FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
IRENE LAYANE DE SOUSA
ADENOSINA QUINASE REGULA A METILAÇÃO DO DNA DE GENES ENVOLVIDOS NO NEURODESENVOLVIMENTO
CAMPINAS 2017
ADENOSINA QUINASE REGULA A METILAÇÃO DO DNA DE GENES ENVOLVIDOS NO NEURODESENVOLVIMENTO
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências
ORIENTADOR: KLEBER GOMES FRANCHINI ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA IRENE LAYANE DE SOUSA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. KLEBER GOMES FRANCHINI.
CAMPINAS 2017
IRENE LAYANE DE SOUSA
ORIENTADOR: KLEBER GOMES FRANCHINI
MEMBROS:
1. PROF. DR. KLEBER GOMES FRANCHINI
2. PROF. DR. TALITA MIGUEL MARIN
3. PROF. DR. SILVIO ROBERTO CONSONNI
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Aos meus pais, Antonio e Laurinda, exemplos de vida, amor e dedicação. Responsáveis por tornarem os meus sonhos uma realidade.
À Deus por sempre me abençoar e guiar minhas escolhas.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Kleber Gomes Franchini, pela orientação, dedicação e compreensão. Obrigada pelo exemplo profissional e pela amizade.
Aos amigos e colegas de laboratório, Raphael, Ana Helena, Alisson, Ana Paula e Danieli, agradeço pelo convívio, amizade e contribuições ao meu trabalho. Agradeço especialmente a Renata Rocha que acompanhou este trabalho desde o ínicio, agradeço pela sua ajuda inestimável.
À Dra. Mariana Maschieto, pela colaboração nos experimentos de análise do metiloma. À Dra. Silvana Rocco, pela colaboração nos experiementos de dosagem de Adenosina.
Ao Dr. José Xavier Neto, à Dra. Ângela Costa e a doutoranda Luana Nunes Santo pela contribuição nos experimentos de validação da via WNT/β-Catenina.
Aos membros da banca, Dr. Sílvio Roberto Consonni e Dra. Talita Miguel Marin, pelas contribuições ao trabalho.
Aos meus pais, Antonio e Laurinda, pelo amor, carinho, dedicação e apoio incondicional em minhas decisões.
À toda minha família, avó, tios e primos pelo carinho e incentivo.
Às minhas primas Claudiana, Lídia, Luana e Márcia, com as quais morei durante o mestrado. Obrigada pelo companheirismo.
Ao meu namorado, Augusto. Pelo carinho, apoio e paciência. Obrigada por estar sempre ao meu lado
Aos meus amigos e amigas, por estarem sempre ao meu lado, agradeço pelo carinho, companhia e amizade.
Ao CNPEM/MCTI/LNBio, por todo o apoio para o desenvolvimento deste trabalho. À Unicamp.
À CAPES pela concessão da Bolsa
Enfim, a todos que contribuíram diretamente ou indiretamente para concretização desse trabalho.
“Como é feliz o homem que acha a sabedoria, o homem que obtém entendimento, pois a sabedoria é mais proveitosa do que a prata e rende mais do que o ouro. É mais preciosa do que rubis; nada do que você possa desejar se compara a ela. ” (Provérbios 3:13-15)
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível” (Charles Chaplin)
A adenosina quinase (ADK) regula o nível de adenosina intracelular (ADO) por catalisar a transferência de um grupo fosfato de ATP para ADO. O fluxo de ADO através de ADK influencia a remoção de S-adenosilhomocisteína, o principal regulador negativo de metiltransferases e, consequentemente, o ciclo de transmmetilação. Aqui, usando mapas alta resolução do metiloma, mostramos que ou a regulação positiva de ADK ou a sua inibição farmacológica promove alterações globais na metilação de sítios CpG do DNA em células Hek 293 Flp-in. A superexpressão de ADK, que é acompanhada por uma redução acentuada nos níveis basais de ADO, está associada à hipometilação global, enquanto a inibição farmacológica de ADK, que é acompanhada por aumento dos níveis basais de adenosina, foi associada à hipermetilação geral de ilhas CpG do DNA. O resultado da análise de todos os sítios diferencialmente metilados do DNA contra a base de dados Metacore revelaram um enriquecimento de alterações no padrão de metilação do DNA em sítios CpGs relacionados a genes pertencentes a vias que são moduladas durante o desenvolvimento do sistema nervoso central. Uma dessas vias, a via Wnt foi testada e demonstrou ser upregulated durante superexpressão de ADK. Essas observações estabelecem a ligação entre ADK, estado de metilação do DNA e neurodesenvolvimento; fornecendo um mecanismo inovador que poderia explicar as anormalidades extensas do neurodesenvolvimento, observadas em pacientes com alterações congênitas na função ADK.
Adenosine Kinase (ADK) regulates the level of intracellular adenosine (ADO) by catalysing the transfer of a phosphoryl group from ATP to ADO. The metabolic clearance of ADO to ADK influences the transmethylation pathway, including the methylation reactions of DNA. Accumulation of adenosine favors the formation of S-adenosylhomocysteine (SAH), which is a potent inhibitor of methyltransferases and consequently of the blockade of transmethylation cycle. Here, we have analyzed DNA methylation patterns in Hek293 Flp-in cells. ADK overexpression, which is accompanied by a marked reduction in the basal levels of ADO, is associated with overall hypomethylation. While pharmacological inhibition of ADK, which is accompanied by an increase in adenosine basal levels, was associated with overall hypermethylation of DNA CpG sites. The differentially methylated DNA sites were analyzed in the Metacore database and revealed an enrichment of genes belonging to pathways that are modulated during neurodevelopment. We highlight the WNT / βcatenin signaling pathway known as a critical component in the development of the central nervous system. This pathway was tested and demonstrated to be upregulated during overexpression of ADK. These critical observations establish a link between ADK, DNA methylation status and neurological development; providing a novel mechanism that could explain the extensive neurodevelopmental abnormalities seen in patients with congenital alterations in ADK function.
Figura 1 Síntese de adenosina e vias metabólicas intra e extracelulares. Dentro da célula as purinas, ATP e Adenosina são recicladas continuamente de acordo com as necessidades energéticas, através de reações de defosforilação e fosforilação mediadas por enzimas, tais como 5’nucleotidase e Adenosina Kinase, respectivamente. A adenosina também pode ser gerada a partir da hidrólise de S-adenisilhomocisteína (SAH). Em resposta a elevada atividade metabólica de ATP, a adenosina é transportada para o exterior da célula por difusão facilitada e transporte ativo secundário. O excesso de adenosina é irreversivelmente desaminado em inosina pela ação da Adenosina deaminase... 22 Figura 2 Via de transmetilação. A adenosina é o produto obrigatório final das
reações de transmetilação, incluindo aquelas catalisadas pelas DNA metiltransferases que são responsáveis pela adição de um grupo metil a citosina do DNA. Se a adenosina não é constantemente removida pela ADK, níveis elevados de adenosina conduzem a síntese de SAH, que é um importante inibidor da metiltransferases dependentes de SAM... 26 Figura 3 A influência da metilação do DNA na expressão gênica. Na ausência
de metilação do DNA, fatores de transcrição ligam-se ao DNA e permitem a transcrição. Na presença de metilação os fatores não conseguem se ligar ao DNA ou proteínas de ligação ao domínio CpG impedem a ligação do fatores de transcrição e recrutam proteínas de remodelamento da cromatina impedindo a transcrição... 28 Figura 4 Via WNT canônica (A) na ausência de de Wnt, o complexo de Via
WNT canônica (A) na ausência de de Wnt, o complexo de destruição Apc-axina-1-Gsk-3β-Ck1 fosforila a β-catenina citoplasmática que também sofre poliubiquitinação e direcionamento para a degradação proteossômica. No núcleo, as proteínas Tcf/LEF estão ligadas a repressores transcricionais Tle e CtBP, impedindo a transcrição de genes alvos de Wnt. (B) Quando a Wnt se liga ao seu receptor Fzd e
