UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
ESCOLA DE VETERINÁRIA
Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE
ISOLADOS DO VÍRUS DA INFLUENZA
EM SUÍNOS NO BRASIL
DANIELA DE SOUZA RAJÃO
Belo Horizonte
Escola de Veterinária - UFMG
2012
1
Daniela de Souza Rajão
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DO
VÍRUS DA INFLUENZA EM SUÍNOS NO BRASIL
Tese apresentada à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal.
Área de concentração: Medicina Veterinária Preventiva. Orientador: Prof. Rômulo Cerqueira Leite
Co-orientadores: Profa. Zélia Inês Portela Lobato
Prof. Roberto Maurício Carvalho Guedes
Belo Horizonte
Escola de Veterinária - UFMG 2012
2
R161d
Rajão, Daniela de Souza, 1983-
Detecção e caracterização de isolados do vírus da influenza em
suínos no Brasil / Daniela de Souza Rajão. – 2012.
90p. : il.
Orientador: Rômulo Cerqueira Leite
Co-orientadores: Zélia Inês Portela Lobato, Roberto Maurício
Carvalho Guedes
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Escola
de Veterinária
Inclui bibliografia
1. Suíno – Doenças – Teses. 2. Vírus da influenza – Teses. 3.
Imunohistoquímica – Teses. 4. Reação em cadeia da polimerase –
Teses. I. Leite, Rômulo Cerqueira. II. Lobato, Zélia Inês Portela. III.
Guedes, Roberto Maurício Carvalho. IV. Universidade Federal de
Minas Gerais. Escola de Veterinária. V. Título.
5
Dedico esta realização aos meus pais, Cid e Cecília, por serem meus maiores incentivadores; à minha irmã, Juliana, pelo companheirismo; ao Thiago, pelo carinho; ao avô Roberto, por ter sido minha inspiração, mesmo que distante.
7
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, por serem meu exemplo de sucesso e me fazerem querer ser sempre melhor. À minha irmã e meu cunhado, pela amizade e apoio para desabafar nos momentos de tensão. Ao Thiago, pelo carinho e por ter entrado na minha vida para torná-la mais feliz. Sem vocês eu não teria conseguido!
Ao Professor Rômulo Cerqueira Leite, exemplo profissional e principal motivador, sem o qual esta e outras conquistas não seriam possíveis. Foi o senhor quem fez tudo acontecer!
À Professora Zélia Inês Portela Lobato e ao Professor Roberto Maurício Carvalho Guedes, essenciais para a realização deste doutorado, pelo incentivo e apoio constantes, pela paciência e por todos os ensinamentos.
Aos membros da banca, Dra. Janice Reis Ciacci-Zanella, Dr. Jorge Caetano Júnior, Dr. Marcos Bryan Heinemann e Dr. Jenner Karlisson Pimenta dos Reis, pelas contribuições para aprimorar este trabalho.
Aos Laboratórios Ipeve e Microvet, e ao Médico Veterinário José Eustáquio Cavalcante, pelo fornecimento das amostras utilizadas neste estudo.
À EMBRAPA Suínos e Aves, ao LANAGRO Minas Gerais e ao Dr. Alexandre Machado, pelo fornecimento das amostras referência de vírus influenza. Ao Dr. Kurt Rossow pelo fornecimento de controle positivo para a Imuno-histoquímica.
Aos colegas Diego Hussin, Marcela Gasparini e Bruno Brasil pelo imenso auxílio no desenvolvimento deste estudo, indispensáveis para a conclusão desta tese.
Aos Professores Jenner Karlisson Pimenta dos Reis e Marcos Bryan Heinemann, que fizeram parte de toda a minha trajetória na Escola de Veterinária e foram essenciais para o meu crescimento.
Às amigas do Retrolab, Fernanda, Helen, Fabiana e Gissandra, pela ajuda na elaboração deste trabalho e por tornarem os momentos no laboratório mais prazerosos. Aos demais companheiros do Retrolab, pelas opiniões e ideias, sempre bem-vindas.
À Dra. Amy Vincent, por abrir as portas para um novo mundo na pesquisa, e por proporcionar meu crescimento profissional e pessoal ao me receber em seu laboratório. À Dra. Crystal Loving, não só pelos ensinamentos, mas por fazer a minha estadia nos EUA inesquecível. Aos amigos do Swine Lab, no USDA, em especial à Pravina Kitikoon, Jamie Henningson, Doug Braucher e Phill Gauger, pela acolhida e pelos ótimos momentos vividos juntos.
Aos amigos da veterinária e do colégio, em especial às amigas Jú, Flávia, Lets, Marcela e Fê, pelos maravilhosos momentos de descontração para reduzir a tensão do dia-a-dia.
Aos funcionários do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, em especial ao Eduardo, Grazielle, Graciela, Anita e Doraci, pela disponibilidade e apoio. Ao Colegiado de Pós-Graduação, pelo acompanhamento e auxílio.
À CAPES pelo apoio financeiro ao meu doutorado e ao CNPq/Labex pelo apoio financeiro ao doutorado SWE; ao CNPq e à FAPEMIG, pelo financiamento deste projeto. Ao INCT-Pecuária pelo apoio a este projeto.
8
SUMÁRIO
ABREVIAÇÕES E SIGLAS ... 13 RESUMO ... 15 ABSTRACT ... 16 INTRODUÇÃO ... 17CAPÍTULO 1: REVISÃO DE LITERATURA ... 18
Classificação e caracterização do vírus Influenza ... 18
Genes e proteínas virais ... 19
Restrição de hospedeiros ... 20
Evolução genética do vírus Influenza ... 20
Histórico do vírus Influenza em suínos ... 21
Epidemiologia ... 21
Influenza suína e saúde pública ... 23
H1N1 pandêmico 2009 ... 24
Patogênese ... 24
Sinais clínicos e lesões ... 25
Resposta imune ... 26
Diagnóstico ... 27
Prevenção e vacinação ... 28
CAPÍTULO 2: EVIDÊNCIA SOROLÓGICA DA CIRCULAÇÃO DO VÍRUS INFLUENZA EM SUÍNOS DE MINAS GERAIS, BRASIL ... 31
Introdução ... 31
Material e Métodos ... 31
Resultados ... 33
Discussão ... 34
CAPÍTULO 3: IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO CLÍNICO- PATOLÓGICA DO VÍRUS INFLUENZA EM SUÍNOS NO BRASIL ... 36
Introdução ... 36
Material e Métodos ... 36
1. Amostras clínicas ... 36
2. Isolamento viral em cultivo celular ... 37
3. Reação de hemaglutinação (HA) ... 38
4. Imunocitoquímica ... 38
9
6. Extração de RNA e transcrição reversa ... 38
7. PCR em tempo real ... 39
8. Clonagem e construção da curva padrão ... 40
9. Quantificação de amostras positivas pela PCRrt ... 41
10. Diagnóstico histológico e imuno-histoquímico ... 41
11. Análise estatística ... 41
Resultados ... 42
1. Achados clínicos ... 42
2. Isolamento viral, hemaglutinação e imunocitoquímica ... 42
3. RT-PCR em tempo real e quantificação ... 42
4. Diagnóstico histológico e imuno-histoquímico ... 44
Discussão ... 46
CAPÍTULO 4: PERFIL SOROLÓGICO PARA O VÍRUS DA INFLUENZA EM GRANJAS COMERCIAIS DE SUÍNOS NO BRASIL ... 48
Introdução ... 48
Material e Métodos ... 48
Resultados ... 50
Discussão ... 53
CAPÍTULO 5: CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS VÍRUS INFLUENZA ISOLADOS DE SUÍNOS NO BRASIL EM 2009 E 2010 ... 57
Introdução ... 57
Material e Métodos ... 58
1. Amostras clínicas ... 58
2. Extração de RNA e transcrição reversa ... 59
3. PCR para segmentos HA e NA ... 59
4. Sequenciamento de nucleotídeos e análise filogenética ... 60
Resultados ... 61
1. Isolados virais ... 61
2. Análise filogenética ... 61
3. Análise de sítios antigênicos e de ligação a receptores ... 62
Discussão ... 69
CAPÍTULO 6: CONCLUSÃO ... 72
BIBLIOGRAFIA ... 73
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Genes dos vírus Influenza A e suas funções... 19 Tabela 2. Ocorrência da influenza suína no Brasil para animais e rebanhos... 34 Tabela 3. Títulos de Inibição da Hemaglutinação para rebanhos positivos e negativos... 34 Tabela 4. Percentual de animais com anticorpos contra múltiplos antígenos de vírus
influenza em Minas Gerais, Brasil... 34 Tabela 5. Conjunto de iniciadores e sondas para uso na PCR quantitativa em tempo real para
detectar ácidos nucléicos do vírus influenza após isolamento viral... 39 Tabela 6. Caracterização das granjas estudadas... 49 Tabela 7. Caracterização das amostras virais estudadas... 59 Tabela 8. Conjunto de iniciadores para uso na PCR para sequenciamento dos genes
hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) completos dos vírus Influenza A... 60 Tabela 9. Sequências de vírus Influenza A depositadas no GenBank com maior identidade
de nucleotídeos para os vírus isolados de suínos (A/swine/Brazil/1-17/2009 e A/swine/Brazil/18-20/2010) e de humano (A/Minas Gerais/21/2009)... 63
