PHABLO SÁVIO ABREU TEIXEIRA
CARACTERIZAÇÃO DO TREINAMENTO FÍSICO
EXPERIMENTAL DE ENDURANCE EM ESTEIRA ADAPTADA
ATRAVÉS DE MARCADORES METABÓLICOS ENERGÉTICOS
FORTALEZA – CEARÁ
2010
CARACTERIZAÇÃO DO TREINAMENTO FÍSICO EXPERIMENTAL
DE ENDURANCE EM ESTEIRA ADAPTADA ATRAVÉS DE
MARCADORES METABÓLICOS ENERGÉTICOS
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Vânia Marilande Ceccatto
FORTALEZA – CEARÁ 2010
CARACTERIZAÇÃO DO TREINAMENTO FÍSICO EXPERIMENTAL
DE ENDURANCE EM ESTEIRA ADAPTADA ATRAVÉS DE
MARCADORES METABÓLICOS ENERGÉTICOS
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Aprovada em:____/____/____
BANCA EXAMINADORA
____________________________
Profª. Drª Vânia Marilande Ceccatto (Orientadora) Universidade Estadual do Ceará - UECE
____________________________ Prof. Dr José Henrique Leal Cardoso Universidade Estadual do Ceará - UECE
____________________________ Prof. Dr Carlos Alberto da Silva Universidade Federal do Ceará - UFC
A minha querida mãe Gerli e as
minhas irmãs Ludimila e Thalyta
Em primeiro lugar a DEUS e por todos os mensageiros de luz que me auxiliaram na construção desta pesquisa.
Agradeço a minha mãe por sua inspiração, diante das dificuldades que nos esbarraram durante o percurso. Agradeço também ao meu pai pela contribuição de vida e enorme incentivo. Ao meu Sensei Rogério e Elizete, pelos pais que são pra mim. As minhas queridas irmãs Ludimila e Thalyta e a minha namorada Priscila, por todo carinho e compreensão. A minha grande amiga Cláudia.
A Dra Vânia Marilande Ceccatto, minha orientadora, por acreditar no meu trabalho e contribuir para execução de minha missão neste mestrado.
A todos que fazem o mestrado, em especial ao Dr. José Henrique Leal Cardoso e à Dra. Aline Alice Cavalcante Albuquerque, coordenadores do Mestrado. Meus sinceros agradecientos também aos funcionários, Ecila, secretária, Lindalva, auxiliar de secretária, ao Pedro, técnico de laboratório e ao Franck.
A todos os professores do mestrado que me auxiliaram a conquista da formação acadêmica, Dra Sandra, Roselí, Cristiane Calado, Cláudia e ao Dr. Krishinamurt.
O meu muito obrigado ao Dr. Bruno Cardi, ex-orientador, pela contribuição a obtenção deste título.
Aos meus colegas Tanes e Gustavo, que se esforçaram junto comigo na execução e sucesso deste trabalho. Ao meu amigo Igor por nossas longas horas de discussão e aprimoramento deste Projeto. Aos colegas de inciação científica Flavinho, Morgana, Howard e aos de mestrado Luís Jr, Walber, Kerli, Tiago, Patrick, Joca, Soujanya, Eder, Fleury, Bete, Rafael, Rômulo.
Aos professores da USP-SP na qual tive a excelente oportunidade de conhecê-los e principalmente colaborarem para os resultados colhidos nesta Dissertação: alunos Júlio, Bianco, Max e Aline pertencentes à Escola de Educação Física e Esporte (EFFE-USP), ao Carlos Hermano, Kaio, Renato, Haroldo, Ronaldo alunos de doutorado do Instituto de
Brum (EEFE-USP). Amigos estes que prestaram colaboração fundamental e de extrema importância neste projeto.
Aos meus colegas André Aciolly e Alex Ferraz, pioneiros na área da pesquisa do esforço em nosso laboratório, pela confiança na obtenção dos resultados satisfatórios encontrados neste estudo.
E por fim ao Instituto Superior de Ciências Biomédicas (ISCB), a Universidade Estadual do Ceará (UECE), a toda colaboração finançeira da FUNCAP durante o período de mestrado e ao auxilio financeiro as passagens aéreas cedidas pela CAPES/ CNPQ.
Embora nínguem possa voltar atrás e
fazer um novo começo, podemos
começar agora e fazer
um novo
fim.
