciclo heteroxeno, necessitando de um hospedeiro invertebrado (Biomphalaria) e de um hospedeiro vertebrado. Cercárias liberadas pelos caramujos penetram ativamente na pele do hospedeiro vertebrado e se transformam em esquistossômulos. Estes atingem o sistema circulatório através da derme, e se alojam no sistema porta-hepático. No sistema porta-hepático os vermes, acasalam-se e, em seguida, migram para as veias mesentéricas dando início à ovoposição. Os ovos atingem as coleções hídricas, eclodem e liberam os miracídios. Os miracídios infectam o caramujo, transformam-se em esporocistos primários que por poliembrionia geram esporocistos filhos e depois cercárias. Adaptado de:
9 1.3 - Diagnóstico e Tratamento
O diagnóstico da esquistossomose pode ser realizado por métodos diretos e indiretos. Os métodos indiretos ou sorológicos dependem de marcadores bioquímicos e imunológicos associados à infecção, dentre os quais se destacam os testes imunológicos como a imunofluorescência, ensaios imunoenzimáticos (ELISA), reação intradérmica e reação periovular. Técnicas de reação em cadeia de polimerase estão sendo descritas para o diagnóstico da doença (Pontes et al., 2002). Atualmente a técnica de Kato-Katz é o método parasitológico recomendado para o diagnóstico da esquistossomose, por ser quantitativo e prático (Katz et al., 1972). No entanto, a sensibilidade desta técnica diminui quando a prevalência e intensidade da infecção são baixas (Zhou et al., 2008, Lin et al., 2008).
Os testes sorológicos para detecção de IgG e IgM no soro de pacientes, possuem uma grande sensibilidade, podendo indicar infestação atual ou passada, principalmente em áreas de baixa prevalência da doença, ou em pacientes com baixa parasitemia. O método de ELISA, por exemplo, além de proporcionar ensaios quantitativos, mostra-se mais adequado para aplicação em estudos populacionais onde se encontra baixa parasitemia, apresentando uma sensibilidade e especificidade próximas de 98% (Oliveira et al., 2005). Teste de imunofluorêscencia para a detecção de anticorpos contra S. mansoni demonstram alto grau de sensibilidade 95,6% para as fases aguda e crônica (Kanamura et al., 2002). Entretanto, este método possui especificidade em torno de 50%. Em geral os ensaios de detecção de anticorpos demonstram ser mais sensíveis que os exames parasitológicos, mas carecem de especificidade. Já a detecção de antígenos circulantes é um método altamente específico, porém não tem demonstrado ser mais sensível que os exames parasitológicos em áreas de baixa endemicidade (Attallah et al., 1999, Van Lieshout et al., 1995). Os testes de reação em cadeia da polimerase (PCR), realizados a partir de amostras de fezes e soros de pacientes, não demonstraram reações cruzadas com outros helmintos, atingindo sensibilidade de 96.7% e especificidade de 88% (Pontes et al., 2002). Contudo, testes como imunofluorêscencia e PCR não estão disponíveis na rotina do sistema público de saúde (Sorgho et al., 2005). Desta maneira, torna-se necessário o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico, especialmente para auxiliar na detecção de pacientes com baixa carga parasitária (Alan Wilson et al., 2006).
10 praziquantel é a droga disponível atualmente, em função do menor custo. O modo de ação do praziquantel não é totalmente compreendido, a maioria dos estudos aponta para perturbações na homeostase do cálcio e comprometimento das funções normais do tegumento (Kasinathan et al., 2010). Neste sentido, o desenvolvimento de novos medicamentos para combater a infecção também se torna necessário, uma vez que existem relatos de resistência do parasito à ação deste fármaco (Kasinathan et al., 2010).
1.4 - Proteômica
A palavra proteoma foi primeiramente introduzida por Wilkins (1996), onde foi utilizada para expressar a idéia do conjunto das proteínas de uma célula ou organismo. Assim, a proteômica foi estabelecida como ferramenta para o estudo da expressão proteica e suas alterações (Anderson and Anderson, 1998). Atualmente existe um grande interesse na aplicação da proteômica, como ferramenta para a identificação de marcadores proteicos. Alguns tecidos, órgãos e fluidos corporais, tais como plasma e saliva já estão sendo utilizados na busca de possíveis biomarcadores de infecções (Bodzon-Kulakowska et al., 2007). A proteômica também reune ferramentas que fornecem informações sobre modificações pós-traducionais, abundância de proteínas e interações proteicas, possibilitando o estudo de alterações metabólicas ocorridas em um organismo (Harvie et al., 2007, Manivannan et al., 2011).