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama ilustrativo da estrutura do vírus influenza A. HA: hemaglutinina; NA: neuraminidase; NP: nucleoproteína; M1/M2: matriz; PA: polimerase ácida; PB1/PB2: polimerase básica... 18 Figura 2. Mapa das mesorregiões em que as granjas estudadas estavam localizadas... 32 Figura 3. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o vírus da influenza suína (SIV)
H1N1, H3N2 SIV e vírus influenza humano H1N1 nas granjas positivas. Amostras negativas (titulo <40); com título baixo (40 e 80); título médio (160 e 320); e título alto (≥640)... 33 Figura 4. Figura esquematizando os procedimentos realizados para detecção do vírus
influenza em fragmentos de pulmão suíno... 37 Figura 5. Gráficos de amplificação na PCR em tempo real para detecção de ácidos nucleicos
da proteína ribossomal canina S26 (A) e do vírus influenza (B)... 43 Figura 6. Gráficos representativos da curva padrão da PCR em tempo real quantitativa para
quantificação de ácidos nucleicos do vírus influenza. Gráfico da eficiência da reação (A) e de amplificação da curva padrão (B)... 43
11
Figura 7. Fotomicrografias de fragmentos de pulmão suíno com lesões histológicas (A, C, E) e detecção de antígenos do vírus Influenza A pela Imuno-histoquímica (B, D, F). (A): Parede bronquial com infiltrado neutrofílico e linfocítico intenso na lamina própria da mucosa e submucosa, particularmente ao redor de glândulas bronquiais. Hematoxilina e eosina, 100X. (B): Marcação positiva em vermelho da nucleoproteína viral no citoplasma de células do epitélio bronquiolar, 200X. (C): bronquiolite necrotizante com descamação do epitélio bronquiolar devido à necrose e infiltração linfocitária na lamina própria, 100X. (D): mesma área de C, corada pela imuno-histoquímica, com intensa marcação no epitélio de revestimento bronquiolar remanescente, 100X. (E): Intenso infiltrado inflamatório neutrofílico no lúmen alveolar, associado ao espessamento de septo interlobular devido ao edema e discreto infiltrado linfocitário, 40X. (F): Intensa marcação positiva em vermelho para nucleoproteína viral em glândulas (setas) e epitélio bronquiais, 40X... 45 Figura 8. Perfil sorológico para os vírus influenza suíno clássico (cH1N1) e pandêmico
(pH1N1) nas granjas estudadas. As médias geométricas dos títulos de anticorpos após transformação logarítmica foram comparadas entre as fases de criação das granjas positivas. Letras diferentes, minúsculas para cH1N1 e maiúsculas para pH1N1, indicam diferenças significativas (P<0,05). Granjas amostradas antes (G1 a G3a) e após (G3b a G6) a pandemia H1N1 2009 em humanos. A linha pontilhada indica o ponto de corte... 51 Figura 9. Distribuição dos títulos de anticorpos contra os vírus da influenza clássico
(cH1N1) e pandêmico (pH1N1) das diferentes fases de criação nas granjas estudadas com resultados positivos. Amostras negativas (titulo <40); com título baixo (40 e 80); título médio (160 e 320); e título alto (≥640). Diferenças significativas (P<0,05) entre a distribuição de títulos numa mesma fase de criação das diferentes granjas estão indicadas por letras diferentes. G3b a G6 = granjas 3b a 6, que obtiveram resultados positivos na Inibição da Hemaglutinação... 52 Figura 10. Estados onde estão localizadas as granjas nas quais os vírus influenza foram
isolados. N= número de propriedades analisadas por Estado... 61 Figura 11. Análise filogenética dos isolados brasileiros de suínos e de humano. Árvore
construída pelo método Neighbor-Joining de (A): HA (1658nt) e (B): NA (1363nt). Foram incluídas na análise sequências de genes HA e NA de vírus H1N1 pandêmico e de vírus sazonais H1N1 e H1N2 isoladas de suínos e humanos no mundo. A análise de HA (A) mostra quatro diferentes clusters (α, β, γ, δ) de vírus H1 endêmicos em suínos norte-americanos, indicado por chaves à direita da árvore. Losango fechado: amostras de vírus influenza pandêmico H1N1 2009 isoladas de suínos neste estudo; losango aberto: amostra de vírus influenza pandêmico H1N1 isolada de humano neste estudo; A/swine/Brazil/12A/2010: amostra de vírus influenza pandêmico previamente isolada no Brasil... 64
12
Figura 12. Dendrograma dos genes HA (A) e NA (B) dos isolados suínos e humano brasileiros, construída pelo método de Neighbor-Net. Sequências dos genes HA e NA de vírus pandêmicos humanos e suínos depositadas no GenBank foram incluídas na análise. Números 1 a 20: isolados suínos; número 21: isolado humano, destacado por borda preta; quadrado cinza: isolados brasileiros deste estudo; círculos pretos: sequências depositadas no Genbank e utilizadas como referência; pH1N1: sequências refêrencia de vírus pandêmicos de humanos; pH1N1swine: sequências refêrencia de vírus pandêmicos de suínos; quadrado cinza com borda preta = isolados brasileiros deste estudo idênticos a amostras depositadas no GenBank... 66 Figura 13. Alinhamento das sequências da hemaglutinina subunidade 1 (HA1) dos isolados
pandêmicos H1N1 suínos e humano brasileiros. As sequências foram alinhadas e numeradas usando a proteína HA1 madura. Pontos representam aminoácidos iguais aos da sequência consenso A/Mexico/4108/2009 (número de acesso GenBank GQ162170). Retângulos grandes: sítios antigênicos (Sa, Sb, Ca1, Ca2 e Cb); triângulos: resíduos de aminoácidos nos sítios de ligação ao receptor; asterisco: alteração observada no resíduo 203... 68 Figura 14. Alinhamento das sequências da proteína neuraminidase (NA) dos isolados
pandêmicos H1N1 suínos e humano brasileiros. Pontos representam aminoácidos iguais aos da sequência consenso A/Mexico/4108/2009 (número de acesso GenBank GQ162169). Triângulos: resíduos de aminoácidos associados com resitência a drogas anti-virais; asteriscos: alterações nos resíduos 106 e 248... 69
13
ABREVIAÇÕES E SIGLAS
AEC = Amino-etilcarbazolBALT = Tecido linfoide bronco-associado CDC = Center for Disease Control and Prevention cDNA = DNA complementar
cH1N1 = Vírus H1N1 suíno clássico CO2 = Dióxido de carbono
DNA = Ácido desoxirribonucléico DNAse = Desoxirribonuclease
dNTP = Desorribonuleotídeo trifosfatado ECP = Efeito citopático
EDTA = Ácido etilenodiamino tetra-acético EID50 = Dose infecciosa 50% em ovos
FAO = Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação g = Força centrífuga
HA = Hemaglutinina ou Reação de hemaglutinação
HA0 / 1 / 2 = Hemaglutinina molécula única/ subunidade 1 / subunidade 2 HCL = Ácido clorídrico
HE = Hematoxilina e eosina
HI = Reação de inibição da hemaglutinação IAV = Vírus Influenza A
IC = Intervalo de confiança ICQ = Imuno-citoquímica IF = Imunofluorescência IFNα = Interferon alfa
IgA / G / M = Imunoglobulina A / G / M IHQ = Imuno-histoquímica IL = Interleucina IM = Intramuscular KCl = Cloreto de potássio KH2PO4 = Hidrogenofosfato de Potássio
LANAGRO/MG = Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais M = Matriz ou Molar
MAPA = Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MDCK = Células Madim-Darby de rim canino
MEM = Meio essencial mínimo MgCl2 = Cloreto de magnésio
MgSO4 = Sulfato de magnésio
MHC = Complexo de Histocompatibilidade Principal mL = Mililitro
mM = Milimolar NA = Neuraminidase NaCl = Cloreto de sódio NaOH = Hidróxido de sódio
NeuAc α2,3/α2,6 = Ácido siálico N-acetilneuramínicos ligado à galactose α2,3/α2,6 ng = Nanograma
14
NS = Não estrutural nt = Nucleotídeo ºC = Graus Celsius
OFFLU = Rede de vigilância em influenza animal OIE = Organização Mundial de Saúde Animal OMS = Organização Mundial de Saúde p/v = Peso por volume
PA = Polimerase ácida PB1 = Polimerase básica 1 PB2 = Polimerase básica 2 pb = Pares de bases
PBS = Tampão salina fostato
PCR = Reação em cadeia da polimerase PCV2 = Circovírus suíno tipo 2
pH1N1 = Vírus H1N1 pandêmico PRCV = Coronavírus respiratório suíno
PRRSV = Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína q. s. p. = Quantidade Suficinte Para
RIDT = Teste rápido para detecção do vírus influenza RNA = Ácido ribonucleico
