Técnicas de isolamento de organelos

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Técnicas de isolamento de

organelos

Estudo de

processos

metabólicos

Fraccionamento

celular e

isolamento de

organelos ou

partículas

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Estrutura duma célula vegetal

Organelos duma célula eucariótica

• Lisossomas

• Peroxissomas • Mitocôndrias • Cloroplastos

• Retículo endoplásmico (ER) • Complexo de Golgi • Núcleo • (Citosol)

Lisossomas

• Responsáveis pela degradação de: z alguns componentes celulares z material captado do meio extracelular • Características: – membrana única – pH do lumen ≅ 5 – hidrolases ácidas catalisam reacções de degradação

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Peroxissomas

• Responsáveis pela degradação de: z ácidos gordos z compostos tóxicos • Características: – membrana única – contém oxidases e catalase

Mitocôndrias

• Local da produção aeróbica de ATP • Características: – membrana externa – espaço intermembranar – membrana interna – matriz

Cloroplastos

• Local da fotossíntese nas plantas e algas verdes • Características: – membrana externa – espaço intermembranar – membrana interna – estroma – membranas tilacóides – lumen dos tilacóides

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Retículo endoplásmico (ER)

• Responsável por: z parte da síntese lipídica z maioria da síntese proteica z armazenamento do ião Ca++

z destoxificação • Características:

– rede de túbulos e vesículas membranares fechadas e interligadas

– composto por regiões lisas e rugosas

Complexo de Golgi

• Modifica e exporta muitos produtos do ER • Características:

– compartimentos e vesículas achatadas

– composto por 3 regiões: cis (entrada), media, trans (saída)

– cada região contem um conjunto de enzimas diferente

Núcleo

• Separa: – o DNA do citosol – a transcrição e a tradução • Características: – membrana externa – membrana interna – poros nucleares – nucléolo

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Citosol

• Porção da célula envolvida pela membrana plasmática mas que não é parte de nenhum organelo • Características: – citoesqueleto – polirribossomas – diversidade de enzimas do metabolismo

Fraccionamento celular

1.Disrupção/homogenização

- dispersão do tecido - ruptura controlada das células - libertação dos organelos

Fraccionamento celular

1.Disrupção/homogenização

2. Fraccionamento

- separação do homogenato em partículas - recorre, p.ex., a diferenças de tamanho/forma, densidade, carga superficial

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Fraccionamento celular

1.Disrupção/homogenização

2. Fraccionamento

3. Análise

- microscopia - enzimas marcadores

- pigmentos ou proteínas específicas

1.Disrupção/homogenização

-dispersãodo tecido e ruptura controladadas células -métodoe dimensões do aparelhoadaptadas a cada caso

(eficiência da ruptura vs. minimizar danos mecânicos)

métodos

osmóticos (lise hipotónica) digestão enzimática (ex. lipases, proteases) mecânicos ex. métodos mecânicos: homogenizador tipo Potter misturador comercial almofariz homogenizador de lâminas homogenizador para eppendorfs

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RUPTURA DO TECIDO/CÉLULAS: Organelos retirados do meio envolvente utilização de meio de extracção iso-osmóticop.ex., com sacarose ou sorbitol Solução tampão mantém pH libertação de proteases, lipases, (ex.dos lisossomas)

realizar todo o processo a

baixa temperatura(≈ 4ºC) libertação de ácidos e outras substâncias acumuladas nalguns organelos desnaturação proteica oxidações (>O2, oxidases) Substâncias antioxidantes (ex.c/SH)

2. Fraccionamento

- separação dos homogenato em partículas com base essencialmente em diferenças nas suas propriedades físicas alguns métodos centrifugação (≠tamanho/forma e/ou densidade) electroforese (≠carga eléctrica) cromatografia (≠ solubilidade, dimensão, etc) partição (≠solubilidade)

-podem usar-se vários métodos em sequência - separação de organelos quase sempre recorre àcentrifugação

CENTRÍFUGA

(ou

CENTRIFUGADORA

):

Geralmente tem um motor, que faz rodar um

rotor

que contém tubos com as amostras

experimentais.

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CENTRIFUGAÇÃO

Utilização da força centrífuga para separar

componentes biológicos com base nas suas

propriedades de sedimentação.

UTILIZAÇÕES PRINCIPAIS:

separar matéria sólida (resíduo) dos solutos dissolvidos (no sobrenadante) separar estruturas ou macromoléculas de diferente massa ou densidade, presentes numa solução.

Rotor basculante

-mais fácil retirar o sobrenadante sem deslocar o resíduo do fundo do tubo

-MAS… não permite velocidades de rotaçãotão elevadas como rotores de ângulo fixo.

sobrenadante sobrenadante

resíduo resíduo resíduo

Rotor de ângulo fixo

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PRINCÍPIOS DA CENTRIFUGAÇÃO

F_c=mω2_r força de sedimentação duma partícula de

massa m; ω-velocidade angular do rotor; r-distância da partícula ao eixo de rotação

OU SEJA, QUANTO MAIOR FOR A MASSA DE UMA

PARTÍCULA E MAIOR A FORÇA CENTRÍFUGA, MAIS

RAPIDAMENTE ELA SE DESLOCA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA.

-

Forças que se

opõem

à centrifugação:

1. força de

impulsão

ou flutuação

2. Resistência da fricção (

atrito

)

1. força de

impulsão

ou flutuação

:

F

i

=mω

2

rνρ

ν−volume parcial específico da partícula;

ρ−densidade da solução

Fc= mω

2

_r

− mω

2

rνρ = mω

2

r(1-νρ)

OU SEJA:

- QUANTO MAIS DENSA FOR UMA PARTÍCULA (i.e., menor forν), MAIS RAPIDAMENTE SE DESLOCA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA

- QUANTO MAIS DENSA FOR A SOLUÇÃO, MAIS

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2. força de

atrito

- depende de factores como a

viscosidade do

meio

, a

forma da partícula

, etc

QUANTO MAIOR FOR O COEFICIENTE DE

ATRITO, MAIS LENTAMENTE SE DESLOCA UMA PARTÍCULA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA.

ex:

mais atrito menos atrito

TIPOS DE CENTRIFUGAÇÃO

-

Centrifugação

diferencial

-

Centrifugação em

gradientes de densidade

-

Centrifugação

diferencial

:

-centrifugações sequenciais, a velocidades cada vez mais elevadas

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Fraccionamento celular por centrifugação

diferencial

-

Centrifugação em

gradientes de densidade

inicial final

força centrífuga

partículas mais densas partículas de densidade intermédia

partículas menos densas aumento

da densidade do meio

- a densidade da solução aumenta ao longo do tubo - as partículas distribuem-se de acordo com as densidades - melhor separação, mas: