UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Veterinária

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Programa de Pós-Graduação em Veterinária

Dissertação

Avaliação de uma vacina de aplicação intravaginal contra o

Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) associada a subunidade B

recombinante da enterotoxina termolábil de Escherichia coli

(rLTB)

Bianca Sica Siedler

BIANCA SICA SIEDLER

Avaliação de uma vacina de aplicação intravaginal contra o Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) associada a subunidade B recombinante da

enterotoxina termolábil de Escherichia coli (rLTB)

Orientador: Prof. Dr. Geferson Fischer

Co-Orientador (es): Dra. Sonia Alejandra Romera Dr. Fabricio Rochedo Conceição

Pelotas, 2012

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área do conhecimento: Veterinária Preventiva).

Dados de catalogação na fonte:

Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel

S571a Siedler, Bianca Sica

Avaliação de uma vacina de aplicação intravaginal contra o Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) associada a subunidade B recombinante da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (rLTB) / Bianca Sica Siedler. – Pelotas, 2012. – 74f. : gráf. – Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Área de concentração: Veterinária preventiva. Universidade Federal de Pelotas. Faculdade de Veterinária. Pelotas, 2012. - Orientador Geferson Fischer ; co-orientador Sonia Alejandra Romera, Fabrício Rochedo Conceição.

1.Veterinária. 2.Imunidade de mucosas. 3.Vacina intravaginal. 4.BoHV-5. I.Fischer, Geferson. II.Romera, Alejandra. III.Conceição, Fabrício Rochedo. IV.Título.

Banca examinadora:

Prof. Dr. Geferson Fischer – Universidade Federal de Pelotas (Orientador)

Profa. Dra. Silvia de Oliveira Hübner – Universidade Federal de Pelotas

Prof. PhD. Fábio Pereira Leivas Leite – Universidade Federal de Pelotas

Profa. Dra. Cláudia Hartleben – Universidade Federal de Pelotas

Para meus pais, com eterna gratidão,

Agradecimentos

Aos meus pais, Antônio e Sandra, pelo incentivo em todos os momentos, especialmente nos mais difíceis, e apoio incondicional. O que sou hoje devo a vocês!

Ao meu orientador Geferson Fischer pela disposição, exemplo de dedicação e ensinamentos.

À minha co-orientadora, Alejandra Romera, por ter me recebido de forma tão carinhosa em seu laboratório e pela disposição em sempre me ajudar no que fosse necessário.

Aos professores, funcionários e amigos do Laboratório de Virologia e Imunologia da UFPel, pela atenção, ensinamentos, carinho e incentivo.

Ao pessoal do Instituto de Virologia do INTA, em especial às minhas companheiras do “Lab J”, Cintia e Silvina, pela amizade e companheirismo durante os meses de convivência. Se les extraña!

Aos colegas e amigos do Núcleo de Biotecnologia – CDTec, UFPel, principalmente ao professor Fábio Leivas Leite, por ter colocado o seu laboratório a disposição; Tiago Collares e Fabiana Seixas, por disponibilizarem a estrutura de seus laboratórios; Vinicius Campos, pelo auxílio e ensinamentos.

Aos meus grandes amigos, Ana Rita, Izabel e Gustavo, pelo incentivo e otimismo de vocês e, principalmente, por essa amizade!

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de estudos.

Enfim, a todos que colaboraram de alguma forma na execução deste trabalho.

“Es en el alma donde nacen las respuestas, cierra los ojos y verás. Es tu ideal, es tu pasión, lo que te mueve a ser mejor, aún mejor... Los desafíos no se enfrentan desde afuera ni desde la oscuridad. La vida es nada si no hay sueños y una luz en el final que alcanzar”.

RESUMO

SIEDLER, Bianca Sica. Avaliação de uma vacina de aplicação intravaginal

contra o Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) associada a subunidade B recombinante da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (rLTB). 2012. 74f.

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

O sistema imune de mucosa representa a barreira inicial frente a diversos patógenos que utilizam estas superfícies como porta de entrada no organismo, como é o caso dos herpesvírus bovinos (BoHV). Estes vírus utilizam as mucosas, principalmente nasal e genital, como ponto inicial de replicação, seguida de disseminação local, viremia sistêmica e disseminação neuronal. Mecanismos inatos de defesa em cooperação direta com mecanismos adaptativos conferem proteção a estas mucosas. A IgA secretora (sIgA) representa um papel fundamental na imunidade humoral destes locais, conferindo proteção a estas superfícies através de distintos mecanismos, incluindo a neutralização viral. Este anticorpo predomina na mucosa vaginal de bovinos, sendo essencial na defesa local frente a patógenos de transmissão genital. Devido a grande importância das vias mucosas na transmissão dos BoHV, torna-se evidenciado o interesse no desenvolvimento de vacinas que propiciem imunidade de mucosa contra estes agentes etiológicos. No presente estudo, oito fêmeas bovinas foram divididas em dois grupos (G1 e G2) e inoculadas por via intravaginal com BoHV-5 inativado associado à subunidade B recombinante da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (rLTB) e xantana (G1) e BoHV-5 inativado associado a xantana (G2). A resposta humoral (IgA e IgG) local e sistêmica induzida nos animais inoculados foi mensurada através do teste de ELISA indireto. A vacina avaliada demonstrou-se capaz de incrementar os níveis de IgA e IgG no soro e nas mucosas nasal e vaginal dos bovinos imunizados. A expressão relativa das interleucinas 2 e 13 (IL-2 e IL-13) foi avaliada através da técnica de real time RT-PCR, a partir dos leucócitos dos animais vacinados, resultando em aumento na expressão de mRNA destas citocinas nos animais inoculados com a vacina experimental. Estes dados comprovam a capacidade da vacina de aplicação intravaginal em bovinos de estimular uma resposta imune local e sistêmica, além de corroborar a atividade imunoestimulante em mucosas da rLTB e também validar a utilização da xantana como sistema de entrega de vacinas de aplicação intravaginal. Portanto, esta via de administração de vacinas torna-se uma alternativa interessante, principalmente quando se objetiva gerar proteção local contra patógenos que utilizam as superfícies mucosas como porta de entrada no organismo.

Palavras chave: Imunidade de mucosas. Vacina intravaginal. BoHV-5.

ABSTRACT

SIEDLER, Bianca Sica. Avaliação de uma vacina de aplicação intravaginal

contra o Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) associada a subunidade B recombinante da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (rLTB). 2012. 74f.

