UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO PRÓ-REITORIA DE GRADUAÇÃO
CENTRO DE ENGENHARIAS
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA E TECNOLOGIA BACHARELADO EM ENGENHARIA QUÍMICA
MÁRIO NUNES DE LIMA
ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS Saccharomyces Cerevisiae EM BAGAÇO DE CAJU – AVALIAÇÃO DE DIFERENTES TRATAMENTOS
MOSSORÓ 2019
MÁRIO NUNES DE LIMA
ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS Saccharomyces Cerevisiae EM BAGAÇO DE CAJU – AVALIAÇÃO DE DIFERENTES TRATAMENTOS
Monografia apresentada a Universidade Federal Rural do Semi-Árido como requisito para obtenção do título de Bacharel em Engenharia Química.
Orientador: Prof. Dr. Álvaro Daniel Teles Pinheiro.
Co-orientador: Prof. Dr. Rafael Barbosa Rios.
MOSSORÓ 2019
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L732e Lima, Mario Nunes de.
Estudo da imobilização de células saccharomyces cerevisiae em bagaço de caju: Avaliação de
diferentes tratamentos / Mario Nunes de Lima. - 2019.
49 f. : il.
Orientador: Álvaro Daniel Teles Pinheiro.
Coorientador: Rafael Barbosa Rios.
Monografia (graduação) - Universidade Federal Rural do Semi-árido, Curso de Engenharia Química, 2019.
1. Imobilização celular. 2. Bagaço de caju. 3.
Carvão ativado. 4. Saccharomyces cerevisiae. I.
Pinheiro, Álvaro Daniel Teles , orient. II.
Rios, Rafael Barbosa, co-orient. III. Título.
À minha amada mãe e mentora, dona Celita Nunes Cardoso.
AGRADECIMENTOS
Ao Criador dos céus, dos mares, das fontes das águas e de tudo que existe são os meus mais profundos agradecimentos, Ele tem sido o meu Pastor, um Maravilhoso Conselheiro, o meu Deus Forte, um Pai Eterno, o Príncipe que trazido a paz e animo para que eu suportasse todas as tribulações. Ele é digno de toda honra, pois me sustenta com a sua destra fiel e não permite desanimar. Assim, dou Graças ao meu bom Deus!
À minha virtuosa mãe, que sem sombras de dúvidas é uma providência divina na minha vida. É quem tem me ensinado desde pequeno o caminho em que devo andar, é quem renunciou a muitos dos seus sonhos para caminhar os meus. Pois bem, não nos devíamos deles. Juntos estamos superando metas que nem a senhora imaginou quando me teve a primeira vez. Te amo dona Celita.
Ao meu sonhador irmão, que juntos contávamos as estrelas e sonhávamos para onde poderíamos ir. Estamos caminhando!
À Igreja Adventista do Sétimo Dia, por cumprir seu papel de zelar uns dos outros, por oportunizar que eu tenha experiencias com Jesus, por anunciar as boas novas e fazer discípulos e me convidar a ir pregar o evangelho eterno. Só o céu poderá nos mostrar o quanto essa obra está sendo importante para nos suster.
À minha tia Tatica, pelas orações constantes.
Aos meus estimados amigos Washington, Mikaelle e Mikael, juntamente com toda a sua família que se tornou a minha. A dona Helena que me aguentou durante todo esse tempo, no partir do pão, nas orações e na comunhão. Em todos os momentos estivemos como amigos, nas dificuldades vocês foram minha família, me abraçaram e compartilharam comigo todas as variações emocionais provocadas nesses últimos anos.
Ao meu amado clube de Desbravadores Fortaleza Suprema, onde vivi momentos de emoções ímpares. Onde fui puro, bondoso, e um leal amigo de todos. As experiencias emocionais desses momentos me fizeram muitas vezes entender que tudo tem sentido e me convidaram a estar no caminho que tenho aprendido desde criança. Obrigado minha diretora Roberta, a diretoria, e a cada um dos meus desbravadores pela convivência, paciência e carinho.
Aos meus amigos Edmilson, Gabriel e Lucas, pelo fantástico companheirismo ao longo dessa etapa. Melhor que fomos quatro do que um só, juntos trabalhamos melhor, nos ajudamos quando estivemos cabisbaixos, fomos psicólogos e nos divertimos muito.
Aos meus amigos Renan, Samyson, Samuel, Leninha, Caio, Eduardo, Hortência, Eduarda e Tayna, pela amizade ao longo do curso e pelos muitos sorrisos.
Aos meus amigos e conselheiros Carlos Eduardo, Élio Barbieri e Márcio Nascimento, pelo apoio, incentivo e preocupações.
Aos meus amigos, orientadores e atendedores de aperreios, Álvaro, Rafael, Raphaela e Lidiane. Obrigado pelo apoio, pelos muitos cajus, por atender em momentos extra expediente, por se disporem a ficar até mais tarde contando células, pela disponibilidade em me ouvir, pela compreensão e por fazerem este trabalho dar certo.
Aos meus amigos e ótimos auxiliares de laboratório, Gabriel, Ione e Maciel, pelo auxílio nas longas e exaustivas atividades deste trabalho.
Aos técnicos de laboratório, Deusilene, Andrezza, Cristiane e Igor pelas instruções, ajuda durante os experimentos e disponibilidade.
E à todos que colaboraram ao longo dessa caminhada, meu muito obrigado!
Aqui está a perseverança dos santos, os que guardam os mandamentos de Deus e a fé em Jesus.
Apocalipse 14:12 (ARA).
RESUMO
Os processos fermentativos possuem diversas aplicações em todo o mundo devido a importância dos seus bioprodutos. Para a fermentação alcoólica, a levedura mais utilizada é a do gênero Saccharomyces. Essa levedura realiza uma catalise oxidativa dos carboidratos simples presentes no meio (glicose e outros açucares), de modo a obter energia para sua manutenção e crescimento, e em consequência produz os chamados bioprodutos. Esse bioprocesso é em geral conduzido com os microrganismos livres no reator. Contudo, uma alternativa à fermentação tradicional são os processos conduzidos com microrganismos imobilizados, reduzindo o trabalho de separação devido a biomassa ficar retida no suporte e criando condições estáveis ao desenvolvimento de microrganismos. Embora essa técnica provoque maior produtividade ao processo, os suportes devem oferecer condições físicas e químicas satisfatórias para o desenvolvimento dos microrganismos. Neste cenário, existem trabalhos procurando determinar suportes a base de materiais lignocelulósicos residuais, tais como: bagaço de cana-de-açúcar e bagaço de caju. Do ponto de vista regional, é notória a alta disponibilidade de bagaço de caju sem usos posteriores, bem como as características porosas do material. Utilizando este material, foi avaliada, a partir da quantidade de células de Saccharomyces cerevisiae imobilizadas e livres, a influência de dois tratamentos químicos no bagaço de caju (bagaço submetido a um tratamento ácido base e um bagaço submetido ao processo de ativação de carbono) e comparados com o bagaço sem tratamento, a fim avaliar qual dos três seria mais eficiente para imobilização. Foi observado que ambos os suportes possuem capacidade de adsorção celular semelhantes, no entanto, o bagaço tratado com ácido e uma base se destacou em todas as análises, sendo capaz de imobilizar 6,37x107 células. g-1 de suporte em 6 horas de processo. Os três suportes tiveram eficiências de imobilização promissoras, ficando na faixa de 24 % a 41 %. Tanto a eficiência de imobilização quanto a contagem de células imobilizadas apontam um resultado interessante para todos os suportes. Foi observado que após essas curvas alcançarem um platô, elas são mantidas, ou seja, nesse estágio os microrganismos atuam na manutenção de um equilíbrio entre o número de células imobilizadas e livres, sem provocar uma brusca dessorção das células. Esta forma de imobilização apresentou-se promissora para futuros estudos mais robustos.
Palavras-chave: Imobilização celular. Bagaço de caju. Carvão ativado.
