(Hymenoptera: Formicidae) e seus Fungos
Simbiontes (Basidiomycota: Agaricales)
ANA CARLA OLIVEIRA DA SILVA PINHATI
Rio Claro
Estado de São Paulo – Brasil
Dezembro de 2004
Evolução e Metabolismo de Alguns Atíneos
(Hymenoptera: Formicidae) e seus Fungos
Simbiontes (Basidiomycota: Agaricales)
ANA CARLA OLIVEIRA DA SILVA PINHATI
Orientador: Prof. Dr. MAURÍCIO BACCI JÚNIOR
Rio Claro
Estado de São Paulo – Brasil
Dezembro de 2004
Tese apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Campus de Rio Claro, para a obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Área de Concentração: Microbiologia Aplicada)
Ao meu marido Elidon pelo amor, paciência, estímulo e também
por ter me compreendido pelos momentos de ausência...
Aos meus pais, Osmar e Creusa, pela dedicação incondicional,
apoio e carinho...
Aos meus irmãos Érica /Adriano e Osmar Junior pela agradável
convivência e conforto nos momentos difíceis. E ao meu sobrinho
Eduardo pela alegria...
...OFEREÇO
DEDICO...
Ao meu filho Giovani que é a minha vida...
E a minha irmã Ellen Mara que foi e sempre será uma luz em meu
caminho.
AGRADECIMENTOS
A Deus que ilumina nossos caminhos.
Ao Prof. Dr. Maurício Bacci Júnior pelas oportunidades oferecidas, pela orientação e confiança.
Aos meus pais Osmar e Creusa, ao meu irmão Osmar Junior, a minha irmã Érica, a minha cunhada Ita, ao meu sogro Elidon, a minha sogra Edi, a minha cunhada Denise e a minha sobrinha Tathiane, por ficarem com o Giovani me ajudando assim a concluir a tese.
Aos professores do Centro de Estudos de Insetos Sociais pela amizade e apoio em especial ao Prof. Dr. Vanderlei Geraldo Martins, Prof. Dr Fernando Carlos Pagnocca e Prof. Dr. Odair Correa Bueno pelo auxílio e disposição em ajudar na realização deste trabalho.
Aos funcionários do Centro de Estudos de Insetos Sociais em especial à secretária Necis Miranda de Lima pela amizade, eficiência e disposição em ajudar.
Aos professores e funcionários do Departamento de Bioquímica em especial a Profa. Dra. Eleonora Cano Carmona e ao Prof. Dr. Jonas Contiero pela coordenação do programa de pós-graduação em Microbiologia Aplicada.
A Aline pelo companheirismo e amizade durante estes anos de convivência. Às amigas Elissena, Itamar, Alexandra, Giovana, Priscila, aos novos amigos Adriana, Danyelle e Joaquim e aos demais colegas do laboratório pela contribuição e momentos de descontração que tornaram a realização deste trabalho muito mais prazerosa.
Aos funcionários da Seção de pós-graduação do Instituto de Biociências e aos funcionários da biblioteca pelo auxílio e contribuição na solução de dúvidas.
A todos os amigos, professores, funcionários e alunos da UNESP, cujos nomes não foram citados, mas que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro.
ÍNDICE
CAPÍTULO I. Introdução ...1
1. INTRODUÇÃO GERAL ...2
1.1. Sistemática de formigas da tribo Attini e seus fungos simbiontes ...5
1.2. Transmissão vertical vesus horizontal de fungos entre as formigas da tribo Attini ...8
1.3. Aspectos nutricionais e co-evolução de formigas e fungos...9
1.4. Sistemática do gênero Atta ...10
2. ESTUDOS DESENVOLVIDOS NESTA TESE ...12
3. REFERÊNCIAS ...13
CAPÍTULO II. Isolation and maintenance of symbiotic fungi of ants in the tribe Attini (Hymenoptera: Formicidae)...18
CAPÍTULO III. Low variation in ribosomal DNA and internal transcribed spacers of symbiotic fungi of leaf-cutting ants (Attini: Formicidae) ...34
CAPÍTULO IV. Estudos metabólicos de fungos simbintes de formigas da tribo Attini ...57
CAPÍTULO V. Morfologia e evolução de alguns fungos simbiontes de atíneos...71
CAPÍTULO VI. Molecular systematics of ants in the genus Atta (Hymenoptera: Formicidae) based on mitochondrial DNA sequences ...88
CAPÍTULO I
1. INTRODUÇÃO GERAL
Poucos animais apresentam capacidade de cultivar seu próprio alimento. Algumas linhagens de insetos, entre elas, formigas, cupins e besouros, há aproximadamente 60 milhões de anos, desenvolveram a capacidade de cultivar fungos para alimento. Alguns destes insetos tornaram-se dependentes do cultivo para alimento e desenvolvem uma sociedade de cooperação com tarefas divididas, que os tornam ecologicamente muito importantes (Mueller, Geraldo, 2002). Em alguns destes grupos de insetos, o consumo de fungo é a principal fonte de alimento, em outros, os fungos compreendem só parte da dieta (Mueller et al., 2001).
Esta dependência de fungos como principal fonte de alimento ocorreu duas vezes em formigas (Formicidae) (Mueller et al., 2001); no monofilético grupo formado por formigas da tribo Attini (Myrmicinae: Formicidae: Hymenoptera) (Schultz, Meier, 1995; Brandão, Mahye-Nunes, 2001), que são dependentes obrigatórias dos fungos que cultivam para alimento (Weber, 1972a; Hölldobler, Wilson, 1990); e nas formigas Megalomyrmex silvestrii (Myrmicinae, tribo Solenopsidini), que são parasitas sociais de formigas da tribo Attini e que consomem os fungos cultivados por atíneos hospedeiros (Brandão, 1990; Adams et al., 2000b).
A tribo Attini compreende mais de 200 espécies, distribuídas em 13 gêneros (Schultz, Meier, 1995; Brandão, Mahye-Nunes, 2001). Estas formigas são herbívoras dominantes na região Neotropical, entre as latitudes 12° N e 33° S (Weber, 1979; Hölldobler, Wilson, 1990), com grande concentração de espécies na região Amazônica (Mueller et al., 2001). Esta dominância é resultado da integração metabólica entre os simbiontes (Martin, 1970; Bass, Cherrett, 1995; North et al., 1997; Siqueira et al., 1998) estabelecida durante os milhões de anos de co-evolução.
Os 13 gêneros da tribo Attini compreendem: Atta, Acromyrmex, Pseudoatta,
Trachymyrmex, Sericomyrmex, Mycetarotes, Myrmicocripta, Mycocepurus, Apterostigma, Cyphomyrmex, Mycetosoritis, Mycetophylax (Schultz, Meier, 1995) e o gênero Mycetagroicus
descrito recentemente por Brandão, Mahye-Nunes (2001) (tabela 1).
Tradicionalmente, a tribo Attini é subdividida em: um grupo monofilético derivado, denominado atíneos superiores, estando incluídas as formigas cortadeiras de folhas do gênero
Atta e Acromyrmex e também as não cortadeiras Trachymyrmex e Sericomyrmex; e um grupo
parafilético, chamado de atíneos primitivos, incluíndo as formigas mais basais (Mueller et al., 2001).
As formigas pertencentes aos gêneros considerados basais são caracterizadas por apresentarem colônias de tamanho muito pequeno; uma exceção é somente o gênero
Myrmycocripta, que apresenta colônias maiores. Em contraste, os atíneos derivados
apresentam grandes colônias, sendo o gênero Atta o que apresenta os maiores ninhos dentro da tribo (tabela 1) (Hölldobler, Wilson, 1990).
Os ninhos de atíneos consistem de formigas e jardins de fungos que são encontrados em uma ou mais câmeras, dependendo do gênero. O jardim de fungo é composto por hifas de fungos e normalmente dominado por um único clone de fungo simbionte (Hölldobler, Wilson, 1990; Weber, 1972a).
As formigas fornecem aos fungos substratos predominantemente de origem vegetal (Hölldobler, Wilson, 1990). Os gêneros Acromyrmex e Atta cortam folhas frescas e têm recebido atenção especial dos pesquisadores devido aos danos causados a plantas silvestres e cultivadas (Mayhé-Nunes, 1995). Os demais atíneos cultivam fungos sobre fezes de animais, carcaças de insetos e, principalmente, material vegetal em decomposição (Wilson, 1971, Hölldobler, Wilson, 1990, Mayhé-Nunes, 1995), coletados e transportados para o interior dos ninhos (tabela 1).
Fungos e formigas se beneficiam com a relação simbiótica; os fungos são utilizados na dieta das formigas que em retribuição, neste mutualismo obrigatório, fornecem aos fungos substratos para crescimento e proteção contra parasitas e competidores (Quilan, Cherrett, 1977; Currie, Stuart, 2001).