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

Mucosal immune system represents the initial barrier against many pathogens, including bovine herpesviruses (BoHV). After infection of mucous membranes, mainly nasal and genital, these viruses disseminate locally followed by viremia and neural spread. Innate defense mechanisms along with adaptive immunity confer protection to mucosal surfaces. In this context, secretory IgA (sIgA) plays an essential role in the mucosal humoral immunity, conferring protection to these body surfaces through different mechanisms, including viral neutralization. This class of antibody predominates in the vaginal mucosa of cattle playing an important role in the local defense against infections. Considering the importance of this infection route in herpesviruses pathogenesis, there is a growing interest in the development of vaccines that provide mucosal immunity against these viruses. In the present study, eight cows were divided in two groups (G1 and G2) and inoculated intravaginally with inactivated BoHV-5 associated with recombinant Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit (rLTB) and xanthan (G1) and inactivated BoHV-5 associated with xanthan (G2). Local and systemic humoral immune response (IgA and IgG) induced after inoculation was measured by indirect ELISA. An increment in the levels of IgA and IgG was detected in sera, nasal and genital mucosa of all the immunized animals. Furthermore, the relative expression of interleukins 2 and 13 (2 and IL-13) was investigated by real-time PCR indicating an increased mRNA expression of these cytokines in leukocytes collected from animals immunized with the experimental vaccine. These results demonstrate that the experimental intravaginal BoHV-5 vaccine induced a local and systemic immune response in cattle. The results also corroborated the immunostimulant activity of the rLTB in mucosal membranes and confirmed the use of xanthan as a delivery system for intravaginal vaccines. Our data also reinforce the importance of this route for administration of vaccines focused on providing local protection against pathogens.

Lista de Figuras

ARTIGO 2 Imunogenicidade de uma vacina inativada contra o BoHV-5 associada a rLTB e xantana de aplicação intravaginal

Figura 1 Níveis sistêmicos de IgA e IgG mensurados por ELISA

indireto ... 66

Figura 2 Níveis nasais de IgA e IgG mensurados por ELISA

indireto ... 67

Figura 3 Níveis vaginais de IgA e IgG mensurados por ELISA

indireto ... 68

Figura 4 Níveis de expressão relativa de mRNA para IL-2 ... 69

Sumário

1 INTRODUÇÃO GERAL ... 10

2 ARTIGO 1 ... 15

Resumo ... 17

Imunidade nas mucosas ... 17

IgA ... 19

Imunidade de mucosa e vacinas ... 20

Considerações finais ... 24 Referências ... 25 3 ARTIGO 2 ... 32 Resumo ... 34 Introdução ... 35 Material e Métodos ... 38 Resultados ... 44 Discussão ... 45 Agradecimentos ... 49 Referências ... 49 4 CONCLUSÃO GERAL ... 66 5 REFERÊNCIAS GERAIS ... 67

1. INTRODUÇÃO GERAL

Os herpesvírus bovinos tipo 1 (BoHV-1) e tipo 5 (BoHV-5) pertencem à ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae (DAVISON et al., 2009), e apresentam genoma constituído por uma fita dupla de DNA (CERQUEIRA et al., 2000). O BoHV-1 é um importante patógeno que afeta os bovinos podendo causar doença respiratória, conhecida como rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), conjuntivite, vulvovaginite pustular infecciosa (IPV), balanopostite pustular infecciosa (IPB), reabsorção embrionária, aborto, infertilidade temporária, nascimento de animais fracos e meningoencefalite (VIEIRA et al., 2003). O BoHV-5 é o agente etiológico da meningoencefalite herpética (ROELS et al., 2000), enfermidade de curso geralmente fatal, que atinge principalmente animais jovens (GOMES et al., 2002). Quando acomete animais adultos, leva ao desenvolvimento de infecção subclínica ou enfermidade moderada (ASHBAUGH et al., 1997; CASCIO et al., 1999; DEL MÉDICO ZAJAC et al., 2006).

Estes vírus estabelecem latência no hospedeiro, quando se instalam em gânglios nervosos, olfatório, trigêmeo ou sacral, dependendo do local da infecção (MEYER et al., 2001), não sendo detectados pelos exames tradicionais. Uma vez estabelecida a latência, o animal pode, periodicamente, re-excretar o vírus através das secreções, disseminando-o para bovinos suscetíveis, o que faz com que os surtos sejam imprevisíveis, especialmente em áreas endêmicas (VOGEL et al., 2003). Os BoHV apresentam distribuição mundial, e o BoHV-5, geograficamente, está mais restrito à América do Sul, principalmente Brasil e Argentina (DEL MÉDICO ZAJAC et al., 2010; MAIDANA et al., 2011). Estudos objetivando estimar a soroprevalência destes vírus foram realizados nos estados de Goiás (BARBOSA et al., 2005) e Rio Grande do Sul (QUINCOZES, 2005; SIEDLER et al., 2008; HOLZ et al., 2009), utilizando a técnica de soroneutralização. Os resultados destes levantamentos sorológicos variaram entre 27,2% de animais soropositivos no Rio Grande do Sul (SIEDLER et al., 2008) a 51,9% no estado de Goiás (BARBOSA et al.,

2005). O percentual de propriedades com pelo menos um animal soropositivo situou-se entre 57,7% nos municípios do Rio Grande do Sul (HOLZ et al., 2009) e 98,5% em Goiás (BARBOSA et al., 2005), o que reflete a disseminação destes vírus nos rebanhos brasileiros.

A infecção pelos BoHV ocorre através de cavidades revestidas por células epiteliais de mucosa, como a cavidade nasal, orofaringe, conjuntiva e trato genital (ENGELS & ACKERMANN, 1996). Após a replicação inicial, sucedem-se disseminação local, viremia sistêmica e disseminação neuronal (PASTORET et al., 1982; ENGELS & ACKERMANN, 1996). A disseminação local na mucosa infectada ocorre através de dois mecanismos: infecção de células epiteliais suscetíveis pelas partículas virais livres no meio extracelular e disseminação direta através de células infectadas a outras células próximas (PASTORET et al., 1982; ENGELS & ACKERMAN, 1996). Ao atingirem os neurônios locais os BoHV podem chegar ao sistema nervoso central (SNC), ocasionando meningoencefalite fatal (BELKNAP et al., 1994; MEYER et al., 2001; PEREZ et al., 2002) ou infecção subclínica (ASHBAUGH et al., 1997; CASCIO et al., 1999; VOGEL et al., 2003). A transmissão dos BoHV ocorre através do contato direto entre animais infectados e suscetíveis, mediante a inalação de aerossóis contaminados e, indiretamente, por meio da ingestão de água e alimentos contaminados (MUYLKENS et al., 2007). O contato entre as mucosas genitais durante a monta natural também é responsável pela transmissão do vírus, mas não é o único fator de importância, visto que a infecção de vacas suscetíveis através de sêmen contaminado durante a inseminação artificial já foi relatada (KUPFERSCHMIED et al., 1986; OLIVEIRA et al., 2011).

