Métodos de Pesquisa e Diagnóstico dos Vírus

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Métodos de Pesquisa e

Diagnóstico dos Vírus

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Estratégias



Isolamento em sistemas vivos



Pesquisa de antígeno viral



Pesquisa de anticorpos



Pesquisa do ácido nucléico viral (DNA ou

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Pré requisitos para um diagnóstico



Escolha do espécime adequado



Colheita no momento adequado

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Colheita de espécimes, transporte e

processamento



Colher o mais cedo possível

(fase aguda da doença)



Usar containeres adequados

(à prova de vazamento)

com identificação

(tipo material, data colheita, nome do paciente, etc)



Refrigerar todos os espécimes até o

diagnóstico

[imediatamente após a colheita – geladeira (4o_{C); freezer (-20}o_{C); [existem algumas}

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Parasita intracelular obrigatório

 Necessita de um sistema vivo para o isolamento:

cultura de células; ovos embrionados de galinha; animais de laboratório.

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Sistemas de Hospedeiro Vivos

Cultura de células

Ovos embrionados de galinha

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Detecção direta do vírus (Ag)

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Princípio da coloração negativa

A. Vaporização do metal pesado B. Formação de camada na superfície do vírus C. Qualquer objeto no caminho do vapor de metal formará uma sombra.

D. Detalhe da sombra com dois ângulos de luz

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Microscópio

eletrônico

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Detecção direta do vírus (Ag)

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Detecção direta do vírus (Ag)

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Pesquisa de antígeno viral

 Usando-se um anticorpo (Ac) obtido após a

inoculação de um animal com um antígeno (Ag) purificado conhecido.

 Ligação do Ac conhecido com o Ag na amostra

clínica.

 Visualização dessa ligação através de marcação

de um segundo Ac com substâncias cromogênicas (fluoresceína, peroxidase) ou radioativas (isótopos radioativos).

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Pesquisa de antígeno viral



Pesquisa do Ag viral em células infectadas

(reação de imunofluorescência)



Reações de aglutinação (aglutinação de

hemácias, aglutinação de látex)

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Pesquisa do DNA ou RNA viral



Pesquisa de DNA viral (Southern blot)



Pesquisa de RNA viral (Northern blot)



PCR (Reação em cadeia da polimerase)



Sequenciamento

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Thermus

acquaticus

JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p. 289-297 Vol. 98, No. I

Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a Nonsporulating Extreme Thermophile

THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE Department of Microbiology, Indiana

University, Bloomington, Indiana 47401

The isolation of a new thermophilic bacterium, Thermus aquaticus gen. n. And sp. n., is described. Successful enrichment requires incubation at 70 to 75 C, and the use of nutrient media relatively dilute with respect to the organic components.

Strains of T. aquaticus have been isolated from a variety of thermal springs in Yellowstone National Park and from a thermal spring in California. The organism has also been isolated from man-made thermal habitats, such as hot tap water, in geographical locations quite distant from thermal springs. Isolates of T. Aquaticus are gram-negative nonsporulating nonmotile rods which frequently form long filaments at supraoptimal temperatures or in the stationary phase. The optimum temperature for growth is 70 C, the maximum 79 C, and the minimum about 40 C. The generation time at the optimum is about 50 min.

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Quem inventou a PCR

Kary Mullis, geneticista Nobel Prize em Química (1993)

pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande

quantidade de um determinado fragmento de DNA

Seus estudos em 1985 permitiram amplificar o DNA

Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54

Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a

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PCR



Princípio: amplificação “in vitro” de segmentos

definidos de DNA



Acúmulo exponencial da sequência alvo ~2

n 

Reagentes:

sais

- Tris pH 8,3-8,9

- KCl

- MgCl

₂

dNTPs (ATCG)

TaqDNA polimerase

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PCR

CÉLULAS OU TECIDOS PRODUTO AMPLIFICADO ELETROFORESE EM GEL DNA de HPV Controle

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Pesquisa de anticorpos (sorologia)

 Usando-se um antígeno (Ag) viral purificado e conhecido,

obtido após a inoculação do vírus em um sistema vivo (cultura de células, ovos embrionados de galinha ou um animal).