Saccharomyces cerevisiae.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Principais métodos de imobilização celular (KOURKOUTAS et al., 2004;
PACHECO, 2009). ... 24
Figura 2 - Fluxograma dos tratamentos dos suportes. ... 32
Figura 3 - Desenho esquemático de uma câmara de Neubauer. ... 34
Figura 4 - Fluxograma dos experimentos de imobilização. ... 35
Figura 5 - Suportes para imobilização. ... 36
Figura 6 - Curva de imobilização de células ao longo de 24 h. ... 38
Figura 7 - Eficiência de imobilização de células nos suportes. ... 40
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Avaliação de células do meio de cultura estoque. ... 36 Tabela 2 - Número de células imobilizadas nos suportes com 24 h de imobilização.
... 37
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 14
2. OBJETIVOS ... 17
2.1. Objetivo Geral ... 17
2.2. Objetivos Específicos ... 17
3. REVISÃO DE LITERATURA ... 18
3.1. Microrganismos fermentadores ... 18
3.2. Bioquímica do processo de fermentação alcoólica ... 19
3.3. Fatores que afetam o processo de fermentação ... 19
3.3.1. Temperatura. ... 20
3.3.2. pH. ... 20
3.3.3. Concentração do substrato ... 21
3.3.4. Concentração de inoculo. ... 21
3.4. Imobilização celular ... 22
3.5. Métodos de imobilização ... 23
3.5.1. Ligação de superfície ... 24
3.5.2. Aprisionamento dentro de uma matriz porosa ... 25
3.5.3. Aglomeração ... 25
3.5.4. Contenção por barreira ... 25
3.6. Suportes para imobilização ... 25
3.6.1. Bagaço de Caju ... 27
3.7. Tratamentos dos materiais para desenvolvimento de porosidade . 28 4. METODOLOGIA ... 30
4.1. Matéria-prima ... 30
4.2. Tratamento do bagaço de caju ... 30
4.2.1. Tratamento ácido básico ... 30
4.2.2. Tratamento de carvão ativado para o bagaço de caju. ... 31
4.3. Microrganismo ... 32
4.4. Meio de cultura ... 32
4.5. Cultura estoque ... 32
4.6. Imobilização de leveduras ... 33
4.7. Dessorção das células imobilizadas ... 33
4.8. Contagem de células ... 34
4.9. Método de eficiência da imobilização ... 35
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 36
5.1. Suportes ... 36
5.2. Microrganismos ... 36
5.3. Imobilização ... 37
5.3.1. Avaliação da capacidade de imobilização dos suportes ... 37
5.3.2. Avaliação do tempo de imobilização ... 38
5.3.3. Eficiência de imobilização ... 39
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 42
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 43
14 1. INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas o etanol tem ocupado um lugar de destaque e de grande importância tecnológica, firmando-se como um produto estratégico para a economia nacional. Desde a instabilidade gerada pela crise do petróleo, o Brasil tem se desenvolvido nos sistemas biotecnológicos de produção de etanol, sendo o segundo maior produtor de etanol do mundo o que contribui para a redução no consumo de combustíveis fosseis, consequentemente reduzindo o impacto ambiental provocado por eles (BATISTA, 2005).
De Acordo com dados da Conab (Companhia Nacional de Abastecimento) para a safra 2018/2019, foram produzidos 30,3 bilhões de litros de etanol no Brasil, sendo usados para os mais diversos fins, como considera Pacheco (2009), cerca de 80% é destinado a ao uso carburante, 5% alimentação, perfumaria e alcoolquímica e 15% a exportação (BRASIL, 2019).
O crescimento do setor proporcionou o desenvolvimento das tecnologias de produção, incrementando rotas e proporcionando maior eficiência em produtividade. No Brasil, atualmente o etanol e obtido por meio da fermentação alcoólica da cana-de-açúcar ou do milho, produtos agrícolas ricos em carboidratos, que são consumidos pelos microrganismos dando origem a novos produtos, como o etanol e o dióxido de carbono (STECKELBERG, 2001). A reação desse processo é promovida por biocatalizadores, ou seja, células de microrganismos que possuem enzimas capazes de quebrar moléculas maiores (amido e glicose) em produtos menores como o etanol (SANTOS, 2008).
Nas fermentações alcoólicas realizados no Brasil, as leveduras são responsáveis por realizar a conversão dos açúcares em álcool. Deste modo, embora existam outros microrganismos capazes de promover essa reação, o agente mais usado é a levedura Saccharomyces cerevisiae (SANTOS, 2010).
O processo fermentativo industrial pode ser conduzido de duas formas: o processo descontinuo ou em batelada e o processo contínuo, sendo o contínuo mais vantajoso economicamente. No entanto, ambas as técnicas procuram o reuso de células, e tornam-se especialmente viáveis quando associada a técnica de imobilização (VERBELEN et al., 2006).
A imobilização de células consiste em “aprisionar” um microrganismo em uma determinada matriz chamada suporte (cana-de-açúcar, sabugo de milho, géis como o alginato de cálcio e outros) (BATISTA, 2005). Para Covizzi et al. (2007), a técnica e uma estratégia
15 tecnológica para conservar a estrutura morfológica desses microrganismos, de maneira a preservar também sua atividade catalítica, promovendo fermentações de maior eficiência, ou seja, sem a necessidade de renovar a cultura ou que a mesma passe por fases de adaptação.
Para Batista (2005), outra vantagem desse processo é facilitar a separação entre o produto e as células em etapas subsequentes. No entanto, a técnica requer suportes que tenham resistência física, não interfiram nas reações do meio, apresente alta solubilidade ao meio e algum tipo de porosidade, o que depende diretamente do tipo em que a técnica é usada.
Covizzi et al. (2007) destacam que alguns materiais foram estudados para essa finalidade, tais como: géis (BATISTA, 2005), sabugo de milho (SANTOS, 2010), colmos de bambu e fibra de coco (SANTOS, 2008), bagaço de malte (DRAGONE; MUSSATTO;
SILVA, 2007) e bagaço de caju (PACHECO, 2009). Esses materiais, de modo geral atendem as características de suportes e, com exceção dos géis, os demais são resíduos agroindustriais, ou seja, são materiais lignocelulósicos sem usos definidos. Dragone, Mussatto e Silva (2007), expõem que, esses materiais lignocelulósicos são ricos em carbonos, porém, não são apresentadas alternativas técnicas para o uso deles. Holanda citado por Luciano et al. (2011), cita que 1,5 milhões de toneladas de bagaço de caju são desperdiçados como rejeitos da indústria de suco de caju somente na região nordeste do Brasil.
No estudo de suporte proposto por Dragone, Mussatto e Silva (2007), o material é submetido a alguns tratamentos com a finalidade de aumentar a porosidade. O bagaço de caju apresenta em sua composição, altas concentrações de três polímeros, sendo: a hemicelulose, a celulose e a lignina. Para Brányik et al. (2002) esses polímeros proporcionam aos resíduos agroindustriais as características adequadas para serem usados como suportes, seja diretamente ou quando submetidos a tratamento químicos adequados.
Tratamentos ácidos ou básicos possuem a capacidade de promover a hidrolise de algumas dessas matérias vegetais, promovendo a exposição de poros que se mostram adequados a imobilização celular por adsorção na superfície (BRÁNYIK et al., 2002;
PACHECO, 2007).
Semelhante a isso, Ehrhardt e Rehm (1985), propuseram a imobilização de Cândida sp. e Pseudomonas sp. em carvão ativado, isso porque os materiais com carbonos ativos apresentam porosidade desenvolvida, sendo considerados como matrizes porosas. González- García (2018), aponta que os materiais lignocelulósicos quando submetidos ao processo de
16 ativação de carbono desenvolvem estruturas rígidas com alto volume interno, além disso, podem ser considerados a alta capacidade de adsorção, o que é adequado para a imobilização de microrganismos em superfícies porosas.