O mutualismo entre fungos e formigas vai além destes dois organismos, sendo muito mais complexo do que se supunha inicialmente. Em trabalhos recentes, foram identificados dois simbiontes adicionais de atíneos: um fungo parasita do gênero Escovopsis (Currie et al., 1999a; Currie, 2001) e uma bactéria filamentosa (actinomiceto) do gênero Pseudonocardia que é cultivada na superfície do corpo das formigas (Currie et al, 1999b) e produz um antibiótico que inibe o crescimento de Escovopsis (Currie, 2001). A associação formiga-fungo-parasita-bacteria é uma das mais complexas associações simbióticas já descritas na natureza (Currie et al, 2003).
A origem da tribo Attini é obscura pelo fato de todas as representantes serem cultivadoras obrigatórias de fungos, não existindo qualquer associação facultativa entre atíneos e fungos que possa refletir o estágio primitivo desta associação. Mesmo os parentes mais próximos dos atíneos não apresentam associação facultativa com fungos, podendo
sugerir uma rápida transição evolucionária do ancestral caçador para a formiga cultivadora de fungos (Mueller, 2002; Mueller et al., 2001; Diniz et al, 1998).
É difícil determinar a natureza desta associação e o passo evolucionário tomado durante a formação da associação original, devido ao enorme tempo e diversificação desde a origem do cultivo de fungos por formigas (Mueller, 2002). Existem dois principais modelos para a origem da fungicultura: o tradicional, sendo que, primeiramente, por acidente um fungo cresce em ninhos de formigas tornando-se parte da sua dieta (consumo), em seguida as formigas desenvolvem a capacidade de cultivar os fungos adicionando substratos (cultivo) e, em um último estágio, os fungos são transmitidos do ninho de origem para os descendentes (transmissão) (Weber, 1972a); e o modelo alternativo, no qual inicialmente as formigas dispersam fungos especializados (transmissão), em seguida as formigas incorporam estes fungos em sua dieta (consumo) e desenvolvem a capacidade de cultivá-los adicionando substratos (Mueller et al., 2001).
Sete hipóteses são propostas e cada uma mostra um diferente substrato (ou forma) que o ancestral de atíneos pode ter utilizado durante a transição de formigas caçadoras para cultivadoras: 1) sementes, 2) paredes dos ninhos, 3) madeira podre, 4) micorriza, 5) corpo de artrópodes, 6) fezes de formigas e 7) pellet infrabucal (Mueller et al., 2001).
No modelo tradicional, observa-se que quem dirigiu o mecanismo originário do mutualismo foi a formiga, começando a cultivar o fungo em um dos seis substratos descritos acima (dependendo da hipótese) e, portanto este foi domesticado passivamente, tornando-se parte da dieta das formigas.
O modelo alternativo sugere que a associação entre fungos e formigas pode ter sido controlada por fungos que utilizaram as formigas para dispersar esporos ou micélios, através do pellet infrabucal, e só depois serviu como componente da dieta das formigas (Mueller et al., 2001).
Todavia, ainda não está claro se a fungicultura em atíneos surgiu de um ancestral micofágico ou de um sistema de fungos utilizando formigas como vetor (Mueller et al., 2001; Mueller, Geraldo, 2002). No entanto, a fungicultura se originou uma só vez em cada grupo como descrito por Chapela, et al. (1994) e Mueller et al. (1998).
Tabela 1. Características de diferentes gêneros de formigas da tribo Attini. Estão descritos também o tamanho dos ninhos e substratos coletados pelas formigas (Hölldobler, Wilson, 1990; Bolton, 1995; Brandão, Mahye-Nunes 2001).
Gêneros (número de espécies)
Tamanho dos ninhos Substratos levados para o ninho
Myrmicocrypta (24) Médio Matéria vegetal em decomposição
Mycocepurus (4) Pequeno Carcaças e fezes de insetos
Apterostigma (28) Pequeno Carcaças e fezes de insetos
Mycetarotes (2) Pequeno Carcaças de insetos e matéria vegetal em decomposição
Mycetosoritis (5) Pequeno Matéria vegetal em decomposição
Cyphomyrmex (36) Pequeno Matéria vegetal em decomposição
Mycetophylax (6) Pequeno Matéria vegetal em decomposição
Mycetagroicus (3) - -
Sericomyrmex (19) Médio Frutas
Trachymyrmex (41) Médio Carcaças de insetos, partes de flores e matéria vegetal em decomposição
Pseudoatta (1) - -
Acromyrmex (26) Grande Material vegetal fresco
Atta (14) Muito grande Material vegetal fresco
1.1. Sistemática de formigas da tribo Attini e seus fungos simbiontes
A classificação das formigas da tribo Attini tem sido foco de muitas discussões. Existe um consenso de que as formigas cortadeiras Acromyrmex e Atta sejam os gêneros mais derivados da tribo (Weber, 1972a, Hölldobler, Wilson, 1990). Com relação aos demais gêneros, existem muitas hipóteses.
Kusnesov (1963), separa os diferentes gêneros em dois grupos informais: o “Palaeoattini”, que representa a primeira derivação da tribo e estando nele incluídos os gêneros Apterostigma, Myrmicocrypta e Mycocepurus; e o “Neoattini”, que inclui as cortadeiras Atta e Acromyrmex, que são consideradas as mais derivadas.
Baseado na biologia geral e no forrageamento, Leal (1998) separa os gêneros de Attini em três grupos. Um grupo basal que inclui os gêneros: Apterostigma, Cyphomyrmex,
Mycetarotes, Mycetophylax, Mycocepurus e Mirmycocrypta; um grupo intermediário que
inclui os gêneros Mycetosorites, Sericomyrmex, e Trachymyrmex; e um mais derivado que inclui as cortadeiras Acromyrmex e Atta, além da parasita Pseudoatta.
Hölldobler, Wilson (1990) subdividem a tribo Attini em dois maiores grupos: os atíneos derivados, que compreendem cinco gêneros, (quatro se o gênero Peseudoatta não for separado de Acromyrmex): Atta, Acromyrmex, Pesudoatta, Trachymyrmex e Sericomyrmex; e os atíneos primitivos, que compreendem os demais gêneros: Mycetarotes, Myrmicocripta,
Mycocepurus, Apterostigma, Cyphomyrmex, Mycetosoritis e Mycetophylax. Schultz, Meier
(1995) e Wetterer et al. (1998) também consideram os gêneros Atta, Acromyrmex,
Trachymyrmex e Sericomyrmex como derivados e os demais gêneros como primitivos, sendo Myrmicocripta, considerado por estes autores, como o gênero mais basal dentro da tribo.
Devido ao gênero Trachymyrmex apresentar algumas espécies mais relacionadas ao gênero Acromyrmex e outras espécies, mais relacionadas ao gênero Sericomyrmex, é muitas vezes considerado como sendo parafilético (Schultz, 2000). Porém, vários caracteres morfológicos diferem as Trachymyrmex dos demais gêneros de Attini, indicando a monofilia do gênero (Mayhé-Nunes, Brandão, 2002).
Os gêneros Trachymyrmex e Sericomyrmex, com relação ao uso de substrato e história de vida, parecem ser intermediários entre os atíneos primitivos e os derivados (Weber, 1972a, Hölldobler, Wilson, 1990).
Alguns autores classificam o gênero Cyphomyrmex como o mais primitivo (Wilson, 1971, Weber, 1972a, Hölldobler, Wilson, 1990) devido a estas formigas cultivarem leveduras ao invés de fungos filamentosos como as demais. No entanto, análises filogenéticas indicam que o gênero Cyphomyrmex não é o mais primitivo, sugerindo que o cultivo de leveduras pode ser um comportamento derivado (Schultz, Meier, 1995 Meier, Schultz, 1996). Em culturas artificiais, leveduras simbiontes de Cyphomyrmex revertem para fase filamentosa, indicando que este fungo é capaz de alterar sua forma dependendo das condições de cultivo. Devido às leveduras, cultivadas por Cyphomyrmex, serem derivadas de um ancestral em estado micelial (Mueller et al., 1998) e a maioria dos atíneos basais cultivarem fungos filamentosos (Schultz, Meier, 1995; Meier, Schultz, 1996; Schultz, 1998), o ancestral de formigas da tribo Attini provavelmente cultivavam hifas, em vez de levedura em seus ninhos (Mueller et al., 2001).
Assim como Atta e Acromyrmex o gênero descrito recentemente por Brandão; Mayhe-Nunes (2001), Mycetagroicus, pertence ao grupo informal “Neoattini”, citado por Kusnesov (1963). Porém o polimorfismo existente em formigas cortadeiras, mas não em Mycetagroicus, é um argumento contra uma possível proximidade filogenética de Atta e Acromyrmex com
Mycetagroicus, sendo que a definição da relação deste gênero com os demais atíneos, ainda
necessita de maiores estudos (Brandão, Mayhe - Nunes, 2001).