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO ... 1Erro! Indicador não definido.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 22
2.1. TREINAMENTO FÍSICO ... 22
2.2. SINALIZADORES ENERGÉTICOS METABÓLICOS ... 24
2.3. LIMIARES METABÓLICOS ... 25
2.3.1. Vias Metabólicas envolvidas na produção de ATP ... 27
2.3.2. Prescrição do Treinamento Físico pela concentração de Lactato sanguíneo 29 2.3.3. Testes Exaustivos com coletas sanguíneas para dosagem de Lactato e análise de Glicemia ... 30
2.3.4. Determinação do Máximo Estado Estável do Lactato através de Testes contínuos com cargas independentes e análise de Glicemia ... 30
2.4. ATIVIDADE MÁXIMA ENZIMÁTICA: CITRATO SINTASE ... 32
2.5. COTEÚDO DE GLICOGÊNIO ... 33
2.6. CONTRATILIDADE E ATIVIDADE ATPase ... 35
2.7. MARCADORES MOLECULARES PROTÉICOS AO TREINAMENTO FÍSICO ... 37
2.7.1. Quantificação protéica de PGC-1α no Músculo Esquelético ... 37
2.7.2. Quantificação protéica de PDK 4 no Músculo Esquelético e Fígado ... 40
2.7.3. Quantificação protéica de Hexoquinase II no Músculo Esquelético... 42
2.7.4. Quantificação protéica de ACCp no Fígado ... 43
2.7.5. Quantificação protéica de Citocromo C no Fígado ... 44
2.8. CONCENTRAÇÃO DE NITRITO: ÓXIDO NÍTRICO ... 45
3 OBJETIVOS ... 47
3.1 GERAL ... 47
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 49 4.1. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL: ... 49 4.1.1. Materiais Biológicos ... 49 4.1.2. Grupos Experimentais ... 49 4.1.3. Treinamento Físico ... 51 4.1.4. Laboratórios ... 52
4.2. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE FÍSICA: ... 54
4.2.1.Teste Exaustivo ... 54
4.2.2. Análise do Limiar Anaeróbio e concentração de Glicemia... 55
4.2.3. Determinação da concentração de Lactato e Glicemia no Repouso ... 56
4.2.4. Teste Progressivo com incremento de Carga até a Exaustão ... 56
4.2.5. Determinação do Máximo Estado Estável do Lactato através de Testes contínuos com cargas independentes e análise de Glicemia ... 57
4.3. SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS: ... 59
4.3.1.Laboratórios ... 59
4.4. AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL: ... 60
4.4.1. Massa Corporal ... 60
4.5. AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA DO MÚSCULO ESQUELÉTICO: ... 60
4.5.1. Dosagem Máxima da enzima Citrato Sintase ... 60
4.6. COTEÚDO DE GLICOGÊNIO ... 61
4.7. CONTRATILIDADE E ATIVIDADE ATPase ... 62
4.8. QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA: WESTERN BLOTTING ... 63
4.9. CONCENTRAÇÃO DE NITRITO: ÓXIDO NÍTRICO ... 64
4.10. TRATAMENTO ESTATÍSTICO ... 65
5 RESULTADOS ... 66
5.1. AVALIAÇÃO DA MASSA CORPORAL: ... 70
5.2.1. Testes Exaustivos com coletas sanguíneas para dosagem de Lactato e análise de Glicemia ... 72
5.2.2. Determinação do Máximo Estado Estável do Lactato através de Testes contínuos com cargas independentes e análise de Glicemia ... 77
5.3. ATIVIDADE MÁXIMA ENZIMÁTICA: CITRATO SINTASE ... 86
5.4. COTEÚDO DE GLICOGÊNIO ... 91
5.5. CONTRATILIDADE E ATIVIDADE ATPase ... 93
5.6. MARCADORES MOLECULARES PROTÉICOS AO TREINAMENTO FÍSICO ... 94
5.6.1. Quantificação protéica de PGC-1α no Músculo Esquelético ... 94
5.6.2. Quantificação protéica de PDK 4 no Músculo Esquelético e Fígado ... 96
5.6.3. Quantificação protéica de Hexoquinase II no Músculo Esquelético... 98
5.6.4. Quantificação protéica de ACCp no Fígado ... 100
5.6.5. Quantificação protéica de Citocromo C no Fígado ... 101
5.7. CONCENTRAÇÃO DE NITRITO: ÓXIDO NÍTRICO ... 102
5.8. RESUMO DOS RESULTADOS ... 105
6 DISCUSSÃO ... 108
7 CONCLUSÃO ... 144
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1: Resumo da metodologia executada para o desenvolvimento deste projeto pré e pós
Sacrifício ... 48
QUADRO 2: Protocolo de familiarização e adaptação a Esteira ... 52
QUADRO 3: Protocolo de treinamento dos animais ... 53
QUADRO 4: Esquema de execução para determinação do limiar de lactato ... 57
QUADRO 5: Esquema de coletas durante execução de teste para determinação do máximo estado estável do lactato ... 58
QUADRO 6: Massa dos órgãos ... 66
QUADRO 7: Correlação do lactato com a glicemia nos testes de determinação do máximo estado estável do lactato sanguíneo ... 86
LISTA DE FOTOS
FOTO 1: Imagem detalhada das raias adaptadas na esteira ergométrica utilizada para o treinamento
dos animais ... 51
FOTO 2: Ilustração dos procedimentos de manuseio durante período de repouso (caixa = 6), local de
treinamento (raias = 6) e luz vermelha utilizada com comprimento de onda não visível ... 52