11
A partir do desenvolvimento de gradientes de pHs imobilizados, para separação das proteínas na 1ª dimensão, obteve-se uma melhor reprodutibilidade dos géis (Gorg et al., 2009). Em seguida, surgiu a necessidade de identificação em larga escala das proteínas detectadas em gel. O emprego da técnica de digestão in gel, a qual baseia-se na excisão da banda contendo a proteína de interesse e incorporação de enzimas proteolíticas, para a geração de peptídeos, possibilitou a identificação destas proteínas por espectrometria de massas. As recentes técnicas de sequenciamento de peptídeos / proteínas via ESI-MS (
Electrospray Ionization Mass Spectrometry ) e MALDI-MS ( Matrix – Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry) e o desenvolvimento de algoritmos de busca utilizando-se de dados espectrais, tornou possível a identificação de proteínas em larga escala (Cottrell, 2011, Seidler et al., 2010). No processo de ionização por ESI, os peptídeos são submetidos à cromatografia líquida e, durante a eluição, direcionados à um spray capilar. Neste capilar aplica-se uma altissíma diferença de potencial, proporcionando a formação e dispersão de gotas microscópicas carregadas. Uma vez dispersadas, as gotículas microscópicas contendo os peptídeos ionizados, são evaporadas formando-se gotas de diâmetros cada vez menores, até atingirem o estado gasoso, evento chamado de fissão de
Figura 5: Géis de eletroforese bidimensional. Géis ilustrativos mostrando a separação das proteínas na
primeira dimensão pH 3-10, seguido de separação de acordo com a massa molecular.Adaptado de (Rusconi et al., 2010)
12 Coulomb (Kebarle and Verkerk, 2009). Após a fissão, a relação m/z (massa/carga) pode ser obtida a partir de uma variedade de analisadores de massas e detectores disponíveis atualmente, Figura 6A.
No processo de ionização por MALDI, os peptídeos são misturados à uma matriz orgânica capaz de absorver radiação ultra violeta. Após a solidificação dos peptídeos na matriz orgânica utiliza-se laser em comprimento de onda definido, para promover a sublimação e transferência de carga aos peptídeos, possibilitando a identificação via diferentes analisadores de massas Figura 6B.
A - ESI
B - MALDI
13 1.5 - Modelo murino de infecção por S. mansoni
Considerado como o principal modelo utilizado para infecção experimental por S. mansoni, o modelo murino vem contribuindo para o entendimento de inúmeros aspectos ligados à esquistossomose e à biologia do parasito (Abdul-Ghani and Hassan, 2010). Dentre os aspectos que justificam sua utilização incluem o baixo custo, a facilidade de manipulação do animal e o tempo reduzido necessário para a evolução clínica da doença. No camundongo, a esquistossomose de fase aguda se estabelece durante os primeiros 30 a 35 dias de infecção, tempo necessário para a instalação dos vermes adultos no sistema porta-hepático, pareamento e início da ovoposição (Loverde and Chen, 1991, Harvie et al., 2007). A fase crônica, por sua vez, inicia-se a partir da postura dos ovos sendo as complicações teciduais ocasionadas pela deposição crescente dos mesmos nos tecidos, especialmente no hepático (Manivannan et al., 2010). Dependendo da carga parasitária, o animal dificilmente sobrevive à 8ª semana de infecção, embora tenha sido demonstrado que a infecção com 45 cercárias garante sobrevida por até 20 semanas em camundongos machos da linhagem CBA/J (Henderson et al., 1993).
14 O presente trabalho pretende, a partir de uma coleção de dados clínicos, ensaios de atividade enzimática, análise histológica de fígado e baço e análise comparativa de proteínas por gel bidimensional, contribuir com o entendimento da relação parasito/hospedeiro durante o curso da infecção por S. mansoni, utilizando camundongos isogênicos da linhagem Balb/c. Espera-se que os resultados encontrados possam, no futuro, apontar candidatos potenciais para melhoria das técnicas de diagnóstico, prognóstico e tratamento da esquistossomose.
Tabela 2: Principais metabólitos alterados em urina de camundongos infectados com S. mansoni e em hamsters infectados com S. japonicum (Utzinger et al., 2011).
a Camundongos fêmeas infectados com 80 cercárias de S. mansoni, amostras de
urina coletadas após 46 e 56 dias de infecção e analisadas por ressonância magnética nuclear (NMR).
b Camundongos fêmeas infectados com 100 cercárias de S. mansoni, amostras de
urina coletadas após 56 dias de infecção e analisadas por eletroforese em capilar (CE).
c Hamsters infectados com 100 cercárias de S. japonicum, amostras de urina
15
2
-
Objetivos
2.1 - Objetivo geral
Identificação de proteínas solúveis diferencialmente presentes no fígado e baço de camundongos Balb/c infectados por S. mansoni, nos estágios de fase aguda e crônica da doença.
2.2 - Objetivos específicos
Discriminar os estágios de fase aguda e fase crônica da esquistossomose em camundongos Balb/c infectados com cercárias de S. mansoni através de ensaios enzimáticos, leucometria, Razão percentual (órgão/Corpo) e análise histológica;
Obter o proteoma solúvel de fígado e baço dos animais controles e infectados nos dois estágios distintos da infecção;
Realizar eletroforese bidimensional comparativa para a detecção de proteínas diferencialmente presentes no fígado e baço de animais infectados;
17
3
-
Metodologia
3.1 - Manutenção do ciclo do S. mansoni
A manutenção do ciclo do S. mansoni é rotineiramente realizada no Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto / USP. Cercárias de S. mansoni da linhagem Porto Rico são recuperadas a partir de moluscos da espécie
Biomphalaria glabrata previamente infectados. Os moluscos são mantidos no escuro por 48 horas antes de serem expostos à luz artificial, pelo período mínimo de 2 horas para a liberação das cercárias. As cercárias liberadas são contadas em microscópio óptico antes de serem utilizadas para a infecção dos animais. O processo de infecção se dá através do contado percutâneo de cercárias com o abdômen dos animais, simulando uma infecção natural.
