UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MAURO PEDROMÔNICO ARRYM
Avaliação da resposta antimicobacteriana
de linfócitos T Citotóxicos e Gama-Delta
em jovens brasileiros verticalmente infectados pelo HIV
em Terapia Antirretroviral Combinada efetiva
CAMPINAS
2017
MAURO PEDROMÔNICO ARRYM
Avaliação da resposta anti-micobacteriana de
linfócitos T Citotóxicos e Gama-Delta
em jovens brasileiros verticalmente infectados pelo HIV
em Terapia Antirretroviral Combinada efetiva
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a
obtenção do título de Mestre em Ciências na área de concentração Saúde da Criança e do Adolescente.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Marcos Tadeu Nolasco da Silva CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Carlos Emilio Levy
CAMPINAS
2017
Dedico este trabalho a todas as pessoas presentes em minha vida:
Minha família, por sempre me inspirar e dar forças.
Meu pai, pelo exemplo de pessoa que é.
Minha mãe (sempre presente), pelo exemplo de mulher e mãe que foi.
Meu irmão, pelo incentivo e confiança.
Minha avó, Elizabeth, minha segunda mãe, por todo o carinho e cuidado.
Minha namorada, por estar ao meu lado em todos os momentos e sempre me apioar.
AGRADECIMENTO
Gostaria de iniciar meus agradecimentos por Deus, por ter chego até aqui, por toda a força concedida para a concretização de um sonho e por colocar pessoa tão incríveis e especiais na minha vida. Sem todos, esse sonho não seria concretizado.
Ao Prof. Dr. Marcos Tadeu Nolasco da Silva e Prof. Dr. Carlos Emilio Levy, pela confiança, disponibilidade, oportunidade de trabalhar ao lado dos senhores e todo o ensinamento. Por terem me recebido e aberto as portas da Universidade para que eu pudesse realizar esse trabalho e um sonho. Obrigado pelas conversas e conselhos.
Ao Dr. Fernando Guimarães, por ter aberto a porta de seu laboratório e disponibilizado implementos essenciais para o desenvolvimento de nosso trabalho. Muito obrigado pela disponibilidade, amizade e confiança.
Aos meus pais, Marcus Geraldes Arrym e Márcia Regina Marcondes Pedromonico (sempre presente), meu infinito agradecimento. Por sempre acreditarem em mim e na minha capacidade. Obrigado por toda a educação, por todo o apoio e suporte dado nesses anos. Vocês são o motivo para que eu sempre de o melhor de mim em tudo. Sem os senhores, nada disso seria possível. Obrigado por tudo.
Ao meu irmão, Tiago Pedromonico Arrym, por sempre me apoiar e se orgulhar de mim. Saiba que tenho uma admiração imensa por você e sempre serei seu maior fã. Conte sempre comigo. Obrigado pela confiança.
À Talita Bianchi Aiello, minha namorada, que sempre esteve ao meu lado, me apoiando, incentivando e me ajudando a superar meus limites. Sua presença foi essencial em toda minha trajetória nesses anos. Obrigado pelo seu companheirismo, amizade, paciência, compreensão, apoio e amor.
À minha família como um todo, avós, tios, tias, primas, por sempre me apoiarem e sempre estarem ao meu lado. Vocês são meu maior bem, sem o apoio de cada um, meu sonho não se tornaria realidade. Obrigado pelo amor incondicional.
Aos integrantes do Grupo HIV/TB do Centro de Investigação em Pediatria (CIPED), Mariana, Paulo, Tais, por toda a paciência, cooperação, amizade, angustias e ensinamentos compartilhados. Meus companheiros do dia-a-dia que sempre estarão comigo.
Aos funcionários do Setor de parasitologia do HC/Unicamp, Angela, Celia, José Sergio e Sueli, por sempre me apoiarem nessa trajetória. A amizade de vocês foi muito importante, assim como todos os conselhos.
Aos meus amigos, por sempre estarem comigo em todos os momentos, me apoiando e fazendo eu me distrair com muitas risadas.
Agradeço a todos os pacientes do Hospital de Clinicas da Unicamp (HC/Unicamp) e aos controles que participaram espontaneamente deste trabalho. Por conta deles está dissertação pode ser concluída. Obrigado pela confiança.
Aos funcionários do HC/Unicamp, médicos e enfermeiros, em especial à Dra. Renata e ao Dr. Lucas, que sempre se mostraram dispostos a ajudar a coletar o material e recrutar os integrantes deste trabalho.
RESUMO
INTRODUÇÃO E OBJETIVO: Estimativas recentes avaliam que um terço da população mundial são portadores do bacilo e que cerca de 10,4 milhões de novos casos de tuberculose ocorrem anualmente em todo o mundo, dos quais 86 mil no Brasil. A infecção pelo HIV prejudica os mecanismos adaptativos da imunidade celular. O controle virológico de longa duração por terapia anti-retroviral combinada (TARC) reduz o risco de infecção por micobacterianos. Os linfócitos T Gama-Delta (γδ) podem adquirir a capacidade de processar e apresentar antígenos. Na tuberculose, podem desempenhar diversos papéis na resposta imunológicas, como produzir citocinas inflamatórias e ação citolítica. Com base nesse cenário, nosso estudo teve como objetivo avaliar a capacidade de produção de grânulos citotóxicos, expressão de fenótipo de apresentação de antígeno e ativação celular, em resposta a antígenos micobacterianos, por linfócitos T CD8+ e γδ, em jovens infectados pelo
HIV por transmissão vertical, vacinados por BCG.
MÉTODO: Foi realizado um estudo analítico, prospectivo, observacional, do tipo corte transversal. Foram recrutados 20 indivíduos, entre 16 e 23 anos, no ambulatório de Imunodeficiência secundária do HC/Unicamp e 20 voluntários saudáveis com idade comparável. Foram realizadas culturas celulares não estimuladas, estimuladas por fitohemaglutinina e antígenos micobacterianos (BCG e Mycobacterium tuberculosis – Mtb). Essas culturas foram marcadas com anticorpo CD107a (marcador de degranulação), HLA-DR+CD80+CD86 (fenótipo de células apresentadoras de antígenos).
RESULTADOS: A expressão de CD107a de células T γδ em resposta a antígenos micobacterianos foi semelhante entre grupos e menor no grupo HIV em resposta a fitohemaglutinina. No grupo HIV, a expressão basal de HLA-DR foi maior e a expressão estimulada por antígeno Mtb foi maior nos linfócitos T CD8+. Especificamente no grupo de pacientes infectados
pelo HIV, observou-se maior expressão de CD107a em resposta à fitohemaglutinina no grupo com imunossupressão grave.
CONCLUSÃO: A produção de grânulos citotóxicos semelhante em células T CD8+ e células T γδ, quando comparada a controles saudáveis, pode
representar a preservação imunológica de longo prazo com reconstituição imune sob a TARC bem-sucedida. No entanto, as diferenças na expressão de HLA-DR podem representar inflamação em curso e respostas mais baixas específicas em jovens infectados pelo HIV. Essas características podem ser relevantes no contexto da precocidade e gravidade da infecção pelo HIV adquirida verticalmente.
ABSTRACT
BACKGROUND: Recent estimates evaluate that one-third of the world's population are carriers of the bacillus, and that around 10.4 million new cases of tuberculosis occur annually around the world, of which 86,000 in Brazil. HIV infection harms the adaptive mechanisms of cellular immunity. Long-term virological control by combination anti-retroviral therapy (TARc) reduces the risk of mycobacterial infection. Gamma-Delta T lymphocytes (γδ) may acquire the ability to process and present antigens. In tuberculosis, they may play several roles in the immune response, such as producing inflammatory cytokines and cytolytic action. Based on this scenario, our study aimed to evaluate the capacity of production cytotoxic granules, expression of antigen presenting phenotype and cellular activation in response to mycobacterial antigens by CD8+ and γδ T
lymphocytes in young infected by HIV by vertical transmission, vaccinated by BCG.
METHODS: A prospective cross-sectional study was conducted. Twenty individuals, aged 16-23, were recruited at the Pedriatric Immunodeficiency Outpatient Unit at the State of University of Campinas (Unicamp) Hospital (Campinas, Brazil) and 20 healthy volunteers of comparable age. Cell cultures stimulated by phytohemagglutinin and mycobacterial antigens (BCG and Mycobacterium tuberculosis – Mtb) or negative control were performed. These cultures were marked with CD107a antibody (degranulation marker), HLA-DR+CD80+CD86 (antigen presenting cell phenotype).