FOTO 3: Ilustração do processo de calibração do capilar com heparina para leitura da Glicemia (10
µL), marcação, corte da cauda e mensuração da Glicemia sanguinea ... 55
FOTO 4: Ilustração do processo de calibração do capilar com heparina para leitura do Lactato (25 µL),
marcação, corte da cauda e mensuração da Lactato sanguinea ... 55
FOTO 5: Lâmina colhida em análise histoquímica de músculo gastrocnêmio de rato, apresentando
diferentes fibras do tipo I (lentas oxidativas), IIa (intermediárias glicolíticas-oxidativas) e IIb (rápidas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Abreviatura Nome
ACCp Acetil CoA carboxilase fosforilada Acetil-Coa Acetil coenzima A
ADP Adenosina difosfato AG Ácidos Graxos
AGIM Ácidos Graxos Intramusculares AGL Ácidos Graxos Lívres
AMP Adenosina monofosfato
AMPK Adenosina Monofosfato Quinase ATP Adenosina trifosfato
ATPase Adenosina trifosfatase
CEUA Comitê de Ética para o Uso de Animais CFMV Conselho Federal de Medicina Veterinária Cit C Citocromo C
CK Creatina kinase
cm Centímetro
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Coa Coenzima A
CS Citrato Sintase
dl Microlitro
DNA Adenina dinucleotídeo Ex A. Int Exercício de alta intensidade Ex B. Int Exercício de baixa intensidade
g Gramas
GB Gastrocnêmio Porção Branca GV Gastrocnêmio Porção Vermelha HE Hematoxilina e eosina
HK Hexoquinase
LA Limiar Anaeróbio LAC Lactato sanguíneo
LAN Limiar anaeróbio
LL Limiar de Lactato
M Molar
m/min Metros por minuto
MCT Transportadores Monocarboxilatos MFEL Máxima fase estável de lactato
mg Miligrama
mg Miligrama
mg/mL Miligramas por mililitro MHC Cadeia pesada de miosina
mL Mililitro
NADH Nicotinamida adenina dinucleotideo
ºC Celsius
PBS Tampão fosfato
PCr Creatina fosfato
PDC Complexo Piruvato Desidrogenase PDK Piruvato desidrogenase quinase
PGC-1α Proliferador de peroxissoma gama ativado coactivator receptor alfa pH Potencial hidrogenionico
Pi Fosfato inorganico
RNAm Acido ribonucleico mensageiro
SED Sedentário
TCA Ácido tricarboxílico TE Teste Exaustivo TG Triacilglicerol
UECE Universidade Estadual do Ceará UFC Universidade Federal do Ceará
RESUMO
Ratos vêm sendo utilizados como modelo experimental em estudos que avaliam o efeito do treinamento físico na melhoria da performance e no comportamento de doenças crônicas degenerativas. Dessa forma, a padronização de protocolos que avaliam a capacidade física dos animais torna-se extremamente importante para obter um controle fidedigno desta variável. A realização de testes com velocidade progressiva até a exaustão tem como objetivo identificar o limiar anaeróbio ou de lactato, importante indicador da capacidade de realização de exercícios de endurance. O máximo estado estável do lactato sanguíneo torna-se também um excelente indicador de performance, representando a equalização da máxima capacidade de entrada e remoção do lactato sanguíneo. Objetivou-se caracterizar o método para medida de lactato sanguíneo em ratos durante teste com velocidade progressiva e teste com velocidade contínua para identificar o máximo estado estável do lactato sanguíneo para ratos em esteira adaptada e analisar marcadores metabólicos energéticos ao treinamento físico. Foram utilizados inicialmente 20 animais, dos quais 12 ratos foram selecionados pelo teste de esforço (TE), exercitados (n=6) e sedentários (n=6), com idade de 60 dias. Os animais foram submetidos nas duas primeiras semanas que antecederam ao TE, ao processo de adaptação e adaptação a esteira. A prescrição do treinamento a 60% foi baseado no teste exaustivo, velocidade inicial de 0,3 km/h e incremento de velocidade (0,2 km/h) a cada 3 min, durante 6 semanas. Ao final do treinamento foram novamente realizados os testes exaustivos, para análises de velocidade total, distância percorrida e tempo final de exaustão. Nos testes com velocidades progressivas, no repouso e a cada 3 minutos, e nos testes com velocidades contínuas, no repouso e a cada 7 minutos, amostras de sangue (25µL) para dosagem de lactato (Yellow Springs 1500) e (10 µL) para análise do comportamento da glicemia (glicosímetro Accu-chek Active) foram coletadas via artéria caudal durante realização do esforços. Verificou-se o limiar anaeróbio e o máximo estado estável do lactato nos animais do estudo e a melhora da performance quanto a metabolização do lactato para os animais exercitados. Observou-se também, uma boa correlação da glicemia com o lactato com o ganho de aptidão física no teste de velocidade progressiva. Foi verificado aumento da atividade enzimática da citrato sintase no músculo esquelético, coração e fígado. Encontrou-se maior conteúdo de glicogênio na musculatura esquelética dos animais treinados. Aumento da atividade ATPase da fibra muscular tipo I, indicadora de elevação de fibras oxidativas nos animais exercitados. Foi observado elevação da expressão protéica de PGC-1α, indicadora de biogênese, de PDK4,