Ck1 e Gsk-3β, gerando um sítio de ligação de alta afinidade para axina e subsequente recrutamento da Axina para o receptor e ruptura do complexo de destruição. A β-catenina acumula-se e transloca-se para o núcleo, onde se liga a diversos parceiros de ligação ao ADN para regular a transcrição de genes alvo... 33 Figura 5 O plasmídeo pFRT/lacZeo é transfectado em células Hek293 para
gerar a linhagem Flp-in resistente a Zeocina. Em seguida, as colônias que apresentam apenas um sítio FRT são transfectadas com o pCDNA6/TR, gerando a linhagem resistente a tetraciclina. Posteriormente, o PCDNA5/FRT que contém o gene de interesse é cotransfectado junto ao pOG44. A recombinase Flp expressa pelo plasmídeo pOG44 catalisa a recombinação homóloga entre os síto FRT da linhagem e o vetor de expressão PCDNA5/FRT, permitindo a reconstrução do gene da higromicina e a seleção dos clones... 37 Figura 6 O repressor Tet (tetR) é expresso a partir do plasmídeios pCDNA6, o
qual é transfectado na linhagem Flp in para conferir resistência a tetraciclina. Os homodímeros de TetR se ligam ao sítio operador Tet (tetO2) no vetor de expressão reprimindo a transcrição do gene de interesse. Ao adicionar tetraciclina, essa se liga aos homodímeros de tetR. A ligação de tetraciclina aos homodímeros de tetR causam uma mudança conformacional no repressor, desligando-o do sítio operador Tet e permitindo a indução da transcrição do gene de interesse... 38 Figura 7 Distribuição das regiões funcionais em relação ao gene, a unidade
transcricional dividi-se em TSS200 e TSS1500; 5’ e 3’ UTR (untranslated region), primeiro éxon, corpo de gene e região intergênica. A cobertura em relação as ilhas CpGs divide-se em em ilhas e regiões situadas nas margens da ilhas, denominadas de ‘shore’ (até 2000 pb da ilha), ‘shelf’ (2000 a 4000 pb) ‘open sea’... 43 Figura 8 (A) O ensaio Inf I, utiliza duas sondas, uma para o alelo metilado (M)
e uma para o alelo não metilado (U), ambos os locus incorporam o mesmo tipo de nucleotídeo, mas a ligação do lucus não metilado ocorre
de sonda que hibridiza a base antecedente ao sítio alvo, e adição de base marcada por fluoróforo. No sítio metilado ocorre a incorporação da base A (vermelho) e no sítio não metilado ocorre a incorporação da base G (verde) ... 45 Figura 9 Western Blotting do extrato total (50 µg de proteína) proveniente de
tratamentos com diferentes concentrações de tetraciclina em células HEK 293 Flp-in. As concentrações de 0, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300 e 400 ng/mL foram testadas visando identificar as melhores condições de indução da proteína ADK... 49 Figura 10 Microscopia confocal das células Hek293 Flp-In. (A) Marcação com
anticorpo anti-FLAG nas células Hek293 Flp-In não induzidas (NI) sem expressão de FLAG-ADK e células Hek293 Flp-In induzidas com tetraciclina (IND) que expressam FLAG-ADK ; (B) Marcação com anticorpo anti-ADK nas Hek293 Flp-In NI que expressam apenas ADK endógena e células Hek293 Flp-In IND com tetraciclina que expressam FLAG-ADK recombinate. A escala indicada pela barra branca é de 20μm... 51 Figura 11 (A) Gráfico do perfil de ADO em células Hek293 Flp-In não induzidas
(NI) sem superexpressão de ADK e células Hek293 Flp-In induzidas com tetraciclina (IND) com superexpressão ADK. Dados apresentados como média dos experimentos realizados em triplicatas (B) Westen blot de células Hek293 Flp-In NI e IND marcadas com anti FLAG... 52 Figura 12 Gráfico do perfil de adenosina em células Hek293 Flp-in não induzidas
(NI) sem superexpressão de ADK. As células NI foram tratadas por 72 horas com diferentes concentrações de TAKS (1, 10, 25, 50 e 100 µM), um inibidor de ADK. Dados apresentados como média... 53 Figura 13 Gráfico do perfil de adenosina em células HEK ADK Flp-In induzidas
com tetraciclina (IND) que superexpressão ADK. As células IND foram tratadas por 72 horas com diferentes concentrações de TAKS
Figura 14 Gráfico de normalização: Comparação da distribuição dos valores de antes e após a normalização por diferentes métodos. A- Primeira etapa de pré-processamento. B- Normalização pelo método Quantile. C- Normalização pelo método SWAN. D- Normalização pelo método Funnorm... 55 Figura 15 Notched box plots representam o valor de β de 1.163 sítios CpGs
diferencialmente metilados entre as células HeK293 Flp in TRex induzidas (IND) e as células não induzidas (NI). A caixa mostra a faixa interquartil (percentil 25 a 75), e a linha mostra a mediana dos dados. Embora não seja um teste formal, se as duas caixas não se sobrepõem, há "forte evidência" (95% de confiança), que suas medianas diferem. Os whiskers acima e abaixo da caixa contêm 99,3% dos dados... 56 Figura 16 Distribuição cromossômica dos sítios diferencialmente metilados
(DMS) detectados em Hek293 Flp-In induzidas (IND) em comparação a células não induzidas (NI) ... 58 Figura 17 Análise de enriquecimento dos genes relacionados a sítios CpGs
diferencialmente metilados na comparação entre células Hek 293 Flp-In induzidas (IND) versus não induzidas (NI). (A) São descritos os 10 GO processos mais significativos identificados pelo Metacore. O comprimento da barra laranja reflete a significância, sendo igual ao logaritmo negativo do p-valor de enriquecimento. (B) Principal rede biológica construída pelo Metacore a partir de genes com sítios CpGs diferencialmente metilados detectados na comparação entre células IND versus NI que estão relacionados ao desenvolvimento do sitema nervoso. A tabela motra a significância estatística da rede... 59 Figura 18 Notched box plots representam o valor de β de 3833 sítios CpGs
diferencialmente metilados entre as células HeK293 Flp in TRex não induzidas e tratadas com DMSO(NI_DMSO) e não induzidas tratadas com TAKS (NI_TAKS). A caixa mostra a faixa interquartil (percentil 25 a 75), e a linha mostra a mediana dos dados. Embora não seja um teste formal, se as duas caixas não se sobrepõem, há "forte evidência"
Figura 19 Distribuição cromossômica dos sítios diferencialmente metilados (DMS) detectados em Hek293 Flp-In não induzidas e tratadas com DMSO (NI_DMSO) em comparação a células não induzidas tratadas com comTAKS (NI_TAKS) ... 63 Figura 20 Análise de enriquecimento dos genes relacionados a sítios CpGs
diferencialmente metilados na comparação entre células Hek 293 Flp-In não induzidas tratadas com DMSO (NI_DMSO) versus não induzidas tratadas com TAKS (NI_TAKS). (A) São descritos os 10 GO processos mais significativos identificados pelo Metacore. O comprimento da barra laranja reflete a significância, sendo igual ao logaritmo negativo do p-valor de enriquecimento. (B) Principal rede biológica construída pelo Metacore a partir de genes com sítios CpGs diferencialmente metilados detectados na comparação entre células
NI_DMSO versus NI_TAKS que estão relacionados ao desenvolvimento de sitemas. A tabela motra a significância estatística da rede... 64 Figura 21 Notched box plots representam o valor de β de 1062 sítios CpGs
diferencialmente metilados entre as células HeK293 Flp in TRex induzidas e tratadas com DMSO(IND_DMSO) e induzidas tratadas com TAKS (IND_TAKS). A caixa mostra a faixa interquartil (percentil 25 a 75), e a linha mostra a mediana dos dados. Embora não seja um teste formal, se as duas caixas não se sobrepõem, há "forte evidência" (95% de confiança), que suas medianas diferem. Os whiskers acima e abaixo da caixa contêm 99,3% dos dados... 65 Figura 22 Distribuição cromossômica dos sítios diferencialmente metilados
(DMS) detectados em Hek293 Flp-In induzidas e tratadas com DMSO (IND_DMSO) em comparação a células induzidas tratadas com comTAKS (IND_TAKS) ... 67 Figura 23 Análise de enriquecimento dos genes relacionados a sítios CpGs
diferencialmente metilados na comparação entre células Hek 293 Flp-In induzidas tratadas com DMSO (IND_DMSO) versus induzidas
