ANÁLISE DE GENES FORMADORES DE BIOFILME E
FATOR DE VIRULÊNCIA EM ENTEROCOCCUS DURANS
LAB18S ISOLADO DE QUEIJO TIPO “MINAS FRESCAL”
C.C Cunha
1, J.N.Uecker², I. B. Jaskulski
2, W.P. Silva
1,3, S. Pieniz
1,41- Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel- Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas-RS-Brasil, fone: (053)84189788- email: cha.cunha@hotmail.com
2- Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel- Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas-RS-Brasil, fone: (053)8123-7035- email: julia_uecker@hotmail.com
2- Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel- Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas-RS-Brasil, fone: (053)3921-1304- email: itianebarcellosj@hotmail.com
3- Departamento de Ciências e Tecnologia Agro-industrial, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel. Universidade
Federal de Pelotas, Pelotas-RS-Brasil, fone: (053)3275-9031- email: wladimir.padilha2011@gmail.com
4- Faculdade de Nutrição- Universidade Federal de Pelotas, Pelotas-RS-Brasil, fone: (053)3921-1304- email:
nutrisimone@yahoo.com.br
RESUMO – A formação de biofilme tem sido amplamente investigada devido a importância deste e a correlação com fatores de virulência. Este estudo teve por objetivo analisar a presença de fatores de virulência e genes formadores de biofilme em Enterococcus durans LAB18s isolado de queijo tipo “minas frescal”. Foram realizadas análise genotípica para identificação de genes de adesão intercellular e detecção da produção da enzima gelatinase. Por meio dos resultados obtidos não foi observada a presença dos genes formadores do operon icaADBC , verificando assim que não há uma relação entre a produção de PIA-dependente e o operon icaADBC. Na análise de virulência, o E.
durans LAB18s apresentou atividade de gelatinase negativa. Desta forma, conclui-se que este
micro-organismo apresenta potencial para a aplicação em alimentos.
ABSTRACT – Biofilm formation has been investigated because of the importance of this and the correlation with virulence factors. This study aimed to analyze the presence of virulence factors and genes biofilm formers in Enterococcus durans LAB18s isolated cheese type "frescal mines." Genotypic analysis was performed to identify intercellular adhesion genes and detection of the enzyme gelatinase production. Through the results did not show the presence of trainers genes operon
icaADBC, thus verifying that there is a relationship between the production of PIA-dependent and the
operon icaADBC. In Virulence analysis, E. durans LAB18s presented gelatinase activity negative. Thus, it is concluded that this organism has the potential for application in foods.
PALAVRAS-CHAVE: Enterococcus; biofilme; adesina polissacarídica intercelular; virulência; gelatinase.
1. INTRODUÇÃO
A formação de biofilme tem sido amplamente investigada devido a importância deste e a correlação com fatores de virulência. Biofilme é um agregado de bactérias aderidas sobre uma superfície, disposta em multicamadas finas e envolta por uma matriz polimérica amorfa e hidratada, produzida pelos próprios micro-organismos (Fey; Olson, 2010; Rohde et al., 2010), onde a formação ocorre por meio de quatro etapas sequênciais: aderência, acumulação, maturação e desprendimento, tendo como principal substância envolvida na fase de acumulação um polissacarídeo de superfície, poli-β(1,6)-N-acetil-D-glicosamina (PNAG), denominado Adesina Polissacarídica Intercelular (PIA) (Mack et al., 1996; Rohde et al., 2010).
De acordo com Heilmann et al. (1996), a PIA é a molécula acumulativa mais prevalente e mais estudada em isolados clínicos de S. epidermidis. Este polissacarídeo é produzido através do locus
icaRADBC, um operon de quatro genes de biossíntese (icaADBC) e um gene de regulação (icaR)
(Mack et al., 1996; Conlon et al., 2002). O operon icaADBC codifica as proteínas IcaA, IcaD, IcaB e
IcaC, onde, IcaA e icaD são proteínas transmembrana que apresentam atividade de
Nacetilglicosaminil-transferase, tendo UDP-N-acetilglicosamina como substrato. Estas duas proteínas atuam em conjunto para sintetizar oligômeros de β-1,6-Nacetilglicosamina. IcaD é requerida para a completa atividade de IcaA in vitro, atuando como uma chaperona que dirige a inserção de IcaA na membrana, podendo atuar também na ligação entre IcaA e IcaC (Gerke et al., 1998). Quando somente o gene icaA é expresso, ocorre indução de uma baixa atividade desta enzima. Entretanto, quando o gene icaA é co-expresso com o gene icaD, observa-se um aumento de cerca de 20 vezes na atividade da transferase, que atua determinando a formação de oligômeros com 10 a 20 resíduos de β-1,6-N-acetilglicosamina.