Neste contexto, foram estudados o uso de materiais lignocelulósicos e suas possíveis aplicações na imobilização de células.
17 2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Foi proposto um suporte a base de bagaço do pedúnculo de caju que seja adequado para a imobilização de leveduras de fermentação alcoólica.
2.2. Objetivos Específicos
Tratou-se o bagaço de caju tornando-o um suporte poroso.
Avaliou-se quantitativamente o número de células imobilizadas pela aplicação da técnica de ligação de superfície nos suportes.
Comparou-se quantitativamente o as células imobilizadas nos diferentes tipos de suporte: bagaço de caju, bagaço de caju submetido a um tratamento ácido básico e um carvão ativado obtido a partir do bagaço de caju.
Avaliou-se o tempo de imobilização das células em cada tipo de suporte.
18 3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Microrganismos fermentadores
O processo de fermentação alcoólica é uma transformação química conduzida na presença de um catalisador biológico, ou seja, os microrganismos possuem atuação primordial neste processo de conversão de carboidratos (moléculas maiores) a moléculas menores, como o etanol e o dióxido de carbono. Existem vários microrganismos capazes de produzir etanol, contudo, a maioria das aplicações em escala industrial são de leveduras do gênero Saccharomyces (TORTORA; FUNKE; CASE, 2000).
Ainda, existe um crescimento de estudo com bactérias, como o de Goto e kavanagh (2012) e o de Lima, Takahashi e Alterthum (2002), realizando a aplicação de cepas da bactéria Escherichia Coli modificada, a qual contém enzimas capazes de realizar a conversão. Ernandes e Garcia-Cruz (2009) estudaram algumas aplicações da bactéria Zimomonas Mobilis no processo fermentativo, e concluem que os estudos na área podem ser promissores, principalmente pela possibilidade de converter substratos de diferentes fontes, contudo o setor atualmente é dominado pelas leveduras Saccharomyces Cerevisiae.
Pertencentes ao reino fungi, as leveduras são organismos eucarióticos, unicelulares, heterotróficos que apresentam diâmetro entre 2 a 8 micrômetros (DICKINSON;
SCHWEIZER, 2004). Para Gondim (2009), o que torna a levedura S. Cerevisiae como o principal agente fermentador são as condições operacionais grosseiras nas quais os bioprocessos são conduzidos, pois trata-se de um processo não estéril necessitando de um microrganismo resistente às oscilações do meio e a presença de outras culturas.
(STECKELBERG, 2001). Doran (1995), destaca que a condução dos processos de fermentação, colocam as células em diferentes condições limitantes, tais como: no início uma alta concentração de substrato, as variações de temperatura provocadas pela dificuldade em controlar a dorna de fermentação, a aeração do meio, o crescimento da concentração de etanol, as diferenças físico-químicas provocadas na mistura em detrimento da conversão dos reagentes em produtos, são mudanças que podem provocar a inibição do microrganismo. Já Garay-Arroyo et al (2004), em um estudo de avaliação da resposta para as diferentes condições de estresse celular, considerou que a maioria das cepas industriais utilizadas, já sofreram alterações genéticas suficientes para se adequarem as alterações do meio e embora essas alterações possam influenciar na taxa de formação celular, esse efeito é momentâneo dentro do processo e não afeta significativamente a produtividade da fermentação. Logo,
19 essas características das leveduras S. Cerevisiae as tornam os principais agentes catalisadores de fermentações alcoólicas.
3.2. Bioquímica do processo de fermentação alcoólica
O processo de fermentação pode ser compreendido com a transformação de açúcares em etanol, gás carbônico e energia por um microrganismo. Gay-Lussac propõe que a estequiometria dessa reação anaeróbica siga a Equação 1 (NELSON; COX, 2018).
C6H12O6 → CH3CH2OH + 2CO2 + Energia Equação 1.
A reação global de glicólise demonstra que 1 mol de glicose (180 g) produz 2 moles de etanol (92g), 2 moles de dióxido de carbono (88g) e 57 kcal de energia. Assim, o rendimento teórico (Yp/s) para a produção de etanol é de 0,511 g/g. na prática este valor não é observado devido a parte da glicose ser destinada a síntese de material celular, a manutenção da levedura e produção de outros bioprodutos (STECKELBERG, 2001).
A fermentação alcoólica é um processo que depende então de um catalisador orgânico.
O princípio desse bioprocesso consiste na conversão açúcares em etanol e outros produtos secundários durante o desenvolvimento dos microrganismos. Para Bruice (2006) essa transformação ocorre devido a síntese de material vivo exigir o consumo de energia, sendo caracterizado como uma reação endergônica. Logo, na fermentação alcoólica, as leveduras S.
cerevisiae realizam uma catalise oxidativa obtendo a energia necessária para sua manutenção e crescimento e em consequência produz os chamados bioprodutos.
3.3. Fatores que afetam o processo de fermentação
Os seres vivos em geral, tais como os microrganismos são dotados da capacidade de identificar as condições ambientais disponíveis, bem como manter o nível de desenvolvimento populacional limitado por essas características. Logo, as composições e as condições físico- químicas do meio de cultura influenciam diretamente no crescimento da cultura microbiológica e por consequência no consumo do substrato (MADIGAN, 2016). Desta forma, tão importante quando a escolha do microrganismo, é a escolha das condições para o processo fermentativo.
Atualmente existem diversos modelos de biorreatores para a produção biotecnológica de etanol, onde a maioria desses destinam-se ao uso de células livres, contudo há um crescimento em trabalhos propondo a imobilização dos microrganismos em diversos tipos de suportes (BATISTA, 2005). Todos esses fatores, são parâmetros determinantes na conversão do substrato em produto durante o processo fermentativo.
20 3.3.1. Temperatura.
A temperatura é um importante parâmetro na realização dos processos fermentativos, para Torija et al (2003), a temperatura determina diretamente a atividade da celular dos microrganismos, de modo que quando o biorreator opera em temperaturas amenas (15 a 20
°C) a células apresentam comportamento de dormência, com baixo crescimento celular; no próximo estágio, entre 25 a 31 °C, as condições do meio são interessantes para as cepas, de modo a haver um crescimentos exponenciais da cultura, e quando a temperatura ultrapassa os 35 °C, as condições ambientais desfavorecem o desenvolvimento celular, provocando uma queda brusca na eficiência do processo. O estudo de Dragone Melnikov (2007), aponta uma faixa maior para o bom desempenho das células, indo de 25 a 35 °C, enquanto que Santos et al (2010), trabalhando com a enzima invertase determinou que as cepas se apresentam estáveis e com pico de conversão na temperatura de 45 °C, após isso a eficiência enzimática decresce, isso devido a desnaturação sofrida pela enzima (DRAGONE MELNIKOV (2007).
3.3.2. pH.
O parâmetro hidrogeniônico (pH), também apresenta sua significativa importância durante a biotransformação. Isso devido à interferência direta que alterações em seus valores podem causar ao crescimento celular e a formação de produtos, devido a efeitos inibitórios, tendo em vista que é um dos parâmetros que mais geram estresse no microrganismo, afetando diretamente o seu desempenho (DORTA et al., 2006). Para tanto, é necessário conduzir o processo em faixas de pH adequada para o desenvolvimento da cepa, que para Ergun (2000), as células do gênero Saccharomyces apresentam bom desempenho em fermentação alcoólica com pH aproximado a 4,5. Gava (2004), aponta que conduzir os processos fermentativos com pH na faixa de 2 a 4,5 apresentam uma viabilidade devido ao mesmo inibir a ação de microrganismos contaminantes. Contudo, Segundo Maia citado por Steckelberg (2001), o pH intracelular contido entre 5,8 e 6,9 independentes do pH externo.