Com relação aos fungos simbiontes, características culturais, bioquímicas e micromorfológicas indicam que estes microrganismos são basidiomicetos subdivididos em quatro grupos. G1: fungos cultivados por Atta, Acromyrmex, Trachymyrmex, Sericomyrmex; G2 e G4: fungos simbiontes de Apterostigma; e G3: fungos simbiontes de Cyphomyrmex,
Mycetosoritis, Mycetophylax, Mycocepurus, Mycetarotes, Myrmicocrypta (Chapela et al.,
1994; Mueller, 2002).
Os fungos cultivados pelas diferentes formigas são distintos entre si e parecem ter evoluído com os insetos. Chapela et al. (1994) propuseram que os fungos do grupo 1, que são propagados clonalmente, são geneticamente similares. O mesmo ocorre com os fungos do grupo 2 e 4 (Mueller, 2002). Por outro lado, os fungos do grupo 3 são geneticamente diversos, indicando que estão mais relacionados com fungos de vida livre do que com outros fungos de atíneos.
Os fungos simbiontes de atíneos derivados são muito semelhantes (Silva-Pinhati et al., 2004), mas são distintos dos fungos cultivados pelos atíneos primitivos. A monofilia do hábito de cultivar fungos nas formigas da tribo Attini (Schultz, Meyer, 1995) indica que o estudo das características dos fungos cultivados pelos atíneos primitivos pode ser útil para revelar como se iniciou a simbiose.
A identificação completa dos fungos simbiontes de formigas da tribo Attini é realizada utilizando-se principalmente estruturas taxonomicamente informativas denominadas basidiomas ou corpos de frutificação. Foram encontrados basidiomas de fungos simbiontes de formigas em quase todos os gêneros de atíneos, exceto Sericomyrmex e Mycetagroicus. Estes fungos, na maioria das vezes, foram classificados como pertencentes à tribo Leucocoprineae (Agaricaceae, Agaricales, Basidiomycota) (Chapela et al., 1994; Mueller, et al., 1998; North, 1997).
Pagnocca et al. (1990) classificaram basidiomas encontrados em ninhos de
Acromyrmex hispidus falax como sendo Leucoagaricus gongylophorus, e comprovaram a
identidade genética entre os basidiomas e o estado micelial do fungo isolado através de RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA). Basidiomas encontrados em ninhos de Atta
sexdens rubropilosa foram descritos como Leucoagaricus gongylophorus (Bononi et al.,
estudos sugerirem que algumas cortadeiras do gênero Atta e Acromyrmex cultivam a mesma espécie de fungo (Stradling, Powell, 1986).
O mutualismo entre fungos e formigas é caracterizado por antiga congruência evolutiva em que grupos específicos de formigas têm se especializado em cultivar um grupo específico de fungos. A maioria das formigas da tribo Attini cultiva fungos pertencentes aos gêneros Leucocoprinus e Leucoagaricus, da família Lepiotaceae (Chapela et al., 1994; Mueller et al., 1998). Pelo fato dos atíneos mais basais cultivarem fungos da tribo Leucocoprineae, provavelmente, a fungicultura se originou com estes fungos (Mueller et al., 2001). Somente os atíneos primitivos do gênero Apterostigma têm adquirido secundariamente fungos da família Tricholomataceae e Pterulaceae, que são distantes dos fungos cultivados pelas demais representantes da tribo (Chapela et al., 1994; Villesen et al., 2004; Munkacsi et al., 2004). Como a formiga Apterostigma também cultiva fungo da família Lepiotaceae (Mueller et al, 1998), é provável que a transição para fungos tricolomatáceos ocorreu na derivação desta espécie (Mueller et al., 2001), assim com ocorreu com a transição para fungos pteruláceos.
1.2. Transmissão vertical versus horizontal de fungos entre as formigas da tribo Attini A congruência entre as árvores de filogenia de fungos simbiontes, baseadas em marcadores moleculares, e dos atíneos derivados, baseadas em caracteres morfológicos (Chapela et al, 1994; Hinkle et al., 1994), é uma evidência de transmissão vertical do fungo simbionte e co-evolução iniciada quando um ancestral de formigas da tribo Attini associou-se a um ancestral dos fungos simbiontes, ou seja, com uma única aquisição de um fungo ancestral. Esta hipótese exige que tanto os fungos simbiontes, como as formigas, sejam monofiléticos. Embora haja indicações de monofilia das formigas da tribo Attini (Schultz, Meier, 1995), o mesmo não ocorre com todos os fungos simbiontes.
Uma outra evidência da transmissão vertical dos fungos de atíneos é o fato de rainhas de Atta, Acromyrmex e Trachymyrmex, terem sido observadas carregando porções do fungo do ninho de origem para o descendente (Weber, 1966 e 1972a). Esta transmissão também foi observada em formigas do gênero Cyphomyrmex (Mueller, 2002), mas não há observações de campo caracterizando o carregamento do inóculo do fungo pelas rainhas dos demais gêneros. No entanto, algumas análises moleculares de populações de fungos fornecem evidência indireta de transmissão vertical em simbiontes de formigas primitivas e derivadas (Mueller, e
al., 1996; Bot et al., 2001; Green et al., 2002), sendo que em diferentes ninhos de mesma espécie podem ser encontrados fungos geneticamente idênticos, indicando que eles podem ter sido clonalmente derivados de um ancestral comum (Mueller, 2002). As mesmas análises que sustentam a transmissão vertical de clones de fungos também revelaram níveis significativos de transferência horizontal entre espécies ou mesmo entre gêneros de atíneos.
A recente descoberta da identidade genética de alguns fungos de vida livre com alguns fungos cultivados por atíneos primitivas sugere que muitos fungos são constantemente domesticados de populações de vida livre (Mueller et al., 1998). Há também evidências genéticas da ocorrência de transferência horizontal destes fungos entre diferentes espécies e até entre gêneros dos atíneos (Mueller et al, 1996; Mueller et al, 1998; Adams et al, 2000a; Bot et al, 2001; Green et al, 2002), contradizendo a hipótese de simples domesticação seguida por propagação clonal.
A propagação clonal dos fungos desde a origem do mutualismo, pode ser regra geral para muitas espécies de formigas da tribo Attini, a curto prazo, no período evolucionário (Mueller et al., 1996). Mas, a longo prazo, esta história pode ser complexa, envolvendo transferência horizontal entre linhagens e repetidos ciclos de domesticação de fungos de vida livre, seguidos por retorno destes ao estágio de vida livre (Mueller et al., 1998).
1.3. Aspectos nutricionais e co-evolução de formigas e fungos
A existência de um mecanismo complexo de integração, caracterizado por codependência nutricional, fisiológica e antibiótica, indica uma longa história co-evolucionária (Mueller, 2002) entre formigas e fungos. Nestas condições, esperam-se encontrar integrações metabólicas entre os simbiontes, desenvolvidas durante estes anos de co-evolução.
A adaptação mútua entre formigas e fungos está presente em alguns fungos simbiontes. Um exemplo disso são os gongilídeos (estruturas localizadas nas hifas que são ricas em nutrientes) que são produzidos geralmente por simbiontes de formigas derivadas (Mueller et al., 2001), embora já tenham sido observados em fungos simbiontes de formigas primitivas (A.C.O. Silva-Pinhati, não publicado), indicando que esta estrutura pode ser uma inovação evolucionária derivada de estruturas homólogas de fungos de atíneos primitivos.
Existe uma tendência para o aumento do tamanho das colônias, da estrutura dos ninhos e do corpo das operárias, de acordo com a derivação dos gêneros dentro da tribo Attini
(Hölldobler, Wilson, 1990). O tamanho das colônias, a complexidade dos ninhos e o tamanho das operárias, são relativamente semelhantes entre os atíneos primitivos e bem menores que aqueles apresentados pelas formigas cortadeiras Acromyrmex e Atta (Leal, 1998).
As colônias de Apterostigma e Cyphomyrmex são as menores dentro da tribo, enquanto que Acromyrmex e Atta são as maiores (Weber, 1972a). Os demais gêneros como
Myrmicocrypta, Sericomyrmex e Trachymyrmex, apresentam tamanhos intermediários muito
mais próximos de Apterostigma e Cyphomyrmex do que de Acromyrmex e Atta (Weber, 1972a) (tabela 1).
A nutrição das formigas também teve que se adaptar para sustentar o aumento da população. Assim, as quantidades de substrato coletadas para o cultivo de fungo pelos atíneos primitivos são similares entre si, mas muito inferiores às coletadas por formigas cortadeiras (Leal, 1998). Além disso, há uma dependência nutricional das formigas com relação aos fungos simbiontes, uma vez que eles fornecem enzimas que degradam polissacarídeos vegetais (Bacci, et al. 1995). Dessa forma, espera-se que o fungo simbionte destas formigas assimile estes polissacarídeos. De fato, a estratégia deste fungo para acessar e utilizar estes nutrientes dos vegetais, foi estudada em nosso laboratório para a formiga Atta sexdens, uma espécie derivada (Siqueira et al., 1998) e Mycetarotes parallelus, uma espécie primitiva (Silva, 2000), sendo constatado que os fungos podem servir de intermediários para a assimilação de polímeros pelas formigas.