barra laranja reflete a significância, sendo igual ao logaritmo negativo do p-valor de enriquecimento... 68 Figura 24 (A)Top 10 Pathway Map estatisticamente significativos criados
usando a análise de enriquecimento GeneGo do Metacore a partir de genes relacionados a sítios CpGs diferencialmente metilados na comparação entre células Hek 293 Flp-In induzidas tratadas com DMSO (IND_DMSO) versus induzidas tratadas com TAKS (IND_TAKS). O comprimento da barra laranja reflete a significância, sendo igual ao logaritmo negativo do p-valor de enriquecimento. (B) Pathway Map desenvolvimento da Via de sinalização WNT, parte 2... 69 Figura 25 (A) A superexpressão de ADK ativa a atividade luciferase. (B) A
superexpressão de ADK ativa a atividade luciferase de maneira depedente de TCF-β- catenina... 70
PÁG. Tabela 1- Distribuição dos sítios diferencialmente metilados (DMS) de acordo
com a região genômica funcional. Sítios hipometilados e hipertilados em Hek 293 Flp-in induzidas (IND) versus células não induzidas (NI)... 57 Tabela 2 - Distribuição dos sítios diferencialmente metilados (DMS) em relação
a ilha CpG. Sítios hipometilados e hipertilados em Hek 293 Flp-in induzidas (IND) em relação a células não induzidas (NI) ... 57 Tabela 3 - Distribuição dos sítios diferencialmente metilados (DMS) de acordo
com a região genômica funcional. Sítios hipometilados e hipertilados em Hek 293 Flp-in não induzidas tratadas com DMSO (NI_DMSO) versus células não induzidas tratadas com TAKS (NI_TAKS) ... 61 Tabela 4 - Distribuição dos sítios diferencialmente metilados (DMS) em relação
a ilha CpG. Sítios hipometilados e hipertilados em Hek 293 Flp-in não induzidas tratadas com DMSO (NI_DMSO) versus células não induzidas tratadas com TAKS (NI_TAKS ... 62 Tabela 5 - Distribuição dos sítios diferencialmente metilados (DMS) de acordo
com a região genômica funcional. Sítios hipometilados e hipertilados em Hek 293 Flp-in induzidas tratadas com DMSO (IND_DMSO) versus células induzidas tratadas com TAKS (IND_TAKS) ... 66 Tabela 6 - Distribuição dos sítios diferencialmente metilados (DMS) em relação
a ilha CpG. Sítios hipometilados e hipertilados em Hek 293 Flp-in induzidas tratadas com DMSO (IND_DMSO) versus células induzidas tratadas com TAKS (IND_TAKS) ... 66
ADA Adenosina deaminase ADK Adenosina Quinase ADK-L Adenosina Quinase long ADK-S Adenosina Quinase short ADO Adenosina
ADP Adenosina Difosfato AMP Monofosfato de adenosina
AMPK proteína quinase ativada por AMP Apc Adenomatous Polyposis Coli ATP Adenosina Trifosfato CK1 caseína-quinase1
DMR Regiões diferencialmente metiladas DMS Sítios diferencialmente metilados DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico DNMT DNA metiltransferase Dvl Dishevelled
FAD Flavina Adenina Dinucleotídeo Fzd Frizzled
Inf Infinium
GMPc Monofosfato cíclico de guanosina GSK-3 β Glicogênio sintase quinase 3 beta GTP Guanosina trifosfato
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência IND Induzida
MBDs proteínas de ligação ao domínio metil-CpG MECP2 Methyl-CpG-binding protein 2
NAD Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo ncRNAs RNAs não codificantes
NI Não induzida RNA Ácido ribonucleico
RNAPII RNA polimerase II RNAPII
RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction SAH S-adenosilhomocisteína
SAHH S-adenosilhomocisteína hidrolase SAM S-adenosilmetionina
SIT Sítio de início de transcrição SNC Sistema nervoso central TCF Fator de células T
1. INTRODUÇÃO ... 21
1.1 Adenosina ... 21
1.2 Adenosina Quinase ... 22
1.3 Metilação do DNA ... 25
1.3.1 Ilhas CpGs ... 26
1.3.2 Sítios de início de Transcrição (SIT) ... 27
1.3.3 Corpos de genes ... 29
1.3.4 Regiões intergênicas ... 30
1.3.5 Mecanismo básico da metilação do DNA – DNMTS ... 30
1.4 Metilação do DNA no neurodesenvolvimento ... 31
1.5 WNT via canônica ... 32
2.OBJETIVOS ... 35
2.1 Objetivos específicos ... 36
3.MATERIAL E MÉTODOS ... 36
3.1 Geração da linhagem HEK Flp-In TRex ... 36
3.2 Análise da superexpressão da ADK ... 39
3.2.1 Extração de proteínas... 39
3.2.2Western Blotting ... 39
3.2.3 Marcação das células Hek ADK Flp in por imunofluorescência ... 40
3.3 Inibição e Dosagem de Adenosina ... 40
3.3.1Coleta de células ... 41
3.3.2 Condições Cromatógraficas ... 41
3.4 Análise de metilação do DNA ... 42
3.4.1 Preparação da amostras para análise do perfil de metilação ... 42
3.4.2Ensaio Illumina Infinium HumanMethylation450 ... 43
3.4.2.1 Análise e interpretação dos dados ... 46
3.4.2.2 Pré-processamento e Normalização... 46
3.4.2.3 Análise dos sítios diferencialmente metilados ... 47
3.4 Ensaio com Luciferase... 48
3.5 Análise estatística ... 48
4.3 Metilação do DNA ... 54
4.3.1 Pré processamento ... 54
4.3.2 Comparação entre grupos de células ... 56
4.3.2.1 Caracterização dos sítios diferencialmente metilados entre células IND e NI ... 56
4.3.2.2 Caracterização dos sítios diferencialmente metilados entre células NI_DMSO e NI-TAKS ... 60
4.3.2.3 Caracterização dos sítios diferencialmente metilados entre células IND_DMSO e IND_Taks ... 65
4.4 ADK e Via de sinalização Wnt/β-catenina ... 70
5.DISCUSSÃO ... 71
6.CONCLUSÃO ... 74
1. INTRODUÇÃO
1.1 Adenosina
A adenosina (ADO) é um nucleosídeo purínico, essencial para a manutenção da homeostase energética, atuando através de mecanismo auto regulatório para ajustar a demanda metabólica. Além disso, ADO é componente integral da molécula de RNA; faz parte das coenzimas NAD e FAD; está relacionada a sistemas de segundo mensageiro; e atua como metabólito central de vias bioquímicas, tais como, a via de transmetilação (1, 2).
A ADO controla diversas funções fisiológicas e patológicas como isquemia-reperfusão, inflamação e doenças neurodegenerativas. Muitas dessas funções são mediadas através da ativação de receptores acoplados a proteína G, denominados A1, A2A,
A2B e A3. (3, 4).Os receptores A1 e A3 quando ativados, inibem a atividade da
Adenil-ciclase e aumentam a da fosfolipase C (6, 7, 8, 9). Em contraste, os receptores A2A e A2B
ativam a Adenil-ciclase (10, 11, 12). Uma vez que estes receptores estão acoplados a distintas proteínas G, atuam em sistemas efetores diversos como canais de cálcio e potássio, GMP cíclico, fosfodiesterase, e proteínas quinases ativadas por mitógenos. Assim, a resposta mediada pela adenosina varia de acordo com o tipo de receptor ativado (13).
Sob condições de estresse, os níveis de ADO são rapidamente aumentados, desencadeando assim efeitos protetores locais (14, 15). Este papel protetor ocorre por dois mecanismos distintos: diminuição da demanda energética e mobilização de reservas locais de nutrientes (15, 17, 18). Além das vias mediadas através de receptores, a ADO também exerce suas funções de maneira independente da ativação de receptores. Estes efeitos estão intrinsicamente relacionados a alterações nos níveis intracelulares de ADO. Por exemplo, a ADO pode influenciar diretamente diversas vias de sinalização, tais como p53 e AMPK (19, 20). Notavelmente, a ADO também desempenha papel crucial na regulação das vias de transmetilação, incluindo a metilação do DNA, regulando a disponibilidade de substrato (1, 21).
Bioquimicamente, a ADO pode ser formada por duas principais vias: a clivagem da S-adenosilhomocisteína (SAH), pela ação da SAH hidrolase (EC 3.3.1.1); e a hidrólise do AMP em adenosina e fosfato inorgânico, fonte mais significativa de adenosina intracelular. As maiores rotas de remoção da adenosina são baseadas em desaminação para formar a inosina, via Adenosina Deaminase – ADA (EC 3.5.4.4), ou fosforilação para formar monofosfato de adenosina (AMP) via Adenosina Quinase - ADK (EC 2.7.1.20), principal enzima reguladora (Figura 1) (22, 23, 24). Sob condições fisiológicas, a homeostase da adenosina está sob o controle da ADK, cuja atividade depende diretamente do estado energético da célula.
