Introdução
A terapia fotodinâmica (PDT – do inglês Photodynamic Therapy) é uma técnica que vem sendo utilizada no tratamento do câncer, bem como em outras doenças não oncológicas [1-4], baseada na administração sistêmica de um foto-ssensibilizador que se acumula preferencialmente nos tecidos doentes [5], em razão da formação de complexos intravasculares entre as substâncias fotossensíveis e lipoproteínas de baixa densidade (LDL) [6]. Devido à maior concentração de receptores desta lipoproteína nas células neo-plásicas (em comparação com as normais), há o
acúmulo preferencial dos fotossensibilizadores sobre este tecido, de modo que a seletividade tumoral aumenta com o caráter lipofílico do agente fotossensibilizador [7,8].
O tumor é então irradiado, utilizando-se uma fonte de luz na região do vermelho ou infravermelho próximo, a fim de que a radiação penetre efetivamente no tecido neoplásico, já que emissões abaixo de 600 nm são absorvidas por cromóforos bioendogênicos e/ou espalhadas pelos tecidos, o que torna a fotoxidação apenas superficial [9]. A irradiação do tumor provoca a excitação do fotossensibilizador a um estado eletrônico de maior energia, do qual pode
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Volume 32, número 1, 2007
Avaliação da atividade fotodinâmica de porfirinas para uso
em terapia fotodinâmica através da fotoxidação de triptofano
J. N. Ribeiro1*, R. A. Jorge2, A. R. da Silva2, A. V. Flores3, L. M. Ronchi1, A. C. Tedesco4
1Laboratório de Química Médica Ambiental, Departamento de Ciências Fisiológicas, Centro Biomédico, Universidade
Federal do Espírito Santo-UFES, Vitória-ES
2Departamento de Fisico-Química, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas-SP 3Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo - USP, Ribeirão Preto-SP
4Centro Federal de Educação Tecnológica do Espírito Santo – CETETES, Vitória-ES
Resumo: Neste trabalho investigou-se a atividade fotodinâmica de octaetilporfirina (OEP),
octaetilporfi-rina de vanadil (VOOEP) e meso-tetramesitilporfioctaetilporfi-rina (m-TMP). Este estudo foi realizado através da deter-minação da constante da velocidade de fotoxidação (kf) do aminoácido triptofano (Trp). A participação do oxigênio singlete nesta fotoxidação foi determinada através da adição de azida de sódio e água deuterada no meio de reação. Os valores de kf/10-4s-1para a fotoxidação de Trp demonstraram que OEP (2,80 ±0.05) é mais eficiente do que m-TMP (1,62 ±0,07) e VOOEP (0,81 ±0,08). Os valores de kfforam menores na presença de azida de sódio e maiores na presença de água deuterada, sugerindo que o oxigênio singlete é o responsável pela atividade fotodinâmica de OEP, VOOEP e m-TMP. Estes resultados sugerem também que as diferenças na atividade fotodinâmica entre as porfirinas podem ser associadas com as diferenças na estrutura molecular das mesmas. A presença do grupo vanadil (V=O) interfere claramente na atividade fotodinâmica de OEP causando considerável redução na sua eficiência.
retornar ao estado fundamental via processos radioativos (como fluorescência ou fosforescên-cia) ou não radioativos (como conversão interna, cruzamento intersistema ou relaxações vibra-cionais). Dentre estes processos de decaimento energético, o cruzamento intersistema é funda-mental para a terapia fotodinâmica (transição proibida por spin, onde o fotossensibilizador no estado eletrônico singlete excitado (S1) sofre uma transição para o estado triplete excitado (T1)). O fotossensibilizador no estado triplete excitado apresenta um tempo de vida maior do que no estado singlete excitado, em razão da transição T1→So ser proibida por spin. Dessa forma, o fotossensibilizador no estado T1 pode interagir fotoquimicamente com moléculas de oxigênio, localizadas próximas à região irradiada, gerando espécies reativas que oxidam biomoléculas e danificam o tecido irradiado (Figura 1) [10-12].
Figura 1. Mecanismos (Tipo Ιe ΙΙ) de geração de ROS pela combinação de luz, fotossensibilizador (FTS) e oxigênio no estado fundamental (3O
2).