RESULTS: CD107a expression of γδ T cells in response to mycobacterial antigens was similar between groups and lower in the HIV group in response to phytohemagglutinin. In the HIV group, the baseline expression of HLA-DR was higher and Mtb antigen-stimulated expression was higher, too. Specifically in the group of HIV-infected patients, greater expression of CD107a was observed in response to phytohemagglutinin in the group with severe immunosuppression.
CONCLUSION: Similar cytotoxic granule production in CD8+ T cells and
γδ T cells, when compared to healthy controls, may represent long-term immune preservation with immune reconstitution under successful CART. However, differences in HLA-DR expression may represent ongoing inflammation and specific lower responses in HIV-infected youngsters. These characteristics may be relevant in the context of the precocity and severity of vertically acquired HIV infection.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1: Classes de antirretrovirais disponíveis no Brasil para o tratamento de crianças e adolescentes (adaptado de BRASIL, 2014). ... 22 Figura 1: Áreas delimitadas (representadas por números) da Câmara de Neubauer... 29 Figura 2: Estratégia de análise de para o ensaio de Produção de grânulos citotóxicos... 32 Figura 3: Estratégia de análise de para o ensaio de Fenótipo de Celulas Apresentadoras de antígeno. ... 33
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Anticorpos utilizados para a marcação de superfície, quantidade (µL/tubo) e fluorocromos. ... 31 Tabela 2: Dados demográficos e laboratoriais dos pacientes infectados por HIV e controles saudáveis ... 35 Tabela 3: Dados clínicos e imunológicos específicos do grupo de pacientes infectados pelo HIV. ... 38 Tabela 4: Dados demográficos e laboratoriais no grupo de pacientes infectados pelo HIV, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave ... 39 Tabela 5: Distribuição da expressão de CD80++CD86+ nas populações de
células HLA-DR+, nos linfócitos T γδ de controles e pacientes infectados por HIV
... 41 Tabela 6: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T CD8+ de
pacientes infectados por HIV e controles ... 42 Tabela 7: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T γδ de
pacientes infectados por HIV e controles ... 43 Tabela 8: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T CD8+, nos
pacientes infectados por HIV e controles ... 44 Tabela 9: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T γδ, nos pacientes infectados por HIV e controles ... 44 Tabela 10: Distribuição da expressão de CD80++CD86+ nas populações de
células HLA-DR+, nos linfócitos T γδ de pacientes infectados por HIV
comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave ... 45 Tabela 11: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T CD8+ de
pacientes infectados por HIV e controles, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave ... 46 Tabela 12: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T γδ de
pacientes infectados por HIV e controles, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave ... 46 Tabela 13: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T CD8+, nos
pacientes infectados por HIV e controles, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave ... 47 Tabela 14: Distribuição da expressão de CD107a (%) em células T γδ, nos pacientes infectados por HIV e controles, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave ... 47
LISTA DE ABREVIAÇÕES
Mtb – Mycobacterium tuberculosis Tb – Tuberculose
LTBI – Tuberculose latente LAM – Lipoarabinomanana TLR2 – Toll-Like Receptor 2
APC – Células apresentadoras de antígeno
ESAT-6 – Early Secreted Antigenic target of 6 kDA CFP-10 – Culture filtrate protein of 10 kDA
Th-1 – T-helper 1
IFN-γ – Interferon Gama IL-4 – Interleucina 4 IL-10 – Interleucina 10
MHC-I – Complexo de Histocompatibilidade I MHC-II – Complexo de Histocompatibilidade II TNF-α – Fator de Necrose Tumoral alfa
IL-2 – Interleucina 2 IL-17 – Interleucina 17
TCR-γδ – T cell Receptor Gamma Delta
HMBPP – (E)-4-hydroxi-3-metil-but-2-enil pirofosfato BCG – Bacilo de Calmette e Guerín
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida NK – Células Natural Killer
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 15
2. OBJETIVO ... 27
3. HIPÓTESE (enunciada na forma nula, ou H0) ... 27
4 MÉTODOS ... 27
4.1 Modelo do estudo ... 27
4.2. População, local e período do estudo ... 28
4.4. Procedimentos ... 30
4.4.1 Hemograma, Imunofenotipagem de sangue periférico e Carga Viral do HIV-1 ... 30
4.4.2 Obtenção dos antígenos utilizados nos ensaios ... 30
4.4.3 Separação de Celulas Mononucleares do Sangue Periférico (CMSP) por gradiente de densidade Ficoll-paque ... 31
4.4.4 Contagem de CMSP em câmara de Neubauer ... 32
4.4.7 Marcação de Anticorpos de superfície ... 34
4.4.8 Estratégia de Análise para o ensaio de Produção de Grânulos Citotóxicos ... 36
4.4.9 Estratégia de Análise para o ensaio de Fenótipo de Células Apresentadoras de Antígeno ... 37 4.5. Variáveis ... 38 4.5.1 Variáveis dependentes. ... 38 4.5.2 Variáveis independentes ... 39 4.6. Análise Estatística ... 39 5. RESULTADOS ... 39
5.1 Dados demográficos da população de estudo ... 39
5.2. Dados específicos ligados ao histórico de infecção pelo HIV no grupo de pacientes. ... 42
5.3. Comparação de subpopulações linfocitárias entre as categorias imunológicas consolidadas 1+2 (imunossupressão ausente ou moderada) e 3 (imunossupressão grave). ... 44
5.4 Comparação entre marcadores celulares em linfócitos T γδ e T CD8+ - pacientes e controles ... 46
5.4.1 Comparação entre Fenótipo de Células Apresentadoras de Antígeno nos linfócitos T γδ – pacientes e controles ... 46
5.4.2 Comparação entre marcadores de ativação celular nos linfócitos T CD8+ e γδ – pacientes e controles ... 47
5.4.3 Comparação na expressão de CD107a nos linfócitos T CD8+ e γδ –
pacientes e controles ... 48
5.5 Comparação entre marcadores celulares em linfócitos T γδ e T CD8+ no grupo de pacientes – gravidade de comprometimento imunológico. ... 49
5.5.1 Comparação entre Fenótipo de Células Apresentadoras de Antígeno nos linfócitos T γδ – imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave ... 50
5.5.2 Comparação entre marcadores de ativação celular nos linfócitos T CD8+ e γδ – imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave ... 50
5.5.3 Comparação na expressão de CD107a nos linfócitos T CD8+ e γδ – imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave ... 52
6. DISCUSSÃO ... 54 7. CONCLUSÃO ... 58 REFERÊNCIAS ... 59 ANEXO 1 ... 67 ANEXO 2 ... 72 ANEXO 3 ... 75 ANEXO 4 ... 77 ANEXO 5 ... 78 ANEXO 6 ... 80 ANEXO 7 ... 81 ANEXO 8 ... 84
1 INTRODUÇÃO
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o patógeno causador da tuberculose, (TB) é um microorganismo dotado de múltiplas estratégias evolutivas de disseminação, invasão, patogenicidade e sobrevivência no hospedeiro humano, sendo considerado por alguns autores o patógeno mais bem sucedido para afetar nossa espécie1. Estimativas recentes avaliam que um terço da população
mundial são portadores do bacilo e que cerca de 10,4 milhões de novos casos de TB ocorrem anualmente em todo o mundo, dos quais 86 mil no Brasil. Apesar da disponibilidade de um tratamento eficaz, a letalidade da tuberculose é alta, com cerca de 1.400.000 mortes por ano, globalmente. No contexto das doenças infecciosas, Mtb é atualmente o patógeno de maior letalidade global. O Brasil atualmente ocupa o décimo nono lugar, entre os 22 países em desenvolvimento, que abrigam 82% dos casos de TB no mundo2.
O Mtb aflige a humanidade há milênios. Lesões características da tuberculose foram identificadas em múmias egípcias. O isolamento do bacilo, passo decisivo para o progresso na compreensão dos mecanismos de doença, diagnóstico e tratamento, ocorreu em 1882, graças à determinação de Robert Koch3. O bacilo faz parte do chamado complexo do Mtb onde estão incluídas
outras cinco espécies de bactérias causadoras da doença, quatro delas capazes de infectar humanos.