3.2 – Delineamento Experimental
18 Após a infecção, os 32 animais foram separados em dois grupos conforme indicado na Tabela 3: Grupo I (animais com 5 semanas de infecção) e grupo II (animais com 7 semanas de infecção). Em seguida, os animais forammantidos em gaiolas à temperatura ambiente com ração e água ad libitum e ciclo claro/escuro com intervalos de 12 horas. Todos os procedimentos realizados com os animais foram aprovados pela Comissão de Ética em Uso Animal.
Grupo I – 5 semanas Grupo II – 7 semanas
Controle (N=6) Controle(N=6) Infectado (N=10) Infectado (N=10)
6-Infecção por anel 5-Suspensão de
cercárias
4-Anestesia dos animais
3-Contagem das cercárias
2-Liberação das
cercárias
1-Biomphalaria glabrata
infectados
Figura 7: Representação do método de infecção por anel. 1 e 2- Caramujos infectados são expostos à luz
para liberação das cercárias. 3- A contagem das cercárias é realizada em microscópio óptico. 4- Camundongos são anestesiados por via intraperitoneal. 5- A suspensão de cercárias (200 cercárias/ml) é
adicionada sobre o abdômen do animal, através do anel de infecção. 6- Decorrido 30 minutos de infecção, a
suspensão de cercárias é retirada do anel.
Tabela 3: Amostragem de animais
19 3.3 - Exame parasitológico de fezes
Cerca de 300 mg de fezes recolhidas de cada animal infectado, foram coletadas entre o 35º e o 50º dia de infecção em intervalos de 5 dias. As amostras foram conservadas em formol tamponado 10% até a realização dos exames. Análise das fezes foi realizada segundo o método de sedimentação espontânea ou método de Hoffman, (Hoffman WA, 1934). O sedimento obtido foi analisado diretamente ao microscópio óptico para a determinação do número de ovos por lâmina. As lâminas foram confeccionadas em triplicata para cada animal, utilizando-se 200 μl de sedimento.
3.4 -Obtenção do material biológico
Todos os animais dos grupos I e II foram eutanasiados respectivamente após 5 e 7 semanas de infecção, utilizando-se a administração intraperitoneal dos anestésicos cloridrato de cetamina 10% (Syntec) a 24.0 mg/Kg e cloridrato de xilazina 2,3% (Vetbrands) a 12.0 mg/Kg. Após verificação de analgesia profunda, os animais foram pesados e, em seguida, cerca de 700 L de sangue coletados por punção cardíaca. O sistema porta-hepático dos animais foi posteriormente perfundido com solução salina citratada (NaCl 0.85%, Citrato de sódio 0.75%).
Após a perfusão foram retirados o fígado e o baço dos animais dos grupos controle e infectado. Os órgãos foram pesados, lavados em tampão fosfato de sódio (PBS 0,01 M pH 7,2) e segmentos de aproximadamente 0.5 cm de largura obtidos e armazenados em formol tamponado 10% para análises histológicas. O restante dos órgãos foi congelado em freezer -80°C para posteriores análises proteômicas.
3.5 – Razão peso do órgão e peso corporal
20 3.6 – Leucograma
O sangue obtido foi dividido em duas partes, sendo cerca de 400 μL mantido na presença de EDTA a 2% para análises hematológicas e 300 μL para obtenção de soro. Para a realização das análises hematológicas foram determinados: contagem global de leucócitos e análise diferencial (número de linfócitos, neutrófilos segmentados, monócitos e eosinófilos). Os leucogramas dos animais do grupo controle serviram como valores normais de referência. Os esfregaços obtidos para a contagem diferencial foram corados utilizando-se o Kit Instant Prov (Labor & Labor Bioclin). Para a contagem global de leucócitos, diluiu-se o sangue em líquido de Turk (ácido acético 2%, violeta genciana 0,1%) na proporção de 1:10 e este foi analisado em câmara de Neubauer espelhada. As análises estatísticas foram realizadas utilizando Student´s t-test não pareado, através do software Prism versão 5.0.
3.7 - Dosagens enzimáticas para ALT, AST e Albumina Sérica
O soro obtido foi utilizado para dosagens bioquímicas de ALT (alanino aminotransferase); AST (aspartato aminotrasferase) e Albumina sérica. As amostras de soro foram analisadas pelo Laboratório de Análises Clínicas - Claudino / Ouro Preto, onde as enzimas transaminases foram dosadas através de métodos cinéticos e submetidas à leitura no ultravioleta por espectrofotometria (Bioclin). A albumina foi dosada através do método colorimétrico verde de bromocresol (Bioclin). As dosagens enzimáticas e de albumina do grupo controle serviram como valores normais de referência. As análises estatísticas foram realizadas utilizando Student´s t-test não pareado, através do software Prism versão 5.0.
3.8 - Análise histológica
Durante a necropsia, amostras de fígado e baço foram fixados em formol 3,7% tamponado (pH 7.2), processados rotineiramente e incluídos em parafina. Secções de aproximadamente 4 μm de espessura foram obtidas em micrótomo e submetidas à coloração com Hematoxilina & Eosina (HE) e Tricrômico de Masson.
21 perivascular e a área média dos granulomas. A coloração de Tricrômico de Masson permitiu a avaliação qualitativa do processo de fibrose no interior dos granulomas.