RNAse = Ribonuclease
RNC = Região não-codificadora RNP = Complexo ribonucleoproteína rpm = Rotações por minuto
rt = Tempo real
RT = Transcrição reversa
S26 = Proteína ribossomal canina S26 SFB = Soro fetal bovino
SIV = Vírus influenza suíno SN = Soroneutralização
TCID50 = Dose infecciosa 50% em cultura de tecido TNFα = Fator de necrose tumoral alfa
U = Unidades µg = Micrograma µL = Microlitro µm = Micrômetro µM = Micromolar
15
RESUMO
O vírus influenza A (IAV) é um importante causador de doença respiratória em suínos, mas a epidemiologia da influenza suína no Brasil ainda é desconhecida. O objetivo deste estudo foi detectar a infecção pelo IAV em suínos do Brasil; fazer a caracterização de cepas virais isoladas; e avaliar o perfil sorológico em granjas antes e após a pandemia de 2009. Foram utilizadas 355 amostras de soro de suínos de 17 granjas de Minas Gerais e 86 amostras de pulmão de 39 granjas de Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso, Santa Catarina, Rio Grande do Sul e Paraná. Dez amostras de soro de cada fase da produção de granjas coletadas antes (3) e após (4) 2009 foram utilizadas no perfil sorológico. As amostras de soro foram testadas pela inibição da hemaglutinação (HI) e as amostras de pulmão foram submetidas ao isolamento viral e à reação em cadeia da polimerase em tempo real (rtPCR). A caracterização genética foi realizada em 21 isolados. No levantamento sorológico, 158 amostras (44,5%) e 11 granjas (64,7%) foram positivas para o vírus suíno (SIV) H1N1; 36 animais (10,1%) e quatro granjas (23,5%) para H3N2 SIV; e 136 animais (38,3%) e 10 granjas (58,8%) para o vírus H1N1 humano. No isolamento viral, 31 amostras foram positivas e 36 na rtPCR. Das 86 amostras de pulmão, 60 foram submetidas à imuno-histoquímica e 38 (63,3%) foram positivas. No perfil sorológico, apenas granjas amostradas após 2009 eram positivas e com queda de anticorpos na creche. Todos os isolados foram agrupados com vírus pandêmicos H1N1. Este estudo comprova a circulação do IAV em suínos no Brasil, inclusive de vírus humanos, ressaltando a importância do suíno na epidemiologia da Influenza.
Palavras-chave: Influenza; suíno; granja; inibição da hemaglutinação; PCR; imuno-histoquímica; caracterização genética, H1N1 pandêmico, Brasil.
16
ABSTRACT
Influenza A virus (IAV) is an important pathogen causing respiratory disease in pigs. However, influenza epidemiology in Brazilian pigs is still unknown. The aim of this study was to detect IAV infection in Brazilian pigs; characterize isolated viruses; and evaluate the serological profile in swineherds prior and after 2009 pandemics. Serum samples of 355 animals from 17 herds in Minas Gerais and 86 swine lung samples from 39 herds in Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, and Paraná were used. Ten serum samples from each production phase from herds sampled before (3) and after (4) 2009 were used for the serological profile. Serum samples were tested by hemagglutination inhibition (HI), and lung samples were tested by virus isolation and real time polymerase chain reaction (rtPCR). Genetic characterization was performed in 21 isolates. In the serological survey, 158 animals (44.5%) and 11 herds (64.7%) were positive for swine virus (SIV) H1N1; 36 animals (10.1%) and 4 herds (23.5%) for SIV H3N2; and 136 animals (38.3%) and 10 herds (58.8%) for human H1N1 virus. Virus was isolated from 31 lung samples and 36 were positive for rtPCR. Sixty lung samples were tested by immunohistochemistry and 38 (63.3%) were positive. For the serological profile, only herds sampled after the pandemic were naturally infected and showed maternal derived antibodies decay in nursery stage. All isolates were clustered with pandemic H1N1 influenza when sequenced. This study shows influenza virus is circulating in Brazilian pigs, mainly human origin viruses, and proves the importance of the swine for influenza epidemiology.
Keywords: Influenza; swine; herd; hemagglutination inhibition; PCR; immunohistochemistry; genetic characterization, pandemic H1N1, Brazil.
17
INTRODUÇÃO
A Influenza é uma zoonose viral que representa um problema econômico e para a saúde pública e animal em todo o mundo. Os vírus Influenza A infectam várias espécies de mamíferos e aves, sendo que a transmissão interespécie pode ocorrer. Os vírus influenza apresentam alta variabilidade genética, principalmente nas duas proteínas principais da superfície viral, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Essas alterações genéticas podem levar à formação de novos subtipos e novas cepas virais contra os quais a população humana não possui imunidade, o que pode resultar na ocorrência de pandemias.
Alguns vírus Influenza estão adaptados à espécie suína, circulam nos rebanhos suínos mundiais, e são endêmicos em diversos países, causando perdas consideráveis na produção. No Brasil, estudos sobre o vírus da influenza em suínos são escassos e não foram capazes de identificar os subtipos e cepas virais endêmicas, mas comprovaram a infecção nos rebanhos suínos nacionais. O suíno pode se infectar tanto com vírus de origem aviária, quanto de origem humana, e apresenta potencial para atuar como hospedeiro intermediário na transmissão de vírus aviários para humanos. Dessa forma, essa espécie tem um papel importante na epidemiologia da Influenza, pois participa na formação de novos vírus, dificultando o controle da Influenza em outras espécies. Existe uma rede de vigilância da Influenza humana formada por diversos países do
mundo e coordenada pela Organização Mundial de Saúde (OMS), com o intuito de monitorar as cepas dos vírus da Influenza circulantes anualmente nos dois hemisférios e definir a melhor cepa vacinal. Além disso, foi criada uma rede de vigilância da Influenza animal (OFFLU) englobando diversos países, através da parceria entre a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO), para trocar informações científicas e conhecimentos, com o intuito de reconhecer e caracterizar cepas do vírus Influenza infectando animais, promovendo segurança alimentar mundial e o bem estar animal. A OMS em associação com a OIE preconizam o monitoramento da Influenza em suínos visando identificar vírus tipo aviários capazes de causar infecção em humanos. Entretanto, não existe um sistema de monitoramento do vírus influenza em suínos no Brasil, medida que é fundamental para avaliar os efeitos da infecção nos plantéis nacionais e identificar os variantes virais existentes.
A pouca informação sobre a infecção pelo vírus influenza em suínos no Brasil e a não associação do vírus a surtos respiratórios nos plantéis nacionais limitam a elaboração e implantação de medidas preventivas. Portanto, este estudo é um passo importante para determinar a real situação em que se encontra a infecção por esse vírus nos rebanhos brasileiros, permitindo elaborar medidas de prevenção e sistemas ideais para monitoramento.
18
CAPÍTULO 1: REVISÃO DE
LITERATURA
Classificação e caracterização do vírus
Influenza
A Influenza é uma doença respiratória altamente contagiosa que acomete humanos e animais. Os vírus influenza são membros da família Orthomyxoviridae (do grego orthos: padrão, ordenado; e myxo: muco) (Palese e Shaw, 2007). A família Orthomyxoviridae possui cinco gêneros diferentes: Influenza A, Influenza B, Influenza C, Thogotovirus e Isavirus (King et al., 2011). Os vírus influenza dos tipos A, B e C são diferenciados de acordo com características antigênicas distintas entre suas proteínas internas do nucleocapsídeo (NP) e da matriz (M) (Palese e Shaw, 2007). Os vírus influenza do tipo A podem ser classificados em diferentes subtipos com base nas características antigênicas de suas glicoproteínas de superfície, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Até o momento, 16 subtipos de HA e nove subtipos de NA foram identificados (Fouchier et al., 2005).