A via principal de infecção pelo Mtb é a transmissão da bactéria pelo aerossol proveniente das secreções respiratórias de pessoas doentes. A história natural da TB em pediatria demonstra que o risco de progressão para TB, após a exposição, varia com a idade. No primeiro ano de vida, cerca de 50% das crianças expostas progridem para doença. Este risco se reduz para 20% a 30% no segundo ano, 5% entre 3 e 5 anos, e 2% entre 5 e 10 anos. Adolescentes e adultos jovens apresentam risco semelhante, em torno de 5%4.
O risco de desenvolver TB após a infecção é determinado por diversos fatores, que incluem a idade em exposição, estado nutricional e imunológico, fatores genéticos, virulência do bacilo e a magnitude do inóculo inicial. Crianças,
idosos ou pessoas portadoras de imunodeficiências possuem maior risco de desenvolver doença grave ou disseminada5.
A TB pode evoluir de diversas maneiras. Em quase todos os casos o complexo primário da infecção se estabelece no pulmão, tendo como porta de entrada os macrófagos alveolares. A forma mais comum de apresentação clínica é a doença pulmonar. Durante seu desenvolvimento os bacilos podem se disseminar pela corrente sanguínea e vasos linfáticos, em grande número, levando à TB miliar ou meníngea, ou em número pequeno de bacilos que formam focos tuberculosos em vários tecidos. Estes focos podem ou não se transformar em TB extrapulmonar posteriormente6.
A resposta imune ao bacilo é complexa e pode resultar tanto na eliminação completa do agente quanto na contenção da infecção pela formação de granulomas, caracterizando uma infecção latente (Latent tuberculosis infection – LTBI). A progressão para TB ativa ocorre de desequilíbrios na relação agente-hospedeiro, com predomínio da replicação bacteriana sobre a resposta imune6.
Uma das razões para o sucesso do Mtb como patógeno está em sua capacidade de sobreviver dentro dos macrófagos alveolares, que compõem a primeira linha de defesa contra o bacilo. A parede celular do Mtb é composta por um arranjo complexo de proteínas, lipídios e glicolipídios. Dentre os componentes desta parede, destaca-se a Lipoarabinomanana (LAM), importante no reconhecimento do bacilo pelos receptores Toll-like 2 (TLR2) das células apresentadoras de antígenos (APCs). Após este reconhecimento, a ativação do TLR2 resulta em inibição da resposta inflamatória. Os mecanismos intracelulares de virulência são caracterizados por sistemas de secreção proteica. Destes, o mais importante é o sistema ESX-1, que secreta, entre outras, as proteínas Early secreted antigenic target of 6 kDa (ESAT-6), e Culture Filtrate Protein of 10 kDa (CFP-10). Tais componentes parecem contribuir com a inibição das funções dos macrófagos, como ruptura da parede do fagossomo e liberação de bacilos no ambiente menos agressivo do citosol, alterando o equilíbrio da resposta inflamatória7.
A resposta imune ao Mtb abrange uma ampla interação entre componentes da imunidade inata e da imunidade adaptativa. A interação entre macromoléculas da parede (notadamente a LAM) e TLR2 inicialmente desencadeia uma resposta de citocinas do tipo T-helper 1 (Th1), com destaque para o Interferon Gama (IFN-γ), principal citocina envolvida na resposta protetora. No entanto, a persistência intracelular do Mtb, resultando em estímulo crônico aos TLR2, resulta em elaboração de citocinas imunossupressoras, principalmente Interleucina 4 (IL-4) e Interleucina 10 (IL-10), e redução da apresentação de antígenos pelo processamento MHC-II. Tal resposta resulta em sobrevida aumentada do Mtb nos macrófagos8.
O IFN-γ tem papel central na imunidade celular ao Mtb, sendo considerado o principal indutor da resposta tuberculostática e proteção do hospedeiro. Produzido principalmente por macrófagos e linfócitos T CD4+, age
na ativação dos próprios macrófagos para fagocitose e produção de radicais oxidativos, tornando-os capazes de controlar e/ou eliminar o bacilo. Neste contexto, são importantes também as citocinas Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e Interleucina 2 (IL-2). Outras funções, como indução de apoptose, condicionamento de APCs e produção de outras citocinas que direcionam a resposta imune, também fazem parte do repertório dos linfócitos CD4+ no
controle da TB. A Interleucina 17 (IL-17), característica da resposta conhecida como Th-17, também participa na defesa contra o Mtb, provavelmente por mecanismos precoces transitórios1.
Devido à complexidade do agente e à resposta do hospedeiro humano, a imunidade contra a tuberculose envolve múltiplos mecanismos. Uma subpopulação de linfócitos T chamada Gama-Delta (TCR-γδ), compondo aproximadamente 1% a 5% dos linfócitos circulantes, desempenha um papel significante, ainda não completamente definido, nas infecções micobacterianas. Essas células promovem funções efetoras importantes, como proliferação, liberação de citocinas Th-1 e atividade citotóxica9. Mais recentemente, o papel
protetor dos TCR-γδ foi experimentalmente demonstrado, pela primeira vez, in vivo, em um modelo de infecção tuberculosa em primatas não-humanos10.
Essa subpopulação se divide em dois principais subconjuntos, o primeiro expressando a região variável (Vδ1), e o segundo expressando a região variavel (Vδ2) no locus delta do receptor TCR. Em individuos saudáveis, as células T Vδ1 são encontradas predominantemente nas mucosas, e são conhecidas por responder a moléculas MHC não classicas. Já as células T Vδ2 representam 70% dos linfócitos T γδ circulantes, são encontradas no sangue periférico, e são capazes de responder a fosfoantigenos sem restrição de MHC11. O principal
fosfoantígeno a estimular a resposta de linfócitos T γδ em humanos é o (E)-4-hydroxi-3-metil-but-2enil pirofosfate (HMBPP), expresso por diversas bactérias, incluindo o Mtb12.
Os linfócitos T γδ podem adquirir a capacidade de processar e apresentar antígenos. Experimentalmente, os linfócitos T γδ são capazes de expressão do fenótipo apresentador de antígeno caracterizado pelos marcadores HLA-DR, CD80 e CD86. A magnitude desta expressão é comparável à observada em células dendríticas, consideradas padrões APC profissionais13. Embora existam
resultados que sugerem um papel específico para as células T γδ na ativação de células T αβ, a relevância da capacidade das células T γδ para atuar como células apresentadoras de antígeno (APCs) ainda não foi confirmada in vivo13-14.
Na tuberculose, as células T γδ humanas podem produzir diferentes respostas funcionais. As células estimuladas pelo Bacilo de Calmette e Guérin (BCG) ou lisados de micobactérias podem induzir a produção de grânulos citotóxicos (granulisinas) e outros peptídeos antimicrobianos e mostrar atividade citolítica após co-cultura com monócitos humanos infectados com micobactérias15.
O processamento dos antígenos micobacterianos resultantes da liberação de Mtb no citosol segue predominantemente a via MHC-I. Desta forma, são apresentados peptídeos aos linfócitos T CD8+. Tais populações podem ser
estimuladas a produzir citocinas Th-1, como IFN-γ1. Além disso, a produção de
grânulos por linfócitos T citotóxicos (CD8+) e linfócitos T gamma-delta foi
caracterizada como um importante mecanismo adjuvante. Proteínas, tais como as perforinas, granzima B e granulisina tem a capacidade de lisar células
infectadas por Mycobacterium tuberculosis, ou até mesmo lisar diretamente os bacilos16.
Apesar dos grandes avanços no conhecimento sobre os mecanismos da imunidade antituberculose, a prevenção da doença ainda é apenas parcialmente bem-sucedida. A vacinação com a BCG apresenta moderada eficácia na proteção contra a doença (aproximadamente 70%), sendo esta eficácia maior em relação às formas disseminadas. A eficácia é maior em países com baixa incidência de micobactérias ambientais17. Há controvérsias sobre a duração
deste efeito protetor. No Brasil, estudos epidemiológicos sugerem que tal efeito se prolongue por cerca de 20 anos18. Há um consenso sobre a necessidade de
uma vacina mais eficaz, para um melhor controle da tuberculose. No entanto, os resultados de estudos controlados até o momento não subsidiaram a adoção de nenhum novo imunógeno19.