Para avaliação do processo inflamatório foram quantificados os núcleos celulares presentes no infiltrado perivascular em toda a extensão do corte histológico. As imagens foram visualizadas pela objetiva de 40x e digitalizadas através da microcâmera Leica DFC340FX associada ao microscópio Leica DM5000B. Todas as imagens foram analisadas com o auxílio do software de análise e processamento de imagem Leica QwinV3 no Laboratório Multiusuários do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto. O processo inflamatório foi determinado pela diferença significativa (p<0,05) entre o número de núcleos celulares presentes nos animais infectados e aquele observado nos animais controles ± desvio padrão.
3.9 - Extração de proteínas
Para a extração de proteínas solúveis, 100 mg de tecidos foram macerados em nitrogênio líquido com o auxílio de um gral e pistilo. O conteúdo macerado foi colocado em
eppendorf e, em seguida, adicionou-se 500 μL de tampão de extração (Tris-HCl 25 mM pH 7,5) contendo 20 μL de PIC ( coquetel inibidor de proteases, Sigma-Aldrich). A mistura foi homogeneizada em vortex por 5 minutos, seguido de sonicação (Sonifer 250 Branson) por 5 ciclos de 20 pulsos em banho de gelo. A suspensão resultante foi centrifugada a 4°C e 100.000 x g por 1 hora em centrifuga Sorvall 5C. O sobrenadante, referente à fração solúvel, foi recuperado e o sedimento contendo membranas, armazenado a -80°C. Uma alíquota de 50 μL do sobrenadante foi armazenada para dosagem de proteínas totais.
22 200 μL de tampão de reidratação (uréia 7 M; tiouréia 2 M; CHAPS (3-[(3-Cholamidopropil) dimetilamônio]-1- propanosulfonato) 4%; azul de bromofenol 0.002%), Figura 8.
Figura 8:Diagrama esquemático para obtenção de proteínas solúveis.
3.10 – Eletroforese unidimensional (1D SDS-PAGE)
Anteriormente à confecção dos géis unidimensionais, fez-se a dosagem de proteínas solúveis, obtidas conforme o item 3.9. pra esta dosagem foi utilizando o kitBCA protein assay
23 pH 6.8; SDS 4%; glicerol 20%; azul de bromofenol 0,002%). As amostras foram fervidas em banho-maria por 5 minutos, e, em seguida, aplicadas no gel. A eletroforese ocorreu a 200 V e 20 mA durante aproximadamente 1,5 horas. Utilizou-se solução de Coomassie Brilliant Blue G 250 (Coomassie Brilliant BlueG 250 2%; etanol 40%; ácido acético 7%) para coloração do gel durante 2 horas. O gel foi descorado em solução A (etanol 40%, ácido acético 7%) por 30 minutos e, em seguida, em solução B (etanol 10%, ácido acético 7%) durante a noite. As imagens dos géis foram obtidas através do scanner ImageScanner III (GE healthcare). A análise densitométrica, utilizando-se de canaletas referências contendo 30 g de proteínas citossólicas, foi realizada com o auxílio do software Quantity One, versão 4.6.9 – Bio Rad. Esta análise foi utilizada para se igualar a quantidade total de proteínas obtidas dos animais controles e infectados e posterior confecção das réplicas técnicas nos géis bidimensionais.
3.11 - Eletroforese bidimensional (2-D SDS-PAGE)
Para a confecção de géis bidimensionais 300 μg de proteínas citosólicas foram solubilizadas em tampão de reidratação contendo DTT a 1% e anfólitos pH 3-10 ou 4-7 0,8%. As amostras foram acondicionadas em sarcófagos (Strip Holder 7 cm, GE Healthcare) para a incorporação das proteínas no gel de primeira dimensão (Immobiline DryStrip Gels 7cm; pH 3-10 ou pH 4-7, Linear,GE Healthcare). A etapa de isoeletrofocalização (IEF) ocorreu à temperatura de 20°C a 50 μA/gel no equipamento Ettan IPGphor III (GE Healthcare) de acordo com o seguinte protocolo: reidratação por 12 horas; 300V durante 30 minutos; 1000V por 30 minutos e 8000V por 3 horas. Após a focalização isoelétrica, as proteínas presentes nos géis de primeira dimensão foram submetidas à redução com 1% de DTT em solução de equilíbrio (uréia 6M; Tris-HCl pH 8.8 1.5M; glicerol 30%; SDS 2%; azul de bromofenol 1%) e, em seguida, alquiladas com iodoacetamida (IAA) a 4% em solução de equilíbrio.
24
healthcare) e sobrepostas através do software 2-D Evolution v.2005, (GE healthcare). A Figura 9 mostra uma representação das etapas de confecção dos géis bidimensionais.
Figura 9: Ilustração das etapas de produção do gel bidimensional (2-DE). Extratos citosólicos, obtidos de
25 3.12 – Digestão in gel e preparo de amostras para espectrometria de massas
Após a obtenção dos géis bidimensionais, os spots de interesse (proteínas diferencialmente presentes nos grupos controle e infectados) foram excisados e transferidos para eppendorfs de 1,5 ml contendo 300 μL de solução descorante (etanol 40%; ácido acético 7%) e mantidas a 37°C até a completa descoloração. A solução descorante foi retirada e os
spots lavados com 500 μL de água milli-Q para remover o excesso de solução descorante. Em seguida, os spots foram novamente lavados e desidratados por 3 vezes durante 5 min em 300 μL de solução 20 mM NH4HCO3 / Acetonitrila (ACN) 50%.