Figura 1: Síntese de adenosina e vias metabólicas intra e extracelulares. Dentro da célula as purinas, ATP e Adenosina são recicladas continuamente de acordo com as necessidades energéticas, através de reações de defosforilação e fosforilação mediadas por enzimas, tais como 5’nucleotidase e Adenosina Quinase, respectivamente. A adenosina também pode ser gerada a partir da hidrólise de S-adenisilhomocisteína (SAH). Em resposta a elevada atividade metabólica de ATP, a adenosina é transportada para o exterior da célula por difusão facilitada e transporte ativo secundário. O excesso de adenosina é irreversivelmente desaminado em inosina pela ação da Adenosina deaminase.
ADK (adenosina 5’- fosfotranferase, EC 2.7.1.20) é a quinase mais abundante nos tecidos de mamíferos, incluindo os seres humanos. Esta enzima catalisa a conversão de ADO em AMP, utilizando um doador de fosfato como ATP ou GTP (25). Esta reação enzimática é fundamental na regulação da disponibilidade de ADO. Outra enzima envolvida na metabolização de ADO é a adenosina deaminase, que transforma ADO em inosina, através de uma reação de desaminação (26). Entretanto, o baixo valor de Km (0,7
µM) da ADK em relação ao valor mais elevado do Km da adenosina deaminase (2mM),
indica que a via de fosforilação deve ser a rota primária de metabolização da adenosina (27, 28).
Estruturalmente, a ADK consiste em um monômero composto por um grande domínio α/β com nove fitas β e oito α-hélices, o qual é responsável pela ligação ao ATP e ADP; e um domínio α/β menor com cinco fitas β e duas α-hélices que junto ao domínio maior forma um sítio catalítico de alta afinidade, que se liga seletivamente a adenosina e AMP ( 29). Um sítio de ligação do magnésio localiza-se entre os sítios de ligação da ADO e ATP, sendo este íon fundamental para a catálise da ADK 26. A catálise da conversão de ADO e ATP em AMP e ADP respectivamente, ocorre através da seguinte reação (30):
ATP+ADO ADP + AMP
Ao realizar esta reação, a ADK controla os níveis intra e extracelular de ADO, exercendo seu papel crucial de regulador metabólico. Em eucariotos, a sequência e estrutura da ADK são bem conservadas e sua expressão requer mecanismos finamente regulados para a manutenção das funções fisiológicas que está envolvida (29, 30). Diante da importância da ADK para manutenção dos níveis de ADO e homeostase energética, não é surpreendente que a sua disfunção vincule-se a patologias como diabetes, doenças cardíacas, epilepsia e câncer. Assim, a regulação dos níveis de ADK torna-se um interessante alvo terapêutico, sendo amplamente estudado (1).
Duas isoformas de ADK (ADK long ou ADK-L e ADK short ou ADK-S) estão presentes em mamíferos, ambas são funcionais e não apresentam diferenças em suas propriedades bioquímicas e cinéticas (31,32). As duas isorformas diferenciam-se apenas
pela região N-terminal, na qual a ADK-L apresenta 20-21 aminoácidos extras, que substituem os 4 primeiros aminoácidos da ADK-S (33). Um estudo de Cui XA e colaboradores 2009 (34) identificou a localização específica de ambas isoformas de ADK, através de análises de imunofluorescência de diferentes linhagens celulares que expressavam apenas uma ou as duas isoformas da proteína. Nas células que expressavam apenas ADK-L a marcação por imunofluorescência com anticorpo ADK foi predominante no núcleo. Em contraste, nas linhagens que expressavam ambas isorformas, a marcação difundiu-se pelo núcleo e citoplasma. Para confirmar a especificidade da localização, células CHO foram transfectadas com ADK-L ou ADK-S (contendo o epitopo c-myc na região C-terminal), e marcadas por imunufluorescencia, utilizando anticorpo c-myc. Essas análises confirmaram a localização subcelular de ADK-L no núcleo e de ADK-S na região citoplasmática.
A função da ADK na via de salvamento de purina é bem conhecida, entretanto a ADK também desempenha um papel essencial na facilitação de várias reações metiltransferases. Adenosina e homocisteína são obrigatoriamente produtos finais das reações de transmetilação que envolvem metiltranasferases, dependentes de S-adenosilmetionina (SAM). Estes produtos finais precisam de um eficiente sistema de remoção para evitar a inibição das reações de transmetilação (35). A localização nuclear de ADK sugere seu papel essencial nas reações de metilação do DNA por remoção do produto final inibitório. Camundongos knockouts para ADK morrem logo após o nascimento, devido a deficiências nos sistemas de termo regulação, crises de apneia e esteatose hepática. Portanto a deleção completa de ADK apresenta-se como fenótipo letal, uma das possíveis razões para este fenótipo letal, seria a perturbação da regulação epigenética, por falhas no sistema de remoção da adenosina (36).
As primeiras evidências da interferência dos níveis de expressão da ADK na manutenção das reações de transmetilação foi sugerida pelo trabalho de Moffatt e colaboradores 2002 (37) que verificaram os efeitos da expressão gênica de ADK em na planta Arabidopsis. A deficiência de ADK em Arabidopsis resultou em um aumento da concentração SAH e inibição das reações de transmetilação SAM dependentes. Adicionalmente, essas plantas apresentaram tamanho reduzido, aparência espessa, folha onduladas e arredondadas, e diminuição da fertilidade.
Williams-Karnesky e colaboradores 2013 (38) demonstraram que a adenosina pode regular níveis globais de metilação do DNA. Eles identificaram o aumento da metilação do DNA em hipocampus de camundongos epilépticos, cujo tratamento com infusão de adenosina foi capaz de reduzir efetivamente o status patológico da metilação do DNA, enquanto a infusão de SAM induziu a hipermetilação global do DNA, demonstrando que o estado de metilação do DNA dependia diretamente da via de transmetilação sensível a adenosina. Notavelmente, a terapia com adenosina também foi eficiente na prevenção da epileptogênese. Além disso, eles demonstraram que a inibição de ADK com Iodotubercidina ou a redução da expressão gênica de ADK resultou em hipometilação no cérebro, ao passo que a superexpressão de ADK resultou em aumento da metilação em cultura de células, sendo que a superexpressão da isoforma nuclear de ADK foi mais eficiente no aumento dos níveis de metilação. Estes dados sugerem o papel da ADK na regulação dos níveis de metilação do DNA, agindo como regulador epigenético (1).
1.3 Metilação do DNA
Mecanismos epigenéticos são alterações hereditárias na expressão gênica que independem de alterações na sequência primária do DNA (39, 40). Embora praticamente todas as células de um organismo contenham a mesma informação genética, nem todos os genes são expressos simultaneamente por todos os tipos celulares. Num sentindo mais amplo, a utilização seletiva do genoma é necessária e é promovida através do estabelecimento de padrões de expressão gênica apropriados. Neste contexto, mecanismo epigenéticos são essenciais para a regulação da expressão gênica, desenvolvimento e homeostase (41, 42).
As modificações epigenéticas incluem a metilação de DNA, modificação pós traducionais de histonas, remodelamento da cromatina e mecanismos baseados em RNAs não codificantes (ncRNAs). Estes mecanismos modulam a estrutura da cromatina e contribuem para regulação de muitos processos moleculares que ocorrem no núcleo da célula, tais como transcrição, replicação, reparo e processamento do DNA (43). A metilação do DNA é o mecanismo epignético mais estudado, sendo conhecido por desempenhar papéis biológicos no silenciamento constitutivo de regiões da cromatina, inativação do cromossomo, imprinting de alelos parentais, reprogramação e estabilidade,
diferenciação celular, pluripotência, silenciamento de transposons, envelhecimento, reações a dietas e respostas a alterações do meio ambiente (44).
As reações de metilação do DNA envolvem ação de DNA metiltransferases (DNMTs) que transferem um grupo metil de SAM ao carbono na posição 5 da citosina. Como resultado temos a formação de S-adenosil-homocisteína (SAH), a qual pode ser clivada em ADO e homocisteína por ação da enzima SAH hidrolase (SAHH). A SAHH é uma enzima reversível, cujo equilíbrio termodinâmico na presença de ADO favorece a síntese de SAH, que é um importante inibidor das DNMTs. Portanto para progressão das reações de metilação do DNA é necessária uma constante remoção de ADO por ADK (Figura 2). Em mamíferos, a metilação do DNA pode ocorrer em citosinas localizadas em qualquer contexto do genoma. No entanto, mais de 98% da metilação do DNA de células somáticas ocorre num contexto dinucleotídeo CpG (1, 45, 46).
Figura 2: Via de transmetilação. A adenosina é o produto obrigatório final das reações de transmetilação, incluindo aquelas catalisadas pelas DNA metiltransferases que são responsáveis pela adição de um grupo metil a citosina do DNA. Se a adenosina não é constantemente removida pela ADK, níveis elevados de adenosina conduzem a síntese de SAH, que é um importante inibidor da metiltransferases dependentes de SAM.