Também, os fungos simbiontes sofreram alterações metabólicas para suportar o aumento da complexidade dos ninhos das formigas (Silva, 2000). Assim, o fungo simbionte de M. parallelus apresenta um crescimento muito mais rápido do que L. gongylophorus, simbionte de Atta sexdens. Porém o crescimento lento de L. gongylophorus pode ser compensado por sua alta capacidade de produzir enzimas. Portanto, além da biomassa fúngica, a quantidade de enzimas produzidas pelo fungo poderia influenciar diretamente na alimentação das formigas, e conseqüentemente no tamanho dos ninhos. Dessa forma o desenvolvimento de uma alta capacidade de produzir despolimerases parece ser uma característica importante na evolução das formigas da tribo Attini.
1.4. Sistemática do gênero Atta
O gênero Atta Fabricius, 1805 (Hymenoptera; Formicidae; Myrmicinae; Attini), compreende os atíneos popularmente conhecidos por saúvas. No Brasil, encontra-se o maior
número de espécies deste gênero, ocupando toda a extensão do País (Della Lucia, 1993). Tal distribuição sugere que aqui tenha ocorrido a sua origem, supostamente na região Norte, onde hoje se encontra a Floresta Amazônica (Weber, 1972a).
A sistemática do gênero Atta foi sempre controversa. Segundo Borgmeier (1950) “um dos aspectos menos agradáveis da taxonomia das formigas é o fato de ela ser baseada quase que exclusivamente em operárias, isto é, em fêmeas estéreis”. Assim, a distinção das espécies de Atta através de caracteres morfológicos é dificultada pelo polimorfismo das castas, além da variação de certos caracteres entre operárias do mesmo tamanho.
A análise da genitália masculina mostrou-se uma ferramenta mais segura para a sistemática de Atta, que inicialmente foi caracterizada com apenas 3 espécies, Atta cephalotes,
Atta insularis e Atta sexdens, sendo as demais formas consideradas como subespécies ou
variedades (Emery, 1913). Quase dez anos mais tarde Emery (1922) reconheceu Atta
colombica e Atta laevigata como espécies, mas distribuiu estas 5 espécies em 3 grupos. No
mesmo caminho Borgmeier (1939) considerou 9 espécies, 6 subespécies e 11 variedades. Com base no trabalho de Emery, Gonçalves (1942) validou 11 espécies e 18 subespécies, definiu os subgêneros Archeatta, Neoatta e Atta, e descreveu duas novas espécies, Atta goiana (Gonçalves, 1942) e Atta capiguara (Gonçalves 1944). Posteriormente, o número de subgêneros aumentou com a inclusão de Paleatta e Epiatta e as espécies passaram a ser 14, com 16 subespécies definidas (Borgmeier, 1950).
Borgmeier (1959) sinonimizou Epiatta e Neoatta, e considerou somente 14 espécies. Em seguida, três das subespécies, as de Atta sexdens, foram novamente consideradas (Gonçalves, 1963; Mariconi, 1970), totalizando 16 formas entre espécie e subespécie. Com a descrição de Atta silvai, o número de espécies foi elevado para 15 (Gonçalves, 1982), mas, em seguida, esta nova espécie foi sinonimizada a Atta laevigata (Delabie, 1998), de modo que o número de espécies voltou a ser 14. Finalmente, as três subespécies de Atta sexdens foram sinonimizadas e chamadas simplesmente de Atta sexdens (Bolton, 1995). Atualmente, as seguintes espécies são descritas: A. colombica Guérin, 1845; A. insularis Guérin, 1845; A.
mexicana (F. Smith, 1858); A. saltensis Forel, 1913; A. texana (Buckley, 1860); A. bisphaerica Forel, 1908; A. capiguara Gonçalves, 1944; A. cephalotes (L., 1758); A. goiana
Gonçalves, 1942; A. laevigata (F. Smith, 1858); A. opaciceps Borgmeier, 1939; A. robusta Borgmeier, 1939; A. sexdens (L., 1758) e A. vollenweideri Forel, 1893. Com exceção das cinco primeiras espécies, as demais são encontradas no Brasil.
2. ESTUDOS DESENVOLVIDOS NESTA TESE
Os objetivos deste trabalho foram estudar as formigas da tribo Attini e seus fungos simbiontes, buscando contribuir no esclarecimento de alguns aspectos da simbiose que ainda não estão bem definidos, como: a transmissão dos fungos, se horizontal ou vertical; o caminho evolutivo e nutricional que estes simbiontes tomaram; e a sistemática do gênero Atta que é sempre controversa.
Para estudar os fungos é necessário, primeiramente realizar o isolamento e cultivo destes microrganismos, sendo que este procedimento normalmente é dificultado devido à baixa velocidade de crescimento de fungos simbiontes, e também pela presença de muitos microrganismos contaminantes nos ninhos das formigas. Para facilitar o estudo do fungo simbionte, nós desenvolvemos um método que aumenta a eficiência de isolamento e cultivo, quando comparado àqueles obtido por método tradicional (Capítulo II). Este novo método vem sendo utilizado para isolar e manter culturas de laboratório de fungos simbiontes de diversas espécies de formigas da tribo Attini.
A seguir, nós utilizamos métodos moleculares para estudos sobre a sistemática e, a maneira de transmissão dos fungos simbiontes das formigas cortadeiras (Capítulo III), além de estudos para caracterização do metabolismo de polissacarídeos pelos fungos simbiontes de formigas de diversos gêneros da tribo Attini (Capítulo IV) e de estudos para a caracterização morfológica dos gongilídeos de fungos simbiontes de formigas nos gêneros Atta, Acromyrmex e Trachymyrmex (Capítulo V). Estes estudos são discutidos de forma a reconstituir a história evolutiva e nutricional dos simbiontes.
Finalmente, nós apresentamos os resultados sobre a sistemática molecular das formigas do gênero Atta, que foi sempre muito controversa (Capítulo VI), devido ao estudo deste gênero ser, até o momento, baseado em caracteres morfológicos que, embora extremamente úteis, por vezes não conseguem resolver alguns ramos da filogenia. Dessa forma, os estudos filogenéticos realizados nesta tese podem, juntamente com estudos morfológicos, comportamentais, ecológicos e fisiológicos, colaborar para reconstrução filogenética do gênero Atta.
3. REFERÊNCIAS
Adams, R. M. M.; Mueller U. G.; Holloway A. K.; Green A. M.; Narozniak J. Garden sharing and garden stealing in fungus-growing ants. Naturwissenschaften 87: 491-493, 2000a. Adams, R. M. M.; Mueller, U. G.; Schultz, T. R.; Norden, B. Agro-predation: usupation of
attine fungos garden by Megalomyrmex ants. Naturwissenschaften 87: 549-554, 2000b. Bacci Jr., M.; Anversa, M. M.; Pagnocca, F. C. Cellulose degradation by Leucocoprinus
gongylophorus, the fungus cultured by the leaf-cutting ant Atta sexdens rubropilosa. Antonie van Leeuwenhoek Amsterdam, v. 67, n. 4, p. 385-386, 1995.
Bass, M.; Cherrett, J. M. Fungal hyphae as a source of nutrients for the leaf-cutting ant Atta
sexdens. Physiol. Entomol. 20: 1-6 1995.
Bolton, B. A new general catalogue of the ants of the world. Harvard University Press, Cambridge, MA, USA, 1995.
Bononi, V. L. R.; Autuori; M.; Rocha M. B. Leucocoprionus gongylophorus (Möller) Heim, o fungo do formigueiro de Atta sexdens rubropilosa Forel. Rickia, v. 9, p. 93-97, 1981. Borgmeier, T. Nova contribuição para o conhecimento das formigas neotropicais (Hym.
Formicidae). Revista de Entomologia 10 (2): 403-428, 1939.
Borgmeier, T. Estudos sôbre Atta (Hym. Formicidae). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 48, p. 239-263, 1950.
Borgmeier, T. Revision der Gattung Atta Fabricius (Hymenoptera, Formicidae). Studia
Entomológica, v. 2 (1-4), p. 321-390, 1959.
Bot, A. N. M.; Rehner, S. A.; Boomsma J. J. Partial incompatibility between ants and symbiotic fungi in two sympatric species of Acromyrmex leaf-cutting ants. Evolution, 55:1980-2001, 2001.
Brandão, C. F. R.; Nunes, A. M. A new fungus-growing ant genus Mycetagroicus gen. n., with the description of three new species and comments on the monophyly of the Attini (Hymenoptera: Formicidae). Sociobiology, 38: 639-665, 2001.
Brandão, C. R. F. Systematic revision of the neotropical ant genus Megalomyrmex Forel (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae) whith the description of thirteen new species.
Chapela, I. H.; Rehner, S. A.; Schultz, T. R.; Muller, U. G. Evolutionary history of the symbiosis between fungus-growing ants and their fungi. Science. v. 266, p.1691-1694, 1994.