A desidratação completa dos spots ocorreu em speed vaccum durante 30 minutos. Os spots foram reidratados com cerca de 15 μL de solução de tripsina a 0,1 μg/ μL em solução 20 mM NH4HCO3. Após 20 minutos, o excesso de solução de tripsina foi retirado e os spots
recobertos com cerca de 40 μl de solução NH4HCO3 a 20mM. A tripsinólise ocorreu a 37°C
por 24 horas. O sobrenadante de reação contendo os peptídeos trípticos foi recuperado e transferido para um novo tubo. Para a extração dos peptídeos presentes no interior dos spots
26 3.13 –Identificação das proteínas por espectrometria de massas
3.13 – Identificação por espectrometria de massas
Os peptídeos provenientes de cada digestão in gel descrita no item 3.12, foram analisados no Setor de Espectrometria de Massas do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais – ABTLuS), Campinas – SP. Inicialmente, os peptídeos foram resusspensos em 12 L de ácido fórmico 0.1% e cerca de 4 L submetidos à pré-coluna nanoAcqutiy Symmetry C18, 5 µm (180 µm x 20 mm, Waters) acoplada ao sistema nanoAcquity UPLC (Waters) utilizando ácido fórmico a 0.1% (v/v) a um fluxo de 10 L/min. A pré-coluna foi lavada durante 5 min e, em seguida, o fluxo foi direcionado para a coluna capilar nanoAcquity BEH130 1.7 µm C18 (75 m x 250 mm, Waters). A separação dos peptídeos nesta coluna ocorreu a partir da utilização de dois solventes, solvente A – 0.1% ácido fórmico e solvente B – 100% ACN/0.1% ácido fórmico. O fluxo para a coluna capilar foi de 300 nL/min, a temperatura da coluna ajustada para 60°C e o perfil do gradiente estabelecido segundo as condições: 5% solvente B por 2 min, seguido por um gradiente
Figura 10: Etapas do processo de digestão in gel. Bandas de interesse dos géis controle e infectados são
27 linear até 35% solvente B durante 20 min. Finalmente, lavou-se a coluna utilizando 95% solvente B por 2.5 min.
O sistema de nanocromatografia citado acima interfaceado com o espectrômetro Q-Tof Ultima (Micromass – Waters) contendo uma fonte de nano-electrospray, constituíram o equipamento utilizado para a detecção e fragmentação dos peptídeos. Espectros MS e MS/MS foram adquiridos utilizando o modo AutoMSMS. Os parâmetros de espectrometria de massas para o modo MS incluíram: voltagem do íon “spray” 1500 V, gás de secagem a 6L/min, temperatura do gás de secagem 160°C, faixa de aquisição m/z 50-2.200. No modo AutoMSMS as condições foram as seguintes: dissociação induzida por colisão com gás N2 ,
faixa de aquisição m/z 350-1.400, carga dos íons selecionados para fragmentação +2, +3 e +4 e exclusão de íons com carga +1.
28
30 4 – Resultados
4.1 – Exame parasitológico de fezes - acompanhamento da ovoposição nos animais infectados
O gráfico representado na Figura 12 mostra o número médio de ovos de S. mansoni presentes no sedimento de fezes após 35º, 40º, 45º e 50º dias de infecção. Os resultados dos exames demonstraram que entre o 35º e 40º dia após a infecção o número de ovos presentes nas fezes é significativamente menor em comparação com a ovoposição observada no período entre o 45º e o 50º dia. Este resultado, embora não exatamente quantitativo, serviu para a definição de dois grupos experimentais distintos para a posterior análise de biomarcadores teciduais associados com a infecção. A partir do 45º dia o número médio de ovos depositados nos tecidos aumenta consideravelmente caracterizando a fase crônica da doença no modelo murino.
Figura 12: Gráfico demonstrando a evolução da ovoposição nos animais infectados entre o 35º e o 50º dia de infecção.
Para as análises estatísticas utilizou-se o número médio de ovos presentes em 300 mg de fezes de 5 animais. As triplicatas das lâminas foram analisadas no software Prism versão 5.0 utilizando Student´s t-test pareado.
31 4.2 – Avaliação de esplenomegalia e hepatomegalia nos animais dos grupos I e II
A Figura 13 demonstra as alterações indicativas de hepatoesplenomegalia nos animais infectados em comparação com os animais controles para os dois grupos avaliados. No gráfico (A) podemos observar um significativo aumento do baço nos animais com 5 semanas de infecção, período no qual o peso do órgão aumenta 100% em relação ao baço de animais controles. No gráfico (B) observa-se um aumento discreto do fígado para estes animais. Para os animais com 7 semanas de infecção foram observados aumentos significativos de baço e fígado, gráficos (C) e (D). Nestes animais observou-se aumento de até quatro vezes para o baço e de até duas vezes para o fígado em relação ao peso dos órgãos nos animais controles. Neste período a hepatoesplenomegalia característica da esquistossomose está bem definida o que contribuiu para a definição de fase crônica da doença nos animais infectados. As análises estatísticas foram realizadas utilizando Student´s t-test não pareado, através do software Prism versão 5.0.
Figura 13: Relação peso do órgão e peso corporal dos grupos I e II. (A) % Baço/Corpo grupo I (B) %
Fígado/Corpo grupo I (C) % Baço/Corpo grupo II (D) % Fígado/Corpo grupo II. As análises estatísticas foram
realizadas através do software Prism versão 5.0, utilizando-se Student´s t-test não pareado. * p≤ 0.05 *** p≤
0.001.