Os vírus influenza A (IAV) infectam naturalmente uma variedade de espécies aviárias e de mamíferos, incluindo humanos, suínos e equinos. Vírus Influenza B infectam apenas humanos, enquanto que os vírus influenza C infectam principalmente humanos, mas também foram isolados em suínos (Webster et al, 1992; Palese e Shaw, 2007).
Os vírus influenza apresentam genoma segmentado composto por RNA fita simples senso negativo. Os genomas dos vírus influenza A e B são divididos em oito segmentos (Palese e Schulman, 1976; Ritchey et al., 1976; Palese et al., 1977) (Fig. 1), enquanto que o dos vírus influenza C apresentam apenas sete segmentos (Palese e Shaw, 2007). O vírus possui um envelope
lipídico derivado da membrana plasmática da célula hospedeira, onde estão embebidas as proteínas HA, NA e matriz 2 (M2), se projetando na superfície viral. Cada segmento de RNA viral é envolto por várias moléculas de nucleoproteínas (NP), formando o complexo ribonucleoproteína (RNP) (Nayak, et al. 2004). As três subunidades da RNA polimerase (polimerase básica 1 - PB1, polimerase básica 2 - PB2 e polimerase ácida - PA) se ligam à extremidade 3’ do RNP, que por sua vez é envolto pela proteína da matriz 1 (M1) (Palese e Shaw, 2007).
A partícula viral é pleomórfica, podendo ser encontrada na forma esférica ou filamentosa. Os vírus isolados de humanos e animais geralmente apresentam partícula filamentosa de diâmetro uniforme (diâmetro ~80nm), mas após o cultivo em laboratório a forma viral esférica (diâmetro de 80-120 nm) é observada mais comumente (Chopin et al., 1960).
Figura 1. Diagrama ilustrativo da estrutura do vírus influenza A. HA: hemaglutinina; NA: neuraminidase; NP: nucleoproteína; M1/M2: matriz; PA: polimerase ácida; PB1/PB2: polimerase básica.
19
Genes e proteínas virais
O genoma do vírus Influenza A consiste em RNA fita simples, dividido em oito segmentos que codificam 11 proteínas virais (Tab. 1) (Ritchey et al, 1976). Todos os segmentos de RNA viral do Influenza A possuem sequências conservadas nas
terminações 5’ (13 nucleotídeos) e 3’ (12 nucleotídeos) da região não codificadora (RNC), seguidas de sequências específicas para cada segmento (Skehel e Hay, 1978; Desselberger et al., 1980).
Tabela 1. Genes dos vírus Influenza A e suas funções.
Segmento Gene Tamanho (nt) Função
1 PB 2 2341 Transcriptase: polimerase, início da transcrição
2 PB1 2341 Transcriptase: polimerase, extensão do RNAv
3 PA 2233 Transcriptase: polimerase, replicação do RNAv
4 HA 1778 Hemaglutinina: ligação à célula hospedeira
5 NP 1565 Nucleoproteína: ligação do RNA, parte do complexo RNP, transporte núcleo-citoplasma do RNAv
6 NA 1413 Neuraminidase: liberação viral
7 M 1027 Matriz: M1 maior componente do vírion, estrutural
M2 canal de íon da membrana
8 NS 890
Não-estrutural: NS1 transporte de RNA, montagem, tradução, antagonista de interferon
NS2/NEP: proteína de exportação nuclear do RNAv
RNAv = RNA viral; Fonte: Adaptado de Webster et al., 1992
A glicoproteína HA é o antígeno de superfície mais importante do vírus influenza e principal alvo para a resposta imune do hospedeiro, é altamente variável e com frequente substituição de aminoácidos (Skehel e Wiley, 2000). A molécula da HA tem aparência de espiga, com a cabeça arredondada e um corpo transmembrana (Webster et al., 1992). A HA é importante determinante de virulência e de especificidade de hospedeiros, pois media a ligação inicial do vírus a receptores de ácido siálico na célula hospedeira, mas também participa da liberação do complexo RNP no citoplasma através da fusão com a membrana do endossomo (Shinya et al., 2006; Nicholls et al., 2008).
Nas células infectadas, a HA é inicialmente sintetizada na forma precursora como
molécula polipeptídica única (HA0). A clivagem proteolítica da HA0 é necessária para a infectividade do vírus e crucial para a patogenicidade viral (Taubenberger, 1998; Steinhauer, 1999). A HA0 é clivada por endoproteases tipo-tripsina do hospedeiro em duas subunidades, HA1 e HA2, ligadas entre si por ligações dissulfeto (Taubenberger, 1998). A subunidade HA1 forma a extremidade distal que contém os sítios de atividade antigênica e o sítio de ligação ao receptor. A subunidade HA2 contém uma sequência altamente conservada de aminoácidos hidrofóbicos que insere a glicoproteína na bicamada lipídica (Schoch e Blumenthal, 1993; Cross et al., 2001). A glicoproteína NA também é um antígeno de superfície do vírus influenza, tem aparência de cogumelo e, como a HA, sofre
20
constantes variações antigênicas. Sua atividade enzimática cliva receptores presentes na mucina que impedem o acesso aos receptores da membrana (Gottschalk, 1957), auxiliando na penetração na célula hospedeira, além de atuar na liberação e disseminação da progênie viral (Matrosovich et al., 2004). Além disso, determinantes de resistência a antivirais foram detectados na proteína NA (Le et al., 2005) e M (Marozin et al., 2002).
Os seis segmentos restantes codificam proteínas estruturais e acessórias (Tab. 1). Uma proteína acessória adicional, PB1-F2 pode ser codificada pelo segmento 2, conferindo virulência aos vírus, pois induz apoptose em células imunes ao se associar a proteínas mitocondriais (Chen et al., 2001).
Restrição de hospedeiros
Análises filogenéticas indicam que todos os 16 subtipos de HA e nove subtipos de NA do vírus influenza A já foram detectados em espécies aviárias, o que sugere que os vírus influenza de mamíferos vieram de reservatórios aviários. Além disso, a infecção geralmente não causa doença em aves silvestres, sugerindo que o vírus é adaptado a esse hospedeiro (Webster et al., 1992).
Embora a transmissão interespécie dos vírus influenza tenha sido demonstrada (Koopmans et al., 2004; Li et al., 2004; Crawford et al., 2005; Newman et al., 2008), os vírus influenza apresentam algumas restrições de hospedeiros e a infecção de novos hospedeiros não resulta em transmissão adequada entre eles. Vírus influenza aviários não replicam eficientemente em humanos (Beare e Webster, 1991), enquanto que vírus influenza humanos não replicam eficientemente em aves (Hinshaw et al., 1983). Os vírus influenza A apresentam afinidade da glicoproteína HA com
receptores de ácido siálico distintos. Vírus humanos reconhecem preferencialmente receptores de ácido siálico N-acetilneuramínicos (NeuAc) ligados à galactose por uma ligação do tipo α2,6 (NeuAc α2,6Gal), pois as células epiteliais da traqueia humana possuem receptores com ligação do tipo NeuAc α2,6Gal (Couceiro et al., 1993), enquanto que vírus aviários e equinos geralmente reconhecem receptores de ácido siálico com ligação α2,3 (NeuAc α2,3Gal) (Ito, 2000; Gambaryan et al., 2005), uma vez que células da traqueia de cavalos e do cólon de aves possuem receptores com esse tipo de ligação (Ito, 2000). Os suínos apresentam ambos os receptores em seu epitélio respiratório (Kida et al., 1994; Gambaryan et al., 2005). Portanto o suíno é susceptível à infecção com vírus humanos e aviários e pode servir de hospedeiro intermediário ou “sítio de mistura” (mixing vessel) para esses patógenos (Ito e Kawaoka, 2000; Ma et al., 2009). No entanto, os receptores de ácido siálico parecem estar distribuídos de forma irregular no trato respiratório dos suínos, com receptores NeuAc α2,3Gal presentes em menor abundância no trato superior, o que leva à pior replicação de vírus aviários nas traqueia e fossas nasais de suínos, dificultando a transmissão de vírus aviários entre suínos (Lipatov et al., 2008; Van Poucke et al., 2011).