O controle dos BoHV tem sido realizado através da vacinação (VAN OIRSCHOT et al., 1996). As vacinas disponíveis comercialmente no Brasil são, em sua grande maioria, inativadas e formuladas com cepas de BoHV-1, devido a identidade aminoacídica de aproximadamente 82% entre as proteínas dos BoHV-1 e BoHV-5, sendo as proteínas mais semelhantes (≥95% de identidade) as envolvidas na replicação do DNA e processamento das proteínas dos vírions (DELHON et al., 2003). Esta relação antigênica, segundo Del Médico Zajac et al. (2006), reflete-se em proteção cruzada in vivo em animais vacinados contra o BoHV-1 e desafiados com BoHV-5. Porém, alguns estudos

relatam proteção insuficiente induzida por vacinas contra BoHV-1 frente desafio com vírus não homólogo (CASCIO et al, 1999; SILVA et al., 2006), enfatizando a necessidade do desenvolvimento de vacinas específicas para o BoHV-5, a fim de prover uma maior proteção frente a este agente. As vacinas atenuadas são geralmente associadas à maior indução de proteção quando comparadas a vacinas inativadas (BOSCH et al., 1996; PATEL, 2005). Em relação às vacinas vivas, uma característica importante é a possibilidade de reversão da virulência, relacionando vacinas atenuadas contra o BoHV-1a abortos, quando administradas em fêmeas prenhes, e a casos de imunossupressão (JONES & CHOWDHURY, 2008), o que limita seu uso. As vacinas inativadas, por sua vez, são consideradas seguras, visto que não revertem à forma virulenta. No entanto, requerem a incorporação de substâncias adjuvantes ou imunoestimulantes para potencialização da resposta imune (COX et al., 1993; JONES & CHOWDHURY, 2008).

A subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB) é uma potente molécula sinalizadora, capaz de modular a resposta do sistema imunológico (SIMMONS et al., 2001), resultando em imunossupressão ou imunoestimulação. Fischer et al. (2010) relataram efeito da dose e via de inoculação na capacidade imunoestimulante desta substância. Além disso, outros estudos demonstram potente capacidade imunoestimulante da imunidade de mucosa em diversos modelos animais, quando administrada diretamente nas mucosas ou por via parenteral (SIMMONS et al., 2001; YAMANAKA et al., 2006). No entanto, quando o objetivo é incitar uma resposta imune contra agentes que utilizam as superfícies mucosas como ponto inicial de colonização e/ou porta de entrada no organismo, como é o caso dos BoHV, deve-se priorizar a estimulação local destas superfícies, através da inoculação de vacinas por via mucosa (NEUTRA & KOZLOWSKI, 2006), visto que vias sistêmicas geralmente induzem uma pobre resposta imune nestas superfícies (BRANDTZAEG, 2007; HOLMGREN & CZERKINSKY, 2005).

A imunidade humoral local, mediada principalmente por IgA secretora (sIgA), tem fundamental importância na defesa das mucosas, pois confere proteção a estas superfícies através de distintos mecanismos, como neutralização viral (TAMURA et al., 1990; RENEGAR & SMALL, 1991; RUSSELL & KILIAN, 2005) e de toxinas (RUSSELL & KILIAN, 2005), além de

possuir atividade antibacteriana (RENEGAR & SMALL, 1991; WINNER III et al., 1991), através da exclusão imune/antigênica (BRANDTZAEG, 2007). Portanto, na escolha da via mucosa de administração da vacina a ser empregada, deve-se avaliar o provável local de ingresso do patógeno no organismo (NEUTRA & KOZLOWSKI, 2006), a fim de estimular uma resposta imune neste sítio. Para tanto, deve-se considerar o sistema de mucosas como um sistema integrado, onde os linfócitos T e B ou células apresentadoras de antígeno (APCs) ativadas em um determinado sítio indutor podem migrar através dos vasos linfáticos para outro sítio efetor nas mucosas (BERGQUIST et al., 1997), com consequente secreção de IgA específica em outro local que não aquele onde ocorreu o estímulo antigênico primário (MESTECKY, 1987). Esta relação é observada entre as mucosas nasal e vaginal (GALLICHAN & ROSENTHAL, 1995; PARR & PARR, 1999; GALLICHAN et al., 2001), o que torna a via intravaginal de inoculação de vacinas promissora na indução de uma resposta imune contra agentes que utilizem estas mucosas, nasal e vaginal, como porta de entrada no organismo, como os BoHV.

Um grande desafio no desenvolvimento de vacinas de mucosa, porém, é representado pelos mecanismos de defesa inata do organismo. Ao ser depositado diretamente em uma superfície mucosa, o antígeno pode ser diluído nas secreções locais, capturado por muco, atacado por proteases e nucleases, além de sofrer exclusão pelas barreiras epiteliais (NEUTRA & KOZLOWSKI, 2006). Por essa razão, é imprescindível a associação do antígeno a substâncias capazes de burlar pelo menos alguns destes mecanismos de defesa. Segundo Pavot et al. (2012) a formulação da vacina de mucosa ideal deve ser capaz de (1) proteger o antígeno vacinal da degradação enzimática e química, (2) limitar sua eliminação ou diluição excessiva no organismo, (3) facilitar a absorção do antígeno pelas células M especializadas do NALT (tecido linfoide associado aos tecidos nasais e faringeanos)/GALT (tecido linfoide associado ao intestino)/BALT (tecido linfoide associado aos brônquios) a fim de possibilitar sua captura pelas APCs, (4) facilitar a captura do antígeno e adjuvante pelas APCs, visando estimular uma resposta imune adequada, composta por sIgA neutralizante e/ou linfócitos T auxiliares (CD4+) e citotóxicos (CD8+). Portanto, sistemas de entrega (“delivery systems”) e imunoestimulantes vêm sendo estudados a fim de incrementar a resposta

imune às vacinas de mucosa (O'HAGAN & VALIANTE, 2003; REED et al., 2009). Dentre eles encontram-se lipossomas, virossomas, microesferas, compostos imunoestimulantes (ISCOMs) e pseudovírus ou partículas semelhantes aos vírus (virus-like particles - VLPs) (MESTECKY et al., 1997; PAVOT et al., 2012), óvulos e géis (ANSEL et al., 2000; ILLUM et al., 2001).