Os dinucleotídeos CpG tendem a concentrar-se em regiões denominadas de ilhas CpG, as quais possuem mais de 200 bases, com teor de C+G maior que 50%, sendo o resto do genoma empobrecido de sequências CpG (47). A maioria dos promotores de genes humanos, aproximadamente 70%, estão associados a ilhas CpG, que geralmente encontram-se desmetiladas sob condições normais (48). A localização das ilhas CpG, especialmente aquelas associadas a promotores, são altamente conservadas entre mamíferos ao longo da evolução, indicando que essas regiões possuem uma importância funcional. TradicIonalmente, a metilação do DNA em regiões promotoras de um gene são relacionadas ao silenciamento e inativação gênica (49).
A metilação do DNA também pode ocorrer em regiões com menor densidade de CpG que se encontram nas margens das ilhas. As margens situam-se em uma distância variável dos promotores e são chamadas de ‘shore’ (até 2000 pb da ilha), ‘shelf’ (2000 a 4000 pb) ‘open sea’ (mais de 4000 pb). A metilação das margens das ilhas CpGs está intimamente relacionada a inativação transcricional e maior a parte da metilação tecido específica encontram-se nessas regiões (50).
Até pouco tempo, a maioria dos trabalhos sobre metilação do DNA enfatizavam as ilhas CpGs localizadas nos sítios de início de transcrição, entretanto o surgimento de novas tecnologias para análise global de metilação do DNA permitiram uma melhor compreensão de como a posição da metilação na unidade transcricional pode influenciar no controle da expressão gênica. As ilhas CpGs estão associadas não apenas a regiões promotoras, mas também localizam-se em regiões intragênicas, corpos de genes ou locais intergênicos. Para o entendimento da função da metilação DNA é fundamental considerar a sua localização no genoma (51).
1.3.2 Sítios de início de Transcrição (SIT)
A metilação do DNA em promotores de genes está firmemente associada a repressão da transcrição, porém os mecanismos ainda não estão claros (52). Nos últimos 40 anos, vários estudos mostraram que os níveis de metilação do DNA em promotores está negativamente correlacionado com a expressão de genes downstream (53, 54). Recentemente, algumas evidências que contradizem o paradigma de que a metilação do DNA sempre reprime a transcrição começaram a aparecer. Promotores com baixo teor CpG são geralmente metilados, mas ainda podem ser transcricionalmente ativos (55).
Além disso, promotores de genes que exibem níveis elevados de metilação durante o desenvolvimento normal, permanecem suprimidos em embriões de camundongos DNMT1 deficientes, sugerindo que o controle da expressão gênica não conta com a metilação da citosina e que os efeitos da metilação do DNA estariam limitados a processos especializados, como imprinting genômica (52).
Apesar das controvérsias, as evidências de que a metilação do DNA tem papel importante na regulação da transcrição gênica, permanece sólida. Assim os mecanismos de interação entre metilação e expressão são de extrema importância (56). Na ausência de metilação do DNA, fatores de transcrição podem se ligar ao DNA, permitindo a ligação da RNA polimerase e início da transcrição. Em um contexto de citosinas metiladas, pode ocorrer uma interferência direta na ligação de fatores de transcrição ao DNA por “mascaramento”, ou indireta através do recrutamento de proteínas de ligação ao domínio metil-CpG (MBDs), as quais possuem atividade remodelamento da cromatina (Figura 3) (51).
Figura 3: A influência da metilação do DNA na expressão gênica. Na ausência de metilação do DNA, fatores de transcrição ligam-se ao DNA e permitem a transcrição. Na presença de metilação os fatores não conseguem se ligar ao DNA ou proteínas de ligação ao domínio CpG impedem a ligação do fatores de transcrição e recrutam proteínas de remodelamento da cromatina impedindo a transcrição.
1.3.3 Corpos de genes
A maioria dos corpos de genes são empobrecidos de dinucleotídeos CpG, são amplamente metilados e contém múltiplos elementos transponíveis e sequências repetitivas de DNA. A metilação de sítios CpG presentes em éxons é uma das principais causas de mutação de transição C – T, podendo provocar doenças em linhagens germinativas ou somáticas (57). É importante destacar que apesar de muitas ilhas CpG localizarem-se em promotores de genes, muitas delas são encontradas dentro de corpos de genes. Evidências sugerem que a metilação do DNA em corpos de gene está associada ao aumento da expressão gênica (58). Curiosamente, iniciadores de transcrição encontram-se desmetilados em genes com uma extensa metilação em regiões intragêncicas, sendo que a presença da metilação em seus corpos de gene não bloqueia a elongação da transcrição (59, 47). Dessa forma, a metilação no promotor do gene está inversamente relaciona com a expressão, enquanto a metilação em corpos de genes é positivamente relacionada a expressão.
Outras funções são propostas para a metilação do DNA em corpos de genes: Estudos mostram que éxons são mais metilados que íntros, e a transição do grau de metilação ocorre nos limites entre éxons e íntrons, sugerindo que metilação do DNA tem importante papel na regulação do splincing alternativo (60). De fato, dados acerca do posicionamento do nucleossoma (sítios preferenciais a metilação do DNA), indicam que sua localização é mais predominante em éxons do que em ítrons. Adicionalmente, novas pesquisas apontam que a ligação entre a proteína CTCF (que age como repressora transcricional e pode ser regulada por metilação do DNA) e elementos isoladores resulta na pausa da RNA polimerase II (RNAPII), cuja cinética de movimento influencia no splicing alternativo (61, 62).
A metilação do DNA também pode ser um mecanismo de controle para o uso de promotores alternativos. A maioria dos genes tem pelo menos dois SIT, de modo que o SIT dowstream localiza-se dentro de ‘corpos’ da unidade transcicional de promotores upstream. Promotores alternativos podem complicar a interpretação de análises da relação entre metilação do DNA e expressão gênica, isso porque as sondas utilizadas para medir a expressão gênica geralmente detectam os sinais de todos os promotores, mesmo que apenas um esteja ativo. Dessa forma, poderia ocorrer contradição entre metilação e a expressão gênica, pois a metilação de um promotor dowstream bloquearia a transcrição
apenas desse promotor, mas admitiria a elongação de um transcrito a partir do promotor upstream (51).
1.3.4 Regiões intergênicas
Em células normais, a metilação do DNA ocorre predominantemente em sequências repetitivas do genoma, incluindo DNA satélite e elementos transponíveis virais. A grande maioria desses elementos são silenciados por metilação do DNA ou por mutações adquiridas ao longo do tempo, se expressos, estes elementos são potencialmente prejudiciais, podendo afetar integridade cromossômica, causar translocações, ruptura do gene e instabilidade cromossômica isto demonstra que uma das principais funções da metilação do DNA é reprimir a expressão de elementos genéticos potencialmente prejudiciais (63, 46).
1.3.5 Mecanismo básico da metilação do DNA - DNMTS
A metilação do DNA de mamíferos é catalisada por ação da família DNMT. Essas enzimas estabelecem os padrões de metilação, junto a fatores associados, de maneira coordenada. São responsáveis pela aquisição do padrão de metilação durante a gametogênese, embriogênese, desenvolvimento e no tecido somático. Em mamíferos foram descritos cinco membros da família DNMT: DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B DNMT3L, entretanto apenas DNMT1, Dnmt3a e DNMT3B participam diretamente a adição de grupos metil ao DNA (64).
A DNMT1 é a principal enzima responsável pela manutenção do padrão de metilação do DNA. Ao contrário das demais DNMTs, a DNMT1 metila preferencialmente DNA hemimetilado e também tem atividade de novo metiltransferase. Durante a replicação semiconservativa do DNA, localiza-se na forquilha de replicação, onde metila precisamente o DNA recém-sintetizado, mantendo o padrão de metilação inicial presente antes da replicação do DNA. A DNMT1 também é capaz de reparar a metilação do DNA (65, 66, 67).
A DNMT2 é a menor DNMT dos mamíferos, sendo denominada agora como TRDMT1. Ela possui apenas um domínio C-terminal, sugerindo que esta enzima participe do reconhecimento de danos, recombinação e reparo do DNA (64).