Para Steckelberg (2001), quando os valores de pH do meio são baixos consequentemente este se torna mais agressivo, uma vez que exigem das leveduras um maior dispêndio de energia na manutenção do pH interno, além de afetar as proteínas de transporte da membrana citoplasmática que ficam expostas ao meio externo. E para Pinheiro et al. (2008), a faixa de 4,3 a 4,7 é uma região de segurança para o desenvolvimento das células sem provocar o estresse delas.
21 3.3.3. Concentração do substrato
A quantidade de substrato disponível para o consumo do microrganismo durante o bioprocesso, deve ser conservado em uma faixa de valores que não provoque o estresse celular. Embora existam discussões quanto a capacidade de adaptação das cepas da levedura S. Cerevisiae, como apontado por Garay-Arroyo et al (2004), isso não as tornam resistentes a todo tipo de alteração no meio. Na verdade, o bom desenvolvimento celular depende da fonte de carbono usada, isso porque a quantidade de substrato presente no meio pode afetar diretamente a sua taxa de crescimento específico, fazendo com que ocorra uma redução no rendimento do processo (TORIJA et al 2003). A concentração de açucares é limitado, pois altos teores de substrato geram um estresse osmótico no micro-organismo, afetando diretamente o processo (LIMA; BASSO; AMORIM, 2001). A cinética da interação da célula com o substrato foi discutida por Monod, de modo que foram criadas faixas para o crescimento da cultura, numa primeira faixa, a baixa concentração de substrato o microrganismo cresce a uma velocidade linear, quando a concentração de substrato é alta (segunda faixa) ou suficiente para saturar o microrganismo, o crescimento é exponencial e ocorre a máxima velocidade de crescimento celular, já na terceira faixa, para valores superiores à saturação da célula ocorre o que é chamado por efeito inibitório (THATIPAMALA et al., 1992). Thatipamala et al. (1992), determinou como ponto máximo de saturação a concentração de 150 g.L-1, de modo que a partir disso o meio já é considerado dentro da terceira faixa, onde o microrganismo sofre com a pressão osmótica provocada pelo substrato e ocorre a inibição.
3.3.4. Concentração de inoculo.
Em geral, o inoculo dos processos fermentativos alcoólicos no Brasil é a levedura S.
Cerevisiae, caracterizada pela biotransformação de açucares em álcool durante os processos de obtenção de energia, que são uteis para manutenção e crescimento da cultura. O processo reprodutivo desse microrganismo é assexuado, e ocorre basicamente por gemação ou como popularmente conhecido brotamento, em que a célula mãe, após um período de união entre os citoplasmas, dá origem a uma nova célula (STECKELBERG, 2001). Experimentalmente é possível observar que este processo ocorre ao longo da fermentação, isso devido ao número de células se multiplicar quando submetido a condições adequadas ao crescimento das mesmas, e é possível verificar que maiores concentrações de inoculo colocado no meio provocam uma máxima velocidade de formação de produtos (OLIVEIRA, 2006). No entanto, a disponibilidade de nutrientes também afeta diretamente o desempenho da cultura,
22 de modo que, para uma alta concentração de inoculo, existe também uma alta demanda por substrato (DORAN, 1995; TORTORA; FUNKE; CASE, 2000).
Experimentalmente, Oliveira (2006), constatou-se que maiores concentrações de leveduras no bioprocesso permitem fermentações mais rápidas, com maior produtividade e controle contra contaminantes, além de restringir o crescimento do próprio microrganismo.
Contudo existem discussões quanto a influência da concentração inicial de células no rendimento da fermentação alcoólica, para Borzani (2006), avaliando a concentração de etanol excretada pelas células, observou-se um rendimento linearmente decrescente quando a concentração inicial aumenta (NAGODAWITHANA; CASTELLANO; STEINKRAUS, 1974). Deste modo, há nesses estudos uma tendência em determinar uma concentração inicial ótima de inoculo, o que para Lim et al. (2013) 10 % (v/v) de células, para Tahir (2010) esse valor foi de 3 % (v/v).
3.4. Imobilização celular
De acordo com a 1ª Conferência em Engenharia de Enzimas (Henniker, Estados Unidos, 1971), biocatalisadores imobilizados, enzimas ou células, são catalisadores fisicamente confinados ou localizados em uma região definida do espaço, com retenção de suas atividades catalíticas, e que podem ser utilizados repetidas vezes ou em processos contínuos (KATCHALSKI-KATZIR; KRAEMER, 2000).
De modo geral, a imobilização pode ser entendida como o aprisionamento de um microrganismo ou enzima em uma determinada matiz conhecida como suporte, podendo ser géis, pectina, crisólita, materiais cerâmicos, resíduos agroindustriais e outros, desde que esse material tenha desenvolvido uma certa porosidade (DRAGONE; MUSSATTO; SILVA, 2007; GIESE, 2015; GONDIM, 2009; PACHECO, 2009; SANTOS, 2008).
Para Covizzi et al. (2007), as vantagens da célula imobilizadas em relação as células livres consistem principalmente na capacidade de operação na presença de uma maior densidade celular, no aumento da estabilidade e do tempo de atividade do biocatalizador.
Batista et al. (2005) considera que a imobilização também evita o washout (lavagem de células dentro de um reator) de células durante as operações com altas vazões de alimentação em processos contínuos, além de possibilitar a reutilização das células em sistemas em batelada e contínuo. Em processos de produção de etanol, por exemplo, existe a
23 possibilidade de ganhos, evitando-se a etapa de centrifugação e consequentemente a economia de energia (BATISTA, 2005).
Em estudos de produção de cerveja Dragone, Mussatto e Silva (2007), consideram como uma das principais vantagens a extração do produto com maior eficiência e menor gasto energético, pois as células imobilizadas eliminam a necessidade de retirada de biomassa ou reciclo. O microrganismo pode ser regenerado e reutilizado em bioprocessos subsequentes sem a necessidade de remoção deles dos tanques fermentativos ou reatores.
Para Feng et al. (2004), o estado morfológico dos microrganismos no processo fermentativo, exerce influência direta na obtenção dos produtos de interesse. A complexidade morfológica das células durante os processos metabólicos, torna a estabilidade promovida pelo confinamento físico ou químico dos microrganismos num ambiente mais adequado ao desenvolvimento deles. Então, células de microrganismos quando imobilizadas na superfície de suportes apresentam maior durabilidade e resistência, aumentando a produtividade do processo fermentativo, além de sofrerem menor influência dos efeitos tóxicos do meio, do pH e da temperatura (DRAGONE MELNIKOV 2007;
GIORDANO et al., 2000; SANTOS, 2008).
As técnicas de imobilização usadas em geral podem ser agrupadas em quatro grandes categorias de acordo com vários autores (BATISTA, 2005; GONDIM, 2009; PACHECO, 2009).
3.5. Métodos de imobilização
Gondim (2009), destaca os quatro métodos de imobilização: ligação de superfície, aprisionamento em matriz porosa, contenção por membrana e auto agregação. Esses métodos ainda podem ser mais detalhados, de modo existirem oito classificações para métodos de imobilização, a Figura 1 apresenta um esquema dos oito tipos de imobilização (PACHECO, 2009)
24 Figura 1 - Principais métodos de imobilização celular (KOURKOUTAS et al., 2004;
PACHECO, 2009).
3.5.1. Ligação de superfície
A imobilização celular num suporte sólido é conhecida como ligação de superfície, devido a ser realizada por adsorção física, ou seja, por forças eletrostáticas ou por ligação covalente entre a membrana celular e o suporte. A espessura do biofilme formado geralmente varia de uma camada de células a 1 mm ou mais (KOURKOUTAS et al., 2004). Como a força de fixação das células é fraca, o descolamento e a realocação celular são possíveis com o estabelecimento potencial de equilíbrio entre células adsorvidas e suspensas livremente. Richetti et al. (2011), considera que ocorrem ligações de baixa energia entre a membrana celular e as proteínas externas com o suporte de fixação, tais como interações de van der Waals ou hidrofílicas, ligações de hidrogênio e iônicas, entre outras.