O produto do gene icaC é também uma proteína de membrana, com 10 domínios transmembrana, cuja atuação é igualmente essencial para uma PIA inteiramente funcional, enquanto que a co-expressão de icaA e icaD permite a produção de oligômeros de N-acetilglicosamina com comprimento máximo de somente 20 resíduos. A co-expressão destes com icaC determina a síntese de cadeias mais longas, de cerca de 130 resíduos, e que reagem com anti-soro PIA-específico, ao contrário do que ocorre com oligômeros curtos (Gerke et al.,1998). Diferente do observado para icaA,
icaD e icaC, o produto de icaB é encontrado principalmente no sobrenadante das culturas, estando
também associado à superfície da célula, sendo responsável pela atividade e deacetilação da PIA, ou seja, fator que resulta em um polímero positivamente carregado importante para sua interação com a superfície negativamente carregada da célula bacteriana (Vuong et al., 2004b).
O PIA manifesta-se através das enzimas codificadas pelo ica, sendo este mecanismo de formação de biofilme um dos mais conhecidos e também ligado ao gênero Staphylococcus. O locus
ica participa na formação de biofilmes por S. aureus, sendo que a sua presença em bactérias CNS
(Staphylococcus coagulase negativa) está aparentemente relacionada com o fator de virulência destas (Cramton et al., 1999; O’Gara, 2007).
Fatores de virulência são substâncias produzidas por micro-organismos que podem causar dano ao hospedeiro. Segundo Schaechter et al. (1999), essa designação passou a significar qualquer componente do micro-organismo que seja capaz de provocar doença ou que potencialize a sua capacidade para este fato. Para que os Enterococcus atuem como patógenos oportunistas é necessário que ocorra a adesão aos tecidos hospedeiros (Jett et al., 1994). Diversos fatores de virulência foram relatados para o gênero Enterococcus, tais como, gelE, que codifica uma metaloendopeptidase extracelular capaz de hidrolisar gelatina, caseína e colágeno (Koch et al., 2004); esp, responsável por uma proteína de superfície que contribui para colonização e persistência no hospedeiro (Shankar et al., 2001); ace, codifica uma adesina de colágeno que participa da ligação dos Enterococcus ao colágeno e dentina (Nallaparedy et al., 2000); cylA, responsável pela citolisina, enzima com atividades hemolítica
e de bacteriocina contra células eucarióticas e procarióticas (Semedo et al., 2003) e agg que codifica uma proteína a qual promove a formação de agregados celulares e pode aumentar a adesão celular (Jett et al., 1994).
Desta forma, este estudo teve por objetivo analisar a presença de genes formadores de biofilmes e fator de virulência em Enterococcus durans LAB18s isolado de queijo tipo “minas frescal”.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Análise genotípica para identificação de genes de adesão intercelular
Por meio da amplificação do DNA por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foram avaliados quatro genes relacionados à formação de biofilme. A técnica visou detectar a presença do gene de adesão intercelular A (icaA), gene de adesão intercelular B (icaB), gene de adesão intercelular C (icaC) e gene de adesão intercelular D (icaD), descritos na Tabela 1, utilizando como controle positivo Staphylococcus epidermidis ATCC 25923. Utilizou-se 1 µL de DNA extraído da amostra, o qual foi adicionado a um mix contendo 17 µl de GotaQ, 1 µl de oligonucleotídeo iniciador específico de cada gene, 1 µl de água ultra pura (milli-q), totalizando 20 µl de volume final. Os genes foram amplificados em um termociclador Amplitherm®, utilizando o seguinte protocolo térmico: desnaturação inicial, 95 ºC durante 5 min; 35 ciclos de desnaturação à 95 ºC durante 0,5 min, anelamento à 50 ºC durante 1 min e extensão à 72 ºC durante 1 min; e extensão final, para 72 ºC 5 min. Os produtos amplificados pela PCR foram analisados em gel de agarose a 1% após eletroforese. A visualização dos fragmentos resultantes foi obtida em um fotodocumentador com transluminação ultravioleta após coloração com Syber Safe (Invitrogen®). O protocolo de amplificação foi realizado com temperatura de anelamento distinta de 50 ºC.
Tabela 1 - Oligonucleotídeos de Sense (f) e Anti-sense (r) e condições da reação de PCR utilizadas para identificação dos genes de adesão intercelular icaA, icaB, icaC e icaD.