Existem casos em que humanos se infectaram com vírus aviários, através do contato com animais dessa espécie, mas a transmissão desse vírus humano-humano é limitada (Shinya et al., 2006).
Evolução genética do vírus Influenza
As populações de vírus influenza estão em constante evolução e apresentam ampla diversidade genética, resultante de mecanismos distintos como: i) recombinação genética; ii) mutação pontual ou antigenic21
drift; e iii) rearranjo ou antigenic shift (Webster et al., 1982; 1992).
i) Recombinação pode gerar variantes novas do vírus influenza através da troca de informação genética, que ocorre quando a polimerase muda o molde ou quando segmentos de ácido nucléico são quebrados e reunidos. Por exemplo, dois vírus aviários de baixa patogenicidade podem ser revertidos em um vírus de alta patogenicidade após a inserção de 21 nucleotídeos do segmento M no segmento HA do outro (Pasick et al., 2005). Em geral, a recombinação é mascarada pela baixa atividade biológica dos vírus recombinantes, mas, em casos de pressão seletiva, podem resultar em vantagem para a linhagem recombinante. ii) Mutação ou antigenic drift resulta do
acúmulo de mutações pontuais resultantes da baixa fidelidade da RNA polimerase e sua inabilidade de correção de erros (Hampson, 2002). Essas mutações ocorrem principalmente em genes que codificam as glicoproteínas de superfície, HA e NA, e resultam da pressão de seleção imposta pelos mecanismos de defesa do hospedeiro (Wright et al., 2007). Embora a maioria das novas variantes não seja viável, algumas podem apresentar vantagens e se tornar dominantes. Na população humana, novas variantes do vírus causam doença grave e podem levar à morte de pacientes com depressão imunológica. Entretanto, antigenic drift no segmento HA do vírus influenza suíno é limitada e ocorre em segmentos sem atividade antigênica (Brown et al., 1997), provavelmente devido à baixa seleção imune em suínos, resultante da constante introdução de animais sem proteção.
iii) Rearranjo ou antigenic shift é a troca de segmentos de diferentes vírus que ocorre em uma célula co-infectada com dois ou mais vírus. Esse mecanismo resulta em
grande variação antigênica das glicoproteínas HA e NA, podendo gerar novos subtipos e introduzir novas cepas virais em populações não imunizadas (Wright et al., 2007). A introdução de novos vírus pode levar à ocorrência de pandemias, como foi o caso da emergência do novo H1N1 (Smith et al., 2009).
Histórico do vírus Influenza em suínos
O primeiro relato da infecção pelo vírus influenza A (IAV) em suínos ocorreu nos Estados Unidos durante a pandemia de 1918 (Gripe Espanhola), quando foi documentado um surto de doença respiratória aguda em suínos semelhante àquele observado em humanos no mesmo período, que levou à morte de 40 milhões de pessoas em todo o mundo (Koen, 1919 citado por Zimmer e Burke, 2009). A etiologia infecciosa da Influenza suína foi confirmada em 1931, quando Robert Shope, um veterinário, foi capaz de causar doença em animais sadios utilizando secreções filtradas de animais doentes (Shope, 1931). Mais tarde Shope sugeriu que o vírus suíno e o vírus humano pandêmico de 1918 eram antigênica e geneticamente semelhantes, o que foi confirmado por estudos moleculares recentes. Entretanto, ainda não se sabe se o vírus original foi transmitido de suínos para humanos ou de humanos para suínos (Shope e Francis, 1936; Reid et al., 2001).Epidemiologia
A introdução da Influenza em um rebanho geralmente está associada à movimentação e introdução de novos animais (Olsen et al., 2006a). A secreção nasal de animais infectados apresenta altos títulos infecciosos durante a fase aguda da infecção (2 a 5 dias após a exposição) e é a principal fonte de transmissão, que ocorre pela via naso-faringeal (Brankston et al., 2007). A
22
transmissão respiratória ocorre através de gotículas e aerossóis, pelo contato direto entre animais, mas também contato indireto com objetos e superfícies contaminadas (Bridges et al., 2003). O vírus se mantém viável por 8 a 12 horas em superfícies porosas (tecido e papel) e por até 48 horas em superfícies não porosas (metal) e nas mãos (Bean et al., 1982). Já em aerossóis, pode permanecer viável por até 24 horas em ambiente com umidade relativa do ar baixa (Brankston et al., 2007). Embora surtos da doença sejam mais comuns em meses mais frios, a doença ocorre durante todo o ano, principalmente em regiões sem grandes variações de temperatura (Hinshaw et al., 1978; Olsen et al., 2000; Caron et al., 2010). Em rebanhos comerciais de ciclo completo infectados, geralmente todos os animais entram em contato com o vírus até a idade de abate (Vincent et al., 2008).
Atualmente, três diferentes subtipos do IAV (H1N1, H1N2 e H3N2) circulam na população de suínos em todo o mundo e, ao contrário do que ocorre com vírus influenza de humanos, os vírus suínos têm origem e caracterização distinta nos diferentes continentes (Vincent et al., 2008). Nos EUA a doença está em constante circulação e acredita-se que cerca de 50% dos suínos possuam anticorpos contra H1N1 (Chambers et al., 1991). Na Europa, vírus H1N1 e H3N2 se tornaram endêmicos em algumas regiões, com prevalências que chegam a 80% e 58%, respectivamente (Van Reeth et al., 2008).
Até a década de 90, a Influenza suína na América do Norte era causada quase que exclusivamente pelo vírus suíno clássico H1N1 (cH1N1), que permaneceu antigênica e geneticamente conservado desde sua introdução em 1918 (Vincent et AL., 2008). No final da década, entretanto, vírus do subtipo H3N2 de dois genótipos diferentes passaram a circular nos rebanhos americanos: um vírus de rearranjo duplo, contendo genes de vírus humano (HA, NA,
PB1) e do suíno clássico (NS, NP, M, PB2, PA); e um vírus de rearranjo triplo, contendo genes de vírus humano (HA, NA, PB1), suíno (NS, NP, M) e aviário (PB2, PA) (Zhou et al., 1999; Vincent et al., 2008). Desses, apenas o rearranjo triplo se manteve na população suína, cuja co-circulação com cH1N1 levou ao aparecimento de novos rearranjos (Webby et al., 2000) que são endêmicos no rebanho suíno americano e canadense, incluindo H3N2 (Webby et al., 2000), H1N1 rearranjado (Webby et al., 2004) e H1N2 (Choi et al., 2002a; Karasin et al., 2002).
A maior parte das linhagens do IAV que circulam nos rebanhos norte-americanos atualmente são rearranjos com combinações diversas de HA e NA com genes internos de vírus humanos, suínos e aviários (Ito, 2000), conhecidos como genes internos de rearranjo triplo (TRIG), com PB1 de linhagem humana, PB2 e PA de linhagem aviária, e NP, M e NS de linhagem suína (Vincent et al., 2008).
Na Europa, os vírus H1N1 são de origem aviária e foram introduzidos na população suína por patos selvagens em 1979 (Pensaert et al., 1981). Já o vírus H3N2 foi introduzido na população suína no início da década de 70 e tinha todos os segmentos originados do vírus humano (Castrucci et al., 1993). Essa linhagem inicial do H3N2 suíno circulou no continente Europeu até a década seguinte, mas a partir daí a linhagem originada do rearranjo entre o vírus tipo humano H3N2 (HA e NA) com o vírus H1N1 tipo aviário (proteínas internas e não estruturais) passou a ser predominante (Jong et al., 2007). O vírus H1N2 emergiu no Reino Unido no início dos anos 90 e se tornou endêmico nos suínos da Europa (Lam et al., 2007). Essa linhagem contém genes de origem humana (HA e NA) e derivados do vírus Europeu tipo aviário H1N1.
Os subtipos H1N1 e H3N2 estão amplamente disseminados nos rebanhos
23
asiáticos (Li et al., 2004). Na Coréia do Sul, ambos os subtipos estão disseminados em quase todo o território, e a co-infecção entre os subtipos existe (Jung et al., 2002; 2007). Na China, o cH1N1 é o vírus influenza predominante infectando suínos, mas os vírus de origem aviária H1N1 (Guan et al., 1996) e H3N2 (Kida et al., 1988) também foram relatados no país. Os vírus H3N2 que circulam em suínos na Tailândia são relacionados a linhagens suínas da América do Norte, Ásia e Europa e também à linhagem humana, e o H1N1 circulante é principalmente relacionado a um vírus humano “tipo-suíno”, mas também a vírus endêmicos suínos norte-americanos (Chutinimitkul et al., 2008). O subtipo H1N2 circula em suínos na Ásia desde a década de 70 (Sugimura et al., 1980) e possui NA de vírus humano e os outros sete segmentos do cH1N1 (Ito et al., 1998). Evidências da circulação do vírus H1N1 e H3N2 foram relatadas em estudos sorológicos na Argentina (Teodoroff et al., 2003; Piñeyro et al., 2007).