O entendimento dos mecanismos de resposta à imunização com BCG é alvo de intensa atividade na pesquisa biomédica. Existe consenso que a indução de linfócitos T produtores de IFN-γ, no contexto da resposta Th-1, está associada à atividade protetora. A via intradérmica é a mais comumente utilizada para sua administração. Os fenômenos iniciais da resposta envolvem a interação entre componentes da parede celular (peptidoglicanos, arabinogalactana e ácido micólico) com receptores Toll-like. A resposta inicial no tecido envolve predominantemente linfócitos T, monócitos e neutrófilos. De forma similar à infecção com patógenos virulentos, é identificado o papel de linfócitos T CD4+ e
T CD8+, bem como T γδ. A vacinação com BCG não é considerada uma indutora
potente de resposta Th-17. Apesar de uma ampla gama de conhecimentos obtidos em ensaios in vitro, ainda não existem marcadores biológicos representativos da proteção em lactentes vacinados20-21.
O impacto epidemiológico e clínico da tuberculose tem acometido a humanidade há milênios. Nos últimos 35 anos, um novo agente infeccioso, o Vírus da Imunodeficiência Humana, passou a interagir com o Mtb. Tal interação resultou em uma intensificação da morbidade e mortalidade de ambas as condições.
A infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), clinicamente expressa, em sua fase avançada, pela Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Aids), se caracteriza, em sua história natural, como uma doença crônica, incurável e invariavelmente fatal, na ausência de tratamento adequado. Atualmente, 37 milhões de indivíduos estão infectados pelo HIV em todo o mundo, dentre estes 3,3 milhões de crianças22. Segundo dados do Boletim
Epidemiológico Aids/DST entre a década de 1980 a junho de 2016, 835.000 casos de Aids foram registrados no Brasil23.
A Aids é caracterizada pela imunossupressão grave no contexto da infecção crônica, insuficientemente tratada, pelo HIV. O HIV se diferencia dos demais vírus pela sua capacidade de infectar células do sistema imunológico: linfócitos T (CD4+), monócitos, macrófagos e células dendríticas. A replicação
viral e a resposta do hospedeiro promovem a disfunção e deleção progressiva destas células, o que resulta na incapacidade do organismo em combater o vírus e outras infecções oportunistas provocadas por bactérias e fungos24.
O HIV é membro do grupo dos retrovírus humanos T-linfotrópicos, da família Retroviridae, caracterizado pela presença da enzima transcriptase reversa. Existem duas variedades patogênicas para humanos. A mais comum, correspondendo a mais de 90% dos casos no mundo e à quase totalidade no Brasil, é conhecida como HIV-1, originária de mutações do Vírus da Imunodeficiência Símia (SIV) do Chimpanzé (Pan troglodytes). Mais raramente, seres humanos podem ser infectados pelo HIV-2, originário de mutações do SIV do Mangabeu Fuliginoso (Cercocebus atys). A história natural da Aids causada pelo HIV-1 apresenta curso mais rápido e compromento clínico e imunológico mais grave25.
O HIV tem tropismo para os receptores CD4 e CCR5, em macrófagos, e CXCR4, em linfócitos. Na superfície do envelope viral encontram-se a glicoproteína externa (gp120) e a proteína transmembrana (gp41), responsáveis pela entrada do vírus na célula alvo. Através da interação destes receptores com seus ligantes na célula hospedeira ocorre a fusão do envelope viral com a membrana celular, liberando seu conteúdo no citoplasma, onde a enzima transcriptase reversa converterá RNA viral, em DNA. que será conduzido e
integrado ao DNA da célula hospedeira com o auxilio da enzima integrase, ativando a produção de proteínas virais que irão compor as múltiplas cópias da cepa infectante. Ao completar-se este ciclo, estelece-se uma infecção vitalícia, com um período inicial variável de latência seguido de um período de progressão para imunodeficiência, na ausência de tratamento24.
Na população, as principais vias de infecção pelo HIV são o contato sexual e o contato com o sangue infectado, por meio de compartilhamento de material contaminado no cenário do uso de drogas psicoativas. Mais raramente na atualidade, pode ocorrer transmissão transfusional, comum no início da epidemia24.
Em crianças, a infecção apresenta como principal via a transmissão vertical, na qual o vírus é transmitido da mãe infectada para o recém-nascido ou lactente (90% dos casos). Mais raramente em pediatria, a transmissão do vírus pode ocorrer via transfusional, por meio de sangue e/ou derivados contaminados, ou mesmo por contato sexual26. A transmissão na fase perinatal
pode ocorrer na vida intrauterina, durante o parto ou no pós-parto, incluindo a fase de aleitamento materno. A taxa de transmissão vertical, na ausência de intervenção, varia de 17% a 29%. No entanto, esta taxa cai para menos de 1%, quando se efetua um protocolo de prevenção, que inclui o tratamento da gestante infectada, precauções no parto, administração de medicamentos antirretrovirais ao recém-nascido e a substituição do aleitamento materno27.
O caráter de persistência do patógeno, associado à infecção pelo HIV, resulta em fenômenos patogênicos complexos. A apresentação antigênica para a resposta citotóxica, fundamental no controle e erradicação de infecções virais, é prejudicada pela modulação negativa do sistema MHC-I. O sistema MHC-II também é afetado, resultando em prejuízo ao processamento de antígenos microbianos externos. O efeito citopático do HIV, associado a mecanismos de lise citotóxica, resulta em depleção de clones de linfócitos T CD4+. O parasitismo
persistente desencadeia ativação imunológica, com inflamação crônica, tendo como resultado, entre outros, um aumento da apoptose de linfócitos T. Estes mecanismos contribuem para a acentuada imunossupressão observada na doença progressiva, notadamente em relação à imunidade celular, resultando
em risco aumentado de infecções oportunistas, autoimunidade e neoplasias. Mecanismos adicionais incluem prejuízo na proliferação linfocitária, desregulação na produção de citocinas, anormalidades do sistema imune inato, disfunção da imunidade humoral e de linfócitos natural killer (NK)28.
Muitas evidências experimentais sugerem um papel direto dos linfócitos T γδ circulantes na resposta imune ao HIV. Eles podem exercer um papel anti-HIV, secretando quimiocinas que inibem os co-receptores de entrada do virus, e outros fatores antivirais, eliminando as células infectadas por mecanismos citotóxicos semelhantes às celulas natural-killer (NK)29.
A infecção por HIV afeta vários mecanismos da resposta imune, incluindo células dendríticas e células T γδ, contribuindo para a perda de competência imune. Estudos com pacientes infectados pelo HIV sugerem que esta infecção pode afetar o repertório e a função efetora das células T γδ. Essas células têm uma freqüência menor em indivíduos infectados pelo HIV30. Um estudo
demonstrou que durante a infecção pelo HIV, as células T γδ circulantes são profundamente afetadas. Pode-se observar uma perda significativa de celulas T Vδ2 no sangue periférico, comprometendo todas as suas funções, em pacientes cronicamente infectados pelo virus31.
Um mecanismo adicional da imunodeficiência associada ao HIV é a redução da capacidade de produção de grânulos citotóxicos, por várias populações celulares, principalmente os linfócitos T CD8+. Tal capacidade de
produção pode ser recuperada com tratamento efetivo32.
Cerca de 25% das crianças infectadas pelo HIV exibem manifestações clínicas graves nos primeiros dois anos de vida, sendo caracterizadas como progressores rápidos. A progressão intermediária e a lenta ocorrem em 65% a 10% das crianças, aproximadamente. Os progressores lentos se caracterizam por não possuírem depleção significativa da população de linfócitos T CD4+ e
nem manifestações clínicas da Aids, por um período de 8 ou mais anos após a infecção33. Os estudos de história natural, nos anos iniciais da epidemia,
forneceram as bases para a classificação clínica e imunológica da infecção por HIV em pediatria. A classificação clínica é baseada na gravidade dos sintomas, variando entre categorias N, A, B e C. A classificação imunológica é baseada na
contagem de linfócitos T CD4+, variando entre categorias 1, 2 e 334. O
detalhamento do sistema de classificação adotado no Brasil está acessível no Anexo 1.
Considerando a gravidade do comprometimento imunológico e das repercussões clínicas, o diagnóstico precoce da infecção pelo HIV em pediatria é, portanto, fundamental para permitir acesso a um tratamento adequado, capaz de reduzir a morbidade, mortalidade e orientar nas decisões quanto à nutrição infantil e melhoria da qualidade de vida destes pacientes, antes do desenvolvimento de doenças oportunistas. O tratamento aos pacientes infectados atua sobre as principais etapas de estabelecimento do vírus, controlando sua replicação e complicações infecciosas com um regime de drogas que bloqueiam as atividades das enzimas transcriptase reversa, protease e integrase, bem como mecanismos de penetração celular pelo vírus. Este regime terapêutico, instituído com grande sucesso a partir do final da década de 90, é hoje denominado Terapia Antirretroviral Combinada (TARC), e tem permitido a transformação de uma doença letal em uma condição crônica, com acentuada melhora nos indicadores de sobrevida e quallidade de vida35.