*
*** ***
32 4.3 – Análises hematológicas e dosagens bioquímicas
33 *
Figura 14: Análise global e diferencial de leucócitos do grupo I com 5 semanas de infecção. (A)
Leucócitos globais (B) % de Monócitos (C) % de Linfócitos (D) % de Segmentados (E) % de
Eosinófilos. As análises estatísticas foram realizadas através do software Prism versão 5.0, utilizando-se
34 *
Figura 15: Análise global e diferencial de leucócitos do grupo II com 7 semanas de infecção. (A)
35 As amostras de sangue recolhidas dos animais dos grupos I e II, também foram utilizadas para avaliação de marcadores clássicos de dano tecidual, especificamente dosagem de atividade de ALT e AST e concentração de albumina sérica. Na Tabela 4 podemos observar as alterações das enzimas transaminases e alterações no nível de albumina sérica ao longo da infecção. Os resultados das avaliações bioquímicas demonstraram diminuição nos níveis das enzimas transaminases ALT e AST, entre os animais infectados e controles do grupo I e do grupo II. A razão ALT/AST teve um aumento em torno de 50% comparando os animais infectados dos dois grupos. A princípio esta razão poderia indicar aumento dos níveis de ALT a partir da 5 semana de infecção, demonstrando a severidade do dano hepático. No entanto, os valores absolutos de atividade enzimática demonstraram que os níveis de ALT permaneceram sem grandes alterações enquanto os níveis de AST diminuíram o que contribuiu para o aumento da razão ALT/AST. Por outro lado, os níveis séricos de albumina diminuíram em relação ao controle nos animais com 5 semanas de infecção e, significativamente, nos animais com 7 semanas de infecção, demonstrando o comprometimento da função hepática associado à fase crônica da esquistossomose.
Grupo I a (5 semanas de infecção)
Grupo II b (7 semanas de infecção)
Controle Infectado Controle Infectado
ALT (U/L) 392,9 203,5 202,5±72,0 150,1±2,4
AST (U/L) 757,9 653,1 511,2±139,6 260,7±17,4
ALT/AST 0,52 0,31 0,40 0,58
ALB (g/dL) 3,76 3,56 3,86±0,11 2,93±0,11**
Tabela 4: Tabela de dosagens bioquímicas
a- Para os animais do grupo I, os dados mostrados correspondem a dosagens de apenas um pool
36 4.4 – Análises histológicas de fígado e baço
37
Figura 16: Fotomicrografias de fígado de camundongos infectados com Schistosoma mansoni e necropsiados com 5 e 7 semanas após a infecção. (A) aspecto histológico normal de camundongos controles do grupo I, evidenciando os componentes da tríade portal (asterisco) e veia centro-lobular (seta);(B) aspecto histológico normal de camundongos controles do grupo
II, evidenciando os componentes da tríade portal (asterisco) e veia centro-lobular (setas); (C) camundongos infectados do grupo I necropsiados após 5 semanas de infecção, apresentando discreto infiltrado inflamatório perivascular (asterisco); (D) camundongos infectados do grupo
II necropsiados após 7 semanas de infecção, evidenciando acentuado infiltrado inflamatório perivascular (asterisco); (E) presença de helmintos na veia da tríade portal (seta); (F) ovos no parênquima hepático de um animal infectado do grupo I, necropsiados após 5 semanas de infecção (cabeça da seta); (G) ovos isolados por inflamação granulomatosa, presente em um
animal infectado do grupo II, necropsiados após 7 semanas de infecção (seta); (H) presença de
granulomas fibrosados no parênquima hepático de um animal infectado do grupo II, necropsiados após 7 semanas de infecção (cabeça de seta). Coloração por Hematoxilina-Eosina
38 O aspecto histológico normal do baço de animais controles dos grupos I e II está demonstrado, respectivamente nas Figuras 18A/18C. Observa-se a polpa branca organizada em folículos nodulares não estimulados e a distribuição celular da polpa vermelha apresenta aspecto histológico normal. Nos animais do grupo I, com 5 semanas de infecção, os nódulos foliculares apresentaram-se hipertróficos, com aparecimento de centros germinativos constituídos de macrófagos e linfócitos, Figura 18B. Os animais do grupo II, com 7 semanas de infecção, apresentaram hiperplasia de polpa branca e aumento acentuado de linfócitos e de células fagocitárias na região de polpa vermelha, Figura 18D. A medida da área nodular do baço, revelou aumento de 100% nos animais com 5 semanas de infecção, Figura 19. Para os animais com 7 semanas de infecção, não foi obtida a área nodular, devido à intensa hiperplasia do órgão, a qual dificultou a delimitação exata do nódulo.
***
Figura 17: Gráfico comparativo do
39
Figura 18: Fotomicrografias de baço de camundongos infectados com Schistosoma mansoni e necropsiados com 5 e 7 semanas após a infecção. (A) aspecto histológico normal de camundongos controles do grupo I, evidenciando a organização nodular da polpa branca (circulado), distribuída entre as células da polpa vermelha (asterisco); (B) hipertrofia
nodular com hiperplasia das células da polpa branca restrita à região folicular em camundongos infectados do grupo I, necropsiados após 5 semanas de infecção. (C) aspecto
histológico normal de camundongos controles do grupo II, necropsiados após 7 semanas de infecção, evidenciando a organização nodular da polpa branca (circulado) distribuída entre as células da polpa vermelha (asterisco); (D) hiperplasia das células da polpa branca
extrapolando a região nodular, com perda de arquitetura esplênica, em camundongos do grupo II, necropsiados após 7 semanas de infecção. (A-D) Hematoxilina-Eosina. Barra=100µm
Figura 19: Gráfico comparando
a área nodular no baço entre os animais controles e infectados do grupo I.