A fotodestruição dos tecidos pode ocor-rer através da geração de radicais livres extremamente reativos (mecanismo tipo I) ou de oxigênio singlete (mecanismo tipo II) [13-15]. No mecanismo tipo I, o fotossensibilizador no estado excitado interage diretamente com um substrato orgânico e/ou outras moléculas vizi-nhas (preferencialmente O2), produzindo radi-cais ou íons radiradi-cais através de reações de
trans-ferência de átomos de hidrogênio ou de elétrons [8-14]. A maioria destes radicais reage instanta-neamente com o O2, gerando uma mistura com-plexa de espécies reativas de oxigênio (ROS), tais como o peróxido de hidrogênio (H2O2), ra-dical superóxido (O2•−) e hidroxila (•OH) [14], os quais são capazes de oxidar uma variedade de biomoléculas [16].
No mecanismo tipo II obtém-se oxigênio singlete (1∆
g O2 ou 1O2), altamente reativo, através da transferência de energia do fotossensi-bilizador no estado triplete excitado para o esta-do triplete fundamental esta-do oxigênio (3∑
g– O2ou 3O
2). Em razão das reações de transferência de energia serem mais rápidas do que as reações de transferência de elétrons, o mecanismo tipo II é geralmente favorecido nas reações de fotoxi-dação [17-20]. Como o tempo de vida do oxigênio singlete é muito curto (~ 2 µs), esta espécie reativa reage no seu sítio de formação. Isto significa que moléculas do fotossensibi-lizador não ligadas às células não serão fototóxi-cas. O oxigênio singlete, quando gerado, pode reagir com lipídeos insaturados (incluindo coles-terol), aminoácidos (como o triptofano, histidina e metionina) e ácido nucléicos1. Lipídeos insatu-rados e proteínas são os principais constituintes das membranas biológicas. Portanto, as reações fotoxidativas ocasionam alterações da permeabi-lidade celular [10], provocando a morte do tecido tumoral via necrose ou apoptose [3,11,21].
O primeiro FTS a ser aprovado pela FDA para o tratamento de câncer através da PDT foi um derivado de hematoporfirina (Photofrin) produzido pela QLT Inc. e atualmente vendido pela Axcan Scandipharm Inc. Outras variantes comerciais são: Photosan, Photogem e Photocarcinorin[7].
constituído por uma mistura complexa de derivados de hematoporfirinas, de maneira que a purificação da droga não é um procedimento simples nem barato, sendo, portanto, pouco acessível economicamente (75mg de Photofrincustam aproximadamente U$ 2.200) [8]. Em vista disto, vários outros fotossensibi-lizadores têm sido investigados [8,22,23].
Alguns trabalhos têm mostrado que a retenção de fotossensibilizadores em células tumorais aumenta com a diminuição da polari-dade da molécula, fato que eleva a eficiência do fotossensibilizador [24,25].
Em razão dos fatos citados acima, nós avaliamos, in vitro, a capacidade de 3 compostos de baixa polaridade (meso-tetramesitilporfirina (m-TMP), octaetilporfirina (OEP) e vanadil octaetilporfirina (VOOEP) (Figura 2) de fotoxi-dar triptofano (Trp) na presença de luz e oxigênio. Além disso, experimentos foram reali-zados para avaliar a participação do oxigênio sin-glete no processo fotoxidativo.
Material e Métodos Material
As porfirinas m-TMP, OEP e VOOEP foram obtidas da Porphyrin Product, Inc. (Logan Utah, USA). O aminoácido triptofano (Trp) e o surfac-tante polioxietilenosorbitan monolaurato (Tween 20) foram obtidos da Sigma Chemical Company (St. Louis, USA). O NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4e a azida de sódio (NaN3) foram obtidos da Merck (Darmstald, Alemanha). O solvente acetato de etila foi obtido da Synth (Diadema, Brasil). A água deuterada (D2O) foi obtida da Aldrich Chemical Company, Inc (Milwaukee, USA).
Para irradiação das porfirinas foram utiliza-dos uma lâmpada de mercúrio Philips HPLN 80W e um filtro Oriel BG 38 para permitir a passagem de radiação na faixa de 400-600 nm. As intensidades de fluorescência de Trp foram obtidas através de um espectrofluorímetro Perkin Elmer LS55.
