Biologia molecular aplicada ao diagnóstico de vírus
Tânia Rosária Pereira Freitas
Pesquisadora em Ciências Exatas e da Natureza
Virologia Animal - Lanagro/MG
Biologia Molecular
DNA
RNA
Proteínas
Célula Animal
Núcleo Celular: cromossomas
Desenovelando o cromossoma
Gene
DNA
Ácido Desoxirribonucléico
DNA: estrutura e composição
Molécula de DNA:
duas cadeias ou fitas de nucleotídeos.
Nucleotídeos:
açúcar + fosfato + base nitrogenada
Disposição:
As bases nitrogenadas estão no centro da molécula e os
esqueletos açúcar-fosfato estão externos.
Nucleotídeos
Cada nucleotídeo contém
1 a 3 grupos fosfato (PO4-) ligado ao
carbono 5’ do açúcar
2’-desoxi – D – ribose
1 base nitrogenada ligada ao carbono 1’
do açúcar
Bases Nitrogenadas
Purinas Pirimidinas
Bases complementares
Complementaridade entre as bases:
Adenina estabelece duas ligações de hidrogênio com Timina
Citosina estabelece três ligações de hidrogênio com Guanina
Relação molar A/T = 1,0 e C/G = 1,0
Nucleotídeos
Direção de crescimento: 5’--- 3’.
Ligações fosfodiester entre o grupo fosfato 5’
de um nucleotídeo e o grupo hidroxila 3’ de outro.
Uma das extremidades tem fosfato livre 5’ e o nucleotídeo da outra
apresenta um hidroxila 3’
livre.
RNA
Ácido ribonucléico
RNA: Composição
Similar ao DNA:
Bases nitrogenadas
Base nitrogenada:
uracila (substitui a timina)
Açúcar: ribose
Grupamento fosfato
Fita única
Altamente reativo
Tipos e funções
RNA mensageiro ou mRNA : carrega a informação (código genético) para síntese protéica (Tradução)
RNA transportador, de transferência ou tRNA: transporta o aminoácido até o maquinaria de tradução.
RNA ribossômico ou rRNA: compõe a estrutura física
do ribossoma, local onde se processará a tradução.
Mecanismos Moleculares
Replicação do DNA Transcrição
Tradução
Mecanismos moleculares
Replicação do DNA
Nova molécula de DNA
Transcrição do DNA
Produz moléculas de RNA
Tradução do RNA
Produção de Proteínas
Replicação do DNA
Replicação do DNA
Replicação: Uma molécula de DNA dupla
fita (parental) pode se replicar originado duas moléculas de DNA (filhas).
Dinâmica: a replicação envolve a ação simultânea e integrada de:
Enzimas
DNA polimerase, Primases, Helicases, etc
Vários fatores protéicos
Nucleotídeos e RNA
Replicação do DNA
Replicação: Semi conservativa
Transcrição
Síntese de RNA
Transcrição do DNA: Síntese de RNA
Procariotos
RNA polimerase separa os pares de base do DNA, desenrolando o DNA, dando início a síntese de RNA, formando uma bolha de transcrição no DNA.
Eucariotos a transcrição envolve 3 classes de RNAs polimerases nos seus núcleos:
Polimerase I: sintetiza o precursor de rRNA (subunidade maior).
Polimerase II: sintetiza precursores dos mRNAs.
Polimerase III: sintetiza os RNAs pequenos, os tRNAs e o rRNA ribossômico (subunidade menor)
Transcrição:
Uma cópia do gene (DNA) é transcrita em RNA
Transcrição do mRNA
Processamento do mRNA:
transcrito primário: splicing hnRNA
mRNA
RNAm contém uma seqüência linear de bases
que são complementares ao DNA que serviu
de molde.
Transcrição do tRNA
RNA transportador ou de
transferência
Transcrição rRNA
Rna ribossômico ou rRNA
Ribossomas
Código Genético
• Códons: Trios ou tripletos de bases do ácido nucléico (DNA e RNA).