Atualmente, as diretrizes pediátricas de TARC no Brasil recomendam o início do tratamento imediatamente após o diagnóstico34. Os resultados encorajadores em
relação à sobrevida e qualidade de vida em pacientes infectados por transmissão vertical trouxeram a esperança, ainda não atingida, de cura da infecção36-37. No
quadro 1, são descritas as classes dos 21 antirretrovirais disponíveis para a TARC pediátrica no Brasil.
Quadro 1: Classes de antirretrovirais disponíveis no Brasil para o tratamento de crianças e adolescentes (adaptado34).
Inibidores de
Entrada Inibidores da Transcriptase Reversa
Inibidores da Protease Inibidores da Integrase Nucleosídeos Nucleotídeos
Não-Nucleosídeos Enfuvirtida (T-20/ Inibidor de fusão) Maraviroque (Inibidor do receptor CCR5) Abacavir (ABC) Didadosina (DDI) Emtricitabina (FTC) Lamivudina (3TC) Estavudina (D4T) Zidovudina (AZT) Tenofovir (TDF) Efavirenz (EFZ) Etravirina (ETV) Nevirapina (NVP) Atazanavir (ATV) Darunavir (DRV) Fosampre-navir (FPV) Lopinavir/ ritonavir (LPV/r) Ritonavir (RTV) Saquinavir (SQV) Tipranavir (TPV) Dolutegravir (DTG) Raltegravir (RAL)
Os jovens infectados pela transmissão vertical apresentam aspecto particular em relação à resposta ao tratamento. A atividade de infecção ocorre desde o início da vida, podendo afetar profundamente o desenvolvimento do sistema imune. A terapia anti-retroviral combinada tem eficácia significativa nessa população, mas a preservação da função imune pode ser incompleta38.
A tuberculose (TB) é uma das doenças oportunistas mais frequentes nos indivíduos infectados pelo HIV, sejam eles adultos ou crianças, sendo atualmente a principal causa de morte entre indivíduos coinfectados, totalizando cerca de 400.000 óbitos/ano39. A pandemia da infecção pelo HIV tem
contribuído, nos últimos anos, para uma intensificação do fardo social da tuberculose, caracterizando uma sindemia. Em 2015, foram notificados 10,4
milhões de casos novos de tuberculose no mundo, sendo cerca de 11% em indivíduos com a coinfecção pelo HIV. Indivíduos infectados pelo HIV com tuberculose latente apresentam um risco 26 vezes superior de reativação, quando comparados a indivíduos não-infectados. A coexistência de ambos os patógenos no mesmo hospedeiro e a consequente mobilização da resposta imune na intensificação da atividade de ambas as doenças, caracterizada por maior morbidade e mortalidade nos pacientes coinfectados40.
A resposta imune à TB depende principalmente do sistema adaptativo, com destaque para a imunidade celular. Na coinfecção pelo HIV, múltiplos mecanismos estão envolvidos na redução da capacidade de estabelecimento de uma resposta celular protetora. Existem evidências que linfócitos T CD4+
específicos para antígenos de Mtb sejam preferencialmente afetados e deletados na infecção pelo HIV, principalmente aqueles com capacidades polifuncionais (expressão simultânea de IFN-γ, TNF-α e IL-2). Outros relatos sugerem que, na tuberculose, ocorra aumento da expressão dos receptores CD4 e CCR5, tornando os linfócitos T mais suscetíveis ao parasitismo pelo HIV41.
Os linfócitos T citotóxicos (CD8+) podem ter sua função prejudicada na
coinfecção. Um estudo em pacientes com TB latente mostrou, naqueles infectados pelo HIV, menor expressão do marcador de degranulação CD107a e menor proliferação em resposta a estímulo com ESAT-6 e CFP-1042. Embora
haja um número menor de relatos sobre a disfunção de linfócitos TCR-γδ na coinfecção por HIV, um estudo demonstrou redução da capacidade de produção de IFN-γ em indivíduos coinfectados43.
A função de macrófagos também é prejudicada na coinfecção HIV/Mtb. Macrófagos infectados pelo HIV apresentam menor apoptose em resposta ao Mtb, permitindo sobrevida aumentada do patógeno intracelular. Tal mecanismo pode em parte ser devido à menor produção de TNF-α por macrófagos infectados44.
O efeito da TARC em relação à recuperação da imunidade antituberculosa em pacientes coinfectados foi demonstrado em diversos estudos. Porém, na maior parte deles, tal restauração mostrou-se parcial ou incompleta44.
Considerando-se o grande impacto epidemiológico e clínico da coinfecção HIV-TB, torna-se oportuno avaliar a capacidade de resposta em indivíduos infectados pelo HIV com TARC efetiva. Tal avaliação assume especial interesse no cenário de jovens infectados por transmissão vertical e vacinados por BCG na infância. Tal população apresenta as consequências de uma infecção crônica, adquirida em fases precoces do desenvolvimento do sistema imune. A perspectiva de sobrevida e boa qualidade de vida proporcionada pela TARC, universalmente disponível no Brasil, justifica a relevância da busca de informações neste contexto, ainda escassamente pesquisado no cenário internacional.
2. OBJETIVO
1. Avaliar a capacidade de produção de grânulos citotóxicos, expressão de fenótipo de apresentação de antígeno e ativação celular, em resposta a antígenos micobacterianos, por linfócitos T CD8+ e γδ, em jovens infectados pelo
HIV por transmissão vertical, vacinados por BCG, comparados a um grupo de controle saudável.
2. Avaliar a capacidade de produção de grânulos citotóxicos, expressão de fenótipo de apresentação de antígeno e ativação celular, em resposta a antígenos micobacterianos, por linfócitos T CD8+ e γδ, em jovens infectados pelo
HIV por transmissão vertical, vacinados por BCG, de acordo com o grau de imunossupressão.
3. HIPÓTESE (enunciada na forma nula, ou H0)
1. Jovens infectados pelo HIV por transmissão vertical, na vigência de TARC efetiva, apresentam capacidade de produção de grânulos citotóxicos, expressão de fenótipo de apresentação de antígeno e ativação celular, por linfócitos T CD8+ e γδ, semelhantes àquela observada em jovens saudáveis.
2. Jovens infectados pelo HIV por transmissão vertical, na vigência de TARC efetiva, apresentam capacidade de produção de grânulos citotóxicos, expressão de fenótipo de apresentação de antígeno e ativação celular, por linfócitos T CD8+ e γδ, independentemente do grau de imunossupressão.
4 MÉTODOS
4.1 Modelo do estudo
4.2. População, local e período do estudo
Foram avaliados 20 pacientes, entre 16 e 23 anos, selecionados na unidade ambulatorial do Serviço de Imunodeficiência Secundária, no Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (HC/Unicamp), Estado de São Paulo, Brasil. Os pacientes faziam parte de uma coorte de 140 crianças e adolescentes infectados verticalmente pelo HIV-1. Este serviço é o principal centro de referência, na Região Metropolitana de Campinas, para acompanhamento de crianças e adolescentes infectados pelo HIV. A abrangência da área de cuidado atinge uma população de aproximadamente quatro milhões de habitantes.
A infecção pelo HIV foi estabelecida e classificada, em relação a aspectos clínicos e imunológicos, de acordo com os critérios do Ministério da Saúde do Brasil45.
Os pacientes foram selecionados, de forma consecutiva, conforme presença às consultas. Os membros do grupo controle fizeram parte de uma amostra de conveniência de estudantes de ensino médio e estudantes de graduação universitária. Os procedimentos do estudo foram realizados entre Setembro de 2016 e Março de 2017.
4.2.1. Critérios de Inclusão:
a) Pacientes infectados pelo HIV • Ter idades entre 16 e 24 anos;
• Ter comprovação da infecção pelo HIV por transmissão vertical, conforme os critérios do Ministério da Saúde do Brasil34.
• Estar em vigência de TARC e possuir controle da replicação viral (carga viral plasmática indetectável) por um período mínimo de doze meses;
• Apresentar evidência de imunização com a vacina composta pelo Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) na infância, de acordo com as diretrizes do Ministério da Saúde do Brasil45. Foi adotada como evidência de imunização a
presença de cicatriz vacinal característica, na área deltoide do membro superior direito.