No entanto, destaca-se como uma das principais vantagens desse método à relativa facilidade de realizar este tipo de imobilização. Em literatura, são citados como suportes para esse tipo de imobilização os materiais celulósicos, (DEAE-celulose, madeira, serragem, serradura deslignificada, resíduos agroindustriais), materiais inorgânicos (montmorillonite, hidromica, porcelana porosa, vidro poroso), etc. A seleção desses materiais depende de suas propriedades, como força mecânica, estabilidade física e química, caráter hidrofóbico/hidrofílico, capacidade de adsorção de enzimas e custo (DALLA-VECCHIA.;
NASCIMENTO; SOLDI, 2004; DRAGONE MELNIKOV 2007; NORTON; D’AMORE, 1994).
25 3.5.2. Aprisionamento dentro de uma matriz porosa
Neste tipo de imobilização, as células podem penetrar na matriz porosa até que a sua mobilidade seja obstruída pela presença de outras células, ou o material poroso seja formado numa cultura de células. Ambos os métodos de imobilização são baseados no aprisionamento de células dentro de uma rede rígida para evitar que as células se difundam para o meio circundante, enquanto ainda permite a transferência em massa de nutrientes e metabólitos.
3.5.3. Aglomeração
A floculação celular tem sido definida por muitos autores como um aglomerado de células para formar uma unidade maior. Esse método de imobilização pode ser espontâneo e natural ou artificial e induzido. O floco de células formado tem como propriedade a adesão a aglomerados e sedimentos (JIN; SPEERS, 1998). Para Kourkoutas et al., (2004) a aglomeração celular pode ser considerada como uma técnica de imobilização, já que o grande tamanho dos agregados possibilita seu uso potencial em reatores. A capacidade de formar agregados é observada principalmente em fungos, como a levedura Saccharomyces cerevisiae. A floculação de levedura é uma propriedade de grande importância para a indústria cervejeira, pois afeta a produtividade da fermentação e a qualidade da cerveja, além da remoção e recuperação de leveduras. Este método de imobilização é afetado por muitos fatores, incluindo a composição da parede celular, pH, oxigênio dissolvido e composição do meio (JIN; SPEERS, 1998).
3.5.4. Contenção por barreira
A contenção de células por barreira é um método de imobilização que pode ser realizado por meio de filtros de membrana microporosa, por aprisionamento de células em uma microcápsula ou aprisionamento na superfície de interação de dois líquidos imiscíveis. Este tipo de imobilização é ideal quando são necessários produtos livres de células e transferência mínima de compostos (PARK; CHANG, 2000). Para Lebeau, Jouenne e Junter (1998), que estudaram a transferência de massa nesse processo, as principais desvantagens da imobilização das células entre as membranas microporosas são as limitações de transferência de massa e a possível incrustação da membrana causada pelo crescimento celular.
3.6. Suportes para imobilização
A adesão de células microbianas a superfícies sólidas é um processo natural dos microrganismos em ambiente livre. Suportes sólidos são usados naturalmente com o
26 propósito de fornecer estabilidade a colônia, para tal, a adesão celular é resultado das propriedades físico-químicas das células e do suporte (GIESE, 2015). A interação entre a célula e o suporte ocorre principalmente por meio de ligações de baixa energia como considerado na seção de ligação de superfície. Para tanto, é necessário a escolha adequada de um suporte que promova a imobilização.
Para SCHIMIDELL et al. (2001), as principais características de um suporte para a imobilização de células vivas são as seguintes: não toxidez às células; alta capacidade de retenção; resistência ao ataque químico e microbiano; pouca sensibilidade às possíveis solicitações mecânicas, seja de compressão por peso, de tensões de cisalhamento ou eventuais pressões internas e externas de gases; e alta difusividade de substratos e produtos.
O suporte deve ser quimicamente inerte às reações que se processam no meio, a fim de resistir nas condições de fermentação, de modo que ele não se torne um fator de inviabilidade ao processo, nem promova a formação de compostos de possam inibir o desenvolvimento celular. Nesse sentido, a insolubilidade é uma característica essencial. A solubilidade do suporte pode provocar alterações físico-químicas no meio, além de desprender a cultura tornando o processo inviável. A morfologia do material também é importante, pois ele deve ter alta porosidade a fim de permitir o confinamento das células (RICHETTI et al., 2011). E Lebeau, Jouenne e Junter (1998), inserem na discussão a afinidade desse material com substâncias aquosas, sendo desejável que o suporte seja hidrofílico, de modo a se obter uma boa difusividade do substrato e dos produtos. Logo, quando os materiais atendem a essas características, podem ser escolhidos como suporte para a imobilização de microrganismos.
Vasconcelos, Lopes e França (2004) trabalhando reatores contínuos, imobilizou Saccharomyces cerevisiae em bagaço de cana-de-açúcar e avaliou a influência da taxa de diluição do sistema e a quantidade de células suportariam aos ciclos operacionais. Deste modo, foram imobilizadas 109 células. g-1 de suporte, sendo que este manteve estabilidade operacional em ciclos operacionais de até 60 dias, com taxa de diluições variando de 0,05 h -1 para 3,0 h -1. Para tanto o autor conclui que a melhor taxa de diluição foi de 0,83 h-1, alcançando uma eficiência de fermentação em torno de 85 %.
Santos (2008), imobilizou leveduras em dois diferentes colmos de bambu e em fibras de coco, onde os três tipos de suporte mostraram-se altamente eficientes para a imobilização, onde os três apresentaram boa estabilidade fermentativa até o ciclo fermentativo 74º. As
27 eficiências das fermentações dos três sistemas mostraram-se elevadas, em torno de 89 % do valor teórico. Contudo o autor destaca que a partir do ciclo 74 o material apresenta resistência a difusão dos compostos, provocando a morte das células imobilizadas mais internamente.
Verbenllen et al. (2006), apresentam que existe uma demanda pelo desenvolvimento da técnica de imobilização, devido ganho de eficiência real, as vantagens do processo fermentativo na presença de células imobilizadas tornam-se notório. Porém, há ainda fatores técnicos e econômicos que impedem a implantação desses sistemas em escala industrial, tal como a grande quantidade de suporte por reator, o que implica numa demanda maior por materiais disponíveis a essa finalidade. Logo, Santos (2008), considera que são necessários estudos que viabilizem a utilização de materiais alternativos, com tratamentos que atendam as demandas de processo.
3.6.1. Bagaço de Caju
O bagaço de caju (Anacardium ocidental L.) é o resíduo proveniente da extração do caldo do pedúnculo do caju, sendo esse rejeito correspondente a aproximadamente 1,5 milhões de toneladas por ano na região nordeste brasileira (HOLANDA apud LUCIANO et al., 2011). Luciano et al. (2011), cita como uma justificativa a grande quantidade de bagaço de caju o fato de o pedúnculo corresponder a cerca de 90 % do que consideramos como caju, que na verdade é o pedúnculo e o fruto verdadeiro é a castanha. Na indústria do caju, a castanha possui alto valor agregado, de modo semelhante o caldo do pedúnculo, ou suco também apresenta sua viabilidade econômica, entretanto, a parte mais volumosa é descartada após a prensagem para extração do caldo.
Pacheco (2009), destaca que a elevada produção desse resíduo o torna atrativo ao uso em outros processos tecnológicos, devido a disponibilidade de matéria-prima. Para Gondim. (2009), além do grande volume de resíduo e as tendências renováveis do uso de resíduos, as características deste material lignocelulósico, como a porosidade proporcionam o ganho espaço em pesquisas cientificas recentemente (GONZÁLEZ-GARCÍA, 2018).
Azevedo et al. (2009), caracterizou o resíduo de caju desidratado com os seguintes valores para matéria seca (88,70%), extrato etéreo (4,15%), proteína bruta (14,00%), fibra bruta (12,0%), cálcio (0,45%), fósforo (0,30%), tanino (0,8%) e energia bruta (4.320 kcal.kg-
1), sendo evidente a grande concentração de material orgânico.