Métodos
Soluções aquosas contendo 50 µM do aminoácido Trp foram preparadas em tampão fos-fato salino (PBS: 0,15 M de NaCl, 1,9 mM NaH2PO4, 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4) contendo surfactante Tween 200,6% (m/v), acetato de etila 2% (v/v) e diferentes concentrações de OEP ou VOOEP ou m-TMP (0 - 10 µM). Estas soluções foram saturadas com oxigênio e irradiadas com lâmpada de mercúrio durante 60 minutos à tem-peratura ambiente (25 ±2oC). As intensidades de fluorescência de Trp foram obtidas através da excitação deste aminoácido em 280 nm, sendo a emissão monitorada entre 300-500 nm. Esta fluo-rescência foi monitorada em intervalos de 10 mi-nutos para se determinar a constante de velocidade de foto-oxidação (kf) de Trp na presença de oxigênio, luz e porfirinas. A lei de velocidade integrada para a fotoxidação de triptofano pode ser escrita, considerando-se a relação linear entre a fluorescência e a concentração da biomolécula [26], conforme a equação abaixo:
ln (F/F0)= -kft
onde F0= fluorescência inicial de Trp em 360 nm,
Figura 2. Estruturas de OEP (A), VOOEP (B) e
F= fluorescência de Trp no tempo t, kf= constante de velocidade de foto-oxidação de Trp. A partir de um gráfico de ln (F/Fo) versus t é possível determinar o valor da constante kfatravés do coeficiente angular. Posteriormente, foram acrescentadas a estas soluções diferentes concentrações de NaN3 (0 – 3000 µM) ou D2O (0 – 50% v/v) para se ve-rificar a participação do oxigênio singlete na fotoxidação do Trp por OEP, VOOEP e m-TMP.
Resultados e Discussão
Espécies reativas de oxigênio como o oxigênio singlete podem destruir o anel indol do Trp [6] (Figura 3). Tal evento pode ser detectado por decaimentos na intensidade de fluorescência deste aminoácido [11]. Os resultados deste tra-balho demonstraram que as três porfirinas foram capazes de fotoxidar Trp, sendo OEP mais efi-ciente do que m-TMP e ambas mais efiefi-cientes do que VOOEP. Isto pode ser confirmado através do decaimento na intensidade de fluorescência de Trp, que é maior na presença de OEP (Figura 4). Os valores das constantes de velocidade de fotoxidação (Tabela 1) indicam que o OEP foi 1,7 vezes mais eficiente que o m-TMP, enquanto este foi 2,0 vezes mais eficiente que o VOOEP. O grupo vanadil (V=O) interfere na atividade de OEP, provocando uma redução considerável em sua eficácia. Este evento pode ser decorrente da natureza paramagnética de VOOEP, o que pode resultar em um menor tempo de vida no estado triplete, comprometendo a geração de espécies reativas de oxigênio. No caso de m-TMP, a pre-sença de fenilas ligadas a grupos metilas no anel porfirínico também reduz a eficiência desta por-firina devido ao aumento de decaimentos não radioativos por processos roto-vibracionais [27]. No entanto, esta redução é menos acentuada do que a que ocorre com VOOEP.
Figura 4. Decaimento na intensidade dos espectros
de fluorescência de Trp na presença de 10 µM de OEP (A), VOOEP (B), m-TMP (C), luz e oxigênio.
Figura 3. Mecanismo de ação do oxigênio singlete
sobre o aminoácido triptofano [6].
(A)
(B)
Pode-se observar pela figura 5 que os valores de kf aumentam com o aumento das concentrações das porfirinas (Figura 5). No entanto, este aumento não é linear, provavel-mente devido à formação de agregados das por-firinas avaliadas. A formação de agregados provoca a diminuição do tempo de vida do fotossensibilizador no estado triplete em razão do aumento dos decaimentos não radiativos por conversão interna, tornando mais difícil a trans-ferência de energia do fotossensibilizador do estado triplete excitado para o 3O
2, o que diminui a eficiência do fotossensibilizador [28, 29]. Karns et al. [29] sugeriram que a agre-gação das porfirinas está associada à resistência do meio aquoso em abrir cavidades para as moléculas hidrofóbicas, resultando na
justaposição das superfícies hidrofóbicas para minimizar a área exposta ao meio aquoso, fato que poderia estar acontecendo neste trabalho. Entretanto, não é conveniente propor uma estrutura ou conformação do agregado das por-firinas estudadas neste sistema complexo, con-stituído de surfactante, tampão e solvente orgânico, sem utilizar técnicas adequadas.
Reinhard Schmidt [30] demonstrou que a água deuterada (D2O) diminui a energia vibracional das moléculas de oxigênio, fato que causa um aumento no tempo de vida do oxigênio singlete de 10 a 26 vezes, comparado à água não deuterada (2-3 µs) [31,32]. A azida de sódio (NaN3), ao contrário de D2O, é um efi-ciente supressor de oxigênio singlete [30-32]. Portanto, é esperado que a presença de D2O no meio reacional aumente a constante de veloci-dade da reação de fotoxidação do triptofano, enquanto que a azida de sódio cause uma diminuição, caso o mecanismo preponderante seja do tipo II.