Cruz, B. P. B.; Batista Filho, A. Manifestação da forma perfeita de Leucocoprinus
gongylophorus (Möller) Heim em sauveiro artificial de Atta sexdens rubropilosa Forel. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v. 60, p. 66-69, 1993.
Currie, C., Mueller, U. G. & Malloch, D. The agricultural pathology of ant fungus gardens.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 96, 7998-8002, 1999a.
Currie, C. R. A Community of Ants, Fungi, and Bacteria: A Multilateral Approach to Studying Symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 55:357, 2001.
Currie, C. R.; Scott, J. A.; Summerbell, R. C.; Malloch, D. Fungus-growing ant use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature, 398: 701-704, 1999b.
Currie, C. R; Wong B.; Stuart, A. E.; Schultz, T. R.; Rehner, S. A.; Mueller, U. G., Sung, G. H., Spatafora, J. W.; Strauss, N. A. Ancient tripartite coevolution in the attine ant-microbe symbiosis. Science, 299: 386-388, 2003.
Delabie, J. H. C. Atta silvai Gonçalves, sinônimo júnior de Atta laevigata (Fred. Smith) (Hymenoptera, Formicidae, Attini). Revista Brasileira de Entomologia, v. 41 (2-4), p. 339-341, 1998.
Della Lucia, T. M. C. As formigas cortadeiras. Viçosa. Ed. Folha de Viçosa. 262 p, 1993. Diniz, J. L. M., Brandão, C. R. F. , Yamamoto, C. I. Biology of Blephariatta ants, the sister
group of the Attini: a possible origem of fungus-ants symbiosis. Naturwissenchaften. 85:270-274, 1998.
Emery, C. Éstudes sur les Myrmicinae: V-VII. Annales de la Société Entomologique de
Belgique. 57:250-262, 1913.
Emery, C. Formicidae: Myrmycinae. IN: Genera Insectorum. v. 174B, editado por P Wytsman. Brussels: Verteneuil & Desmet. p. 95-206, 1922.
Green, A. M.; Adams, R. M. M.; Mueller, U. G. Extensive exchange of fungal cultivars between sympatric species of fungus-growing ants. Molecular Ecology 11: 191-195, 2002.
Gonçalves, C. R. Contribuição para o conhecimento do gênero Atta Fabr., das formigas saúvas. Boletim da Sociedade Brasileira de Agronomia, v. 5, (3), p. 333-358, 1942.
Gonçalves, C. R. Descrição de uma nova saúva brasileira. Revista Brasileira de Biologia, v. 4 (2), p. 233-2238, 1944.
Gonçalves, C. R. Atta silvai, nova espécie de formiga saúva (Hymenoptera, Formicidae).
Arquivos da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, v. 5 (2), p.173-178, 1982.
Gonçalves, C. R. Nota sobre a sistemática de Atta sexdens (L., 1758) e de suas subespécies. (Hym., Formicidae). Boletim Fitossanitário, v. IX (1 e 2), p. 1-3, 1963.
Hinkle, G.; Wetterer, J. K.; Schultz, T. R.; Sogin, M. L. Phylogeny of theattine fungi based on analysis of small subunit ribosomal RNA gene sequences. Science, Washington, v. 226, n. 5191, p. 1695-1697, 1994.
Hölldobler, B.; Wilson, E. O. The ants. Cambridge: Havard Univ. Press, p. 596-608, 1990. Kusnezov, N. Zoogeografia de las hormigas em Sudamerica. Acta Zoológica Lilloana. 19:
25-185, 1963.
Leal, I. R. Ecologia e história natural de formigas Attini em vegetação de cerrado. Campinas, 1998. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas (Ecologia) – Instituto de Biologia) - Universidade Estadual de Campinas.
Mariconi, F. A. M. As saúvas. São Paulo, Ed. Agronômica Ceres. 167 p, 1970.
Martin, J. S.; Martin, M.M.. The biochemical basis for the symbiosis between the ant, Atta
colombica tonsipes, and its food fungus. J. Insect. Physiol. 16: 109-119 1970.
Meier, R.; Schultz, T. R. Pilzzucht und Blattschneiden bei Ameisen - Präadaptationen und evolutive Trends. Sitzungsber. Ges. Naturforsch. Freunde Berl. N.F.
35, 57-76, 1996.
Mueller, U. G.; Lipari, S. E.; Milgroom, M. G. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) fingerprinting of symbiotic fungi cultured by the fungus-growing ant
Cyphomyrmex minutus. Molecular Ecology, 5: 119-122, 1996.
Mueller, U. G.; Rehner, S. T.; Schultz, T. R. The Evolution of Agruculture in Ants. Science,v. 281, pp. 2034-2038, 1998.
Mueller, U. G.; Schultz, T. R.; Currie C. R.; Adams, R. M. M.; Malloch, D. The origin of the attine ant-fungus symbiosis. Quarterly Review of Biology , New York, v. 76, n. 2, p. 169-197, 2001.
Mueller, U. G. Ant versus Fungus versus Mutualism: Ant-Cultivar Conflict and the Desconstruction of the Attini Ant-Fungus Symbiosis. American Naturalist, v. 160, pp. S67-S98, 2002.
Mueller, U. G.; Geraldo, N. Fungus-farming insects: Multiple origens and diverse evolutionary histories. PNAS. 23:15247-15249, 2002.
Mayhé-Nunes, A. J. Filogenia de los Attini (Hym., Formicidae): un aporte al conocimiento
de las hormigas fungívoras. Caracas, 1995. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) -
Universidad Simón Bolívar.
Mayhé-Nunes, A. J.; Brandão, C.R.F. Revisionary studies on the Attini ant genus
Trachymyrmex Forel. Part 1: Definition of the genus and the Opuletus group
(Hymenoptera: Formicidae). Sociobiology. 40: 667-698, 2002.
Muchovej, J. J.; Della Lucia, T. M., Muchovej, R. M. Leucoagaricus weberi sp nov. from a live nest of leaf-cutting ants. Mycol. Res., v. 95, p.1308-1311, 1991.
Munkacsi, A. B.; Pan, J. J.; Villesen, P.; Mueller, U. G.; Blackwell, M.; McLaughlin, D. J. Convergent coevolution in the domestication of coral mushrooms by fungus-growing ant.
Proc. Roy. Soc., in press.
North, R. D.; Jackson, C. W.; Howse, P. E. Evolutionary aspects of ant-fungus interactions in leaf-cutting ants. Tree., v. 12 p. 386-389, 1997.
Pagnocca, F. C.; Silva, O. A.; Hebling-Beraldo, M. J.; Bueno, O.C.; Fermnandes, J. B.; Vieira, P. C. Toxicity of sesame extracts to the symbiotic fungus of leaf-cutting ants. Bul.
Entomol. Res., 80: 349-352, 1990.
Quinlan, R. J., Cherrett, J. M. Role of substrate preparation in symbiosis between leaf-cutting ant Acromyrmex-Octospinosus(Reich)and its food fungus. Ecological Entomology 2 (2): 161-170, 1977.
Quinlan, R. J.; Cherret, J. M. The role of fungus in the diet of the leaf-cutting ant Atta
cephalotes (L). Ecol. Entomol., v. 4, p. 151-60, 1979.
Schultz, T. R.; Meyer R. A phylogenetic analysis of the fungus-growing ants (Hymenoptera: Formicidae: Attini) based on morphological characters of the larvae, Syst. Entomol., v. 20, p. 337-370, 1995.
Silva, A.C.O. Isolamento do fungo simbionte da formiga Mycetarotes parallelus e avaliação
de suas habilidades metabólicas. Rio Claro, SP, 2000. (Master Degree Thesis. Instituto de
Silva-Pinhati, A. C. O.; Bacci Jr, M.; Hinkle, G.; Sogin, M. L., Pagnocca, F.C.; Martins, V. G.; Bueno, O.C.; Hebling, M. J. A. Low variation in ribosomal DNA and internal transcribed spacers of symbiotic fungi of leaf-cutting ants (Attini: Formicidae). Brazilian
Journal of Medical and Biological Research, v. 37, p. 1463-1472, 2004.
Silva-Pinhati, A. C. O.; Bacci Jr.,M.; Siqueira, C. G.; Silva, A.; Pagnocca, F. C.; Bueno, O. C.; Hebling, M. J. A. Isolation and Maintenance of Symbiotic Fungi of Ants in the Tribe Attini (Hymenoptera: Formicidae). Neotropical Entomology, 2004 (no prelo).
Siqueira, C. G.; Bacci Jr., M; Pagnocca, F. C.; Bueno O. C.; Hebling, M. J. A. Metabolism of plant polysaccharides by Leucoagaricus gongylophorus, the symbiotic fungus of the leaf-cutting ant Atta sexdens L. Applied and Environmental Microbiology, 64: 4820-4822, 1998.
Stradling, D. J.; Powel, R. J.. The cloning of more highly productive fungal strains: a factor in the speciation of fungus growing ants. Experientia, v. 42, p. 962-964, 1986.