No Brasil, existem evidências sorológicas da circulação do vírus H1N1 e H3N2 nos estados do RS, SC, PR, SP, MG, MS, MT e GO, com ocorrência de 2,2 e 16,7% em animais, e 11,8 e 50,9% em propriedades para H1N1 e H3N2, respectivamente. Tentativas de isolamento e caracterização dos vírus circulantes foram realizadas, mas sem muito sucesso (Brentano et al, 2002; Mancini et al, 2006; Schaefer et al, 2008). Recentemente, um estudo relatou a prevalência sorológica de 46% de granjas e 20% de animais infectados com H3N2 no Paraná (Caron et al., 2010).
Alguns subtipos distintos também foram isolados em suínos, principalemte em animais de países asiáticos, como o H9N2 e o H5N1 isolados na China (Li et al., 2004), o H3N1 isolado em Taiwan (Tsai e Pan, 2003), mas também o H2N3 isolado nos EUA (Ma et al., 2007), o H1N7 no Reino
Unido (Brown et al., 1997) e H3N8 no Brasil (Schaefer et al., 2011a).
Influenza suína e saúde pública
Além do suíno contribuir para a geração de vírus com potencial pandêmico para a população humana, o IAV também apresenta potencial zoonótico (Thacker e Janke, 2008; Neumann et al., 2009). Infecções de humanos com vírus influenza de suínos foram relatadas na América do Norte, Europa e Ásia, geralmente envolvendo indivíduos com contato direto com suínos, e sem distinção de sinais clínicos das infecções com vírus humanos (Alexander e Brown, 2000; Gregory et al., 2003). A maioria dos casos ocorreu pela infecção com o vírus cH1N1, embora casos de infecção com vírus tipo aviário H1N1, rearranjos H3N2 e rearranjos H1N1 também tenham sido relatados em humanos (Gray et al., 2007; revisado por Myers et al., 2007; Newman et al., 2008).
Alguns casos de infecções humanas com IAV de suínos sem qualquer contato com esses animais foram relatados, sugerindo a disseminação do vírus suíno de humano para humano (revisado por Myers et al., 2007), como são os casos do Fort Dix (Gaydos et al., 1977) e do vírus Influenza H1N1 2009 (Neumann et al., 2009).
A presença de receptores para vírus humanos e aviários no trato respiratório de suínos (Ito e Kawaoka, 2000) e sua capacidade de atuar como “sítio de mistura” fazem dessa espécie um potencial hospedeiro intermediário dos vírus influenza. Dessa forma, o suíno tem papel importante na epidemiologia da influenza humana e pode ser responsável pelo surgimento de cepas virais com potencial pandêmico para a população não imunizada (Brown, 2000).
24
H1N1 pandêmico 2009
Em março de 2009, um novo vírus de origem suína H1N1 (pH1N1) foi identificado em humanos e se disseminou rapidamente na população mundial, levando a Organização Mundial de Saúde a declarar fase de pandemia 6 após poucas semanas (CDC, 2009b).
O novo vírus pH1N1 é resultante do rearranjo quádruplo entre vírus influenza tipo aviários circulantes em suínos na Europa e Ásia, e vírus de rearranjo triplo circulantes em suínos norte-americanos (Smith et al., 2009). Portanto, o H1N1 pandêmico possui genes derivados de linhagens aviárias (PB2 e PA), humanas H3N2 (PB1) e do vírus suíno clássico (HA, NP e NS) presentes no vírus norte americano, e genes derivados do vírus suíno tipo aviário da Eurásia (NA e M) (Smith et al., 2009).
O pH1N1 pode infectar e se disseminar em suínos (Lange et al., 2009; Brookes et al., 2010) e a infecção natural de suínos com o vírus pandêmico já foi demonstrada em diversos países, geralmente relacionada ao contato prévio com seres humanos que apresentavam sinais clínicos respiratórios (Pasma e Joseph, 2010; Pereda et al., 2010; Sreta et al., 2010; Schaefer et al., 2011c). Suínos infectados pelo pH1N1 apresentam sinais clínicos e lesões semelhantes aos observados na infecção pelo IAV sazonal (Pasma e Joseph, 2010; Pereda et al., 2010) e a resposta imune gerada por exposição prévia a vírus endêmicos resulta apenas em proteção parcial contra o pH1N1 (Vincent et al., 2010b). Além disso, animais infectados apresentaram eliminação viral nas secreções respiratórias por 11 a 20 dias, período mais prolongado que na infecção pelo influenza suíno sazonal (Lange et al., 2009; Pasma e Joseph, 2010; Pereda et al., 2010).
Patogênese
O vírus replica em células epiteliais de todo o trato respiratório, como mucosa nasal, tonsilas, traqueia, pulmão e linfonodos traqueo-bronquiais (Nicholls et al., 2007). A infecção geralmente fica restrita ao trato respiratório, mas a viremia de curto prazo e título baixo já foi detectada em casos raros (Brown et al., 1993). No entanto, o vírus não foi detectado em nenhum tecido não respiratório (Vincent et al., 2009a; Brookes et al., 2010). O tropismo por tecidos específicos ocorre devido à expressão de proteases necessárias para a ativação viral (Rot et al., 1995). O pulmão é o principal órgão alvo da infecção e títulos virais podem chegar a 109 dose infecciosa 50% em ovo (EID50/mL) (Haesebrouck et al., 1985), uma
vez que o IAV apresenta tropismo elevado pelo epitélio bronquiolar e se replica rapidamente nessas células (Brown et al., 1993; Olsen et al., 2006a).
As lesões celulares causadas diretamente pelo IAV estão atribuídas a apoptose, desencadeada pelas proteínas NA e PB1-F2 (Schultz-Cherry e Hinshaw, 1996; Gibbs et al., 2003). No entanto, as citocinas pró-inflamatórias iniciais, produzidas por células não imunes no local da infecção durante a fase aguda, possuem papel fundamental para o desenvolvimento da reação inflamatória local e de alguns sinais clínicos sistêmicos. As citocinas iniciais como o Interferon-α (IFNα), fator de necrose tumoral-α (TNFα), interleucina-1 (IL-1) e IL-6, têm sido associadas à ocorrência de febre, prostração e anorexia (Van Reeth, 2000; Jo et al., 2007). TNFα e IL-1 estimulam moléculas quimioatrativas de neutrófilos e macrófagos, como IL-8, levando à rápida infiltração dessas células fagocíticas no trato respiratório (Ulich et al., 1991). As citocinas tardias são produzidas principalmente pelos linfócitos T após reconhecimento de antígenos, e são moduladores importantes da resposta imune específica (La Gruta et al., 2007). Apesar de participar no estímulo à
25
resposta inflamatória, as citocinas iniciais e tardias também contribuem para a injúria pulmonar, com aumento da permeabilidade vascular, hemorragia e edema (Ulich et al., 1991).
A duração da infecção pelo IAV é curta e o clearance viral é extremamente rápido. Não é possível detectar o vírus na secreção nasal e no pulmão a partir de sete dias após a infecção natural ou experimental (Brown et al., 1993; Jo et al., 2007).
Sinais clínicos e lesões
A Influenza suína é uma doença aguda de rebanho, com alta morbidade (pode chegar a 100%) e baixa mortalidade (inferior a 1%). As principais perdas econômicas da Influenza resultam dos altos custos de medicações, mortalidade aumentada e produtividade diminuída nos rebanhos acometidos. O aparecimento da doença é súbito, após um período de incubação de um a três dias e recuperação rápida após quatro a sete dias (Maes et al., 1984).
A doença clínica geralmente é restrita a animais susceptíveis sem proteção imune contra o vírus, e a faixa etária mais acometida em propriedades de ciclo completo é de animais com idade de até 16 semanas (creche, recria e terminação) (Loeffen et al., 2009).
As manifestações clínicas da infecção pelo IAV em suínos são febre (40,5 a 41,7°C), apatia, inapetência, prostração e anorexia, que resultam em perda de peso significativa. Tosse, espirros, conjuntivite, rinite e descargas nasais são sinais comuns da infecção. Sinais de angústia respiratória, como respiração abdominal e com a boca aberta, podem ocorrer (Alexander e Brown, 2000; Richt et al., 2003).