28 3.7. Tratamentos dos materiais para desenvolvimento de porosidade
O uso de materiais lignocelulósico em produção de matrizes porosas estão em grande desenvolvimento atualmente, além de atenderem a demanda do reuso de resíduos, essas novas aplicações desses materiais estão ganhando destaque devido a características deles.
González-García (2018), destaca que esses materiais apresentam elevada concentração de três polímeros a base de carbono, oxigênio e hidrogênio, sendo eles: a celulose, a hemicelulose e a lignina. Esses novos materiais podem ser obtidos por meio de diversos tratamentos, a depender das características esperadas dele.
Brányik et al, (2002), trabalhando com bagaço de malte para imobilização de microrganismos, observou que alguns processos químicos promoviam alterações na superfície do suporte. Estudos semelhantes realizados por Dragone, Mussatto e Silva (2007).
comparam três diferentes metodologias de tratamento desses suportes, determinando que o tratamento proposto por Brányik et al, (2002), trabalha uma sequência de reações no material que proporcionam uma maior porosidade superficial. Tratamentos ácidos hidrolisam o amido residual e são eficientes na remoção de hemicelulose, consequentemente a remoção da hemicelulose torna o material mais exposto o que favorece o processo de deslignificação, logo, este método proposto apresenta-se como eficiente no preparo de superfícies porosas.
Outro meio de produção de matriz porosa a partir de resíduos lignocelulósicos bastante difundido é a ativação de carbono. Nesse sentido, González-García (2018), revisando esses processos considera que cada reagente químico permite formação de estruturas porosas diferentes no precursor. Marsh e Rodríguez-Reinoso (2006), consideram que além de outras variáveis como temperatura e o tempo, o agente químico influencia diretamente no material, sendo que agentes ácidos tendem a desenvolver poros maiores (mesoporos e macroporos), enquanto agentes básicos formam poros menores, ou seja, os micrósporos.
Zuo, Yang e Liu (2010), trabalhando com ácido fosfórico (H3PO4) como agente ativante de madeira, notou que alterações no tempo e temperatura do tratamento de ativação, resultavam em volume de poros diferentes, de modo a concluir que uma ativação com elevada taxa de ganho de temperatura (5-7,5 °C.min-1), uma temperatura de ativação na faixa 400 a 450 °C e um tempo de 90 min resulta em um tratamento mais propício a gerar mesoporos.
29 Já Prauchner e Rodríguez-Reinoso (2012), trabalhando com ativação química da casca de coco, avaliou os parâmetros temperatura de ativação, a taxa de impregnação do agente químico no precursor, e observaram que uma temperatura ótima ocorre por na faixa de 400 a 550 °C, a partir do qual começa a reduzir a porosidade. Este estudo também aponta que para a casca de coco como material precursor, uma taxa de 0,54 g de agente químico para cada grama de precursor na etapa de impregnação é considerada como uma razão ótima para o tratamento, tendo em vista que concentrações maiores não influenciaram muito na porosidade do material.
30 4. METODOLOGIA
4.1. Matéria-prima
Os cajus utilizados para produção dos suportes foram obtidos no comércio da cidade de Mossoró-RN. Os cajus foram prensados manualmente e em seguida foram submetidos à 3 lavagens com água. Depois disso o bagaço foi colocado em estufa (Estufa com circulação e renovação de ar da marca Tecnal, modelo: TE-394/1) a 60 °C por um período de 24 h.
Após a secagem as amostras foram trituradas em moinho de facas e peneiradas, sendo o material desejável entre os diâmetros 0,84 e 0,17 mm. Depois de padronizadas as amostras foram armazenadas no dessecador com sílica.
4.2. Tratamento do bagaço de caju
As amostras de caju foram submetidas a dois diferentes tipos de tratamentos, um tratamento ácido básico conforme sugerido por Dragone, Mussatto e Silva (2007), com algumas alterações, sendo que algumas foram propostas por Pacheco (2009) devido as pequenas divergências entre o bagaço de malte usado por Dragone, Mussatto e Silva (2007).
O outro tratamento proposto por Prauchner e Rodríguez-Reinoso (2012), consistindo no preparo de carvão ativado tendo como precursor a casca de coco, já para este estudo usou- se o bagaço de caju.
4.2.1. Tratamento ácido básico
As amostras de bagaço caju seco e padronizados quanto a granulometria foram inicialmente submetidas ao tratamento ácido. O bagaço de caju foi colocado em um banho de ácido clorídrico (HCl) 3 % (v/v), na proporção de 100 gramas de bagaço para 1500 mL de solução acida, a mistura foi realizada em um becker de 2 L que foi colocado em um banho termostático (Banho termostático, marca Tecnal, modelo: TE/0541) a 60 °C sob agitação durante 2,5 h.
Após o tratamento ácido, o material foi filtrado e submetido a várias lavagens com água destilada até que o pH do material entrasse em equilíbrio com o da água, em aproximadamente 6. Despois disso, o bagaço de caju foi seco em estufa (Estufa com circulação e renovação de ar, marca: Tecnal, modelo: TE-394/1) a 60 °C por 24 h.
As amostras após serem tratadas com ácido, lavadas e secas foram colocadas em um banho básico. O bagaço de caju foi colocado em banho de hidróxido de sódio (NaOH) 2 % (m/v), na proporção de 100g de bagaço para 1500 mL de solução básica. As amostras foram
31 divididas em erlenmeyers de 500 mL, e colocados na incubadora (Incubadora Shaker, marca:
Solar, modelo: SL 222) a 30 °C sob agitação de 150 rpm durante 24 h.
Após o tratamento básico, o material foi filtrado e submetido a várias lavagens com água destilada até que o pH do material entrasse em equilíbrio com o da água, em aproximadamente 6. Na sequência, o bagaço foi seco em estufa (Estufa com circulação e renovação de ar, marca: Tecnal, modelo: TE-394/1) a 60 °C por 24 h. O material foi novamente submetido a moagem e peneiramento, ficando com as partículas com diâmetro entre 0,84 e 0,17 mm. As amostras foram armazenadas em dessecador com sílica. A Figura 2 apresenta o fluxograma de processamento do material conforme já exposto.
4.2.2. Tratamento de carvão ativado para o bagaço de caju.
Para a ativação química do bagaço de caju, o tratamento foi dividido em duas etapas, primeiramente ocorre a impregnação do material e posteriormente a ativação. O bagaço de caju foi inicialmente preparado seguindo o item 3.1, em seguida foi impregnado com uma solução de H3PO4 (10 mL.g-1 de precursor), a concentração foi determinada a partir da quantidade de ácido colocado, sendo a taxa determinada por Prauchner e Rodríguez-Reinoso (2012), de 0,5 gramas de ácido para cada grama de precursor.
A etapa de impregnação foi conduzida durante 2 h sob agitação, com temperatura de 85 °C, nesta etapa é destinada para a difusão da solução através das partículas de bagaço de caju. Em seguida, a temperatura da solução foi aumentada para a ebulição da água e a completa incorporação do produto químico, nesta etapa a temperatura foi elevada a 150 °C por aproximadamente 30 min.
Na etapa de ativação, o material foi levado em um cadinho de porcelana para um forno mufla (Forno industrial mufla, marca: Zezimaq), até uma temperatura de 450 °C durante 2 h (6 °C.mim-1), sob um fluxo de nitrogênio gasoso N2 de 100 mL.min-1. Depois de ativado o material foi lavado com água destilada até alcançar um pH de 6. Os produtos foram secos em estufa (Estufa com circulação e renovação de ar, marca: Tecnal, modelo: TE- 394/1), a 100 °C até atingirem massa constante. A Figura 2, apresenta também fluxograma do processamento do carvão.
32 Figura 2 - Fluxograma dos tratamentos dos suportes.
4.3. Microrganismo
O microrganismo usado na fermentação foi a levedura Saccharomyces cerevisiae obtida comercialmente na forma liofilizada.