Os gráficos apresentados na Figura 6 demonstram que os valores de kf referentes à fotoxidação ocasionada por OEP (A), VOOEP (B) e m-TMP (C), decrescem na presença de NaN3. Ao contrário, a presença de D2O (Figura 7) provoca um aumento considerável nestes valores. Tais dados sugerem que o mecanismo predominante na fotoxidação de Trp pelas três porfirinas é do Tipo II, ou seja, com destacada participação do oxigênio singlete. No entanto, deve-se ressaltar que não apenas o mecanismo Tipo II pode estar envolvido, já que vários tra-balhos têm demonstrado que a fotoxidação de biomoléculas pode ocorrer pelos dois mecanis-mos simultaneamente [20,32]. Segundo Ochsner [14], na presença de baixas concen-trações de triptofano (≤0,1 mM), o mecanismo do tipo II compete com o mecanismo do tipo I, mesmo em soluções altamente polares onde há o favorecimento das reações que envolvem espécies radicalares.
Do ponto de vista clínico, a participação do oxigênio singlete é preferível em Terapia Fotodinâmica devido à extrema reatividade desta espécie e ao seu tempo de vida extrememente curto, fato que evita danos aos tecidos sadios adjacentes ao tumor [33].
Tabela 1. Valores das constantes de velocidade de
foto-oxidação (kf) de Trp na presença de 10 µM de OEP, VOOEP, m-TMP, luz e oxigênio. Os valores representam a média de três medidas ± desvio padrão amostral.
Porfirinas kf para Trp / 10-4s-1
OEP 2,80 ± 0,05
VOOEP 0,81 ± 0,08
m-TMP 1,62 ± 0,07
Figura 6. Influência de NaN3na fotoxidação de Trp mediada por 10 µM de OEP (A), VOOEP (B), m-TMP (C), luz e oxigênio. Os valores apre-sentados representam a média de três medidas ±
desvio padrão amostral.
(A)
(B)
(C)
Figura 7. Influência de D2O na fotoxidação de Trp mediada por 10 µM de OEP (A), VOOEP (B), m-TMP (C), luz e oxigênio. Os valores apre-sentados representam a média de três medidas ±
desvio padrão amostral.
(A)
(B)
Conclusões
Os resultados deste trabalho demons-traram que as três porfirinas são capazes de fotoxidar Trp. Além disso, os efeitos supressor e estimulador de NaN3e D2O, respectivamente, na fotoxidação, sugerem que o oxigênio singlete seja a espécie reativa de oxigênio predominante neste processo. As diferenças observadas na atividade fotodinâmica das três porfirinas podem ser asso-ciadas com as diferenças em suas estruturas mo-leculares. O grupo vanadil (V=O) interfere na atividade de OEP, provocando uma redução
con-siderável em sua eficiência. A presença de feni-las, ligadas a grupos metifeni-las, no anel porfirínico de m-TMP, também reduz a eficácia desta porfi-rina. No entanto, esta redução é menos acentuada do que a que ocorre com VOOEP. Portanto, os dados obtidos neste estudo estimulam a con-tinuidade dos trabalhos com OEP e m-TMP, visando a futura aplicação das mesmas em Terapia Fotodinâmica.
Recebido em: 14/08/2006. Aceito em: 17/01/2007.
J. N. Ribeiro, R. A. Jorge, A. R. da Silva, A. V. Flores, L. M. Ronchi, A. C. Tedesco. Evaluation of photodynamic activity of porphyrins for use in photodynamic therapy through tryptophan photo-oxidation.
Abstract: In this work an investigation of the photodynamic efficiency of octaethylporphyrin (OEP),
vanadyl octaethylporphyrin (VOOEP), and meso-tetramesitylporphyrin (m-TMP) was done. This study was performed by the determination of photoxidation rate constants (kf) of the tryptophan amino acid (Trp). The mechanism involved in the photoxidation of Trp was also studied using sodium azide (singlet oxygen scavenger) and deuterium oxide. The values of kf/10-4s-1 for Trp photoxidation demonstrated that OEP (2.80 ±0.05) is more efficient than m-TMP (1.62 ±0.07) and VOOEP (0.81 ±
0.08). The values of kfwere reduced by the presence of sodium azide and increased by deuterium oxide indicating that singlet oxygen is responsible by OEP, VOOEP, and m-TMP photoactivity. These results indicated that differences in the photodynamic activity between porphyrins could be associated with differences in their molecular structures. The presence of vanadyl group (V=O) interferes clearly in the photodynamic activity of OEP causing a considerable reduction in its efficiency.
Keywords: photodynamic therapy; porphyrins; singlet oxygen.
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