• Manifestar concordância com a participação no estudo, por meio da assinatura no Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE - anexo 3), após leitura do documento escrito, pelos pacientes ou responsáveis legais, no caso de menores de idade;
b) Participantes do grupo de controle • Ter idades entre 16 e 24 anos;
• Ser presumidamente saudável, com ausência de diagnósticos de condições crônicas de saúde;
• Apresentar evidência de imunização com a vacina composta pelo Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) na infância, de acordo com as diretrizes do Ministério da Saúde do Brasil45. Foi adotada como evidência de imunização a
presença de cicatriz vacinal característica, na área deltoide do membro superior direito.
• Manifestar concordância com a participação no estudo, por meio da assinatura no Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE - anexo 3), após leitura do documento escrito, pelos pacientes ou responsáveis legais, no caso de menores de idade;
4.2.2. Critérios de Exclusão:
• Estar em uso de medicamentos com potencial de alteração da resposta imune, como corticosteroides ou outros imunossupressores;
• Tabagismo;
• Apresentar, no momento da coleta de material para o estudo, infecção aguda com padrão clínico viral ou bacteriano;
• Especificamente para o grupo de controle, apresentar anormalidades hematológicas (anemia, leucopenia ou plaquetopenia);
4.3. Considerações éticas
O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de Campinas (declaração 286.070 / 2013 - anexo 2). Foram seguidas as normas estabelecidas na Resolução 466, de 21 de dezembro de 2012, do Conselho Nacional de Saúde46.
4.4. Procedimentos
4.4.1 Hemograma, Imunofenotipagem de sangue periférico e Carga Viral do HIV-1
Um mL de sangue periférico foi coletado em tubos de ácido etileno diaminatetraacético (EDTA) para realizar o hemograma, no Laboratório Clínico Especializado do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti – Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM) da Unicamp (analisador de hematologia automatizado KX-21, Sysmex, EUA).
Para a imunofenotipagem, foi utilizado o painel contendo os marcadores: CD3-APCH7 (clone SK7), CD4-BB515 (clone RPA-T4), CD8-PercpCy5 .5 e TCRγδ-PE (BD Biosciences, EUA). A leitura do experimento foi realizada com o auxílio do citometro de fluxo FACSVerse® (BD Biosciences, EUA), no Laboratório
Clínico Especializado do CAISM/Unicamp.
A carga viral (RNA viral/mL de sangue) foi quantificada através do kit Abbott RealTime HIV-1 e a leitura no instrumento Abbott m2000rt (Promega Corporation, EUA), no Laboratório de Pesquisa em AIDS do HC/Unicamp. Foi considerado carga viral indetectável, números menores ou iguais a 40 cópias de RNA viral/mL.
4.4.2 Obtenção dos antígenos utilizados nos ensaios
O lisado de BCG (Mycobacterium bovis) foi desenvolvido a partir da cultura, em meio de cultura sólido para micobactérias (Lowenstein Jensen), de uma cepa atenuada do Bacilo Calmette-Guérin (Fundação Ataulpho de Paiva -
Cepa Moreau RJ), no Laboratório de Patologia Clínica do HC/Unicamp (setor de microbiologia).
O lisado de Mtb (Mycobacterium tuberculosis) foi desenvolvido a partir da cultura, em meio de cultura sólido para micobactérias (Lowenstein Jensen), da cepa H37RA, no Laboratório de Patologia Clínica do HC/Unicamp (setor de microbiologia).
Ambas as bactérias foram incubadas em estufa de cultura bacteriológica, a 37°C. Após crescimento, foi realizada a raspagem e transferência do material em tubos contendo tampão fosfato-salino (PBS).
A inativação das micobactérias foi realizada através do calor. Os lisados foram adquiridos por meio de sonicação, no Laboratório de Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Unicamp. Neste mesmo laboratório, foi realizada a quantificação de proteínas pelo método de Bradford, com o kit da Bio-Rad® (EUA).
4.4.3 Separação de Celulas Mononucleares do Sangue Periférico (CMSP) por gradiente de densidade Ficoll-paque
Primeiramente foi realizado a limpeza do Fluxo Laminar com álcool 70% em toda a superfície metálica e em todas as micropipetas que foram utilizadas. Após essa limpeza, a luz ultravioleta foi ligada por 30 minutos para a realização da esterilização.
Aproximadamente 20 mL de sangue periférico foram coletados em tubos com heparina e foi realizada uma diluição de 1:1 com solução salina a 0,9% estéril. Com o auxílio de um pipetador, essa diluição foi transferida lentamente para um tubo cônico de 50 mL contendo o reagente Ficoll Paque®
(Sigma-Aldrich, EUA), tomando cuidado para que não houvesse mistura da solução sangue/salina com o Ficoll Paque®.
Essa solução foi centrifugada por 20 minutos a 600G (18°C, aceleração 2 e freio 1). Com o auxílio de uma pipeta Pasteur, foi retirada apenas a “nuvem”
de CMSP transferindo-a para um tubo cônico de 15 mL. Esse tubo foi centrifugado por 5 minutos a 700G (18°C, aceleração 4 e freio 4).
Após esse procedimento, o sobrenadante foi descartado e o “pellet” ressuspendido em 10 mL de solução salina a 0,9% estéril. Os tubos novamente foram centrifugados a 700G (18°C, aceleração 4 e freio 4).
O sobrenadante foi descartado e o “pellet” foi ressuspendido em 10 mL de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com gentamicina. Essa solução foi homogeneizada em vórtex, e foi retirada uma alíquota de 20 µL para contagem em Câmara de Neubauer.
4.4.4 Contagem de CMSP em câmara de Neubauer
Após a retirada da alíquota (20 µL) do tubo contendo os CMSP em meio de cultura, foi adicionado a ela o mesmo volume do corante azul de trypan. Essa solução foi homogeneizada e transferida para uma das áreas da câmara de Neubauer (preenchendo toda a área com a amostra, evitando bolhas).
Em microscópio óptico comum, foi efetuada a contagem na área número 5, tendo sido contados 5 quadrantes dos 25, preferencialmente os quatro extremos e o central (figura 1). Foi realizada a seguinte fórmula para a obtenção do número total de células:
Média dos 5 quadrantes contados x 25 x 2 (diluição) x 104 (área da câmara) = Número de células/mL
Número de células/mL x volume de meio da suspensão original = Número total de células da amostra.
4.4.6 Ensaio de Produção de grânulos citotóxicos e Fenótipo de Células Apresentadoras de Antígeno
Primeiramente foi realizado um protocolo preliminar para analisar os melhores tempos de culturas (12 horas/ 16 horas/ 18 horas) e as concentrações ideais para os anticorpos monoclonais em estudo. Para isso, foi coletado sangue periférico de três indivíduos, sabidamente “bons respondedores” à antígenos micobacterianos. As concentrações dos anticorpos testadas foram as indicadas pela bula, variando até dois µL para menos.
Após a análise preliminares dos resultados, verificamos que o tempo de cultura ideal seria 18 horas e as concentrações dos anticorpos poderia variar Figura 1: Áreas delimitadas (representadas por números) da Câmara de
Neubauer.
1
2
3
4
5
6
dois µL para menos, pois não houve diferença estatística entre o valor indicado pela bula e sua nova concentração.
Para o desenvolvimento final do protocolo, as células obtidas foram diluídas, em meio RPMI, para ficarem em uma concentração de 1x106
células/mL. Após esse procedimento, foram feitos quatro tubos: um controle negativo, um controle positivo, um tubo estimulado pelo lisado de BCG e um estimulado pelo lisado de Mtb.
Em cada um desses tubos foram adicionados: meio de cultura RPMI 1640 suplementado com gentamicina, Soro Humano AB 10% (10 µL), anticorpos monoclonais anti-CD28 e anti-CD49d (1 µg/mL cada). O controle positivo foi estimulado pela fitohemaglutinina (PHA), um mitógeno desenvolvido pela Sigma-Aldrich® (EUA). O tubo negativo não tinha estímulo especifico, apenas meio de
cultura.
Para o controle positivo, foram utilizados 15 µg/mL de PHA. Para os lisados, foram utilizados 10 µg/mL (BCG e Mtb).
Após a realização dos quatro tubos, esses foram cultivados em estufa microbiológica a 37°C, 5% de CO2, por 18 horas. Durante as últimas quatro
horas, foi inoculado o anticorpo anti-CD107a (marcador de produção de grânulos citotóxicos). As células em degranulação são identificadas pela expressão de CD107a na superfície. A proteína CD107a é conhecida como Proteína de Membrana Associda ao Lisossoma (LAMP-1). O marcador é mobilizado para a superfície celular após a exocitose de grânulos induzida pela ativação.