A xantana, um biopolímero produzido pela bactéria Xanthomonas

campestris, foi a substância avaliada neste estudo como sistema de entrega do

antígeno. Este biopolímero é muito utilizado na indústria de alimentos como agente de suspensão, espessante, emulsificante e estabilizante, devido as suas propriedades reológicas únicas (PALANIRAJ & JAYARAMAN, 2011). A xantana vem sendo estudada como sistema de entrega de drogas, por ser atóxica, apresentar excelente estabilidade em soluções ácidas e alcalinas (D’CRUZ & UCKUN, 2001; PALANIRAJ & JAYARAMAN, 2011), ser consideravelmente resistente ao calor, enzimas bacterianas e degradação por exposição a luz UV (SUDHAKAR et al., 2006). Além disso, possui propriedades bioaderentes (D’CRUZ & UCKUN, 2001) que são de extremo interesse por prolongarem o tempo de exposição do antígeno às células efetoras do sistema imune, ponto crítico na indução de uma resposta efetiva nas superíficies mucosas (WALKER, 1994). O objetivo deste estudo foi avaliar a imunogenicidade de uma vacina inativada contra o BoHV-5 associada à LTB recombinante (rLTB), de aplicação intravaginal em bovinos, utilizando xantana como veículo vacinal. Para tal foram mensurados níveis de IgA e IgG locais e sistêmicos, além da expressão relativa de mRNA (RNA mensageiro) para as citocinas IL-2 e IL-13.

2. ARTIGO 1

Imunidade de mucosa: características e indução vacinal

(Artigo científico a ser submetido ao periódico

Imunidade de mucosa: características e indução vacinal

Bianca Sica Siedler*, Gilberto D´Avila Vargas, Silvia de Oliveira Hübner, Geferson Fischer

Laboratório de Virologia e Imunologia, Faculdade de Veterinária, UFPel, Campus Universitário, Caixa Postal 354, 96010-900, Pelotas, RS, Brasil

___________________

*Autor para correspondência. Rua Fernando Ferrari, 52, 96080-090, Pelotas, RS, Brasil. Tel +55 53 32757498; FAX +55 53 32757498 E-mail: bisiedler@hotmail.com (B. S. Siedler)

Resumo

As superfícies mucosas representam a porta de entrada de inúmeros micro-organismos nocivos à saúde animal e humana. A resposta imune humoral, mediada por sIgA, tem um papel importante na defesa destas superfícies, pois é capaz de impedir o ingresso dos patógenos no organismo. Vacinas de aplicação local vêm sendo estudadas a fim de estimular uma resposta imune eficiente nas mucosas, visto que as vacinas convencionais, de aplicação parenteral, tendem a incitar uma resposta sistêmica em detrimento à resposta local. As vacinas de aplicação local são capazes de gerar uma resposta imune na mucosa de aplicação e sítios correspondentes, já que o sistema de mucosas é um sistema integrado, o que representa uma importante vantagem na escolha da via de inoculação a ser empregada. Esta revisão tem como objetivo elucidar alguns conceitos referentes à imunidade das mucosas de um modo geral e, além disso, pretende aclarar o quê vem sendo estudado em relação a vias mucosas de administração de vacinas, imunomoduladores e sistemas de entrega (“delivery systems”) de antígenos. Palavras chave: imunidade de mucosas; vacinas; vias de administração; imunomoduladores; sistemas de entrega.

1. Imunidade nas mucosas

Uma grande variedade de micro-organismos utiliza as superfícies mucosas como ponto inicial de colonização e/ou porta de entrada no organismo [1] devido à vulnerabilidade deste tecido [2] que consiste, em sua maior parte, de uma monocamada de células epiteliais [1]. O sistema imune de mucosa representa a barreira inicial frente a esses patógenos [3,4], através de mecanismos inatos de defesa, em cooperação direta com mecanismos adaptativos [1].

As mucosas dos tratos respiratório, gastrointestinal e urogenital são separadas do exterior por delicadas barreiras de tecido epitelial [2], e dotadas de eficientes mecanismos físicos e químicos de expulsão, que degradam e repelem substâncias estranhas ao organismo. Estes mecanismos inatos, associados à resposta adaptativa altamente especializada, protegem o organismo contra potenciais ameaças exteriores [5]. Em contraste às condições estéreis proporcionadas pelo sistema imunológico na grande maioria dos órgãos, o tecido imune associado às mucosas (MALT) possui um microambiente distinto [6], repleto de substâncias estranhas ao organismo [5] e características imunológicas que o tornam único frente aos outros tecidos [6]. O MALT consiste em um sistema altamente compartimentalizado e funciona, essencialmente, de forma independente ao sistema imune sistêmico. A maior parte deste tecido é constituída por GALT, tecido linfóide associado ao intestino, que engloba as Placas de Peyer no íleo distal, o apêndice e numerosos folículos linfóides isolados. Este tecido epitelial contém células M , que variam em número dentro das diferentes espécies e de acordo com o grau de atividade estimulatória [7]. Estas células especializadas também estão presentes no epitélio respiratório [8] e diferem das células absortivas por não secretarem muco, apresentarem formato achatado e sem microvilosidades, e sua membrana basolateral formar estruturas semelhantes a bolsas que contém linfócitos T e B e células dendríticas (DCs) [9]. As células M transportam efetivamente antígenos vivos e antígenos não replicantes da luz do órgão até o folículo linfóide, sem

degradá-los. Ao chegarem ao folículo, os antígenos são capturados por células apresentadoras de antígenos (APCs), como as DCs, e apresentados aos linfócitos T auxiliares (CD4+) e citotóxicos (CD8+) que estão localizadas nos sítios de indução (local de encontro com o antígeno) [5], dando início a uma resposta específica [10]. Diversos agentes infecciosos enteropatogênicos utilizam as células M como porta de entrada no organismo, evidenciando certa vulnerabilidade na superfície epitelial intestinal. Porém, estas lacunas na barreira epitelial são de grande importância na indução da resposta imune desta mucosa [1]. Também fazem parte do MALT o tecido linfóide associado aos tecidos nasais e faringeanos (NALT) [11-15] e o tecido linfóide associado aos brônquios (BALT), este último não encontrado, em condições normais, em pulmões humanos adultos [16].