Infectado Controle
40 4.5 – Análise proteômica comparativa de fígado e baço dos animais dos grupos I e II
Cerca de 100 mg de baço e fígado foram utilizados para extração de proteínas solúveis conforme descrito no item 3.9. Alíquotas destas preparações foram utilizadas para determinação do conteúdo proteico utilizando o método BCA protein assay (Thermo scientific). Concentrações de proteínas solúveis de animais representantes dos diferentes grupos estão indicadas na Tabela 5, a seguir.
Fígado Baço
Grupo I Grupo II Grupo I Grupo II
Controle 4,22 µg/µl 3,36 µg/µl 5,59 µg/µl 6,55 µg/µl
Infectado 7,99 µg/µl 5,04 µg/µl 4,46 µg/µl 4,97 µg/µl
4.6 – Perfil eletroforético unidimensional e análise densitométrica
As frações proteicas obtidas foram inicialmente analisadas em géis de poliacrilamida unidimensionais (1D SDS-PAGE) para avaliação de integridade e perfil de bandeamento antes e após a etapa de precipitação por TCA/Acetona. Na Figura 20 observa-se a presença de proteínas em ampla faixa de massa molecular sugerindo efetiva inibição proteolítica durante o preparo da amostra. Além disso, a precipitação não alterou o perfil eletroforético das proteínas solúveis de fígado e baço e provavelmente eliminou de maneira satisfatória a presença de ácidos nucleicos, sais e lipídeos. Contudo, como a solubilização das proteínas precipitadas diretamente no tampão de reidratação dificulta análises precisas de conteúdo proteico, optou-se por realizar densitometria em gel 1D utilizando-se de quantidade conhecida de suas respectivas frações solúveis não precipitadas. Desta maneira, foi possível igualar as quantidades de proteínas presentes nos géis bidimensionais de animais controles e infectados nos dois grupos.
41 4.7 – Perfil proteico em eletroforese bidimensional (SDS-PAGE) da fração solúvel de fígado
Géis bidimensionais confeccionados com proteínas solúveis de fígado dos animais com 5 e 7 semanas de infecção, foram corados por Coomassie brilliant blue G250 e analisados com auxílio do software 2-D Evolution v.2005, para posterior comparação com seus respectivos géis controles. Uma análise global revelou alterações pouco evidentes entre o proteoma solúvel dos animais controles (A) e infectados (B) por 5 semanas, Figura 21. Entretanto a análise de bandas específicas destes animais, após sobreposição dos géis, demonstrou diferenças significativas de expressão entre animais controles e infectados Tabela 6. Por outro lado, o perfil eletroforético bidimensional de fígado dos animais com 7 semanas de infecção, revelou nítidas alterações na abundância de proteínas compartilhadas por animais controles (A) e infectados (B), Figura 22 e Tabela 6.
A Figura 23 mostra o perfil eletroforético bidimensional de fígado, em pH 4-7, dos animais com 7 semanas de infecção. Esta faixa estreita de pH proporcionou uma melhor resolução das proteínas realçando as alterações no nível de expressão de proteínas neste grupo de animais. Os spots, diferencialmente presentes nos géis confeccionados, foram excisados e submetidos ao processo de digestão in gel utilizando tripsina. Posteriormente os peptídeos provenientes da digestão foram identificados por espectrometria de massas. Dos 74 spots de interesse procedentes de cinco pares de géis réplicas de fígado (pH 3-10 e pH 4-7), foram
Figura 20: Perfil eletroforético representativo de proteínas citosólicas de fígado e baço. FS –
Fração solúvel. FP – Fração precipitada. Alíquotas
contendo cerca de 30 μg de proteínas foram separadas em gel SDS-PAGE 10%.Coloração por
42 selecionadas pelo menos 14 proteínas que apresentaram alterações de expressão comuns aos animais de 5 e 7 semanas de infecção, Tabela 6. O aumento do poder de resolução dos géis com o emprego do pH 4-7 não impediu com que houvesse confluência de bandas para proteínas com massa molecular e ponto isoelétrico semelhantes. Isto resultou, na maioria dos casos, na identificação de mais de uma proteína por spot. Contudo, a utilização da abordagem LC-MS/MS permitiu através do parâmetro de abundância relativa, (emPAI- Exponentially modified protein abundance index), identificar o componente de maior abundância, o qual constitui o foco de investigação neste trabalho.
Figura 21: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de fígado de animais do grupo I (5 semanas de infecção). A) animais controles. B) animais infectados. Géis de poliacrilamida 10%, pH 3-10 SDS-PAGE, com aproximadamente 300 μg de proteínas. Spots vermelhos: Aumento em relação ao controle. Spots
azuis: Diminuição em relação ao controle.
Figura 22: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de fígado de animais do grupo II (7 semanas de infecção). A) animais controles. B) animais
infectados. Géis de poliacrilamida 10%, pH 3-10 SDS-PAGE, com aproximadamente 300 μg de proteínas. Spots vermelhos: Aumento em relação ao controle. Spots
azuis: Diminuição em relação ao controle.