4.4.7 Marcação de Anticorpos de superfície
Após as 18 horas de cultura, foram adicionados 100 µL de EDTA 20 milimolar (mM) em cada tubo, por 15 minutos, agitando cada tubo, em vórtex, a cada 5 minutos para desfazer os grumos de células. No final dos 15 minutos, foram adicionados 3 mL de PBS em cada tubo e foi realizada a centrifugação (2200 rpm por 4 minutos).
O sobrenadante foi desprezado e o “pellet” ressuspendido em 20 µL de Imunoglobulina humana. Os tubos foram incubados por 5 minutos a temperatura ambiente (TA).
A marcação de superfície foi realizada utilizando os seguintes anticorpos monoclonais e incubados por 20 minutos a TA, sob abrigo da luz:
Tabela 1: Anticorpos utilizados para a marcação de superfície, quantidade (µL/tubo) e fluorocromos.
Anticorpo Quantidade (µL/tubo) Fluorocromo
CD3 3 APCH7 CD8 3 PercpCy5.5 TCR-γδ 10 FITC CD80 10 PE CD86 10 APC HLA-DR 3 BV421
Após os 20 minutos de incubação, foram adicionados 3 mL de PBS em cada tubo e foi realizada a centrifugação (2200 rpm por 4 minutos). O sobrenadante foi descartado e o “pellet” ressuspendido em 300 µL de PBS, e os tubos foram analisados em citômetro de fluxo FACSVerse® (BD Biosciences,
EUA), no Laboratório Clínico Especializado do CAISM/Unicamp. As amostras foram adquiridas pelo software FACS suite, e analisados pelo software FlowJo™, versão 10.2 (FlowJo, EUA). Os níveis de corte de fluorescência para todos os ensaios de citometria foram estabelecidos com a análise de populações não marcadas.
4.4.8 Estratégia de Análise para o ensaio de Produção de Grânulos Citotóxicos
Após cultura de 18 horas e marcação de anticorpos de superfícies, a população de células T CD3+ foi selecionada (CD3-APCH7 x Side Scatter Area
(SSC-A)) a partir das CMSP de pacientes infectados por HIV e controles saudáveis. Os “doublets” de células foram excluídos (Forward Scatter Area (FSC-A) x Forward Scatter Height (FSC-H)). As subpopulações de linfócitos T CD8+ (CD3-APCH7 x CD8-PercpCy5.5) e T γδ+ (CD3-APCH7 x TCR-γδ-FITC) e
a degranulação (CD107a-BV510 x SSC-A) foram quantificados a partir de 10 mil eventos (Figura 2)
4.4.9 Estratégia de Análise para o ensaio de Fenótipo de Células Apresentadoras de Antígeno
Após cultura de 18 horas e marcação de anticorpos de superfícies, a população de células T CD3+ foi selecionada (CD3-APCH7 x Side Scatter Area
(SSC-A)) a partir dos CMSP de pacientes infectados por HIV e controles saudáveis. Os “doublets” de células foram excluídos (Forward Scatter Area (FSC-A) x Forward Scatter Height (FSC-H)). As subpopulações de linfócitos T CD8+ (CD3-APCH7 x CD8-PercpCy5.5) e T γδ+ (TCR-γδ-FITC x SSC-A) e o +
Controle negativo PHA BCGL MTBL
Controle negativo PHA BCGL MTBL
Figura 2: Estratégia de análise de para o ensaio de Produção de grânulos citotóxicos.
T CD8
fenótipo de células apresentadoras de antígeno: HLA-DR+ (HLA-DR-BV421 em
histograma), e as células duplo-positivas, CD80+ e CD86+ (CD86-APC x
CD80-PE) foram quantificados a partir de 10 mil eventos (Figura 3).
4.5. Variáveis
4.5.1 Variáveis dependentes.
- Produção de grânulos citotóxicos: expressa pela porcentagem de linfócitos T CD8+ ou linfócitos T γδ+, com expressão do marcador CD107a na membrana.
Figura 3: Estratégia de análise de para o ensaio de Fenótipo de Celulas Apresentadoras de antígeno.
T CD8
- Capacidade de apresentação de antígenos: expressa pela porcentagem de linfócitos T γδ+, com expressão dos marcadores HLA-DR + CD80 + CD86 na
membrana
- Ativação celular: expressa pela porcentagem de linfócitos T CD8+ ou linfócitos
T γδ+, com expressão do marcador HLA-DR na membrana
4.5.2 Variáveis independentes
- Estado de infecção pelo HIV: expresso pelas categorias “pacientes” ou “controles”.
- Gravidade da imunossupressão (exclusivamente no grupo de pacientes): expressa pelas categorias imunológicas 1 + 2 (imunossupressão ausente ou moderada) e 3 (imunossupressão grave).
4.6. Análise Estatística
Os dados obtidos foram armazenados em base de dados do programa de computador SPSS para Windows, versão 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL; EUA). A análise dos resultados foi realizada através do mesmo programa. Análise preliminar com o teste de Kolmogorov-Smirnov demonstrou que as principais variáveis contínuas não apresentavam distribuição normal. As associações entre variáveis contínuas e categorias foram analisadas por meio do teste de Mann-Whitney. Foram consideradas significativas diferenças com valor de p ≤ 0,05.
5. RESULTADOS
5.1 Dados demográficos da população de estudo
A tabela 2 mostra os dados demográficos e laboratoriais dos 20 controles saudáveis e dos 20 pacientes infectados pelo HIV incluídos no estudo. Não houve diferença significativa na idade entre os grupos. O grupo controle apresentou um número maior de células T CD4 (MW, p = 0,03) e na relação de
células T CD4/T CD8 (MW, p = 0,02) em comparação ao grupo de pacientes. Todos os pacientes apresentaram cargas virais indetectáveis e recuperação ótima de células T CD4 por uma terapia antirretroviral combinada a longo prazo, no momento da coleta.
Tabela 2: Dados demográficos e laboratoriais dos pacientes infectados por HIV e controles saudáveis Variáveis HIV Controles p* n = 20 n = 20 Idade (anos) 0,22 Média 19,25±2,48 18,37±1,95 Sexo Masculino/Feminino 15/5 12/8 Leucócitos (x103/µl) 0,53 Mediana 5800 6650 (Min-Max) 4300 - 13800 4100 – 10500 Monócitos (x103/ul) 0,14 Mediana 559,0 689,5 (Min-Max) 310 – 1115 377 - 1134 Neutrófilos (x103/ul) 0,3 Mediana 3136.5 3685 (Min-Max) 1791 - 9191 1509 – 6741
Tabela 2. (continuação) Variáveis HIV n = 20 Controles n = 20 p* Linfócitos (%) Mediana 30,6 29,2 (Min-Max) 14,2 - 56 17,7 – 42,9 T-CD3 (%) 0,8 Mediana 64,1 64,6 (Min-Max) 19,9 – 79,0 51,5 – 74,3 T-CD3 (cel/µl) 0,84 Mediana 1409 1377 (Min-Max) 270 - 2064 765 - 1795 T-CD4 (%) 0,02 Mediana 23,3 29,3 (Min-Max) 9,0 – 39,8 20,4 – 42,8 CD4 (cel/µl) 0,03 Mediana 516.5 632 (Min-Max) 122 - 775 344 – 1071 T-CD8 (%) 0,66 Mediana 22,6 22,5 (Min-Max) 7,4 – 43,6 14,2 – 32,6 T-CD8 (cel/µl) 0,49 Mediana 493 424 (Min-Max) 101 - 1452 230 – 811 TCR-γδ (%) 0,15 Mediana 2,0 3,1 (Min-Max) 0,7 – 9,2 1,2 – 12,6 TCR-γδ (cel/µl) 0,24 Mediana 44,0 54,5 (Min-Max) 10 - 233 22 - 162
Tabela 2 (continuação) Variáveis HIV n = 20 Controles n = 20 p* CD4/CD8 0,02 Mediana 1,1 1,4 (Min-Max) 0,4 – 1,7 0,8 – 2,9 *Mann-whitney.