HKII, ACCp e Citocromo C no músculo esquelético e fígado dos animais submetidos ao protocolo de treinamento. Foi analisado também aumento da concentração de nitrito, indicadora da presença de óxido nítrico no coração e músculo esquelético dos animais exercitados. Concluiu-se que a prescrição do treinamento a 60%, obtido no teste exaustivo inicial sem coleta sanguínea, corresponde ao máximo estado estável do lactato, sendo por tanto um método confiável de prescrição de exercício aeróbio ou de endurance. A padronização dos protocolos de avaliação foram eficientes em avaliar o limiar anaeróbio e a performance ao treinamento. A intensidade empregada no treinamento foi satisfatória em causar adaptações funcionais e estruturais, observadas pela elevação das atividades enzimáticas e pela expressão de proteínas pertencentes ao metabolismo energético.
ABSTRACT
Rats have been used, as an experimental model, in studies that evaluate the effects of exercise training in improving performance and in degenerative diseases behavior. Thus, standardization protocols that evaluates animal physical capacity is extremely important to get a reliable control of this variable. Increasing speed tests until exhaustion aims to identify the anaerobic threshold or lactate, an important indicator of ability to perform endurance exercises. The blood lactate maximum steady state also becomes an excellent performance indicator, representing the equalization of the maximum input capacity and blood lactate removal. This study aimed to characterize the method for measuring blood lactate in rats during increasing speed test and continuous speed test in order to identify the blood lactate maximal steady state for rats on adapted treadmill and analyze energy metabolic markers of physical training. Were initially used 20 animals, of which 12 rats were selected by the stress test (TST), exercised (n = 6) and sedentary (n = 6), aged 60 days. The animals underwent to the process of treadmill habituation and adaptation in the first two weeks till TE. The training prescription of 60% was based on exhaustive testing, initial speed of 0.3 km / h increase in speed (0.2 km / h) every 3 min for 6 weeks. At the end of training, exhaustive tests for analysis of total speed, distance traveled and total exhaustion time was, again, conducted. In progressive speeds tests, at rest and every three minutes, and in continuous velocities tests, at rest and every seven minutes, blood samples were collected (25μl) for lactate ratio analysis (Yellow Springs 1500) and (10 l) behavior of blood glucose analysis (glucometer Accu-chek Active) via the caudal artery during completion of efforts. It was detected the anaerobic threshold and maximum lactate steady state in the studied animals, the performance improvement as well the lactate metabolism of exercised animals. There was also expressive correlation with blood glucose and lactate in physical fitness improvement at increasing speed test. Higher levels of citrate synthase enzyme activity in skeletal muscle, heart and liver were detected. Higher glycogen content in trained animals skeletal muscles also were found. Indicating elevated oxidative fibers in exercised animals, was found an ATPase activity increased in muscle fiber type I. An elevated PGC-1α protein expression was detected, indicating mitochondrial biogenesis. Levels of PDK4, HKII, ACC and cytochrome C in rats skeletal muscle and liver were also elevated in the trained animals. Increased nitrite concentrations were also founded in the heart, indicating nitric oxide concentration in the
exercised animal hearts. It was concluded that the training prescription up to 60% obtained from the exhaustive test without blood collection corresponds to the maximum lactate steady state, and therefore being a reliable method for aerobic or endurance exercise prescription. The standardization of assessment protocols was effective in assessing the anaerobic threshold and performance of training. The training intensity used was satisfactory in causing functional and structural adaptations, observed by enzyme activity elevation and energy metabolism proteins expression.