As superfícies mucosas podem ser classificadas em tipos I e II. O tipo I está presente no intestino e pulmões, sendo coberto por epitélio cúbico simples, enquanto o tipo II é encontrado na vagina, olhos e cavidade oral, sendo caracterizado por uma camada protetora de epitélio escamoso estratificado [17]. Outras importantes diferenças entre os dois tipos de mucosa referem-se à presença (tipo I) ou ausência (tipo II) de mecanismos de transporte de IgA, além das distintas composições celulares, considerando-se a presença (tipo I) ou ausência (tipo II) de tecidos linfoides associados à mucosa. Geralmente, a submucosa das mucosas tipo I é constituída por um grande número de DCs, macrófagos e linfócitos de memória, enquanto a submucosa das mucosas tipo II contém um repertório escasso de DCs e macrófagos, além de raros linfócitos. O trato genital feminino humano é constituído pelos dois tipos de mucosa, apresentando o tipo II na vagina externa, interna e ectocérvix, e tipo I na endocérvix e útero. Neste último, podem-se observar agregados linfóides de função desconhecida, compostos por um núcleo de linfócitos B circundado por linfócitos T CD8+. Estes agregados expandem-se durante a fase secretória [18]. Considerações sobre a constituição das mucosas do trato genital feminino bovino são escassas na literatura. Entretanto, Leung et al. (2000) descrevem a distribuição de células imunológicas no útero, enfatizando as grandes concentrações de linfócitos B, linfócitos T CD4+ e macrófagos no estroma subepitelial uterino, em relação ao endométrio e miométrio. É possível que estas células formem agregados linfóides semelhantes aos encontrados no útero humano.

A resposta imune nas mucosas é regulada pela natureza do antígeno, tipo de APC envolvida e microambiente local. A maioria dos antígenos não patogênicos, como as proteínas alimentares, acarreta a formação de linfócitos T helper tipo 2 (Th2) através das DCs e outras APCs, além da regulação da resposta das células T [20], o que resulta em uma supressão ativa da imunidade sistêmica, ou “tolerância oral” [5].

Após a sensibilização de linfócitos B e T no sítio de indução, ocorre circulação destas células via vasos linfáticos e sanguíneos, com consequente colonização da mucosa correspondente, onde se diferenciam em células efetoras e de memória [5]. A ativação de linfócitos B pode ocorrer através de variados mecanismos. Algumas substâncias microbianas são consideradas superantígenos, devido a sua capacidade de interagir diretamente com o receptor das células B (BCR) [1], sem o envolvimento de células T CD4+. O protótipo de superantígeno é a proteína A do Staphylococcus aureus que, após ligação cruzada, ocasiona uma forte resposta policlonal [21]. Outras substâncias microbianas, conhecidas como antígenos T-independentes tipo 1 (TI-1), incluindo açúcares, estruturas lipídicas e alguns ácidos nucléicos, são diretamente mitogênicos quando em contato com linfócitos B. Os antígenos T-independentes tipo 2 (TI-2), por sua vez, não são mitogênicos por natureza, porém, causam extensas ligações cruzadas através de repetidos epítopos em contato com BCRs. Há diferenças notáveis

entre antígenos TI-1 e TI-2 em diferentes espécies, como por exemplo o lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano, que age como antígeno TI-1 em células B de camundongose como antígeno TI-2 em linfócitos B humanos [1].

A imunidade humoral é mediada por anticorpos específicos secretados por células B diferenciadas, conhecidas como plasmócitos. Os plasmócitos residem em certos tecidos e provém da estimulação antigênica de células B inativas ou de memória, evento este que ocorre nos órgãos linfóides secundários, como baço e linfonodos. Em resposta à ligação antigênica às imunoglobulinas de superfície das células B virgens, estas iniciam um processo de divisão e diferenciação em células B de memória ou secretoras (plasmócitos). Os primeiros plasmócitos formados, responsáveis pela resposta humoral primária, secretam IgM, anticorpo de baixa afinidade com o antígeno [22].

Após a co-estimulação de células B ativas por linfócitos T auxiliares CD4+, através da secreção de citocinas [23], ocorre formação de centros germinativos, onde se dão a troca de classe de imunoglobulinas, maturação da afinidade e hipermutação somática. O resultado destas modificações evidencia-se na geração de células B de memória e plasmócitos que sintetizam anticorpos de alta afinidade. Estes plasmócitos podem permanecer no tecido linfóide secundário de origem, o que é particularmente comum no caso de plasmócitos que secretam imunoglobulina M (IgM), ou trafegar via linfa eferente até o sangue a fim de colonizar locais distantes [15,24].

O isotipo da imunoglobulina secretada pelo plasmócito é determinado pelo local de apresentação do antígeno pelas APCs, assim como a natureza da estimulação antigênica, e ambos, o local de indução e o isotipo expresso, determinarão o tecido para o qual estes plasmócitos serão destinados [22]. As células B ativas sofrem mudança de classe de imunoglobulinas ao serem estimuladas por determinadas citocinas secretadas pelos linfócitos T auxiliares, como por exemplo IL-5 e TGF-β, que levam a secreção de imunoglobulina A (IgA) [25], anticorpo predominante nas secreções mucosas [26,27].

2. IgA

A produção de IgA nos mamíferos não ruminantes supera os demais isotipos, sendo o anticorpo dominante nas membranas mucosas, em contraste com a imunoglobulina G (IgG), predominante na imunidade humoral sistêmica [28,29]. Nos ruminantes a IgG1 representa um importante papel na defesa das superfícies mucosas, principalmente na glândula mamária, onde é encontrada em quantidades superiores à IgA [30]. Nos bovinos há predominância de IgA na mucosa vaginal, enquanto IgG predomina no útero. Apenas uma fração de IgG1 encontrada neste local provém do endométrio, sendo o restante, além da IgG2, derivados da circulação periférica; a IgA presente na secreção vaginal é secretada no útero [31,32].

Os monômeros de IgA possuem um peso molecular de 150 kDa, mas esta imunoglobulina normalmente é secretada como um dímero e, ocasionalmente, como polímero [27]. No caso da IgA dimérica, as moléculas se combinam com uma cadeia J, um polipeptídeo sintetizado por células secretoras de anticorpos, ligando um domínio Ca2 de uma molécula ao domínio Ca3 da outra molécula [33]. Além de unir os monômeros de IgA, a cadeia J interage com o receptor de imunoglobulina polimérica (pIgR), uma glicoproteína transmembrana transportadora de anticorpos, expressa na superfície basolateral de células epiteliais de mucosa [34]. O pIgR transporta a IgA através das células epiteliais por um processo de transcitose que culmina com a translocação de complexos IgA secretora (sIgA) à superfície mucosa [28]. Estes complexos compreendem uma peça secretora originada da clivagem endocítica do pIgR,

conferindo propriedades mucofílicas à sIgA [35, 36], incluindo resistência a degradação em ambiente rico em proteases, como é o caso das superfícies mucosas [37]. Esta resistência à degradação enzimática também se deve ao alto grau de glicosilação durante sua síntese [29] e tem grande importância no trato gastrointestinal, devido à presença de enzimas proteolíticas como pepsina, tripsina e quimotripsina neste meio [38].