Ocasionalmente alguns sinais reprodutivos podem ser observados, como abortos, natimortos, infertilidade e leitegadas
pequenas e fracas (Wallace e Elm, 1979; Vannier, 1999; Wesley, 2004).
Além da doença clínica aparente, a doença subclínica ocorre frequentemente. Diversos fatores podem alterar a gravidade de sinais clínicos, como estado imune do animal, idade, infecções concomitantes e condições climáticas (Olsen et al., 2006a). Apesar de geralmente resultar em doença branda, a infecção por IAV em suínos pode apresentar complicações quando ocorre infecção intercorrente com outros patógenos. A infecção bacteriana secundária com Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis e Streptococcus suis tipo 2 pode aumentar a gravidade e a duração de sinais clínicos da Influenza (Thacker et al., 2001; Choi et al., 2003). A co-infecção com vírus respiratórios, como Coronavírus Respiratório Suíno (PRCV), Circovírus Suíno tipo 2 (PCV2) ou Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína (PRRSV), também pode agir como fator de complicação da Influenza, aumentando o curso e a gravidade da doença (Choi et al., 2003; Hansen et al., 2010).
As alterações patológicas são predominantes nos lobos apical e cardíaco e os lobos diafragmático e acessório são menos afetados. Macroscopicamente observa-se consolidação vermelho-escura bem demarcada, geralmente na porção crânio-ventral. Edema pulmonar grave, principalmente nos septos interlobulares, e pleurite serosa ou serofibrinosa são achados comuns na necropsia, além de vias aéreas repletas de exsudato fibrinoso a mucopurulento e linfonodos mediastinais edemaciados (Olsen et al., 2006a).
Achados microscópicos comuns consistem em necrose e descamação das células epiteliais bronquiolares e acúmulo de restos celulares, fluído proteináceo e leucócitos no lúmen de vias aéreas (Van Reeth et al., 2008). Também podem ser observadas
26
infiltração leucocitária peribronquial e perivascular, e pneumonia intersticial de intensidade variada (Richt et al., 2003).
Resposta imune
A resposta imune contra a infecção com IAV é rápida, envolve tanto a imunidade humoral como a celular, e resulta no clearance viral completo dentro de uma semana após a infecção. A infecção leva à ativação da imunidade inata e liberação de IL-6 e IFNα pelas células epiteliais, além de estimular a atividade de células natural killers (NK) para lise de células infectadas (Wright et al., 2007). A correlação entre a resposta humoral e a resposta mediada por células é necessária para desencadear a imunidade protetora contra a infecção com o vírus influenza.
A imunidade humoral tem papel importante na prevenção e resistência contra a infecção e contra a manifestação clínica. Os anticorpos produzidos durante a infecção são direcionados contra as proteínas HA, NA, M e NP, no entanto apenas aqueles específicos contra HA e NA são capazes de neutralizar a infectividade viral, enquanto que os demais podem interferir na liberação da progênie viral da célula hospedeira (Cox et al., 2004). Todas as principais imunoglobulinas (IgA, IgG e IgM) podem ser identificadas na infecção pelo IAV em soro e lavados nasal e broncoalveolar de suínos (Heinen et al., 2000). Anticorpos específicos contra o vírus Influenza podem ser detectados no soro três dias após a infecção e em suabes nasais quatro dias após a infecção (Lee et al., 1993). A IgA secretória é a principal imunoglobulina neutralizante contra o IAV no trato respiratório e é detectada em altos títulos na secreção nasal e broncoalveolar após a fase aguda (Heinen et al., 2000). A proteção clínica contra a Influenza geralmente está diretamente relacionada aos níveis de anticorpos capazes de inibir a hemaglutinação (HI), que são direcionados
contra a proteína HA (Cox et al., 2004). Os anticorpos HI podem ser detectados de sete a 10 dias após a infecção e apresentam pico entre duas e três semanas, se mantendo em níveis elevados por várias semanas. Os títulos começam a declinar por volta de 10 semanas após a infecção, mas são mantidos até o abate (Renshaw, 1975; Desrosiers et al., 2004; Van Reeth et al., 2004). Títulos consideráveis de anticorpos podem ser detectados até seis meses após a infecção (Olsen et al., 2006a). Após a recuperação da infecção primária, é estabelecida a imunidade duradoura. Diante de um contato secundário, o sistema imune monta resposta rápida e forte. No entanto, a proteção imune humoral contra uma nova infecção só ocorre contra vírus homólogos, mas a infecção com vírus diferentes pode ocorrer (Vincent et al., 2008).
Anticorpos maternos são capazes de reduzir a manifestação clínica, mas não impedem a infecção com vírus diferentes. Em rebanhos com circulação viral contínua, animais lactentes podem se infectar e eliminar vírus nas secreções mesmo na presença de anticorpos passivos, mas quanto maior os níveis de anticorpos, menor a gravidade de sinais clínicos (Renshaw, 1975; Loeffen et al., 2003a; Kitikoon et al., 2006; Vincent et al., 2008).
A imunidade celular tem papel importante na recuperação da Influenza e no clearance viral (Flynn et al., 1998; Woodland et al., 2001), mas não contribui significativamente na prevenção da infecção. Linfócitos específicos para o IAV foram detectados no sangue, linfonodos do trato respiratório, mucosa faríngea e nasal e no baço de animais infectados experimentalmente (Larsen et al., 2000). A lise de células infectadas é mediada por linfócitos TCD8+ em associação com anticorpos específicos e com o Complemento (Cox et al., 2004). A resposta T citotóxica contra o IAV pode ser detectada a partir de sete dias de infecção em suínos e os TCD8+ apresentam reatividade
27
cruzada contra vírus Influenza do mesmo tipo (Larsen et al., 2000). A lise de células infectadas por células TCD8+ ocorre através da apresentação de peptídeos pelos
receptores do Complexo de
Histocompatibilidade Principal de classe I (MHC I) e sua atividade é direcionada aos epítopos mais conservados das proteínas NP e M (Heinen, 2002).
Diagnóstico
O diagnóstico definitivo da infecção pelo IAV em suínos deve ser realizado através da associação entre diagnóstico clínico e laboratorial, uma vez que outras afecções respiratórias apresentam sinais clínicos semelhantes. A Influenza pode ser diagnosticada através de isolamento viral, detecção de RNA e/ou proteínas virais, ou pela detecção de anticorpos específicos. A detecção de anticorpos contra o IAV não indica necessariamente infecção atual, uma vez que anticorpos podem ser detectados vários meses após a infecção (Olsen et al., 2006a).
O IAV pode ser isolado de secreções respiratórias coletadas através de suabe nasal ou naso-faringeal de animais vivos, durante a fase aguda da doença. Em animais eutanasiados ou que morrerem durante o estágio agudo, amostras de tecido de traqueia ou pulmão podem ser utilizadas para isolamento. Suabes e amostras de tecido devem ser mantidos refrigerados a 4°C para serem testados em até 48 horas. Em caso de estoque por maior período, as amostras devem ser mantidas a -80°C, uma vez que o vírus não é estável a -20°C (OIE, 2010). As suspensões preparadas a partir de suabes nasais ou de tecidos podem ser inoculadas na cavidade alantoide de ovos embrionados com 10 a 11 dias de incubação ou em cultura de células. A confirmação da presença do vírus é realizada através da reação de Hemaglutinação (HA) (Meguro et al., 1979; Clavijo et al., 2002). A técnica
padrão para isolamento do vírus influenza é a inoculação em ovos embrionados, entretanto devido à sua longa duração, o isolamento em cultura de células Madin-Darby de rim canino (MDCK) é amplamente utilizado. Entretanto, é necessária a utilização de meio de cultura contendo tripsina, importante para a clivagem da HA (Tobita et al., 1975; Herman et al., 2005). Técnicas moleculares para identificar material genético do vírus vêm sendo aprimoradas e largamente utilizadas no diagnóstico da Influenza, uma vez que apresentam alta sensibilidade, rapidez de resultados e possibilidade de teste de grande número de amostras ao mesmo tempo (Hall et al., 2009). A transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) tem sido amplamente utilizada na detecção de vírus humanos e animais (Schorr et al., 1994; Lorusso et al., 2010), e algumas RT-PCR multiplex para detecção e subtipagem simultâneas do vírus já foram desenhadas (Choi et al, 2002b; Lee et al., 2008). A RT-PCR em tempo real é amplamente utilizada, apresenta maior sensibilidade e segurança que a RT-PCR convencional, além de gerar resultados mais rápidos (Spackman et al., 2002). Os testes rápidos para detecção do vírus influenza (RIDT) detectam antígenos virais em secreções respiratórias (lavados ou suabes) através de imunoensaios enzimáticos ou ópticos, geram resultados rápidos (30 minutos) e têm custo baixo, mas sua eficiência depende do tipo e qualidade da amostra e do tipo do vírus Influenza a ser testado (Gavin e Thomson, 2003; CDC, 2009a). Mas esses testes parecem ter baixa sensibilidade para o vírus pandêmico 2009 (Drexler et al., 2009).