Figura 23: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de fígado de animais do grupo II (7 semanas de infecção). A) animais controles. B) animais infectados. Géis de poliacrilamida 10%, pH 4-7 SDS-PAGE, com aproximadamente 300 μg de proteínas. Spots vermelhos: Aumento em relação ao controle. Spots
azuis: Diminuição em relação ao controle.
Spot e Proteínad No. de acesso (gi)
emPAI pI Massa
(kDa)
Função 5 semanas
de infecção
7 semanas de infecção
Referênciaa c
1 Carbamoil Fosfato Sintetase I (CPSase I)
- Citoqueratina-8 (CQ-8)
124248512 52789 0.34 0.06 6.48 5.70 164.61 54.56 CUR EST
-0,24 - 0.57* - 2.6
2 Proteína reguladora de glicose 94 kDa (GRP-94)
-Calreticulina (ERp-60) 6755863 6680836 1.07 0.07 4.74 4.33 92.47 48.14 CHP/re CHP/re
+1.11* + 0.65 sr
3 Proteína reguladora de glicose 78kDa (GRP-78)
-Proteína de choque térmico 70 kDa 1A (HSP-70.3) -Gama glutamil trasferase
1304157 193983 201941 0.86 0.10 0.04 5.07 5.52 4.98 72.42 70.07 78.33 CHP/re CHP/ct ACT
+0.49** +0,79* + 3.9
4 Proteína de choque térmico 71 kDa (HSP-71)
-Albumina
-Proteína reguladora de glicose 75kDa (GRP-75)
13242237 191765 14917005 1.70 0.07 0.04 5.37 5.75 5.91 70.87 68.69 73.52 CHP/ct TRP CHP/ct
+0.18 +0,43* + 4.6
5 Albumina
- Superóxido dismutase Cu/Zn
26340966 226471 0.98 0.21 5.75 6.02 68.69 15.94 TRP ATO
- 0.46** -0.10 - 2.1
6 Transferrina
-Triose-fosfato isomerase (TIM)
14250269 54855 0.72 0.12 6.94 5.56 76.73 32.19 TRP GLC
sv +2.14* + 3.6
7 Transferrina 14250269 0.72 6.94 76.73 TRP +0.62* +2.25* + 4.2
8 Calreticulina (ERp-60) 6680836 1.07 4.33 48.14 CHP/re +0.08 +0,74* + 2.9
9 Dissulfeto isomerase 54777 1.58 4.77 57.06 CHP/re +0.33** +1.24 +2.2
10 Indoletilamina N-metiltransferase 6678281 1.31 6.00 29.46 MTR -0.94*** -0,91*** sr
11 Peroxiredoxina-6
-Indoletilamina N-metiltransferase - Citoqueratina-8 (CQ-8)
-Citoqueratina-1(CQ-1) -Exportina 1 -Metilmalonil-CoA mutase. 3219774 6678281 52789 4159806 15126703 53151 1.12 0.23 0.06 0.05 0.05 0.04 5.71 6.00 5.70 8.39 5.58 6.45 24.87 29.46 54.56 65.60 64.38 82.84 ATO MTR EST EST TRP MTE
-0.45* -0,86** - 6.1
Tabela 6: Proteínas de fígado identificadas por espectrometria de massas
a b a b
Spot e Proteínad
No. de acesso (gi)
emPAI pI Massa
(kDa)
Função 5 semanas de infecção
7 semanas de infecção
Referênciaa c
12 Anidrase carbônica III
-Enoil-CoA hidratase. -Citoqueratina -2 (CQ-2)
31982861 12805413 85701680 1.34 0.22 0.05 6.89 8.76 8.68 29.36 31.47 63.31 ATO MTE EST
-0,52** -0,88** - 5.6
13 Anidrase carbônica III
- Citoqueratina-8 ( CQ-8) - Citoqueratina-1(CQ-1) 31982861 52789 4159806 2.59 0.06 0.05 6.89 5.70 8.39 24.06 54.56 65.60 ATO EST EST
-0,28* -0,84*** - 5.8
14 Triose-fosfato isomerase (TIM)
-Imunoglobulina cadeia leve
-Ribonucleoproteína heterogênea A2/B1
-Ribonucleoproteína heterogênea A3 isoforma A
54855 110434 3329498 31559916 1.26 0.47 0.30 0.08 5.56 7.06 8.97 9.10 32.19 24.49 37.40 39.65 GLC IMG TRD MPT
+0,88** +0,44* - 2.3
CUR- ciclo da uréia; GLC- glicólise; ACT- acetiltransferase.; TRP- Transporte; MTE- metabolismo energético; IMG- imunoglobulina; TRD- tradução; MTR- metil-transferase; CHP/mt- chaperona de mitocôndria; CHP/ct- chaperona de citosol; CHP/re- chaperona de retículo endoplasmático; ATO- anti-oxidante; EST- estrutural.
a (– diminuição na expressão em relação ao controle; + aumento na expressão em relação ao controle). b(razão entre o volume do spot no animal infectado e o volume do spot no animal controle).
c (referência de alterações na abundância de proteínas em camundongos CBA/J infectados com 45 cercárias de S. mansoni, com 12 semanas de infecção). d (classificação das proteína identificadas por
spot de acordo com o índice emPAI).
e (Numeração dos spots nos géis bidimensionais).
sv (sem variação). sr (sem referência).
* p< 0.05 ** p< 0.01 *** p< 0.001.
a b a b