1 INTRODUÇÃO
A atividade física é considerada como uma das tônicas do século XXI. Longe dos modismos e discussões paralelas, a atividade física pode ser conceituada como uma condição na qual ocorre uma elevação da exigência de diversos sistemas orgânicos com subsequente ativação de mecanismos de mobilização de substratos energéticos, através das vias aeróbias ou anaeróbias. A atividade física não é sinônima de exercício físico, sendo este, definido como toda atividade física planejada, estruturada e repetitiva que tem por objetivo a melhoria e a manutenção de um ou mais componentes da aptidão física (NOAKES, 2006). Os benefícios do treinamento regular à saúde humana são inúmeros. Sabe-se que o treinamento regular induz a diversas adaptações homeostáticas em diferentes sistemas fisiológicos como, por exemplo, os de ordem cardiorrespiratório, muscular, etc. (COGGAN; WILLIAMS, 1995) que por sua vez, são determinantes da performance para os seus usuários. As respostas regulatórias desses sistemas frente ao treinamento físico variam de acordo com a intensidade, duração, tipo de exercício e progressões empregadas.
O estudo da fisiologia do exercício e do treinamento físico vem deixando a sua adolescência e se tornando uma ciência à parte, amadurecendo e propondo novos desafios para o conhecimento fisiológico. Tanto que a principal agência de fomento à pesquisa científica no Brasil, o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, discrimina atualmente, na sua tabela de áreas, dentro da Fisiologia especificamente, a fisiologia do exercício. Em relação às principais áreas de interesse dentro desta disciplina, vêm se destacando o estudo dos marcadores energéticos metabólicos em atividades aeróbias e seus efeitos adaptativos na musculatura esquelética. A musculatura esquelética depende, predominantemente, do metabolismo oxidativo para a manutenção das contrações necessárias a continuidade do desempenho físico. Este requer a utilização de uma determinada taxa de energia, através da hidrólise do ATP e que, consequentemente, necessita ser ressintetizada constantemente (COGGAN; WILLIAMS, 1995).
As alterações moleculares e celulares ao exercício físico de endurance resultam do aumento da disponibilidade de oxigênio, aumento da densidade mitocondrial (biogênese mitocondrial), da atividade de enzimas oxidativas e transporte de substratos
metabólicos, como por exemplo, a melhora da cinética do lactato. Pode-se destacar também o aumento a oxidação de gorduras, do transporte e utilização de glicose, além de alterações morfológicas, incluindo maior proporção de fibras tipo I por área muscular, e aumento da capilaridade (HANSEN et al. 2005). As adaptações crônicas, caracterizadas como sessões repetidas de atividade contrátil, resultam na ativação de vias especificas de sinalização que regulam a síntese ou degradação de proteínas específicas ao metabolismo energético frente ao esforço físico (COFFEY e HAWLEY, 2007).
Os marcadores bioquímicos do treinamento são uma área de intenso interesse e significativo avanço nas últimas décadas, em evolução com o aumento da importância da atividade física na saúde humana. Podemos destacar a atividade da enzima citrato sintase, a qual receberá destaque neste estudo, uma vez que é uma importante marcadora do metabolismo oxidativo ao treinamento (BASSET; HOWLEY, 2000). Trabalhos vem demonstrando que a adaptação músculo-esquelética funciona com a transição de fibras aos quais caracterizam o uso predominante da via oxidativa frente ao treinamento de endurance (HADDAD, 2001). Dessa forma, a transição efetuada pelas fibras musculares, revelada em colorações específicas em cortes histoquímicos, também vêm sendo utilizada pelos fisiologistas para determinar as adaptações crônicas ao treinamento (TAKEKURA et al., 2001). A produção de lactato ocorre internamente no músculo esquelético, onde a mensuração sanguínea durante exercício fornece informações precisas acerca do fornecimento energético para execução do mesmo, implicando na utilização desse parâmetro como uma ferramenta na prescrição e obtenção de treinamento (PYNE et al., 2001).
Desta forma este trabalho quer estabelecer uma análise comparativa entre os parâmetros apresentados, utilizando ratos treinados em esteira adaptada. É importante ressaltar que os protocolos de exercícios físicos experimentais apresentam resultados contraditórios e algumas vezes inconsistentes quanto aos parâmetros orgânicos adaptativos ao esforço (KRAEMER, 1999). Detre as inúmeras variáveis do treinamento, não é consenso na literatura, à utilização de um determinado protocolo de exercício experimental ou determinado marcador bioquímico padrão (BENEKE , 2003).
O Laboratório de Bioquímica e Cultura de Células, do Instituto Superior de Ciências Biomédicas, vem testando diferentes protocolos e marcadores de exercício
experimental, tendo obtido alguns avanços neste campo. Estes parâmetros de treinamento experimental ainda não foram otimizados. Este trabalho busca analisar parâmetros , utilizando ratos em exercício, em esteira ergométrica adaptada, avaliando modificações fisiológicas, como a atividade enzimática, histoquímica e o conteúdo protéico de enzimas envolvidas no metabolismo energético.