Atualmente, a reação de inibição da hemaglutinação (HI) é o método sorológico mais utilizado para detecção da infecção causada pelo IAV. Esse teste baseia-se na habilidade da proteína HA da superfície viral de aglutinar eritrócitos e na presença no soro de anticorpos capazes de inibir tal atividade.
28
Alguns problemas do teste estão relacionados à presença de inibidores inespecíficos da hemaglutinação ou à ocorrência frequente de alterações genéticas dos vírus circulantes, que podem levar a resultados errôneos (Wood et al., 1994; Julkunen et al., 1985). Além da HI, também podem ser utilizados o teste de soro neutralização (SN) e o ensaio de imunoadsorção ligada à enzima (ELISA) (Julkunen et al., 1985). Atualmente existem testes ELISA comerciais disponíveis para detecção de anticorpos contra H1N1 e H3N2 (Lee et al., 1993; Leuwerke et al., 2008), que são de fácil execução e geram resultados rápidos, mas que demonstraram uma sensibilidade reduzida e custo elevado (Yoon et al., 2004). A SN detecta anticorpos neutralizantes capazes de impedir a infecção do vírus em células (Leuwerke et al., 2008). Esse teste é trabalhoso e é vírus-específico (Julkunen et al., 1985). A existência de anticorpos maternos contra o IAV em leitões lactentes ou desmamados pode levar à ocorrência de resultados falso-positivos nos métodos sorológicos (Kitikoon et al., 2006). Outros métodos de detecção do IAV ou seus antígenos são a reação de imunofluorescência (IF) em tecido pulmonar, células nasotraqueais ou lavado broncoalveolar; ou imunohistoquímica (IHQ) em tecidos fixados em formol e embebidos em parafina (Vincent et al., 1997). A IF gera resultados mais rápidos que o isolamento, mas exige habilidade técnica e necessita de microscópio de fluorescência (Rabalais et al., 1992; Selleck et al., 2003). A IHQ é um teste relativamente rápido, de baixo custo e de fácil execução. O vírus presente em células epiteliais, macrófagos ou pneumócitos, pode ser visualizado e sua presença pode ser associada a lesões microscópicas características da doença (Vincent et al., 1997). Esse teste também é útil em estudos retrospectivos em que tecidos frescos podem não estar disponíveis (Haines et al., 1993).
Prevenção e vacinação
As principais formas de prevenção da Influenza suína são a biossegurança e a vacinação. Algumas medidas podem prevenir a introdução do vírus em uma propriedade, como o controle da entrada de novos animais, quarentena, limpeza e desinfecção de instalações antes da entrada de um novo lote e prevenção do contato com outras espécies, especialmente aves ou humanos com sinais de influenza (Olsen et al., 2006a). Segregação e depopulação parcial de animais infectados, além de medidas rigorosas de higiene são essenciais para controlar a disseminação do IAV dentro de um plantel e para minimizar os efeitos da doença no rendimento econômico da granja (Kothalawala et al., 2006).
A vacinação é o método específico mais utilizado na prevenção da Influenza suína, geralmente utilizado em fêmeas reprodutoras. As vacinas atuais são compostas por vírus inativado re-suspendido em adjuvante oleoso, sendo geralmente preparadas por propagação em ovos embrionados (Ma et al., 2010). A vacinação induz altos títulos de IgG pulmonar e sistêmica em cerca de 2-6 dias, que reduzem a ocorrência e gravidade de sinais clínicos, mas a proteção total só ocorre quando a proteína HA vacinal é geneticamente relacionada à HA do vírus que causa a infecção (vírus homólogos). No entanto, a replicação e eliminação viral em secreções respiratórias são reduzidas (Poland et al., 2001; Kothalawala et al., 2006). A vacinação em plantéis susceptíveis geralmente consiste de duas aplicações pela via intramuscular (IM) com intervalo de duas a quatro semanas entre elas (Olsen et al., 2006a). Vacinas comerciais para suínos contra IAV estão disponíveis em vários países. Como existem diferenças genéticas e antigênicas entre as cepas virais circulantes nos diferentes continentes, a composição vacinal também difere. Nos Estados Unidos, são utilizadas vacinas bivalentes contendo
29
cH1N1 e rearranjo triplo H3N2, mas também existem vacinas trivalentes ou mesmo pentavalentes contendo vírus de rearranjo (Kitikoon et al., 2006; Vincent et al., 2008; Vincent et al., 2010a). Na Europa, as vacinas utilizadas são compostas por vírus H1N1 (A/New Jersey/8/76 ou Sw/Netherlands/25/80) e vírus H3N2 (A/Port Chalmers/1/73) (Van Reeth et al., 2003).
A constante variação genética que ocorre nos vírus influenza de suínos resultou numa ampla diversidade de IAV circulando nos suínos do mundo. A influenza suína não é mais considerada sazonal, e existe um número elevado de variantes virais circulando, dificultando, assim, a produção de vacinas comerciais eficazes. Consequentemente, o uso de vacinas autógenas com cepas específicas do rebanho de origem está aumentando como medida alternativa de controle da enfermidade (Vincent et al., 2008; Ma e Richt, 2010). A utilização de vacinas autógenas preparadas de culturas de vírus após inativação deve ser restrita àquele rebanho e de acordo com a legislação vigente no país, além de que o acompanhamento veterinário deve ser preconizado (BRASIL, 2003; Ma e Richt, 2010).
Vacinas vivas modificadas são capazes de aumentar a imunidade local e promover proteção cruzada para outros subtipos (Thacker e Janke, 2008). Entretanto a utilização de vacinas vivas gera a possibilidade de rearranjo entre vírus vacinais e vírus de campo e o surgimento de novos vírus, portanto vacinas vivas para Influenza não estão disponíveis para suínos (Erdmann e Crabtree, 2006).
Vacinas de DNA são uma alternativa para a proteção contra a Influenza e vêm sendo amplamente estudadas. Esse tipo de vacina utiliza DNA viral para a produção de antígenos virais intracelulares que serão apresentados por moléculas MHC I e MHC
II, induzindo a resposta humoral e celular de longa duração (Thacker e Janke, 2008). Vacinas de DNA mostram-se vantajosas por levarem à produção de resposta imune contra diversos subtipos e não sofrerem interferência de anticorpos maternos (Kim e Jacob, 2009). Entretanto, testes experimentais mostraram que são eficientes apenas como estímulo primário e que existe a necessidade de revacinação com vacinas inativadas convencionais (Heinen et al., 2002; Larsen e Olsen, 2002). Além disso, existe a preocupação de integração do DNA vacinal à célula hospedeira, aumentando o risco de malignidade e ocorrência de doenças auto-imunes (Kim e Jacob, 2009). Vetores vacinais contra a infecção com IAV vêm sendo estudados para suínos, utilizando alphavirus (Vander Veen et al., 2009), adenovírus (Wesley et al., 2004) ou vírus da pseudoraiva (Tian et al., 2006). O uso de baculovírus vem sendo utilizado na vacinação de humanos e aves, mas ainda não é empregado em suínos (King Jr et al., 2009).
Embora a ocorrência de antigenic drift nos suínos seja menos frequente que em humanos, a variabilidade genética e antigênica do IAV resulta na perda de eficácia vacinal devido à discordância entre o antígeno vacinal e a amostra viral circulante no campo. Dessa forma, a vigilância epidemiológica global do IAV é uma ferramenta necessária para a atualização frequente de cepas circulantes e para melhorar os resultados vacinais (Thacker e Janke, 2008; Ma e Richt, 2010). Além disso, outro obstáculo importante para a vacinação bem sucedida é a presença de anticorpos maternos, que consequentemente reduz a eficiência vacinal e aumenta a incidência da doença na fase em que os níveis de anticorpos colostrais reduzem. Anticorpos passivos podem suprimir a resposta de anticorpos e de linfócitos T específicos para o IAV resultante da vacinação (Kitikoon et al., 2006).