A IgA humana é a mais amplamente estudada e caracterizada, consistindo de duas subclasses denominadas IgA1 e IgA2 [39-41]. Segundo Pakkanen et al. (2010), 71% dos plasmócitos secretores de IgA circulantes sintetizam IgA1, subtipo predominante no soro sanguíneo, lágrimas, fluido nasal e saliva. Em contrapartida, a IgA2 é encontrada em maior quantidade nos tratos intestinal e genitourinário, comumente colonizados por micro-organismos comensais [43-45]. Os níveis de IgA1 e IgA2 são proporcionalmente equivalentes no fluido vaginal. Estas subclasses distinguem-se, estruturalmente, quanto ao tamanho da região de dobradiça, mais longa na IgA1 [46], o que ocasiona maior suscetibilidade à proteases bacterianas que têm como alvo a região de dobradiça das imunoglobulinas [38,47]. Quanto a IgA2, a presença de cadeias especiais de carboidratos, além de região de dobradiça pouco flexível ou ausente, conferem proteção contra enzimas proteolíticas [48]. A distribuição das subclasses nas secreções é determinada pela natureza do antígeno encontrado no local e pelos estímulos específicos fornecidos aos linfócitos locais [42].

A sIgA confere proteção às membranas mucosas através de distintos mecanismos, como neutralização viral [49-51] e de toxinas [50], além de possuir atividade antibacteriana [53,54], através da exclusão imune/antigênica [1]. Esta última baseia-se em uma atividade antagonista entre sIgA e bactérias patogênicas, resultando em decréscimo na adesão destas bactérias às células epiteliais [53,54]. Porém, micro-organismos como Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria

meningitidis, e Neisseria gonorrhoeae desenvolveram mecanismos capazes de burlar

esta atividade, através da produção de proteases capazes de clivar IgA1 [55]. Contudo, também se observa esta atividade antagonista em relação às bactérias comensais do organismo, o que da margem a questionamentos, devido aos benefícios ocasionados por esta microbiota [58,59]. Porém, evidências sugerem uma possível atividade agonista entre sIgA e os micro-organismos comensais no intestino [60], através de pressão de seleção [61], favorecendo a colonização por estas bactérias.

Em relação à neutralização viral, estudos com o vírus da influenza sugerem que este mecanismo varia de acordo com o número de moléculas IgA por virion [62]. É importante salientar que a IgA, durante seu transporte pelas células epiteliais realizado pelo pIgR, é capaz de interagir com patógenos intracelulares, como os vírus, bloqueando sua replicação e/ou brotação [63]. Formam-se, então, complexos IgA-vírus no interior da célula infectada que, provavelmente, são expelidos para a luz do órgão [37]. Este mecanismo já foi evidenciado in vitro com os vírus de Sendai, influenza e imunodeficiência humana [64-66]. Mazanec et al. (1992) utilizaram monocamadas de células epiteliais polarizadas, infectadas com o vírus de Sendai, para demonstrar a co-localização de IgA anti-hemaglutinina-neuraminidase (HN) e destas proteínas virais. Além disso, observaram uma produção viral muito inferior nas células tratadas com IgA anti-HN, em relação às células tratadas com IgA inespecífica ou IgG anti-HN.

3. Imunidade de mucosa e vacinas

A resposta imune de mucosa é induzida de maneira mais eficiente quando a inoculação ocorre por via oral, nasal, retal ou vaginal [2], visto que vias sistêmicas geralmente induzem uma pobre resposta imune nestas superfícies, com consequente menor eficácia frente à infecção por patógenos que utilizam estas superfícies como porta de entrada no organismo [5]. Apesar de este conceito estar consolidado, a grande maioria das vacinas utilizadas é administrada por via parenteral, o que é compreensível pelo fato desta via permitir maior exatidão na quantidade de antígeno injetada no organismo, além de resultar em fácil mensuração das respostas humoral e celular geradas, através de amostras sanguíneas [2]. Ainda assim, quando o objetivo é induzir uma resposta imune em nível de mucosa e sistêmica, a melhor estratégia é a imunização por via mucosa [67].

Thiry et al. (2007) inocularam cabras com uma vacina viva atenuada contra herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), por via intranasal, seguido de desafio por via intravaginal com uma cepa de herpesvírus caprino tipo 1 (CpHV-1). Estes autores utilizaram o vírus bovino como cepa vacinal devido a relação antigênica e genética existente entre o BoHV-1 e CpHV-1. Após desafio, observou-se significante redução na severidade da doença nos animais vacinados, além de inferior duração e pico da excreção viral, quando comparado ao grupo controle. Em outro estudo realizado com vacinas contra o BoHV-1 de inoculação intranasal, Gogev et al. (2002) avaliaram vacinas inativadas formuladas com as glicoproteínas C e/ou D do BoHV-1. O desafio foi realizado pela mesma via de inoculação das vacinas, resultando em leve ou ausente sintomatologia clínica nos animais que receberam as vacinas experimentais, enquanto os animais do grupo não vacinado desenvolveram sintomatologia típica respiratória. Tempesta et al. (2007), por sua vez, inocularam cabras com uma vacina inativada contra o CpHV-1 associado a um mutante da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTK63), por via intravaginal. Estes animais desenvolveram altos níveis de SIgA e significante proteção frente ao desafio com uma cepa virulenta de CpHV-1, evidenciada pela queda na excreção viral quando comparado aos animais não vacinados.

Na escolha da via mucosa a ser empregada, deve-se considerar o sistema de mucosas como um sistema integrado, onde os linfócitos T e B ou APCs ativadas em um determinado sítio indutor podem migrar através dos vasos linfáticos para outro sítio efetor nas mucosas [71], com consequente secreção de IgA específica em outro local que não aquele onde ocorreu o estímulo antigênico primário [72]. Este mecanismo baseia-se na expressão de moléculas de adesão tecido-específicas (quimiocinas, integrinas e citocinas) e seus receptores, guiando estas células de volta ao local onde houve o estímulo antigênico e a sítios efetores relacionados [2,21]. Exemplificando, plasmócitos IgA+ que são ativados no MALT expressam CCR10, receptor para CCL28, este último secretado por células epiteliais presentes no intestino delgado e grosso, glândulas salivares, tonsilas, trato respiratório e glândulas mamárias em fase de lactação [22]. Desta forma, estes plasmócitos CCR10+ podem ser atraídos para qualquer um destes tecidos [72]. Bergquist et al. (1997) observaram aumento nos níveis de IgA e IgG na secreção vaginal de mulheres imunizadas por via nasal com a subunidade B da toxina colérica (CTB), o que sugere relação entre estes locais. Diversos outros estudos relataram esta mesma relação [73-80]. Di Tommaso et al. (1996) compararam as vias intravaginal e intranasal na indução de resposta imune sistêmica e vaginal contra LTK63, um mutante da enterotoxina termolábil de Escherichia coli, eficiente como adjuvante de mucosa, e observaram resposta humoral sistêmica gerada por ambas as vias de imunização, além de altos níveis de IgG e IgA vaginais. O grupo de ratas

imunizadas por via intranasal desenvolveu uma resposta de IgA vaginal mais tardia quando comparado ao grupo imunizado por via intravaginal, porém um maior título deste anticorpo foi encontrado na secreção vaginal, após repetidas imunizações, nas ratas que receberam o imunógeno por via intranasal. A razão pela qual a via intranasal de administração de antígenos parece ser tão promissora, resultando na disseminação de células B e T efetoras em outros sítios que não apenas o de inoculação, incluindo o trato genital feminino, ainda é desconhecida. Iwasaki (2010) atenta para o fato do trato respiratório, em especial os pulmões, ser altamente vascularizado, facilitando assim a dispersão destas células para outros órgãos e tecidos.