 O Ag produzido é usado em reações para a pesquisa de

anticorpos (Ac) específicos contra este Ag no sangue do paciente.

 Ligação do Ag conhecido com o Ac na amostra clínica.  Visualização dessa ligação através de marcação de um

segundo Ac com substâncias cromogênicas (fluoresceína, peroxidase) ou radioativas (isótopos radioativos).

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Sorologia

Detecção do aumento do título de anticorpos entre as fases agudas e convalescentes da infecção, ou a detecção de infecção primária pela detecção de IgM.

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Perfil sorológico típico após uma infecção aguda

Verificar que durante a reinfecção, IgM pode estar ausente ou presente em baixos níveis

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ELISA para sorologia de HIV

Microplaca de ELISA para sorologia de HIV: poços coloridos indicam reatividade

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Western Blot para pesquisa de Acs – HIV

 1: Controle Negativo  2: Controle Positivo  3: dia 0  4: dia 2  5: dia 3  6: dia 5  7: dia 7  8: dia 12  9: dia 22  10: dia 30

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Western Blot para pesquisa de Acs

Western Blot HIV-1

 Lane1: Controle Positivo  Lane 2: Controle Negativo  Paciente A: Negativo

 Paciente B: Indeterminado  Paciente C: Positivo

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Uso dos métodos diagnósticos



Identificação/confirmação da presença

do agente.



Relação do agente com determinado

quadro clínico.

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O que a nossa mente vê?



As coisas são o que parecem ser.



As coisas são e não parecem ser.



As coisas não são, mas parecem ser.



As coisas não são nem parecem ser.

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Relação entre SER e PARECER

SER

PARECER

+ -

+ As coisas são o que

parecem ser

As coisas são são, mas parecem ser

- As coisas são mas

não parecem ser

As coisas não são nem parecem ser

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Relação entre teste diagnóstico e

agente microbiano pesquisado

AGENTE MICROBIANO (vírus)

TESTE

+ -

+ Verdadeiro positivo Falso positivo

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Sensibilidade e Especificidade

AGENTE MICROBIANO (vírus)

Presente Ausente TOTAL

TESTE + (a) verdadeiro positivo (b) falso positivo a + b - (c) falso negativo (d) verdadeiro negativo c + d TOTAL a + c b + d a + b + c + d Sensibilidade = a / (a + c) Especificidade = d / (b + d)

Sensibilidade: é a probabilidade de um teste dar positivo na presença do vírus, isto é, avalia a capacidade do teste detectar o vírus quando este está presente. Especificidade: é probabilidade de um teste dar negativo na ausência do vírus, isto é, avalia a capacidade do teste negativar quando o vírus está ausente

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Qual teste diagnóstico devo usar?



Sensíveis

 Usados para o diagnóstico de vírus associados a

doenças potencialmente graves

 Usado no rastreamento de doenças em uma

população



Específicos

 Usados para os casos quando um resultado falso

positivo pode ser muito prejudicial

 Confirma um diagnóstico sugerido por outros

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VANTAGENS DESVANTAGENS

Isolamento do vírus

- permite futuro estudo do

agente.

- geralmente sensível para

alguns vírus.

- demora no diagnóstico.

- alguns vírus não são

cultiváveis.

Pesquisa de antígeno

-ME: diagnóstico rápido e

detecta vírus não cultiváveis.

-Permite distinguir sorotipos

diferentes.

-não é aplicável a todos os vírus.

Pesquisa de ácidos

nucléicos

-PCR: método rápido e sensível.

- potencialmente aplicável a

todos os vírus.

- PCR: risco de contaminação

por DNA (falsos positivos).

-PCR: requer conhecimento da

sequência alvo a ser

amplificada. Pesquisa de anticorpos -método rápido. -útil em acompanhamento de surtos na população.

- podem ocorrer falsos