Espera-se obter, pela caracterização destes parâmetros, uma diretiva objetiva, em termos de treinamento experimental, buscando assim, padronizar e otimizar os protocolos de exercício, assim como os marcadores bioquímicos e fisiológicos utilizados para os futuros trabalhos que utilizam o treinamento aliado ao diabetes mellitus, a osteopenia ou osteoporose em ratas, a insuficiência cardíaca, imobilização e outras linhas de pesquisa.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 TREINAMENTO FÍSICO
Em decorrência da repetição de séries de exercícios durante dias, semanas ou meses, surgem adaptações fisiológicas e bioquímicas, o que leva à melhora no desempenho de tarefas específicas. A natureza e a magnitude da resposta adaptativa dependem da intensidade e da duração dos exercícios, do tipo de treinamento, da frequência de repetição da atividade, das limitações genéticas e do nível anterior de atividade do indivíduo. A sobrecarga adequada a determinado indivíduo pode ser obtida por combinações variadas de intensidade, duração, frequência e modo de treinamento. As adaptações ao treinamento são essencialmente transitórias e reversíveis, bastanto somente alguns dias de interrupção para que ocorra redução da capacidade metabólica (WILMORE, 2003).
As adaptações fisiológicas e metabólicas ao treinamento são específicas à natureza da sobrecarga. Isso significa que o treinamento de velocidade e força, por exemplo, produz alterações diferentes das geradas pelo treinamento de resistência ou endurance. Os principais efeitos desse último sobre o músculo esquelético relacionam-se à sua capacidade oxidativa (WILMORE, 2001). Torna-se necessário também programar um tempo suficiente de recuperação regenerativa dentro de um programa de treinamento para permitir que as adaptações ocorram, embora os fatores genéticos sejam determinantes da plasticidade muscular de um indivíduo não treinado. A característica adaptativa do tecido muscular permite que o treinamento produza alterações consideráveis em sua funcionalidade e morfologia (HAWLEY, 2008).
Tem sido cada vez mais investigado a forma pela qual a atividade física atua e interage de maneira a induzir adaptações estruturais e funcionais que aprimorem o desempenho físico e propiciem resultados desejáveis à aquisição e manutenção de bons níveis de aptidão física relacionada à saúde. Desta forma, o homem nem sempre pode ser utilizado para tais investigações e as pesquisas experimentais de laboratório quase sempre lançam mão do estudo da prática de exercícios em modelos animais, mais especificamente em ratos MIYASAKA et al., 2003).
Encontra-se atualmente na literatura inúmeras possibilidades de exercícios físicos utilizados para o treinamento de ratos em laboratório, desde exercícios voluntários em ambiente de confinamento mais amplo ou rodas para caminhada voluntária (NOVELLI et al., 2004), caminhadas e corridas com o uso de esteiras (CARVALHO et al.,2005; LIU et al., 2002), natação em piscina funda com ou sem uso de sobrecarga (MEDEIROS et al., 2000) até protocolos de levantamento de peso com estimulação elétrica (BARAUNA et al., 2005) ou métodos de estimulação elétrica da contração muscular simulando o exercício (BOLSTER et al., 2003).
O trabalho experimental com animais revela-se um importante instrumento para a observação do organismo frente ao esforço físico, elaborados para simular aplicações em treinamento físico (OLIVEIRA et al., 2005). O grupo de pesquisa do laboratório de cultura de células e bioquímica vem, recentemente, testando e padronizando protocolos de avaliação, na tentativa de melhor prescrever esforços crônicos a esses animais, em distintas condições fisiológicas, submetidas ao exercício de corrida em esteira rolante adaptada. Devido à facilidade de utilização e excelente resposta dos ratos frente ao treinamento fisico nesse ergômetro, realizou-se um estudo de caracterização de marcadores fisiológicos adaptativos ao treinamento. Em síntese, os resultados obtidos nesse estudo confirmam a padronização e a utilização de protocolosinvasivos e não invasivos para avaliação aeróbia e anaeróbia de ratos submetidos ao exercício de corrida emesteira rolante adaptada, bem como a determinação de intensidade de esforço para o controle rígido do treinamento adotado em modelos experimentais.