Por outro lado, Parr & Parr (1999), ao confrontarem estas vias de imunização em camundongas, utilizando uma vacina viva atenuada contra herpes simplex virus tipo 2 (HSV-2), observaram que a via intranasal não incrementou o número de plasmócitos secretores de IgA e IgG na vagina, além de não haver originado um acréscimo significativo de IgA na secreção vaginal, quando comparada a via intravaginal. Do contrário, a via intravaginal gerou incremento do número de plasmócitos secretores de IgG na vagina e aumento deste anticorpo tanto na secreção vaginal como no soro, indicando imunidade local e sistêmica, visto que proporcionou maior proteção frente ao desafio das camundongas com uma cepa virulenta de HSV-2. Entretanto, vale salientar que a resposta a vacinas inoculadas por esta via pode ser alterada conforme o estágio do ciclo estral da fêmea no momento da imunização [2], o que dificultaria uma resposta homogênea no estudo de populações.

Morrison et al. (1998), por sua vez, defendem a imunização intranasal complementar à parenteral, baseados na proteção frente ao desafio com HSV-2. Estes autores avaliaram a resposta imune conferida pela imunização de camundongas com uma vacina viva mutante contra HSV-2, administrada por via subcutânea e intranasal. A via subcutânea gerou uma forte resposta sistêmica, enquanto a via intranasal induziu resposta sistêmica e de mucosa, evidenciada por anticorpos IgA na secreção vaginal. Neutra & Kozlowski (2006) também defendem esta teoria, salientando que, em humanos que não apresentam uma resposta imune prévia contra o agente vacinal, a imunização por via mucosa seguida de inoculação parenteral representaria a melhor escolha, devido à indução primária da expressão de receptores celulares nas mucosas e sistêmicos.

Deste modo, algumas considerações parecem importantes na escolha da via de inoculação a ser utilizada, como a espécie a ser inoculada, a natureza da vacina e a provável porta de entrada do agente em questão no organismo. Além disso, um grande desafio no desenvolvimento de vacinas de mucosa é representado pelos mecanismos de defesa inata do organismo. Ao ser depositado diretamente em uma superfície mucosa, o antígeno pode ser diluído nas secreções locais, capturado por muco, atacado por proteases e nucleases, além de sofrer exclusão pelas barreiras epiteliais. Desta forma, seria necessário inocular um grande volume de vacina e seria impossível determinar exatamente a dose que foi capaz de atravessar estas barreiras e incitar uma resposta imune [2].

Segundo Pavot et al. (2012) a formulação da vacina de mucosa ideal deve ser capaz de (1) proteger o antígeno vacinal da degradação enzimática e química, (2) limitar sua eliminação ou diluição excessiva no organismo, (3) facilitar a absorção do antígeno pelas células M especializadas do NALT/GALT/BALT a fim de possibilitar sua captura pelas APCs, (4) facilitar a captura do antígeno e adjuvante pelas APCs, visando estimular de forma apropriada uma resposta imune adequada, composta por sIgA neutralizante e/ou linfócitos T CD4+ e CD8+. Estes anticorpos neutralizantes são responsáveis pelo bloqueio tanto da colonização da mucosa por patógenos como da

ligação das toxinas bacterianas nas células epiteliais, enquanto as células CD8+ exercem sua função eliminando células infectadas e prevenindo, desta forma, a invasão local pelo patógeno. Neutra & Kozlowski (2006) ainda mencionam a importância de mimetizar alguns aspectos chave presentes nos patógenos, como o fato de serem multiméricos e/ou particulados, possuírem a capacidade de adesão nas superfícies mucosas (ou diretamente às células M), estimularem eficientemente uma resposta inata e incitarem uma resposta adaptativa. Para que seja possível atingir estes objetivos, ou pelo menos alguns deles, é de suma importância a escolha do adjuvante adequado, pois vacinas inativadas, de subunidades e partículas não microbianas geralmente estimulam uma resposta imune adaptativa fraca ou não detectável quando administradas diretamente em mucosas. Portanto, sistemas de entrega (“delivery systems”) e imunoestimulantes vêm sendo estudados a fim de incrementar a resposta imune às vacinas de mucosa [82,83].

Os sistemas de entrega geralmente utilizados na formulação de vacinas de mucosa podem ser classificados em dois grupos: sistemas particulados de entrega de antígenos; e soluções [84]. O primeiro grupo é composto por sistemas capazes de proteger parcialmente o antígeno da degradação enzimática nas secreções mucosas [8], envolvendo a proteína antigênica como uma “gaiola”, tornando-a assim menos suscetível às agressões do sistema imune inato local. Este grupo inclui emulsões, lipossomas, virossomas, microesferas, compostos imunoestimulantes (ISCOMs) e pseudovírus ou partículas semelhantes aos vírus (virus-like particles - VLPs) [8,85]. O segundo grupo de sistemas de entrega compreende soluções onde o antígeno é dissolvido ou suspenso, como óvulos e géis [86,87]. Os óvulos, depois de inseridos na vagina, têm sua base amolecida e dissolvem-se, distribuindo o antígeno [86]. Já os géis com capacidade aderente, onde se destaca a quitosana, um polissacarídeo catiônico insolúvel em pH alcalino e neutro, e a xantana, um biopolímero produzido pela bactéria

Xanthomonas campestris consideravelmente resistente ao calor, enzimas bacterianas e

degradação por exposição a luz UV [88], formam sais quando em contato com ácido hidroclorídrico, lático, acético, glutamínico, entre outros. Estes sais têm a capacidade de ligar-se a materiais carregados negativamente, como as superfícies celulares e muco [87], prolongando o tempo de exposição do antígeno às células efetoras do sistema imune, ponto crítico na indução de uma resposta efetiva nas superíficies mucosas [89].