Identificação Oligonucleotídeo Sequência 5’ – 3’ Tamanho fragmento Controle positivo Referências
icaAf TCTCTTGCAGGAGCAATCAA 188pb S. epidermidis ATCC
25923
Arciola et al. (2001)
icaAr TCAGGCACTAACATCCAGCA
icaCf ATAAACTTGAATTAGTGTATT 989pb S. epidermidis ATCC
25923
Ziebuhr et al. (1999)
icaCr ATATATAAAACTCTCTCTTAACA
IcaBf ATGGCTTAAAGCACACGACGC 526pb S. epidermidis ATCC
25923
Ziebuhr et al. (1999)
icaBr TATCGGCATCTGGTGTGACAG
icaDf CGTGTTTTCAACATTTAATGCAA 198pb S. epidermidis ATCC
25923
Arciola et al. (2001)
icaDr ATGGTCAAGCCCAGACAGAG
2.2. Detecção da produção da enzima gelatinase
A produção de gelatinase foi realizada de acordo com Marra et al. (2007). A linhagem em estudo (E. durans LAB18s) foi inoculada em tubos contendo 4ml de BHI (Brain Heart Infusion) com
12 % de gelatina por 24 h a 37 °C. Após incubação, os tubos foram alocados em banho de gelo por 30 minutos, sem agitação. O Resultado foi interpretado como negativo: meio sólido; positivo: meio líquido.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na análise genotípica realizada com os genes formadores do operon icaADBC (icaA, icaB,
icaC e icaD), os quais são relacionados a formação de biofilmes, não foi detectada a presença dos
mesmos, verificando assim que não há uma relação entre a produção de PIA-dependente e o operon
icaADBC no E. durans LAB18s. Este resultado apresenta relevância, pois indica que este
micro-organismo denota segurança com relação a um possível uso alimentar.
Em estudo anterior realizado por Pieniz et al. (2015) verificou que o E. durans LAB18s isolado de queijo “minas frescal” exibiu forte capacidade de formação de biofilme. Entretanto, este fator não foi associado com a presença de genes de virulência e esta capacidade pode ser relacionada com as propriedades de adesão de probióticos (Pieniz et al., 2014). Ainda Pieniz et al. (2015) investigou a presença dos genes de virulência ace (proteínas de adesão ao colágeno), agg e asa (substância de agregação) por PCR, e estes não foram detectados no E. durans LAB18s. Da mesma forma, os autores constataram por meio da amplificação por PCR que o E. durans LAB18s não exibiu presença dos genes de virulência bopA (putative glycosyltransferase) , bopB (beta-phosphoglucomutase), bopC (aldose 1-epimerase), e bopD (sugar-bindingtranscriptional regulator) envolvidos no metabolismo de maltose e formação de biofime, apresentando importante papel relacionado com patogêneses clínicas (Donlan e Costerton, 2002).
De acordo com os resultados obtidos na análise de virulência observou-se que o E. durans
LAB18s apresentou atividade de gelatinase negativa. Este resultado é de suma importância, visto que a
gelatinase é uma endopeptidase extracelular de zinco com capacidade para hidrolisar várias substâncias, como a gelatina, o colágeno, a caseína, a hemoglobina e outros pequenos peptídeos biologicamente ativos (Jett et al., 1994). Segundo Wang et al. (2011), a gelatinase é a expressão do gene gelE, fenotipicamente detectada in vitro por liquefação de um determinado meio de cultura com gelatina. Barbosa et al. (2010) e Lindenstrauß et al. (2011), verificaram que a gelatinase é um fator de virulência frequentemente observado e relataram que este fator esta somente associado à espécie E.
faecalis. De acordo com Diarra et al. (2010) a degradação pela gelatinase das proteínas da matriz
extracelular do hospedeiro é importante fator na patogenicidade de E. faecalis. Pressupõe-se que a função da gelatinase na patogênese enterocócica seja o fornecimento de nutrientes para as bactérias a partir da degradação do tecido hospedeiro (Fischer et al., 2009). Ainda, Marra et al. (2007) afirmam que a capacidade de formação de biofilme é independe da produção de gelatinase, visto que foram observados isolados fortemente formadores de biofilme, sem a expressão de gelatinase.
Ressalta-se ainda, que em estudo anterior foi realizada análise quanto à capacidade probiótica do E. durans LAB18s, sendo que o mesmo apresentou perfil probiótico (Pieniz et al., 2014). A investigação de fatores de virulência e formação de biofilmes em micro-organismos considerados probióticos torna-se relevante, pelo fato de que estes possam vir a ser utilizados em alimentos.
No presente estudo verificou-se que o E. durans LAB18s não apresentou genes formadores de biofilmes icaA, icaB, icaC e icaD. Por meio da análise de gelatinase observou-se que o E. durans
LAB18s foi negativo para esta atividade. Desta forma, conclui-se que este micro-organismo apresenta
potencial para a aplicação em alimentos.
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