• No RNAm os códons podem ser:
– iniciadores (códon de iniciação),
–podem especificar um dos 20 diferentes
aminoácidos que são encontrados normalmente nas proteínas
– finalizadores (códon de terminação)
• O códon é dito degenerado pois mais de um
tripleto pode especificar o mesmo aminoácido
Código genético: códons
Tradução
Síntese de proteínas
Tradução
RNA mensageiro
RNA transportador
Ribossomas
Vários fatores protéicos
Enzimas
Tradução
Transcrição/Tradução
Dogma Central
Genomas
Virologia Molecular
Diagnóstico Molecular
Vírus
• Parasitas intracelulares obrigatórios
• Genoma: DNA ou RNA
• Simples ou complexos
• Mecanismos de replicação
• Utilizam a maquinaria celular
• Interferem no metabolismo celular
Vírus: classificação
Vírus RNA
Vírus DNA
Vírus DNA: Herpes
Aplicação de métodos moleculares
Custo x Benefício
Conhecimento em biologia molecular
Equipamentos, insumos biológicos e reagentes
Tipo de infecção
Aguda ou crônica
Tipo de Amostra
Corte de tecidos
Excreções e secreções
Sistemas de Replicação viral
Animais
Cultivos celulares
Virologia Molecular
Métodos:
Análise genômica
Diagnóstico
Conhecimentos precursores
Eletroforese em gel
Gel de Poliacrilamida – PAGE Proteínas
Gel de Agarose – ácidos nucléicos
Enzimas de restrição
Mapas de restrição – Padrão de cortes
Eletroforese em gel
Técnica de separação de moléculas
Migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial.
As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho:
Poros do gel
Menor massa migração mais que as de maior
massa.
Eletroforese
Eletroforese de fragmentos de DNA
em gel de agarose
Enzimas de Restrição (1953): Bacteriófago
fenômeno de restrição/modificação
Nucleases bacterianas altamente específicas que clivavam o DNA estranho.
Degradação do DNA estranho ( restrição ).
Proteção do próprio DNA pela metilação
( modificação ).
Enzimas de restrição
Enzimas de restrição
Enzimas e organismos de origem
Ava I- Anabaena variabilis: C* C/T C G A/G G
Bam HI - Bacillus amyloliquefaciens: G* G A T C C
Bgl II- Bacillus globigii: A* G A T C T
Eco RI - Escherichia coli RY 13: G* A A T T C
Eco RII- Escherichia coli R245: * C C A/T G G
Hae III - Haemophilus aegyptius: G G * C C
* Local do corte
Enzimas de restrição: Clivagens
Aplicação
Enzimas de restrição
Padrões de corte
Mapas de restrição
Tecnologia do DNA Recombinante
Clonagem
Vetores
Inserção e deleção de genes
Mapeamento de restrição
Mapa de restrição de Herpesvirus suíno1
(doença de Aujeszky)
Mapa de restrição: Plasmídeo
DNA recombinante: clonagem
Diagnóstico molecular
Técnicas de Hibridização de ácidos
nucléicos
Hibridizações
Definição: pareamento dos nucleotídeos em fitas complementares de DNA ou RNA
Hibridização “in situ”
Sondas ou Probes
Blotting
North blotting
South blotting
Hibridização: conceito
Hibridização “in situ” - ISH
Pareamento:
DNA-DNA; DNA-RNA; RNA-RNA
Detecção de DNA ou mRNA:
Localizar com precisão um gene específico ou seus transcritos em um tipo de
população celular ou áreas.
Detectar a presença do DNA ou RNA infecciosos em processos patológicos.