Esforços têm sido dispendidos na tentativa de desenvolver substâncias que, além de exercer papel de sistema de entrega, possuam atividade intrínseca imunomoduladora [90]. Os lipossomas, por exemplo, agem como sistema de entrega e imunoestimulante [84], incitando uma resposta humoral e celular, inclusive LT citotóxica [83,84], tanto sistêmica como local [91-93]. Os virossomas, por sua vez, são combinações de lipossomas e proteínas do envelope viral [84,94] e apresentam como vantagem, quando comparados aos lipossomas, o fato de possuírem glicoproteínas de superfície dos vírus com alta afinidade por receptores presentes nas células das superfícies mucosas, o que facilita a ligação antígeno-mucosa [85]. Já os ISCOMs são complexos de 30-100 nm compostos pela saponina Quil A parcialmente purificada, devido a sua variável toxicidade; colesterol, fosfolipídios e a proteína antigênica de interesse. A despeito de sua toxicidade devido à fração Quil A, estes compostos diminuem em até 60 vezes a quantidade de proteína viral necessária para desencadear uma resposta imune, quando comparados ao vírus intacto, e ainda são facilmente endocitados pelas APCs, induzindo altos títulos de anticorpos e uma forte resposta celular, sistêmica e local [82,83,85]. Os VLPs, por sua vez, referem-se à capsídeos virais sem material genético em seu interior, mantendo, desta forma, apenas a estrutura viral. Partículas de tamanho e forma semelhantes aos vírus, porém obtidas por

engenharia genética, contendo antígenos virais ou não virais também são consideradas VLPs [84]. Este sistema de entrega é particularmente interessante no caso das vacinas de mucosa, pois, além do baixo custo e facilidade de fabricação, podem ser administrados pela mesma via utilizada pelo patógeno alvo da vacina, por ser capaz de mimetizar a infecção natural, resultando em uma resposta imune composta por sIgA e células CD8+ [5] e proteção frente a desafios via mucosa [95-97].

Tratando-se de substâncias exclusivamente imunoestimulantes, a toxina colérica (CT) e a enterotoxina termolábil produzida pela Escherichia coli (LT) são especialmente poderosas quando co-administradas a antígenos solúveis nas mucosas [98], porém muito tóxicas, sendo responsáveis pela cólera e diarreia dos viajantes, respectivamente [82,99,100]. Ambas as toxinas consistem em uma subunidade B formada por cinco monômeros de 11 kDa, cada arranjados em uma estrutura cilíndrica [101,102] que é responsável pela ligação da toxina às células epiteliais da mucosa [82]; a subunidade A, responsável pela toxicidade, é composta por dois domínios: A1 e A2. O

domínio enzimático A1 apresenta estrutura globular e medeia a ribosilação do ADP,

com consequente ativação constante de adenil ciclase, acúmulo anormal de AMPc e perda excessiva de fluidos [82,98,103]. O domínio A2 é formado por uma longa α hélice

que se insere na cavidade central da subunidade B [98]. Devido a sua alta toxicidade, estas toxinas não são apropriadas para uso humano [82], fazendo-se necessário o desenvolvimento de derivados ou mutantes desprovidos de atividade tóxica, ou com toxicidade significativamente reduzida, mantendo-se sua alta capacidade imunoestimulante [82,98]. Com este objetivo, a subunidade B de CT e LT (CTB e LTB) foi isolada e avaliada quanto a sua ação adjuvante, e demonstrou uma capacidade imunoestimulante de mucosa inferior à holotoxina completa, mas significante quando administrada por via intranasal [103]. Geralmente, a perda da ação tóxica reflete-se em diminuição da atividade adjuvante. Entretanto, apenas poucas proteínas disponíveis apresentam atividade adjuvante significativa na ausência de toxicidade detectável [5]. Portanto, uma opção à exclusão da subunidade A seria uma mutação pontual no domínio A1 a fim de reduzir seu potencial tóxico [5,82,98]. Dentre os mutantes

disponíveis, destaca-se o LTK63 [82,98], resultado da substituição do aminoácido serina por lisina na posição 63 da subunidade A. Este mutante é totalmente atóxico e demonstrou forte atividade imunoestimulante em diversas espécies, sendo capaz de induzir altos títulos de anticorpos específicos contra o antígeno co-administrado [98], além de estimular a produção de IL-12 e TNF-α e translocação do NFκβ (fator de transcrição nuclear kapa-beta), responsável pela regulação da expressão dos genes de inúmeras citocinas. Pizza et al. (1994), ao confrontarem a ação imunoestimulante do mutante LTK63 e o derivado de LT, LTB, enfatizam a importância da subunidade A, mesmo que inativa, na capacidade de incitar uma resposta imune, não apenas pelo fato de possuir um maior número de determinantes antigênicos, presentes na subunidade A, refletindo em um maior número de células B e T específicas [104-107], mas também pela habilidade de influenciar eventos intracelulares, como processamento e apresentação de antígenos [98].

4. Considerações finais

As vacinas administradas diretamente nas mucosas objetivam, principalmente, estimular uma forte imunidade local capaz de minimizar a carga infectiva de patógenos que utilizam tais superfícies como porta de entrada no organismo. A sIgA representa um papel importante na defesa das mucosas, através da neutralização e exclusão antigênica. Por esta razão, é importante que a vacina estimule uma forte resposta humoral além de,

é claro, incitar uma resposta celular adequada. Diversos obstáculos dificultam a elaboração de uma vacina eficiente, como a escolha da via de administração apropriada e o sistema de entrega do antígeno mais pertinente. Levando-se em consideração a relação entre o sistema de mucosas, é possível escolher uma via que represente maior facilidade na inoculação visando estimular uma resposta imune na mucosa correspondente. Esta relação é observada entre os tratos respiratório e genital, pois diversos autores relatam que, ao administrar um antígeno por via intranasal em fêmeas, observaram uma resposta específica na mucosa vaginal. O sistema de entrega da vacina, por sua vez, deve ser capaz de burlar barreiras físicas e químicas do organismo e disponibilizar antígeno suficiente para incitar uma resposta imune. Algumas substâncias, além de exercerem este papel, apresentam atividade imunoestimulante, ampliando a resposta gerada, como é o caso dos lipossomas e ISCOMs. Tratando-se de substâncias exclusivamente imunoestimulatórias, derivados e mutantes de toxinas bacterianas vêm sendo estudados com este propósito. A LTB e o mutante LTK63 são exemplos promissores, exercendo papel imunoestimulante quando co-administrados a antígenos solúveis. Ainda são necessários estudos a fim de esclarecer a eficiência destas substâncias e a relação entre as vias mucosas de administração de vacinas em animais de grande porte, visto que diversas enfermidades de importância econômica, principalmente na pecuária bovina, são transmitidas pelo contato com as superfícies mucosas.

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