DNMT3a e DNMT3B são semelhantes em sua estrutura e função, são duas proteínas relacionadas, mas codificadas por genes distintos. Possuem função de novo metiltransferase, ou seja, podem metilar qualquer sequência CpG não apresentando preferência pelo DNA hemimetilado. Possuem uma distribuição dispersa pelo núcleo e não está relacionada com locais de replicação. Sugere-se que essas DNMTs são responsáveis por estabelecer os padrões de metilação durante o desenvolvimento embrionário, pois são altamente expressas durante o desenvolvimento embrionário e downrgulated nas células diferenciadas (68). Já a DNMT3L é expressa durante a gametogênese, sendo necessária para estabelecer imprinting genômico. Embora seja cataliticamente inativa A DNMT3L age como um fator estimulante para DNMT3a e DNMT3B, interagindo e se co-localizando com elas (69,70).
1.4 Metilação do DNA no neurodesenvolvimento
O Sistema nervoso central (SNC) é formado por vários tipos celulares, tais como neurônio, astrócitos, oligodendrócitos e células da glia. Estas células são todas derivadas de células precursoras neurais comuns (conhecidas como células estaminais neurais) que sofreram diferenciação durante o desenvolvimento, para estabelecer redes neuronais (71). A diferenciação celular é definida pela aquisição de funções precisas e bem definidas durante o desenvolvimento. Neste contexto, mecanismos epigenéticos são fundamentais para estabelecer os padrões de expressão gênica tecido-específica (72)
A metilação do DNA é um mecanismo molecular fundamental para orquestrar a regulação da transcrição gênica durante desenvolvimento do sistema nervoso A importância da metilação do DNA no desenvolvimento do cérebro fetal é realçada pela expressão dinâmica das DNMT3a e DNMT3B durante o período perinatal e deficiências no desenvolvimento neurológico associadas com mutações no gene Methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2). Além disso, a metilação do DNA é conhecida por operar durante a plasticidade sináptica, aprendizagem e memória, assim como no declínio cognitivo relacionado ao envelhecimento (73)
As células do cérebro dependem de mecanismos complexos e altamente regulados para ativar ou silenciar adequadamente os programas genéticos em resposta a estímulos ambientais. Estes eventos são controlados por vias de sinalização que medeiam a expressão gênica através de modificações na atividade, localização e expressão de
enzimas reguladoras da transcrição em combinação com alterações na estrutura da cromatina (74). Portanto, mecanismos epigenéticos parecem desempenhar um papel fundamental na sustentação do programa de transcrição responsável pelo estabelecimento e refinamento de conexões sinápticas e circuitos neuronais (75, 68). Dessa forma, não é surpreendente que a desregulação dos mecanismos epigenéticos estejam envolvidos em transtornos do desenvolvimento, transtornos psiquiátricos e doenças neurodegenerativas (76)
No presente estudo, foram identificados sítios CpGs diferencialmente metilados em vários genes relacionados a vias de sinalização que são relevantes para o neurodesenvolvimento. Estes resultados propuseram que alterações na atividade de ADK podem induzir alterações generalizadas dos padrões de metilação do DNA durante o desenvolvimento. Uma análise mais detalhada dos dados revelou um enriquecimento de genes particularmente envolvidos na via de sinalização WNT canônica.
1.5 WNT via canônica
A sinalização mediada pela família Wnt é um dos mecanismos fundamentais para determinação do destino celular, proliferação, migração, polaridade e expressão gênica. A via de sinalização Wnt canônica é a mais estudada, funcionando como regulador dos níveis de β-catenina, co-ativador transcricional que controla os principais programas de expressão gênica durante o desenvolvimento. Na ausência de Wnt, a β-catenina é constantemente degradada pelo complexo de destruição, que consiste nas proteínas Axina, Apc, caseína-quinase1 (CK1), glicogênio sintase quinase 3 beta (GSK-3 β). CK1 seguida por GSK-3 β fosforilam a região N-terminal da β-catenina, o que resulta no reconhecimento da β-catenina por β-TRCP, uma subunidade de ubiquitina-ligase E3 e subsequente ubiquitinação e degradação proteossômica da β-catenina. Esta remoção constante de β-catenina impede, que ela alcance o núcleo, assim as proteínas Tcf/LEF permanecem ligadas a repressores transcricionais Tle e CtBP, impedindo a transcrição de genes alvos de Wnt. A via de sinalização Wnt canônica é ativada após ligação da Wnt ao receptor Frizzled (Fzd) e a proteína de baixa densidade LRP6 ou LRP5. A formação do complexo Wnt-Fz-LRP6 junto ao recrutamento da proteína Dishevelled (Dvl) resulta na fosforilação e ativação de LRP6 e recrutamento do complexo Axina, assim a β-catenina
não sofre degradação e se acumula no citoplasma, podendo alcançar o núcleo, no qual forma complexos com TCF/LEF e ativa a expressão de genes alvos de Wnt (77,78).
Figura 4: Via WNT canônica (A) na ausência de de Wnt, o complexo de destruição Apc-axina-1-Gsk-3β-Ck1 fosforila a β-catenina citoplasmática que também sofre poliubiquitinação e direcionamento para a degradação proteossômica. No núcleo, as proteínas Tcf/LEF estão ligadas a repressores transcricionais Tle e CtBP, impedindo a transcrição de genes alvos de Wnt. (B) Quando a Wnt se liga ao seu receptor Fzd e correceptor Lpr5/6, Disheveled (Dvl) é recrutado para o complexo Wnt / receptor para promover a fosforilação do co-receptor Lrp5 / 6 por Ck1 e Gsk-3β, gerando um sítio de ligação de alta afinidade para axina e subsequente recrutamento da Axina para o receptor e ruptura do complexo de destruição. A β-catenina acumula-se e transloca-se para o núcleo, onde se liga a diversos parceiros de ligação ao ADN para regular a transcrição de genes alvo. Modificado de Gattinoni L, Ji Y, Restifo NP, 2010 (78).
JUSTIFICATIVA
Considerando os aspectos expostos nas sessões anteriores, a atividade da ADK é fundamental para a controle dos níveis de ADO, que cumpre funções essenciais como regulador homeostático e metabólico em todos os seres vivos. Descobertas recentes apontam que os níveis de adenosina podem desencadear alterações no epigenoma. Este efeito epigenético está diretamente relacionado a via de transmetilação e inibição de enzimas metiltransferases por SAH, metabólito que aumenta quando depuração metabólica de ADO por ADK é prejudicada. Anormalidades no perfil epigenético estão relacionadas a várias doenças, incluindo aterosclerose, câncer e doenças neurodegenerativas. Neste contexto, o uso de agentes que possam interferir na ação de enzimas que alteram a metilação do DNA tornam-se um interessante alvo terapêutico, sendo amplamente estudado. Visto que inibidores de DNMTs, tais como azacitidina e decitabina são altamente tóxicos. Inibidores de ADK poderiam ser empregados de forma alternativa como agentes reguladores da metilação do DNA. Para isso, é importante compreender a maneira pela qual aos níveis de adenosina interferem na metilação do DNA, além de investigar se a adenosina possivelmente regula a metilação do DNA de forma randômica ou em sítios específicos.
2. OBJETIVOS
Avaliar se a superexpressão ou inibição de ADK pode modular os níveis de metilação do DNA de células Hek293 Flp-in.
2.1 Objetivos específicos
• Estabelecer uma linhagem celular que superexpressa ADK. • Testar o potencial de um inibidor de ADK.
• Verificar se a regulação dos níveis de adenosina por ADK podem interferir nos níveis de metilação global do DNA.
• Identificar sítios CpGs diferencialmente metiladas no DNA de células Hek293. • Validar as vias que apresentarem genes com CpGs diferencialmente metilados.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Geração da linhagem HEK Flp-In TRex
Para estudar o papel da Adenosina Quinase na modulação da metilação do DNA em células de mamífero, foi utilizado o sistema Hek 293 Flp-In T-REx (InvitrogeN) para geração de linhagens celulares estáveis e induzíveis para superexpressão de ADK. O sistema Flp-in permitiu a integração do gene de interesse ao genoma células de mamífero, através de um sistema de recombinação proveniente de Saccharomyces cerevisiae, o qual utiliza a recombinase (Flp) e um sítio específico (FRT) de recombinação do DNA.
Este sistema utiliza quatro vetores para gerar as linhagens isogênicas que expressam o gene de interesse:
O principal deles é o pFRT/lacZeo, que é utilizado para gerar a linhagem Flp-In. Este vetor contém o gene de fusão lacZ-zeocina, cuja expressão é controlada pelo promotor SV40. Um sítio FRT é inserido downstream ao códon de iniciação ATG do gene lacZ-zeocina. O sítio FRT atua como sítio de ligação e clivagem para Flp recombinase. O plasmídeo pFRT/lacZeo é transfectado nas células de mamíferos, e os clones são selecionados quanto a resistência de zeocina. Posteriormente, essas células são transfectadas com o segundo plasmídeo pCDNA6/TR, o qual gera linhagens induzíveis por tetraciclina. O vetor pCDNA6/TR expressa constitutivamente o repressor Tet, controlado pelo promotor CMV.