Ratos vêm sendo utilizados como modelo experimental em estudos que avaliam o efeito da atividade física no comportamento de doenças crônicas degenerativas, como insuficiência cardíaca (KEMI et al., 2002), diabetes (OLIVEIRA et al., 2005), dentre outras. Desta forma, a padronização de protocolos que avaliam a capacidade física dos animais torna-se extremamente importante para obter um controle fidedigno desta variável. É de extrema importância oferecer ferramentas capazes de avaliar a evolução dos parâmetros aeróbios e anaeróbios, cujo treinamento físico seja abordado como condição funcional. Na literatura científica observa-se que algumas investigações têm utilizado com sucesso avaliações fisiológicas em ratos para identificação de intensidades alvo, como por exemplo, em treinamento contínuo (SOUZA et al., 2003; VOLTARELLI et al., 2004), treinamento
intervalado (BRAGA et al., 2006) e periodizado (PAPOTI et al., 2007); além de respostas de performances decorrentes de manipulações dietéticas (GOBATTO et al., 2005); obesidade (SOUZA et al., 2003), diabetes experimental (OLIVEIRA et al., 2005); em diferentes condições ambientais (MANCHADO et al., 2007) e destreinamento (CHIMIN et al., 2007).
2.2 SINALIZADORES ENERGÉTICOS METABÓLICOS
A ação muscular é consolidada na literatura científica como resultante de uma série complexa de eventos fisiológicos e a incapacidade de manutenção do maquinário contrátil durante uma determinada tarefa é definida como exaustão (St CLAIR GIBSON et al., 2001). Durante testes de esforço máximo, como por exemplo, nos estágios finais de testes progressivos realizados em esteira, frequentemente é observado o maior valor de captação, transporte e utilização de O2 pelo organismo, designado como consumo máximo de oxigênio ou VO2 max (BASSET; HOWLEY, 1997). A elevação na captação do O2 tem por objetivo
atender à elevação da demanda energética imposta pelos exercícios físicos durante testes exaustivos, ao passo que a redução da oferta desse gás induz ao processo de anaerobiose, que por sua vez, influencia na redução da tensão gerada pelos músculos (HARMS, 2000). Esse comportamento foi inicialmente caracterizado por Taylor et al., (1955), quando atribuíram um aumento inferior a 2,1 ml.kg-1.min-1 na captação de O2 com o incremento de carga,
estabelecendo assim, a presença do fenômeno denominado de platô.
Dessa forma, a presença do platô tem sido atribuída ao aumento da participação do sistema glicolítico, que por sua vez, promoveria a exaustão pela depleção dos substratos energéticos, ou especialmente, pela elevação da concentração dos íons de hidrogênio (H+), oriundos do ácido lático (HARMS, 2000). A contribuição relativa de cada substrato para a manutenção da demanda energética durante o exercício é determinada pela intensidade e duração do esforço, como por exemplo, em estímulo agudo (GOEDECKE et al., 2000), em adaptação crônica ao treinamento (COGGAN et al., 2000), pela dieta (BERGMAN e BROOKS, 1986), dentre outras.
Nas fases iniciais do exercício de intensidade progressiva (~ 45% do VO2max) a demanda energética é satisfatoriamente suprida por mecanismos oxidativos (ciclo de Krebs e fosforilação oxidativa), através da degradação preferencial de ácidos graxos. No entanto, a
produção de energia por estes mecanismos é dependente da contínua conversão de glicogênio a oxaloacetato condensada a acetil-CoA para formar citrato, uma vez que esta controla diretamente a oxidação do acetil-CoA derivado tanto do piruvato de fontes de carboidratos como de ácidos graxos (GOEDECKE et al., 2000). A depleção dos estoques hepático e muscular de glicogênio, possível de ocorrer durante o exercício prolongado, limita a produção de oxaloacetato e da atividade oxidativa (ODLAND et al,. 2000).
Com o aumento da intensidade do exercício (~ 45% a 70% do VO2 max) a
oxidação de ácidos graxos em relação à oxidação de glicogênio diminui progressivamente, inibida principalmente pelo maior fluxo de substratos através da via glicogenolítica/glicolítica e pelo aumento da atividade da enzima piruvato desidrogenase (PDH) (ODLAND et al., 2000). Após a transição exercício moderado-intenso (~ 75% do VO2max), a demanda
energética passa a ser suprida predominantemente pela glicogenólise e pela glicólise hepática e muscular com subsequente acúmulo sanguíneo de lactato e íons H+. A alteração do pH intramuscular afeta a atividade das enzimas glicogenolíticas e glicolíticas, como consequência, observa-se a diminuição da produção de energia pela via glicolítica, gerando fadiga ou exaustão (COLLINS et al., 2000).
2.3 LIMIARES METABÓLICOS
As crescentes investigações nos últimos anos, buscando uma melhor compreensão dos vários aspectos que interferem no treinamento físico e que são utilizados como parâmetros de prescrição do exercício, tem sido tema de questionamentos que buscam identificar outras variáveis que podem ser de grande importância para o desenvolvimento desta área de estudo (AVELAR et al., 2007).