Oncogênese
Hibridização “in situ” - ISH
Amostras:
Fixação - Paraformaldeído estéril 4%
Desidratação - Sacarose 30%
Polímero inerte (criomolde) e
Congelamento e cortes em criostato (-10m)
Sondas: DNA, cDNA e cRNA e oligonucleotídeos
Marcação
Radioisótopos (3H, 35S, 135I, 32P)
Biotina, fosfatase alcalina
Fluorescente
Hibridização “in situ”
FISH – sonda fluorescente
Sonda marcada com radioisótopos
North blotting e South blotting
Northern Blot: RNA
Técnica para estudar a expressão gênica
Verificar se um determinado gene de um genoma é ou não transcrito em RNA
Quantificar esse transcrito
Utilizando sonda de DNA
Envolve a técnica de eletroforese do ácido nucléico
A fixação num suporte sólido
Northern Blotting
Southern blot: DNA
Western Blotting
Especificação de uma proteína viral através de anticorpos específicos
Bandeamento da proteína pela eletroforese em gel de poliacrilamida - PAGE
Transferência para membrana de nitrocelulose
Incubação com anticorpos policlonais ou monoclonais conjugados com enzimas
(Peroxidase) ou substâncias luminescentes
Revelação: Cromógeno (OPD)
WB
Reação em Cadeia de Polimerase
PCR – RT/PCR
Extração do genoma
Purificação
Produção de cDNA
Amplificação
Seqüênciamento
Análise (edição)
Dendogramas
Tipos e topotipos virais
PCR: “Polymerase Chain Reaction”
Definições:
PCR: amplificação de uma seqüência ou fragmento da molécula de DNA.
O fragmento a ser amplificado é delimitado por seqüências iniciadoras (primers)
RT-PCR: Vírus com genoma RNA é necessário
produzir o DNA complementar – cDNA
PCR: dinâmica
Produto do PCR
VP1
Vírus da Febre Aftosa
Ciclo viral
Serotype: Foot-and-mouth disease virus O (FMDV-O)
5' UTR L VP4 VP2 VP3 VP1 2A 2B 2C 3A 3B1 3B2 3B3 3C 3D 3' UTR
Serotype: Foot-and-mouth disease virus A (FMDV-A)
5' UTR L VP4 VP2 VP3 VP1 2A 2B 2C 3A 3B1 3B2 3B3 3C 3D 3' UTR
Serotype: Foot-and-mouth disease virus C (FMDV-C)
5' UTR L VP4 VP2 VP3 VP1 2A 2B 2C 3A 3B1 3B2 3B3 3C 3D 3' UTR
Vírus da Febre Aftosa:
Foot-and-mouth disease virus (FMDV)
Metodologia
Amostras com vírus inativado (tecido, raspado esofágico – faríngeo, cultivo celular, etc.)
Extração do RNA Viral (Chomczynski & Sacchi, 1987)
Método homogeneização da amostra em tiocianato de guanidina + ß-mercaptoetanol (100mM), fenol, precipitação em álcool.
RNA em Trizol ® (fenol + tiocinato de guanidina)
Extração do RNA
Transcrição do RNA viral - RT
RNA viral
Enzima: Transcriptase reversa
AAAA
5’ 3’
cDNA
Amplificação do cDNA obtido
pela Reação da Cadeia de Polimerase
cDNA
Taq DNA Polimerase
Iniciadores da seqüência 1D (VP1)
N= No.2
nIIII
IIII
Iniciadores aplicados na PCR
Primer Seqüência Tamanho Local.
O dir ACCAACCTCCTTGATGTGGCT 1301 2766-2789
A dir TACCAAATTACACACACGGAA 863-866 2746-2765
C dir TACAGGGATGGGTATGTGTGTACC 813-816 1445- 1465
Iniciador Reverso (para os três sorotipos)
LMR GACATGTCCTCCTGCATCTG 3998-
4017
1:C3Rezende/Bra/55 2: A 24 Cruzeiro/Bra/55 3: O1Campos/Bra/58
PM 1 2 3 CN PM
1301 pb 863 pb 813 pb
Produtos do PCR
Kit Comercial
(Concert Rapid Gel Extraction System, GIBCO-BRL)
Eletroforese ( Peso e massa)
Eluição do produto amplificado
Pureza e Rendimento
Purificação dos fragmentos de DNA por afinidade
Purificação dos produtos da PCR
860 pb
∼ 80ng
2000pb = 200ng 1200pb = 120ng 800pb = 80ng
400pb= 40ng 200pb= 20ng 100pb=10ng
Quantificação dos produtos purificados
Preparar amostras para o seqüênciamento automático
Similar ao PCR: Polimerizar o produto do PCR com nucleotídeos fluorescentes
Kit Comercial (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, Applied Biosystems)
Pelo menos 60ng/amostra
Designação Seqüência (5’-3’) Localização
Iniciador Universal:
(sentido reverso)
GAAGGGCCCAGGGTTGGACTC 3926-3946