5.2. Dados específicos ligados ao histórico de infecção pelo HIV no grupo de pacientes.
Entre os pacientes infectados, a maior parte (11/20) estava situada na categoria clínica B, e 9/20 estavam situados na categoria imunológica 3. Tal estadiamento caracteriza pacientes com evolução crônica. Nenhum dos pacientes apresentava história prévia de infecção por micobactérias. Os dados estão sumarizados na tabela 3.
Tabela 3: Dados clínicos e imunológicos específicos do grupo de pacientes infectados pelo HIV.
Paciente Idade Sexo Classificação Clínica Classificação Imunológica Idade ao início da TARC Tempo de TARC (anos)
Esquema atual de TARC
P1 21,55 M N 2 10,57 10,98 TDF+3TC+EFZ P2 23,16 M B 2 15,41 7,76 NVP+LPV/r+RAL+TDF+3TC P3 21,37 M B 1 16,56 4,81 AZT+3TC+EFZ P4 18,33 M B 1 4,34 13,99 LPV/r+TDF+3TC P5 18,13 F A 2 3,48 14,65 LPV/r+TDF=3TC P6 19,01 M B 2 3,86 15,16 ATV/r+TDF+3TC P7 17,28 F B 3 4,23 13,05 3TC+DDI+LPV/r P8 18,06 F B 1 1,54 16,53 FPV/r+RAL+TDF+3TC P9 19,24 M C 3 2,34 16,91 AZT+3TC+EFZ P10 20,99 M C 3 5,04 15,95 AZT+3TC+EFZ+LPV/r+RAL P11 17,59 F B 2 1,16 16,43 LPV/r+TDF+3TC P12 21,96 M C 3 5,59 16,37 LPV/r+TDF+3TC P13 16,13 M C 3 10,28 5,86 TDF+3TC+EFZ P14 22,40 M C 3 6,00 16,41 AZT+3TC+RAL+DRV/r P15 20,88 M C 3 4,33 16,56 TDF+3TC+FPV/r P16 20,25 M A 1 6,77 13,48 LPV/r+TDF+3TC P17 21,11 M B 1 8,59 12,52 3TC+ABC+LPV/r P18 13,37 F B 2 10,09 3,28 AZT+3TC+NVP P19 16,69 M B 3 1,61 15,08 RAL+TDF+3TC+EFZ+DRV/r P20 17,41 M B 3 1,76 15,65 T20+ETV+MARA+TDF+3TC+DRV/r
Abreviaturas – antirretrovirais: 3TC – Lamivudina; ABC – Abacavir; ATV/r – Atazanavir/ritonavir; AZT – Zidovudina; DDI – Didanosina; DRV/r – Darunavir/ritonavir; EFZ – Efavirenz; ETV – Etravirina; FPV/r: Fosamprenavir/ritonavir; LPV/r - Lopinavir/ritonavir; MARA – Maraviroque; NVP – Nevirapina; RAL – Raltegravir; T20 – Enfuvirtida; TDF – Tenofovir
Abreviaturas – classificação clínica: N – Sintomas ausentes; A – sintomas leves; B – sintomas moderados; C – sintomas graves.
5.3. Comparação de subpopulações linfocitárias entre as categorias imunológicas consolidadas 1+2 (imunossupressão ausente ou moderada) e 3 (imunossupressão grave).
Com o objetivo de melhor caracterização do grupo de pacientes para posterior análise, foram estabelecidos dois grupos, de acordo com o grau de comprometimento imunológico. Devido ao pequeno número, foram consolidadas as categorias imunológicas 1 e 2 (imunossupressão ausente ou moderada) e mantida a categoria 3 (imunossupressão grave). Observou-se na categoria 3 maior porcentagem de linfócitos totais (medianas de 39,2% versus 25,8%, p = 0,04). Os dados estão sumarizados na tabela 4.
Tabela 4: Dados demográficos e laboratoriais no grupo de pacientes infectados pelo HIV, comparando-se imunodeficiência ausente ou moderada versus imunodeficiência grave Variáveis Categorias 1+2 Categoria 3 p* n = 11 n = 9 Idade (anos) 0.71 Média 19.01±2.65 19.24±2.41 Gênero Masculino/Feminino 7/4 8/1 Leucócitos (x103/µl) 0.88 Mediana 5600 5800 (Min-Max) 4600 - 13800 4300 – 9300 Monócitos (x103/ul) 0.82 Mediana 547 571 (Min-Max) 423 - 1115 310 – 1086 Neutrófilos (x103/ul) 0.94 Mediana 3177 3096 (Min-Max) 1927 - 9191 1791 – 6699
Tabela 4 (continuação) Variáveis Categorias 1+2 Categoria 3 p* n = 11 n = 9 Linfócitos (%) 0.04 Mediana 25,8 32,9 (Min-Max) 14,2 – 40,0 18,10 – 56,0 T-CD3 (%) 0.37 Mediana 66,8 55,7 (Min-Max) 49,7 – 79,0 19,9 – 77,2 T-CD3 (cel/µl) 0,20 Mediana 1540 1397 (Min-Max) 684 - 2064 270 – 1625 T-CD4 (%) 0,76 Mediana 24,0 21,6 (Min-Max) 13,2 – 39,8 9,0 – 37,9 CD4 (cel/µl) 0,88 Mediana 508 530 (Min-Max) 337 – 761 122 – 775 T-CD8 (%) 0,26 Mediana 27,3 19,9 (Min-Max) 15,5 – 43,6 7,4 – 39,7 T-CD8 (cel/µl) 0,33 Mediana 594 481 (Min-Max) 246 - 1452 101 - 685 TCR-γδ (%) 0,71 Mediana 2,0 2,0 (Min-Max) 0,9 – 9,2 0,7 – 4,1 TCR-γδ (cel/µl) 0,26 Mediana 45 42 (Min-Max) 21 - 233 10 – 71
Tabela 4 (continuação) Variáveis Categorias 1+2 Categoria 3 p* n = 11 n = 9 CD4/CD8 0,45 Mediana 1,1 1,1 (Min-Max) 0,4 – 1,7 0,6 – 1,7 *Mann-whitney.
5.4 Comparação entre marcadores celulares em linfócitos T γδ e T CD8+ - pacientes e controles
5.4.1 Comparação entre Fenótipo de Células Apresentadoras de Antígeno nos linfócitos T γδ – pacientes e controles
A tabela 5 apresenta a distribuição da expressão de CD80++CD86+ nas
populações de células HLA-DR+, nos linfócitos T γδ. Não houve diferenças
significativas na expressão de HLA-DR++CD80++CD86+ quando comparamos
pacientes infectados por HIV e o grupo controle.
Por outro lado, constatamos que os linfócitos T γδ, de ambos os grupos, apresentam fenótipo para APC.
Tabela 5: Distribuição da expressão de CD80++CD86+ nas populações de
células HLA-DR+, nos linfócitos T γδ de controles e pacientes infectados por HIV
HIV (n = 20) Controles (n = 20) Amostras Mediana (%) Mínimo (%) Máximo (%) Mediana (%) Mínimo (%) Máximo (%) p* Negativo 3,01 0,39 6,88 1,31 0,30 6,20 0,08 Positivo 3,32 0,59 10,30 2,21 0,39 6,82 0,35 BCG 2,99 0,43 7,22 2,07 0,26 7,34 0,25 MTB 2,19 0,62 5,56 1,72 0,41 5,66 0,22
*Mann-whitney
5.4.2 Comparação entre marcadores de ativação celular nos linfócitos T CD8+ e γδ – pacientes e controles
As tabela 6 e 7 apresentam a distribuição da expressão de HLA-DR (%) nas células T CD8+ e T γδ, respectivamente, de paciente infectados por HIV e
grupo controle.
O grupo de pacientes infectados por HIV apresentou uma expressão de HLA-DR significativamente maior em células T CD8+ não estimuladas e após
estimulação com Mtb (Tabela 6).
Já nas células T γδ, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, para os diferentes estímulos (Tabela 7).
Tabela 6: Distribuição da expressão de HLA-DR+(%) em células T CD8+ de
pacientes infectados por HIV e controles.
HIV (n = 20) Controles (n = 20) Amostras Mediana (%) Mínimo (%) Máximo (%) Mediana (%) Mínimo (%) Máximo (%) p* Negativo 30,65 12,30 66,60 23,40 11,60 49,40 0,03 Positivo 77,45 14,70 88,90 72,45 56,70 89,50 0,70 BCG 26,45 10,80 66,90 24,20 9,89 46,20 0,21 MTB 28,40 10,00 65,80 21,15 11,60 45,70 0,05 *Mann-whitney