Schultz, T. R.. The origin and evolution the fungus-growing ants: Clues from the phylogeny of the fungus-growing ants. IN: Internetional Congress of Entomology (21: 2000. Foz do Iguaçu)., vol. 2, p. 865.
Villesen, P.; Mueller, U. G.; Schutz, T. R.; Adans, R. M. M.; Bouck, A. C. Evolution of ant-cultivar specialization and ant-cultivar switching in Aperostigma fungus-growing ants.
Evolution, in press.
Weber, N. A. The fungus growing ants. Science, v. 153, p. 587-604, 1966.
Weber, N. A. Gardening ants: the attinies. The American Philosofical Society, Philadelphia, p. 23, 1972a.
Weber, N. A. Fungus-culturing by ants. IN Insect- fungus symbiosis: Mutualism and
commensalism, Monticlar: Allanhed e Osmun, p. 77-116, 1979.
Wetterer, J. K; Schultz, T. R.; Meier, R. Phylogeny of fungus-growing ants (tribo Attini) based on mtDNA sequence and morphology. Molecular Phylogenetics and Evolution. 9: 42-47, 1998.
Wilson, E. O. The insect societies. Cabridge: Belknap Press of Havard University Press, 1971. 548 p.
CAPÍTULO II
Isolation and maintenance of symbiotic fungi of
ants in the tribe Attini (Hymenoptera:
Formicidae)
ISOLATION AND MAINTENANCE OF SYMBIOTIC FUNGI OF ANTS IN THE TRIBE ATTINI (HYMENOPTERA: FORMICIDAE)
Ana Carla O. Silva-Pinhati, Maurício Bacci Jr., Célia G. Siqueira, Aline Silva, Fernando Carlos Pagnocca, Odair C. Bueno & Maria José A. Hebling.
Centro de Estudos de Insetos Sociais, Universidade Estadual Paulista. Av. 24A, 1515. Rio Claro, SP. CEP 13506-900. Brazil.
RESUMO
O isolamento e a manutenção de fungos basidiomicetos simbiontes de formigas da tribo Attini tem sido dificultado pela baixa velocidade de crescimento desses fungos, bem como pela presença de muitos microrganismos que vivem na superfície do material que as formigas mantêm no interior nos ninhos como substratos para o crescimento dos seus fungos simbiontes. No presente trabalho nós descrevemos um método que aumenta em mais de sete vezes a eficiência de isolamento destes fungos, quando comparada àquela obtida por procedimentos tradicionais. Ninhos subterrâneos de formigas atíneas dos gêneros Atta,
Acromyrmex, Trachymyrmex e Mycetarotes foram localizados e deles foram coletadas
amostras contendo fungos simbiontes e formigas, que foram transportadas para o laboratório, onde as formigas foram capazes de limpar a cultura do fungo e estimular o seu crescimento. Em seguida, porções dos micélios foram assepticamente coletadas e transferidas para meio Yeast Nitrogen Base contento glicose e cloranfenicol. Para facilitar a manutenção dos isolados em culturas de laboratório, diferentes nutrientes foram analisados para a elaboração de um meio de cultivo complexo, que possibilitou aumentar a velocidade de crescimento dos fungos e estocá-los por longos períodos. Este método foi aplicado com sucesso para os fungos simbiontes de todos os gêneros de formigas estudados, gerando, assim, um procedimento extremamente útil para a formação e manutenção de uma coleção representativa de diferentes fungos simbiontes de formigas da tribo Attini.
ABSTRACT
The isolation and maintenance of symbiotic basidiomycete fungi living in association with ants of the tribe Attini has been hindered by the slow growth rate of these fungi and the presence of other microorganisms on the surface of the material which the ants maintain inside their nests to provide a growth substrate for their symbiont. In this paper we describe a method which increases the efficiency of isolation of these fungal symbionts by over seven fold as compared to traditional isolation procedures. Underground nests of attine ants of the genera Atta, Acromyrmex, Trachymyrmex and Mycetarotes were located, from which samples containing the fungal symbiont and ants were collected and transported to the laboratory where the ants were able to clean the fungal culture and stimulate its growth. As the symbiotic fungus grew, portions of its mycelium were collected and transferred to solid Yeast Nitrogen Base culture medium containing glucose and chloramphenicol. To facilitate the maintenance of the isolates in laboratory cultures, several nutrients were tested to formulate a complex culture medium for fast fungal growth and long-term storage. We successfully applied this methodology to the fungal symbionts of all the ant genera studied, thus producing a useful tool for the creation and maintenance of a comprehensive collection of fungi symbiotic of ants in the tribe Attini.
An obligate symbiosis exists between basidiomycete fungi and leaf-cutting ants of the tribe Attini. This association results in the exploitation of a great variety of vegetation by leaf-cutting ants (Cherrett 1968), which are important both as herbivores in natural habitats (Wint 1983) and pests in agriculture settings (Cherrett & Pregrine 1976, Fowler et al. 1986).
In their nests, leafcutter ants propagate the fungal symbiont by providing it with cut leaves and inhibiting the growth of competing microorganisms (Cherrett et al. 1989), while the fungus produces enzymes, principally polysaccharidases and proteinases (Boyd & Martin 1975, Cherrett et al. 1989, Siqueira et al. 1998), which digest the cut leaves to produce the nutrients necessary for the survival of the larvae and adult ants (Quinlan & Cherrett 1979, Bass & Cherrett 1995), the fungus growing in the cut leaves inside the nests being called ‘fungus garden’.
The dependence of Attini ants on their fungal symbiont is so great that the ants have never been seen living isolated from their fungi and any disruption to this symbiotic association is highly deleterious for the ants, thus the control of the attine pest ants would greatly benefit from an understanding of the mechanisms by which the fungal symbiont contributes to ant herbivory and survival. However, the study of these symbiotic fungi has been hampered by their slow growth rate in laboratory culture, which makes isolation and storage a very laborious and time-consuming task. To facilitate future work on Attini symbiotic fungi, we have improved the isolation procedure and developed a culture medium which allows fast fungal growth and which can also be used for long-term storage.
MATERIALS AND METHODS
Ants and nest location. Underground nests of Attini ants of the genera Atta, Acromyrmex,
Trachymyrmex and Mycetarotes were located and samples of the fungus garden and ants
collected and transported to the laboratory where the ants were able to reorganize the fungus garden material and clean the fungal culture and stimulate its growth. The ant species, nest location and date of sampling are listed in Table 1, all the ant species involved in this study being deposited in the Coleção Entomológica Adolph Hempel at the Instituto Biológico, São Paulo-SP, Brazil.
Culture media. For fungal isolation from the fungus garden we used Yeast Nitrogen Base Glucose Chloramphenicol (YNBGC) agar consisting of Yeast Nitrogen Base media (YNB, Difco 100697) supplemented with (gl-1) glucose (Merck, 108342, Darmstadt, Germany), 5; agar-agar (Merck, 1.01614), 17; chloramphenicol (Sigma C-0378), 0.1 and sufficient 2M-NaOH to adjust the pH to 6.0. For maintenance we used YNB-glucose agar (i.e. YNBGC without chloramphenicol).
To assess biomass production as a measure of growth we used unsupplemented Pagnocca’s et al. (1990) liquid Medium A containing (gl-1) glucose, 10; NaCl (Labsynth C1060.01.AH, São Paulo, Brazil), 5; peptone (Sigma P-0556), 5; malt extract (Difco 0186-01), 10, as well as Medium A agar (containing 17 gl-1 agar-agar). We also used liquid Medium A supplemented with (gl-1) casein hydrolysate (Sigma ‘Amicase’ A-2427), 20; flaked oats (Maisvita, São Paulo, Brazil), 20; flaked soybean (Imalaia Oriente, Santa Gertrudes, Brazil), 20. Both unsupplemented and supplemented liquid Medium A had a final pH of 6.0. We also used YNB media supplemented with 5 gl-1 of one of the following:bovine albumin (Sigma A-6003), casein (Quimibrás 10578, São Paulo, Brazil), casein hydrolysate, egg albumin (Riedel de Häen 188 01), gelatin (Sigma G-9382), glucose, flaked oats, flaked soybean, soybean flour (Sigma S-9633) or xylose (Sigma X-1500), the final pH being 6.0.
Based on the experimental evidence presented in this paper and published data we produced a new buffered and supplemented formulation of Pagnocca’s Medium A agar that we called Medium B agar and which contained (gl-1) glucose, 10; NaCl, 2; peptone, 2; malt extract, 10, agar-agar, 17; casein hydrolysate, 20; flaked soybean, 20; flaked oats, 20; dibasic
sodium phosphate, 3.8; citric acid, 2.5; final pH 5.0. All media were sterilized for 20 minutes at 120° C.