4.4. Meio de cultura
O meio utilizado para a propagação e imobilização do microrganismo, foi o meio complexo YEPD (Yeast Extract-Peptone-Dextrose) constituído por: extrato de levedura 10 g.L-1, peptona 20 g.L-1 e glicose usada nas concentrações definidas a depender da finalidade, sendo: 100 g.L-1 para o meio de propagação e 120 g.L-1 para o meio de imobilização e desenvolvimento celular.
4.5. Cultura estoque
Foram preparados 250 mL de meio YEPD para propagação (100 g.L-1 de glicose) em um frasco schott, o meio foi esterilizado em autoclave (Autoclave, marca: Prismatec, modelo: autoclave vertival CS) a 110 °C por 10 minutos. Após o resfriamento do meio foram adicionados 2 g da levedura Saccharomyces cerevisiae em pó, e em seguida o meio inoculado foi colocado sob agitação (Incubadora Shaker, marca: Solar, modelo: SL 222) de 150 rpm a 30 °C no agitador rotativo durante 24 h. Posteriormente , a cultura foi centrifugada por aproximadamente 2000 rpm por 2 minutos, produzindo assim um “pellet” de células. A cultura concentrada foi diluída em água salina 1% (m/v) e armazenada sob refrigeração de aproximadamente 5 °C para o uso na imobilização e contagem de células presentes.
33 4.6. Imobilização de leveduras
A imobilização foi realizada com meio YEPD para imobilização (120g.L-1 de glicose). Os suportes foram colocados nos meios, de modo a representarem 10 % em massa do volume do meio mantendo a proporção considerada por Gondim (2009), sendo os suportes, o bagaço de caju sem tratamento (item 3.1.), o bagaço tratado com ácido e base (item 3.2.1.) e o bagaço submetido ao tratamento de carvão ativado (item 3.2.1.). O pH dos meios foi ajustado para a faixa adequada ao crescimento dos microrganismos (4,3 a 4,7). Os meios com os suportes foram esterilizados em autoclave a 110 °C por 10 min. Após o resfriamento, foram inoculados aproximadamente 3x108 células da cultura estoque por grama de suporte. O meio com suporte e a cultura inicial foi incubado em estufa bacteriológica (Estufa bacteriológica, marca: Solar, modelo: SL 101) durante 24 h a 30 °C.
Os experimentos foram divididos em duas etapas; o experimento 1 foi realizado a imobilização em 10 g de cada tipo de suporte para avaliar a quantidade de células seriam avaliadas em cada tipo de suporte. No experimento 2 foram realizadas 10 imobilizações para cada tipo de suporte, sendo imobilizadas em 0,5 g de suporte em cada uma. O experimento 2 teve suas imobilizações interrompidas ao longo do tempo (0,25 h, 0,5 h, 0,75 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 17 h e 24 h) sendo eliminadas as culturas e destinou-se a avaliar a quantidade de células que foram imobilizadas dentro desse período. Foram coletadas para o experimento 2 amostras do meio fermentado em cada intervalo para avaliar as células livres no meio. A Figura 4, ilustra esquematicamente, como foram conduzidos os experimentos 1 e 2, bem como todas as etapas para avaliar a imobilização. Todo o experimento foi realizado em duplicada para eliminar erros.
4.7. Dessorção das células imobilizadas
Após a etapa de imobilização, foram estudas a quantidade de células imobilizadas.
Os erlenmeyers/tubos falcon retornaram a câmara de fluxo laminar, devidamente esterilizado com etanol 70 %, os outros materiais usados na câmara foram esterilizados com lâmpada UV. O bagaço foi então filtrado em peneira e lavado com água salina 1% (m/v) para remoção das células fracamente adsorvidas. Em seguida, os suportes foram transferidos para erlenmeyers e adicionado 30 mL de solução salina 1 % (m/v) para cada grama de suporte.
Depois os erlenmeyers foram colocados em agitação a 150 rpm durante 24 h para promover a dessorção das células. Após as 24 h, foram recolhidas as amostras e preparadas as diluições para fazer a contagem de células.
34 4.8. Contagem de células
A contagem de células livres no meio bem como as imobilizadas nos suportes foi realizada com o uso de uma câmara de Neubauer (marca: Improved) e um microscópio óptico com objetiva de 40X. Foram preparadas diluições das amostras para concentrações possíveis de contar o número de células. Foram retirados 0,1 mL da solução de leveduras e homogeneizados em vortex (Agitador Vortex, modelo: Even VX-38) com 0,3 mL de uma solução de azul de metileno 0,2%, sendo viáveis as células que não absorveram o corante.
Essa mistura foi colocada por capilaridade entre a câmara de Neubauer e a lamínula. Após 2 minutos esperando as células sedimentarem a câmara foi colocada no microscópio óptico para contagem de células.
A Figura 4, apresenta o esquema de quadriláteros presentes na câmara, segundo a técnica de contagem devem ser contatos os números de células nos quatro quadrantes dos vértices (N° Cél), conforme circulado.
Figura 3 - Desenho esquemático de uma câmara de Neubauer.
A concentração de células nas amostras foi calculada pela Equação 2.
𝑁° 𝑐𝑒𝑙(𝑥)
𝑚𝐿
=
𝑁° 𝑐𝑒𝑙4
∗ 𝑓𝑎 ∗ 𝑓𝑏 ∗
1𝑉
2
Na Equação 2, os termos: N° cél(x) representa o número de células por mL, contadas para uma amostra qualquer; N° cel foi o número de células contadas nos 4 quadrantes; 𝑓𝑎 representa o fator de diluição da amostra no corante, sendo igual a 4, já que foram colocados 0,1 mL de células para 0,4 mL; 𝑓𝑏 foi o fator de diluição da amostra para contagem; e V é o volume da câmara de Neubauer (0,1 mm3 = 0,0001 mL).
No experimento 2 foram contadas tanto as células imobilizadas (N° cél (i)) no suporte como as células livres (N° cél (l)) no meio para avaliar a eficiência da imobilização.
35 Figura 4 - Fluxograma dos experimentos de imobilização.
4.9. Método de eficiência da imobilização
Os dados foram analisados com base no método adotado por Santos (2008), onde avalia o número de células imobilizadas no suporte e o número de células no meio de fermentação.
Ao longo do experimento 2 foram coletadas as amostras e realizada a contagem das células livres e das imobilizadas seguindo o procedimento de imobilização (item 4.6), dessorção (item 4.7) e contagem de células (item 4.8). Pela Equação 3, determinou-se o quanto de células estavam sendo imobilizadas no decorrer da análise.
𝐸𝑓 =
𝑁° 𝑐é𝑙 (𝑖)𝑁° 𝑐é𝑙 (𝑖)+𝑁° 𝑐é𝑙 (𝑙) 3
36 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1. Suportes
O Bagaço de caju foi submetido aos diferentes tratamentos, propostos no item 4.2., produzindo os suportes para a imobilização (Figura 5).
Figura 5 - Suportes para imobilização.
Legenda: A - Suporte a base de caju sem tratamento; B - Suporte a base de caju submetido a tratamento ácido básico; C - Suporte de carvão ativado a base de bagaço de caju.
Durante os tratamentos, foram observados que os materiais sofreram uma expressiva perda de massa, sendo cerca de 60% a 70% no tratamento com ácido clorídrico e hidróxido de sódio e 90% durante o processo de ativação de carbono.
5.2. Microrganismos
Inicialmente, cultivou-se Saccharomyces cerevisiae para obtenção da cultura estoque, ou seja, uma massa de células para a imobilização. Para caracterizar a viabilidade da cultura estoque foram contadas as células viáveis e inviáveis pela coloração das células, a Tabela 1 apresenta os resultados da contagem.
Tabela 1 - Avaliação de células do meio de cultura estoque.