O terceiro maior componente do Sistema Flp-In é o vetor de expressão pCDNA5/FRT/TO, no qual a construção da ADK long (Mouse) fusionada ao peptídeo FLAG na porção N terminal foi clonado. O vetor também contém o gene de resistência a higromicina, este gene não possui promotor e nem códon de início da tradução.
O quarto plasmídeo utilizado nesse sistema é o pOG44 encarregado pela expressão da recombinase Flp. Após estabelecer a linhagem de célula Flp in, essas células são cotransfectadas com os plasmídeos pCDNA5/FRT/TO e pOG44. Dessa forma, a recombinase Flp medeia a recombinação homóloga entre os sítios FRT do plasmídeo pCDNA5/FRT/TO e do genoma da célula Flp-In, permitindo a reconstrução do gene de resistência a higromicina. Assim as células que sofreram recombinação podem ser
selecionadas pelo antibiótico higromicina (FONTE: Flp-In System User Guide, Invitrogen).
Figura 5: O plasmídeo pFRT/lacZeo é transfectado em células Hek293 para gerar a linhagem Flp-in resistente a Zeocina. Em seguida, as colônias que apresentam apenas um sítio FRT são transfectadas com o pCDNA6/TR, gerando a linhagem resistente a tetraciclina. Posteriormente, o PCDNA5/FRT que contém o gene de interesse é cotransfectado junto ao pOG44. A recombinase Flp expressa pelo plasmídeo pOG44 catalisa a recombinação homóloga entre os síto FRT da linhagem e o vetor de expressão PCDNA5/FRT, permitindo a reconstrução do gene da higromicina e a seleção dos clones. FONTE: T-REX System User Guide, Invitrogen.
O sistema Flp-In T-REx utiliza elementos regulatórios do operon de E.coli resistentes a tetraciclina que permite regular a expressão do gene de interesse por tetraciclina. A expressão do gene de interesse presente no vetor pCDNA5/FRT/TO é controlada pelo promotor CMV, no qual foi inserido duas cópias do operador tet 2 (TetO2). Na ausência de tetraciclina, o repressor Tet (expresso a partir do vetor pCDNA6/TR) forma um homodímero que se liga a sequência TetO2, reprimindo a transcrição do gene de interesse. Após adição de tetraciclina, esta se liga com alta afinidade ao homodímero do repressor Tet, provocando uma alteração conformacional do repressor, que o torna incapaz de ligar-se ao operador Tet. Assim, torna-se possível a transcrição do gene de interesse.
Figura 6: O repressor Tet (tetR) é expresso a partir do plasmídeios pCDNA6, o qual é transfectado na linhagem Flp in para conferir resistência a tetraciclina. Os homodímeros de TetR se ligam ao sítio operador Tet (tetO2) no vetor de expressão reprimindo a transcrição do gene de interesse. Ao adicionar tetraciclina, essa se liga aos homodímeros de tetR. A ligação de tetraciclina aos homodímeros de tetR causam uma mudança conformacional no repressor, desligando-o do sítio operador Tet e permitindo a indução da transcrição do gene de interesse. FONTE: T-REX System User Guide, Invitrogen.
Após a seleção dos clones, as células foram mantidas a 37ºC, atmosfera com 5% de gás carbônico (CO2), em meio DMEM, com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina, e higromicina. Para indução da expressão da proteína ADK nas células Hek 293 Flp-In, tratou-se com tetraciclina em uma concentração final de 200 ng/µL por 48 horas. A melhor concentração de tetraciclina para indução da expressão de ADK foi determinada através de uma curva dose resposta, na qual as concentrações de 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300 e 400 ng/ml de tetraciclina foram testadas
3.2 Análise da superexpressão da ADK 3.2.1 Extração de proteínas
Para análise da superexpressão da proteína ADK-FLAG, as células Hek 293 Flp-In foram plaqueadas na concentração 3x105 em placas de 100mm, ao atingirem confluência de 50% essas células foram induzidas com 200ng/ml de tetraclina por 48 horas. Posteriormente, as células foram cuidadosamente lavadas com PBS e coletadas em tampão RIPA (50mM tris; 150mM NaCl; 1% triton; 0,1% SDS; 0,5% deoxicolato de sódio), mantidas a 4ºC por 30 minutos e centrifugadas a 13.000 g, para extração total das proteínas. O sobrenadante foi coletado, quantificado e fervido em tampão de amostra para análises por Western Blotting.
3.2.2 Western Blotting
As amostras de proteínas foram submetidas à eletroforese SDS-PAGE em gel de acrilamida 11% em tampão de corrida (4X: 200mM Tris-HCl;7,18mM EDTA; 0,4% SDS; 1,52M glicina). A eletrotransferência das proteínas do gel de acrilamida para a membrana de nitrocelulose (Immobilon-P) foi realizada por 45 minutos sob uma corrente de 20 Volts utilizadndo tampão de transferência (25mM Tris-HCl; 20% metanol; 0,02% SDS; 192mM glicina).
Posteriormente a membrana foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente com solução bloqueadora (5% de leite em pó desnatado; 150 mM NaCl; 5mM Tris- pH 7,5; 0,02% Tween) para diminuir ligações inespecíficas de anticorpos. Em seguida foi lavada por 30 minutos em TBST (150 mM NaCl; 5mM Tris- pH 7,5; 0,02% Tween). Para imuno marcação, as membranas serão incubadas overnight a 4C com o anticorpos
primário (anti ADK, anti FLAG, anti GAPDH) em tampão de anticorpo (3% de leite em pó desnatado; 150 mM NaCl; 5mM Tris- pH 7,5; 0,02% Tween). Após serem lavadas por 30 minutos em TBST, as membranas foram incubadas por 2 horas com anticorpo secundário (anti mouse, anti rabbit) diluído em tampão de antiorpo (3% de leite em pó desnatado; 150 mM NaCl; 5mM Tris- pH 7,5; 0,02% Tween). A membrana foi novamente por 30 minutos com TBS. Para a imunodetecção das bandas será utilizado kit de quimioluminescência da Pierce, de acordo com as especificações do fabricante, fotodocumentador e software Imagequant (GE).
3.2.3 Marcação das células Hek ADK Flp in por imunofluorescência
As células foram cultivadas e fixadas com uma solução fixadora (4% de paraformaldeído, 4% sacarose, 0,6% Triton X-100) por 5 minutos à temperatura ambiente, e mais 40 minutos no gelo. As células foram então lavadas três vezes com PBS gelado e incubadas com solução contendo PBS + 0,3% Triton por 5 minutos. Posteriorente, foram incubadas com solução bloqueadora (1% de BSA, 0,1% Triton X-100, 50 mM glicina) por 30 minutos e em seguida passaram por três lavagens de 5 minutos, em gelo, com solução de lavagem (1:5 da solução bloqueadora). Após fixação, permeabilização e bloqueio, as células foram incubadas com anticorpo primário anti ADK Santa Cruz Biotechnology (1:100) ou anti FLAG Sigma (1:250) por 16h a 4ºC. Posteriormente, as células foram lavadas três vezes por 5 minutos com PBS e incubadas com anticorpo secundário (Alexa 488 ou 568, INVITROGEN) na diluição de 1:100 por 2 horas à temperatura ambiente. Posteriormente, os passos de lavagem foram repetidos e as células foram incubadas com faloidina (INVITROGEN) por 1 hora à temperatura ambiente. Após a lavagem, as lamínulas foram montadas em lâmina com uso de VectaShield (+DAPI). As imagens foram adquiridas por microscopia confocal no Laboratório Nacional de Biociências (LNBIO), com o uso do microscópio confocal de varredura modelo Leica SP8.
3.3 Inibição e Dosagem de Adenosina
O composto TAKS (inibidor de ADK) foi sintetizado pela Dra. Silvana Aparecida Rocco do LNBIO. Para o ensaio de inibição de ADK, as células Hek293 Flp-in foram plaqueadas na concentração 3.105 em placas de 100mm, ao antingirem
confluência de 50% essas células foram induzidas com 200ng/ml de tetraclina por 48 horas para superexpressão de ADK. Posteriormente essas células foram tratadas com100µg de TAKS (dissolvido em DMSO) por 72 horas. Outro grupo de células foi plaqueado na mesma concentração, mas não foi induzido, ao atingirem confluência 80%, as células foram tratadas com os ou 10µg de TAKS por 72 horas. Em paralelo, células NI e IND também foram tratadas com 1% de DMSO para controle interno do veículo do inibidor.