Fungal isolation and cultivation. The fungus garden material collected from underground nests of the different ant species was incubated (25° C, 80% humidity) for 10 to 20 days in the dark in petri dishes containing worker ants which cleaned the garden material by removing soil fragments to a different part of the petri plate. When white mycelial spots of the fungal symbiont appeared on the leaf material some of the mycelia was collected using aseptic technique and transferred to YNBGC agar in petri plates where it was incubated at 25ºC in the dark for 30 days. Alternatively, the fungus garden material from underground nests was collected and immediately plated onto YNBGC agar and incubated at 25ºC in the dark for 30 days. In both cases, after 30 days of cultivation on YNBGC agar the fungal isolates were subcultured to YNB-glucose agar (without chloramphenicol) and cultured for a further 30 days. To evaluate biomass production by the symbiotic fungus of the ant Atta sexdens (Linnaeus, 1758) (formerly Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908) on various carbon substrates we subcultured the fungus on YNB-glucose agar for 30 days to produce large amounts of mycelia which was collected and suspended in sterile water with a Potter homogenizer. A suitable volume (containing 2.1 ± 0.11 mg dry weight) of this suspension was transferred to tubes containing 5 ml of liquid Medium A (supplemented and unsupplemented), supplemented YNB media or supplemented culture media A agar and B agar. After 30 days static incubation at 25° C, liquid media without insoluble components was filtered through a 0.25 µm Millipore filter to collect the mycelia while for liquid media containing insoluble carbon sources (casein, gelatin, soybean, flaked flour or flaked oats) mycelia was harvested with a loop. In both cases the mycelia was dried at 65° C for 24h and weighed. Fungal growth in solid culture media was estimated based on the mycelial surface and density as previously described in Pagnocca et al. (1990).
Statistics. Cultures in liquid media were replicated six to ten times for each of the carbon sources. The determined dry weight values were expressed as means ± standard deviations, the Tuckey test being used to test for differences between the weight of mycelia produced in the different media and the Mann-Whitney test for differences between initial and final pH (Zar 1996).
RESULTS AND DISCUSSION
The maintenance of fungus garden material from ants’ nests in the absence of ants resulted in the development of many filamentous fungi and yeasts which often overgrew the characteristic white spots of the symbiotic fungus (Fig. 1a) initially seen on the fungus garden material, and because of this only one in about 30 attempts resulted in the isolation of the symbiotic fungus.
Isolation efficiency was increased by keeping the fungus garden material in petri plates at 25° C and 80% humidity in the presence of worker ants which started to clean the fungus garden material by removing soil fragments to a different part of the plate, almost all soil debris being removed from the leaf material within 24 hours. This cleaning activity stimulated the growth of the fungal symbiont as characterized by the accumulation of white mycelial spots on the surface of the leaf material in the fungus garden (Fig. 1b). These spots were collected over the 20 days of the experiment and plated onto YNBGC agar, a procedure which resulted in one successful isolation out of every four attempts. As explained in the Materials and Methods, after 30 days of cultivation on YNBGC agar the fungal isolates were transferred to YNB-glucose agar (without chloramphenicol) and cultured for 30 days to produce larger amounts of mycelia. Few contaminants developed at this stage allowing the mycelia to be subcultured to YNB-glucose without antibiotics for further cultivation and maintenance.
Among the symbiotic fungi isolated (Table 1), those from Atta, Acromyrmex or
Trachymyrmex ants exhibited white mycelium which slowly spread as a thin film over the
YNB-glucose agar (Fig. 1c) and had swollen hyphal tips (Fig. 1d) called gongylidium (Chapela et al. 1994, Fisher et al. 1994), the isolates from Mycetarotes ants rarely, if ever, presenting gongylidia. In general, isolates started to become dark brown after 30 to 40 days so that further replication in fresh culture media results poor or no fungal growth, this loss of viability meaning that many replications are needed to maintain the isolates, making laboratory cultivation a continuous and exhaustive task.
To minimize laboratory work, attempts have been made to formulate a culture medium which was more efficient at maintaining laboratory cultures of symbiotic fungi. To accomplish that we investigated the growth rate of the A. sexdens fungal symbiont by cultivation in liquid Medium A and YNB containing different nutrients (Table 2), glucose and
xylose being used as controls because these simple carbohydrates efficiently support the growth of this fungus in laboratory cultivation and it has been proposed (Siqueira et al. 1998) that the production of glucose and xylose by the fungal degradation of starch and xylan is the major process for the generation of nutrients from the vegetal matter which the ants bring into their nests.
Our results (Table 2) using supplemented YNB confirm that the simple carbohydrates glucose and xylose were the most efficient carbon sources in respect to the production of fungal biomass, while the most efficient complex carbon sources was flaked oats, followed by gelatin, flaked soybean, bovine albumin, casein hydrolysate, soybean flour, egg albumin and casein. It seems, therefore, that the A. sexdens fungal symbiont is better adapted to grow on carbohydrates and not on proteinaceous substrates, the slow growth rate on proteins having also been reported for the symbiotic fungus of the ant Atta colombica tonsipes Santschi, 1929a (Martin & Martin 1970).
After 30 days incubation there was a statistically significant (Mann-Whitney test, 95% confidence limit) decrease in the original pH (6.0) of YNB broth supplemented with xylose to pH 4.8 and to pH 2.7 for YNB supplemented with glucose. Supplementation of YNB with bovine or egg albumin or flaked oats resulted in no significant pH change, while supplementation with gelatin, flaked soybean, soybean flour, casein or casein hydrolysate resulted in a small (but statistically significant) increase in pH to 6.2-6.3 (Table 2). It thus seems that metabolism of carbohydrates by fungal symbiont causes a decrease in pH while the metabolism of proteins either does not affect or slightly increases pH.
Medium A agar, described by Pagnocca et al. (1990), is normally used for culturing the fungal symbiont of A. sexdens. We tested the effect of supplementing liquid Medium A with casein hydrolysate, flaked soybean and flaked oats and found that the quantity of fungal biomass produced in supplemented liquid Media A after 30 days cultivation was over 2.5 times higher than in unsupplemented liquid Medium A (Table 2) and more than twice the biomass achieved in YNB-glucose. Both supplemented and unsupplemented liquid Medium A reached pH 5.0 after 30 days incubation, significantly different from their initial pH of 6.0 (Table 2). That supplemented liquid Medium A attained the same pH value as unsupplemented liquid Medium A may have been due to the fact that both media contained glucose and peptone, the metabolism of which had opposing effects on pH and which may have helped to stabilize the final pH of these media.
Considering the optimum pH values (around pH 5) reported for fungal symbionts of Attini ants (Silva 1999) and the good growth achieved on supplemented liquid Medium A we decided to buffer Medium A agar to pH 5.0 as described by Stoll & Blancard (1990) and to supplement it, as described in Materials and Methods, in order to produce what we called Medium B agar. We found that Medium B agar supports faster growth of the symbiotic fungus of A. sexdens than that found in Medium A agar and that although Medium B agar contained suspended particles of the insoluble components (flaked soybean and flaked oat) of the medium and appeared lumpy, removal of these particles by filtration (before agar addition) caused a decrease in fungal growth rate (Table 3). Cultures could be conserved for up to 40 days in Medium B agar instead of starting to become dark brown after 30 to 40 days as on YNB-glucose agar or Medium A agar, indicating that the mycelia is still viable, while there also appeared to be less contamination on Medium B agar. These characteristics indicate that Medium B agar is better optimized for the cultivation of Attini ant symbiotic fungi and can facilitate the maintenance of several isolates simultaneously.
The methods for the isolation and maintenance of Attini ant symbiotic fungi described in this paper will facilitate the formation of collections of the fungi associated with these ants, and thus help provide important information that may be useful for the control of those Attini ant species which are agricultural pests.
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) for the financial support of this work, as well as the Ph.D. degree fellowships of A. C. O. S. P., C. G. S. and A. S.
REFERENCES
Bass, M. & J.M. Cherrett. 1995. Fungal hyphae as a source of nutrients for the leaf-cutting ant Atta sexdens. Physiol. Entomol. 20: 1-6.
Boyd N.D. & M.M. Martin. 1975. Faecal proteinases of the fungus growing ant, Atta texana: Properties, significance and possible origin. J. Insect Physiol. 21:1815-1820.
Chapela, I.H., S.A. Rehner, T.R. Schultz & U.G. Mueller. 1994. Evolutionary history of the symbiosis between fungus-growing ants and their fungi. Science 266: 1691-1694.
Cherrett, J.M. 1968. The forraging behavior of Atta cephalotes L. (Hymenoptera, Formicidae) 1. Foraging pattern and plant species attacked in tropical rain forest. J. Animal Ecol. 37: 387-403.
Cherrett, J.M & D.J. Peregrine. 1976. A review of the status of leaf-cutting ants and their control. Ann. Appl. Biol. 84: 124-128
Cherrett, J.M., R.J. Powell & D.J. Stradling. 1989. The mutualism between leaf-cutting ants and their fungus, p.93-120. In N. Wilding, N.M. Collins, P.M. Hammond & J.F. Weber (eds.), Insect-fungus interactions. Academic Press, San Diego, 146p.