Parâmetro (N° cél. mL-1) x109 Células viáveis 3,170 ± 0,147 Células mortas 0,483 ± 0,305 Células totais 3,653 ± 0,437
O desenvolvimento dessa cultura estoque, apresentou que essa cultura é menos viável que a usado por Santos (2008), onde foram encontradas 2,06x1010 células viáveis no meio, porém esse número de células não causa interferências diretas tendo em vista que as
(A) (B) (C)
37 aplicações dessa cultura na imobilização foram calculadas e seguiram a razão de 3x108 células viáveis por grama de suporte.
5.3. Imobilização
5.3.1. Avaliação da capacidade de imobilização dos suportes
Foram inoculadas no meio 1 mL da cultura estoque diluída, cerca de 3x109 células viáveis em cada meio com suporte, os cultivos foram inoculados para a imobilização durante 24 horas. Os resultados para essa etapa estão expostos na Tabela 2.
Tabela 2 - Número de células imobilizadas nos suportes com 24 h de imobilização.
Número de células x108.g-1 de suporte
Bagaço de caju
Bagaço de caju Tratado com ácido e
base
Carvão ativado
Repetição 1 1,188 3,780 4,050
Repetição 2 1,368 3,900 4,560
Repetição 3 1,188 3,780 3,240
Repetição 4 1,380 3,780 5,280
Repetição 5 1,500 4,820 5,280
Média 1,324 4,012 4,482
Desvio Padrão 0,135 0,454 0,867
Os dados obtidos no experimento 1 apontam que os suportes submetidos aos tratamentos químicos são mais viáveis a imobilização, sendo o número de células imobilizadas no bagaço tratado com ácido e na base e o carvão ativado aproximadamente quatro vezes maior que a imobilizada no bagaço sem tratamento.
Estudos realizados por Batista (2005) e por Brányik et al. (2002), foram destacadas as diversas viabilidades presentes na técnica, no entanto Covizzi et al. (2007), colocam em discussão as características dos materiais suportes, considerando os aspectos físicos e químicos que podem desfavorecer a técnica. Assim, o experimento 1, destinou-se a identificar se os suportes desenvolvidos seriam capazes de imobilizar as leveduras. O número de células imobilizadas no carvão ativado após 24 h de imobilização (4,48x108 células. g-1 de suporte), foi semelhante ao encontrado por Gondim. (2009), que imobilizou 4,5x108 células. g-1, usando esta mesma metodologia e são superiores ao encontrado por Pacheco (2009), que imobilizou 1,3x108 células. g-1 em suporte de caju submetido ao mesmo tratamento com etapa de imobilização semelhante, ambos os estudos realizados também com
38 a levedura S. cerevisiae. Os resultados são também parecidos com os obtidos por Santos (2008), imobilizando leveduras em colmos de bambu e em casca de coco, que ficaram entre 4x108 e 4,5x108 células. g-1.
5.3.2. Avaliação do tempo de imobilização
Para avaliar a imobilização ao longo do tempo, foram inoculados 1,5x108 células em cada meio com suporte, sendo mantida a proporção de 3x108 células por grama de suporte.
Os cultivos foram incubados para imobilização a 30 °C durante os tempos determinados no item 4.6. Assim, o experimento 2, avalia a quantidade de células imobilizadas em cada tipo de suporte ao longo do tempo, os dados são apresentados no gráfico da Figura 6.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
2,0x107 4,0x107 6,0x107 8,0x107 1,0x108 1,2x108 1,4x108
N°cél.g-1 de suporte
Tempo (h)
Bagaço sem tratamento Bagaço tratado ácido-base Carvão ativado
Figura 6 - Curva de imobilização de células ao longo de 24 h.
Os dados apresentam que a imobilização em todos os suportes ocorre principalmente nas primeiras 6 h de contato, sendo alcançados picos de imobilização para o bagaço sem tratamento e para o tratado com ácido e base de 9,11x107 e 1,27x108 número de células. g-1 de suporte, respectivamente.
O desenvolvimento celular mais acelerado no início do processo é atribuído por Madigan (2016) as condições que o meio proporciona, nas primeiras horas, o meio apresenta mais substrato, proporcionando a saturação do microrganismo, e consequentemente gerando um crescimento exponencial.
39 Os estudos envolvendo a técnica de imobilização, apontam que a técnica em si, é muito viável para os bioprocessos devido a criar estabilidade ao microrganismo no meio de fermentação, promovendo maior conversões e consequentemente mais produtos (COVIZZI et al., 2007; Gondim., 2009; SCHIMIDELL et al., 2001; VERBELEN et al., 2006). No entanto, Richetti (2011), considera que o uso da técnica de imobilização por adsorção das células na superfície do suporte é também de fácil dessorção, isso se deve as ligações de superfície serem fracas, e liberarem a célula para o meio de fermentação.
Nesse sentido, Doran (1995) considera que o número de células imobilizadas influencia diretamente no bioprocesso promovido com esse tipo de imobilização, embora existam outros fatores a serem considerados, tais como: a difusão do substrato e do produto, a formação de colônias agrupadas na superfície e outros. Grandes números de células imobilizadas garantem que embora algumas se desprendam, muitas outras ainda permanecem no suporte.
O gráfico apresentado na Figura 7, expressa o que para Covizzi et al. (2007), e tido como um platô de atividade metabólica. Microrganismos livres provocam picos de atividade enzimática, no entanto, na imobilização é alcançado um platô que pode durar por muitas horas atendendo a uma maior conversão. PRASAD et al. (2005), ainda consideram que quando o número de células imobilizadas chega à região uma estacionaria, ou seja, onde ocorre o platô, a alta atividade metabólica é devido a estabilidade celular criada pelo suporte.
A curva de células do carvão ativado apresenta comportamento crescente ao longo do tempo, logo, embora menos acelerada após o platô, o processo de imobilização continua.
Desta forma, uma hipótese que pode ser considerada, é de que devido ao carvão ser uma matriz porosa, pode haver mais macroporos superficiais, e as células inicialmente imobilizadas estarem se desenvolvendo nessas regiões, porém, devido a formação dos géis de adesão celular das células mais externas a difusão do substrato e produto está sendo dificultada.
5.3.3. Eficiência de imobilização
O estudo da eficiência da imobilização foi realizado juntamente com o de avaliação do tempo de imobilização de células, sendo que para este estudo, quando as amostras eram coletadas foram contatas as células livres no meio. A Figura 7 apresenta um gráfico das eficiências de imobilização dos três materiais, calculados pela Equação 3.
40
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
Eficiência
Tempo (h)
Bagaço sem tratamento Bagaço tratado ácido base Carvão ativado
Figura 7 - Eficiência de imobilização de células nos suportes.
O gráfico da Figura 7 demonstra que a imobilização das células alcança sua eficiência máxima em um tempo de até 6 h para o bagaço tratado com ácido-base e para o bagaço sem tratamento, já para o carvão ativado há um desenvolvimento de eficiência ao longo do tempo, devido ao aumento de células imobilizadas, como já discutido no item 5.3.2.. A eficiência foi de 41,8 % em 6 h, de 34,8 % em 2 h e de 26,4 % em 12 h, para o bagaço tratado com ácido e base, o bagaço sem tratamento e o carvão ativado respectivamente. Logo, é possível considerar que a imobilização se processa em tempos inferiores as 24 horas esperadas, esse comportamento também foi apontado por Gondim. (2009).
A técnica de adsorção natural em superfície é uma das técnicas de imobilização mais viável, pois não demanda um custo e fixa as células, e embora algumas células possam se desprender devido as ligações fracas, existe a manutenção do equilíbrio entre as células imobilizadas e as livres (VERBELEN et al., 2006). Gondim. (2009) apontam que esse gradiente de concentração celular pode ser mais bem avaliado por meio da eficiência de imobilização das células conforme mostrado na Figura 7.
A eficiência de imobilização é também um parâmetro avaliado por Batista (2005), onde foram imobilizadas células de Saccharomyces em partículas de gel de alginato de cálcio