3.3.1Coleta de células
As células foram coletadas em 10 ml de PBS-1X e centrifugadas a 1500rpm por 5 minutos, descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se as células em 1ml de PBS-1X. Foram retirados 10 µl de amostra para contagem do número total de células por citometria de fluxo. As células foram novamente cetrifugadas e ressuspendidas em 500 µl de tampão de lise contendo 50 mmol/L KH2PO4 e 25mmol/L ácido cítrico (pH 2,5).
As amostras foram incubadas a 85°C por 2 minutos e o pellet de células foi lisado por estresse mecânico (as amostras foram passadas na agulha de insulna 10-15x). As amostras foram homogenizadas por vórtex de 5 segundos e armazenadas a -80°C. Para as análises por HPLC, as amostras foram de descongeladas e filtradas em filtros Millex (Millipore, Milford, Mass, USA). Em seguida, adicionou-se 20 µl de 2-cloroacetaldeído em 200 µl de amostra, aqueceu-se por 20 minutos a 80°C.
3.3.2 Condições Cromatográficas
As corridas de cromatografia líquida foram realizadas em um equipamento Alliace série Waters 2695 (Milford, MA, USA), o qual contém uma bomba quartenária, injector e desgaseificador automáticos, e detector de fluorescência Waters 2475. A fluorescência dos compostos derivatizados (ATP, ADP, AMP e ADO) foi monitorado em comprimentos de onda de excitação e emissão fixados em 280 e 420nm, respectivamente. A separação cromatográfica dos compostos foi realizada à temperatura ambiente, utilizando uma coluna de fase reversa Cosmosil 5C18-MS (150x4.6 mm; 5µm de tamanho de partículas), protegida com uma pré-coluna (5C18-MS10x4.6 mm), ambas adquiridas da Phenomenex (Torrance, CA, USA). A coluna foi equilibrada e eluída sob
condições de gradiente, utilizando uma taxa de fluxo de 1,0 ml / min. A fase móvel usada para promover a separção cromatógrafica foi composta por metanol (A) e uma solução de 50 mmol / L de KH2PO4 e 25mmol/L de ácido cítrico (pH 4,5) (B), a qual foi preparada
diariamente e filtrada em um sistema de vácuo através de um filtro de 0,45 µm (Millipore, Milford, MA, EUA).
As condições de gradiente foram: 0-4 minutos, 2% de A; 4-12 minutos, gradiente linear de 2-15% de A; 17-18 minutos passo de recondicionamento da coluna foi de 2% de A durante 2 minutos isocráticos. O tempo total corrida cromatográfica para cada amostra foi de 20 minutos. Alíquotas de 25 ul foram injetados no sistema de HPLC. O controle do sistema, a aquisição e o processamento dos dados foram realizados através de um computador PC-Pentium IV da Dell, operado com o Microsoft Windows XP versão 2003 e o software de cromatografia Waters Empower de 2002.
A validação do método cromatográfico, incluiu um conjunto de amostras de calibração e controle de qualidade em quatro níveis. As curvas de calibração padrão para quantidades conhecidas de ATP, ADP, AMP e ADO variaram 0.016- 3.0µmol/L, eram lineares (r> 0,999) e foram descritas pela equação de regressão linear: y = 0,3536 x X - 0,03 (r = 1), em onde y é a concentração de composto em µmol /L e X é a área do pico do cromatograma.
3.4 Análise de metilação do DNA
3.4.1 Preparação das amostras para análise do perfil de metilação
O DNA foi extraído das células utilizando-se QIAamp DNA BloodMidi Kit (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. A concentração e pureza do DNA extraído foram quantificados utilizando-se o Nanodrop (Thermo Fisher Scientific). Posteriormente, 500 ng de cada amostra de DNA foram tratados com bissufito de sódio utilizando-se EZ DNA Methylation kit (Zymo Research Corp) de acordo com a recomendações do fabricante. Este tratamento possibilita a conversão de bases citosina não metiladas em uracila, enquanto as bases citosinas metiladas permanecem como citosinas. O DNA bissufito convertido foi utilizado para hibridação na plataforma Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip, seguindo o respectivo protocolo. Ambos experimentos foram processados pela Deoxi Biotecnologia (www.deoxi.com). Os dados brutos foram extraídos pelo scanner iScan SQ (Illumina) utilizando o software
GenomeStudio (v.2011.1), com o módulo de metilação v.1.9.0 (Illumina), em arquivos IDAT, que foram utilizados para análises posteriores.
3.4.2Ensaio Illumina Infinium HumanMethylation450
O ensaio Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip investiga o estado de metilação de 485.577 citosinas localizadas ao longo do genoma, das quais 482.421 (99,3%) são dinucleotídeos CpG, 3.091 (0,6%) correspondem a regiões não CpGs e 65 são SNPs (< 0.1%). Um total de 850 controles são empregados, sendo 614 controles “negativos” (79). A lâmina abrange a cobertura de 99% de genes Ref Seq, com uma média de 17,2 sondas por região gênica. dm é dividida em regiões funcionais, sendo: regiões promotoras separadas por 200 ou 1500 pb dos sítios de início de transcrição (TSS- transcription start site), respectivamente denominadas de TSS200 e TSS1500; 5’ e 3’ UTR (untranslated region), primeiro éxon, corpo de gene e região intergênica (80). A cobertura em relação as ilhas CpGs é 96% com base no banco de dados UCSC, e seu conteúdo divide-se em ilhas e regiões situadas nas margens da ilhas, denominadas de ‘shore’ (até 2000 pb da ilha), ‘shelf’ (2000 a 4000 pb) ‘open sea’ ( mais de 4000 pb) Figura7 (81).
Figura 7: Distribuição das regiões funcionais em relação ao gene, a unidade transcricional dividi-se em TSS200 e TSS1500; 5’ e 3’ UTR (untranslated region), primeiro éxon, corpo de gene e região intergênica. A cobertura em relação as ilhas CpGs divide-se em em ilhas e regiões situadas nas margens da ilhas, denominadas de ‘shore’ (até 2000 pb da ilha), ‘shelf’ (2000 a 4000 pb) ‘open sea’. Modificado de Dyson et al. 2014 (81)
Esta técnica utiliza dois tipos de ensaios químicos (Infinium I e Infinium II). Ambos são baseados numa genotipagem quantitativa do polimorfismo C/T gerado pela
conversão bissulfito de DNA. O ensaio Infinium I, segue a tecnologia de seu precursor HumanMethylation27 BeadChip, que utiliza duas sondas (uma para o alelo metilado e uma para o alelo não metilado), e extensão de base única para os dois alelos. Se o CpG alvo foi metilado na amostra, o fragmento de DNA permanecerá não convertido após tratamento de bissulfito, portanto se ligará à sonda complementar ao locus ‘metilado’ que termina com uma citosina na extremidade 3’. Na condição em que o CpG alvo não foi metilado, a ligação ocorrerá com a sonda complementar ao locus ‘não metilado’ que termina na extremidade 3’ com uma timina. A ligação de cada sonda é seguida por extensão de base única que resulte na adição de um nucleotídeo marcado por fluoróforo. Por outro lado, o ensaio Infinium II utiliza uma única sonda para ambos alelos e a extensão de base varia de acordo com o estado de metilação da molélula de DNA hibridizada. A extremidade 3’ de cada sonda Infinium II é diretamente complementar a base upstream do sítio CpG alvo . O estado de metilação é detectado por extensão de uma única base, no locus não metilado ocorre a ligação da sonda com incorporação da base A (adenina), marcada com fluoróforo vermelho, no sítio não metilado T( timina). No lucus metilado ocorre a ligação da sonda com a incorporação da base única G (guanina) corado com fluoróforo verde, no sítio metilado C (citosina) (Figura8). (80, 82, 83).
Figura 8: (A) O ensaio Inf I, utiliza duas sondas, uma para o alelo metilado (M) e uma para o alelo não metilado (U), ambos os locus incorporam o mesmo tipo de nucleotídeo, mas a ligação do lucus não metilado ocorre na sonda com base CA, o locus metilado se liga a sonda que permite a formação da base CG. (B) O ensaio Infinium II utiliza apenas um tipo de sonda que hibridiza a base antecedente ao sítio alvo, e adição de base marcada por fluoróforo. No sítio metilado ocorre a incorporação da base A (vermelho) e no sítio não metilado ocorre a incorporação da base G (verde). Modificado de Maksimovic et al, 2012 (83).