Fisher, P., D.J Stradling & D.N. Pegler. 1994. Leucoagaricus basidiomata from a live nest of the leaf-cutting ant Atta cephalotes. Mycol. Res. 98: 884-888.
Fowler, H.G., L.C. Forti, V.P Silva, & M.B Saes. 1986. Economic of grass-cutting ants, p.18-35. In C.S. Lofgren, & R.K. Vandermeer (eds.), Fire ants and leaf-cutting ants. Biology and management. Westview Press, Bolder, Colorado and London, 253p.
Martin, J.S. & M.M. Martin. 1970. The biochemical basis for the symbiosis between the ant, Atta colombica tonsipes, and its food fungus. J. Insect. Physiol. 16: 109-119.
Pagnocca, F.C., O.A. Silva, M.J. Hebling-Beraldo, O.C. Bueno, J.B. Fernandes & P.C. Vieira. 1990. Toxicity of sesame extracts to the symbiotic fungus of leaf-cutting ants. Bul. Entomol. Res. 80: 349-352.
Quinlan, R.L. & J.M. Cherrett. 1979. The role of the fungus in the diet of the leaf-cutting ant Atta cephalotes (L.). Ecol. Entomol., 4: 151-160.
Silva, A.C.O. 1999. Isolamento do fungo simbionte da formiga Mycetarotes parallelus e avaliação de suas habilidades metabólicas. Rio Claro, SP, Master Degree Dissertation. Instituto de Biociências, UNESP, Rio Claro, 104p.
Siqueira, C.G., M. Bacci, Jr., F.C. Pagnocca, O.C. Bueno & M.J.A Hebling. 1998. Metabolism of plant polysaccharides by Leucoagariccus gongylophorus, the symbiotic fungus of the ant Atta sexdens L. Appl. Environm. Microbiol. 64: 4820-4822.
Stoll, V.S. & J.S. Blancar. 1990. Buffers: Principles and practice, p. 31-32. In M.P. Deutscher (ed.), Guide to protein purification. Pasadena Academic Press, Pasadena, v. 182, 45p.
Wint, G.R.W. 1983. Leaf damage in tropical rain forest canopies. p. 229-239. In S.L. Sutton, T.C. Whitmore & A.C.Chadwick (eds.), Tropical rain forest: Ecology and management. British Ecological Society, Blackwell Scientific, Oxford, 245p.
Zar, J.H. 1996. Bioestatistical analysis, 3rd ed. Prentice-Hall do Brasil, Ltda, Rio de Janeiro, Brazil, 1996, 663p.
Table 1. Attini ants from which symbiotic fungi have been isolated. Ant Nest location1 Isolation date
Atta sexdens (Linnaeus, 1758) Rio Claro Aug, 1997
Atta capiguara Gonçalves, 1944 Botucatu Sep, 1995
Atta laevigata (Fr. Smith, 1858b) Rio Claro Nov, 1995
Atta cephalotes (Linnaeus 1758) Almeirin Aug, 1997
Acromyrmex crassispinus (Forel, 1907) Rio Claro Sep, 1995
Acromyrmex hispidus fallax Santschi, 1925 Rio Claro Mar, 1996
Trachymyrmex fuscus Emery, 1834 Rio Claro Dec, 1998
Mycetarotes parallelus (Emery, 1905b) Rio Claro Jul, 1997
1
All the collection sites, except for the A. cephalotes site, were in the Brazilian state of São Paulo. A. cephalotes was collected in the Brazilian state of Pará.
Table 2. Weight of mycelia and final pH (mean ± SD) of liquid culture media after growth of the symbiotic fungus of A. sexdens.
Medium Weight of mycelia1
(mg, dry weight) pH Supplemented2 Medium A (9)3 34.4 ± 8.82a 5.0 ± 0.11* Medium A (9) 13.2 ± 1.44 b 5.0 ± 0.11* YNB-xylose (9) 15.5 ± 0.91 b 4.8 ±0.12* YNB-glucose (9) 14.6 ± 0.91 b 2.7 ± 0.11* YNB-flaked oats (7) 12.0 ± 1.33 b, c 6.1 ± 0.11 YNB-gelatin (10) 9.4 ± 0.32c, d 6.3 ± 0.13* YNB-flaked soybean (9) 8.3 ± 1.19d 6.2 ± 0.09* YNB-bovine albumin (8) 7.9 ± 0.8 d 5.9 ± 0.33 YNB- casein hydrolysate (8) 7.6 ± 0.38d 6.3 ± 0.23* YNB-soybean flour (8) 6.4 ± 0.63d 6.2 ± 0.12* YNB-egg albumin (6) 5.1 ± 0.58d 5.9 ± 0.11
YNB-casein (6) 4.7 ± 0.5d 6.2 ± 0.11*
1
Values followed by different letters are significantly different by the Tuckey test (95% confidence limit).
2
Supplemented with (gl-1) casein hydrolysate, 20: flaked soybean 20; flaked oats, 20.
3
Number of replicates.
*Values significantly different from the initial pH value (6.0) by the Mann-Whitney test (95% confidence limit).
Table 3. Relative growth of the symbiotic fungus of A. sexdens in different solid culture media.
Medium
Relative Growth (30 days)
Medium A agar (8)1 2 +
Medium B agar (9) 5 +
Filtered2 Medium B agar (6) 3 +
1
Number of replicates.
2
Filtration was tentatively carried out (before agar addition) to remove suspended particles of the insoluble components (flaked soybean and flaked oat) of the medium, which minimized the lumpy appearance of Medium B agar, but however caused a decrease in fungal growth rate.
Figure 1. Isolation of the fungal symbiont of the ant A. crassispinus. Note the development of contaminants in fungus garden samples after 15 days without ants (a), in contrast to the selective propagation of the fungus in the presence of ants (b). After isolation, the fungus grew as white mycelium on Yeast Nitrogen Base Glucose (YNBG) agar (c) and presented swollen hyphal tips called gongylidium (d) which is a general characteristic of the symbiotic fungi of higher Attini.
Figure 1, Silva-Pinhati et al.
(a) (b)
CAPÍTULO III
Low variation in ribosomal DNA and internal
transcribed spacers of symbiotic fungi of
leaf-cutting ants (Attini: Formicidae)
Brazilian Journal of Medical and Biological
Research
LOW VARIATION IN RIBOSOMAL DNA AND INTERNAL TRANSCRIBED
SPACERS OF SYMBIOTIC FUNGI OF LEAF-CUTTING ANTS (ATTINI:
FORMICIDAE)
A.C.O. Silva-Pinhati1, M. Bacci Jr1,2, G. Hinkle5, M.L. Sogin5, F.C. Pagnocca,1,2, V.G. Martins,1,4, O.C. Bueno,1,3, M.J.A. Hebling1.
1
Centro de Estudos de Insetos Sociais. 2Departamento de Bioquímica e Microbiologia,
3
Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Av. 24A, 1515, Rio Claro-SP, Brazil 13506-900.
4
Departamento de Fonoaudiologia. Universidade Estadual Paulista. Av. Hygino Muzzi Filho, 737. Marília-SP, Brazil 17525-900.
5
Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory. 7 MBL Street, Woods Hole, MA, USA 02540-1015.
Correspondence
M. Bacci Jr. Universidade Estadual Paulista, Centro de Estudos de Insetos Sociais, Av. 24A, 1515, Rio Claro, SP, Brazil 13506-900. Telephone: 19-3526-4165. FAX: 19-3534-8523. E-mail: mbacci@rc.unesp.br
Key words: Atta, Acromyrmex, internal transcribed spacer, leaf-cutting ants, Leucoagaricus.
ABSTRACT
Leaf-cutting ants of the genera Atta and Acromyrmex (tribe Attini) are symbiotic with basidiomycete fungi of the genus Leucoagaricus (tribe Leucocoprinae) which they cultivate on vegetable matter inside their nests. We assessed the variation of 28S, 18S, and 5.8S ribosomal DNA (rDNA) gene loci and the rapidly evolving internal transcribed spacers 1 and 2 (ITS1 and ITS2) of sympatric and allopatric fungi associated with colonies of eleven species of leafcutter ants living up to 2,600 km apart. We found that the fungal rDNA and ITS sequences from different species of ants were identical (or nearly identical) to each other, whereas ten GenBank Leucoagaricus species showed higher ITS variation. Our findings suggest that Atta and Acromyrmex leafcutters living in geographic sites that are very distant from each other cultivate a single fungal species made up of very closely related lineages of
Leucoagaricus gongylophorus. We discuss the strikingly high similarity in the ITS1 and ITS2
regions of the Atta and Acromyrmex symbiotic L. gongylophorus studied by us, in contrast to the lower similarity displayed by their non-symbiotic counterparts. We suggest that the similarity of our L. gongylophorus isolates is an indication of the recent association of L.
gongylophorus with these ants, and propose some mechanisms involved in the