Indicadores de aptidão aeróbia como o consumo máximo de oxigênio (Vo2 máx) (HOWLEY et al., 1995) e o limiar anaeróbio (LA)(SVEDAHL et al., 2003) têm sido frequentemente utilizado na avaliação funcional em diferentes populações. O LA, por apresentar alta correlação com a performance aeróbia, destaca-se no campo da avaliação funcional, sendo aplicado como marcador de adaptação ao treinamento. O termo limiar anaeróbio (LA) representa a fase do exercício onde ocorre um aumento brusco de CO2 e de
lactato sanguíneo, refletindo uma mudança nas vias produtoras de ATP em direção à via metabólica anaeróbia (WASSERMAN e MCILROY, 1964).
Outro método tem se destacado, visando identificar o LA, que é o da resposta da glicemia durante o exercício progressivo (SIMÕES et al., 1998). A distribuição de glicose para a contração do músculo esquelético, segundo o autor, parece sofrer um aumento durante o exercício como consequência de um grande aumento do fluxo sanguíneo, embora isto não possa explicar totalmente uma maior captação de glicose (HAYASHI et al., 1997). A amplitude do aumento da captação de glicose induzida pelo exercício está relacionada com a duração e intensidade da atividade. Esse é o resultado do aumento progressivo do transporte de glicose nos sarcolemas e do aumento do metabolismo devido à menor quantidade de glicose-6-fosfato, já que o nível de glicogenólise muscular cresce à medida que o exercício continua (WASSERMAN e FUEGER, 2006). Estudos têm demonstrado que, no exercício anaeróbio, a glicemia pode elevar-se a níveis superiores ao estado de repouso. A maior produção de lactato, nesta modalidade de exercício, aumenta a atividade neoglicogênica, resultando em um aumento da glicemia (SILVA et al., 2006).
A resposta da glicemia tem sido foco de recentes estudos buscando a sua relação com os outros parâmetros já existentes. Avelar et al., (2007), buscaram comparar o limiar anaeróbio determinado por variáveis ventilatórias e o limiar glicêmico individual em ciclistas, encontrando uma relação entre as duas variáveis, o que referencia a ideia da adoção do limiar glicêmico individual para determinar o limiar anaeróbio em ciclistas. Outro estudo, onde se realizaram testes em esteira ergométrica buscando comparar protocolos diretos de lactato, glicose e consumo máximo de oxigênio (VO2), e protocolos indiretos (velocidade crítica e velocidade média em 3 km) para avaliar a aptidão aeróbia, verificou-se que os autores encontraram uma alta correlação entre as variáveis estudadas (SILVA et al., 2005).
O conhecimento da intensidade correspondente ao limiar de lactato e ao comportamento da glicemia sanguínea pode ter importância prática na prescrição de intensidades, quer seja para indivíduos fisicamente ativos, ou portadores de algum distúrbio metabólico, como no caso da diabetes. Os raros estudos dessa natureza têm sido conduzidos em atletas (RIBEIRO et al., 2004) e em indivíduos fisicamente ativos (não-atletas) (SIMÕES et al., 2003). A identificação do LA, utilizando-se o lactato, parece delimitar, pelo menos em
indivíduos saudáveis, domínios de intensidade com predomínio de captação e produção de glicose sanguínea. Entretanto, aspectos como nível de aptidão funcional, estado de treinamento, presença ou não de outros fatores de risco como obesidade e hipertensão, podem modificar tanto as intensidades absolutas como as relativas de ocorrência do LA (MATTERN et al., 2003).
A realização de teste progressivo máximo até a exaustão tem como objetivo identificar o ponto onde ocorre mudança no comportamento metabólico, pois que o limiar anaeróbio é um importante indicador da capacidade de realização de exercícios de endurance (PILIS et al., 1993). O teste de máximo estado estável do lactato sanguíneo torna-se também um excelente indicador da performance de endurance (BALDARI e GUIDETTI, 2000), representando a equalização da máxima capacidade de entrada e remoção do lactato sanguíneo (JONES e CARTER, 2000; BILLAT, 2003). A padronização da curva de lactato sanguíneo durante os testes progressivos e os testes de máxima estabilização do lactato, com e sem coleta de sangue, foram de grande valia para esta pesquisa e para o desenvolvimento de um protocolo de treinamento físico.
2.3.1 Vias metabólicas envolvidas na produção de ATP
A energia consumida durante o exercício físico, gerada pelas diferentes vias metabólicas, torna-se um dos principais fatores limitantes da atividade física. Dessa forma, a otimização deste sistema pode levar à melhora da capacidade de realizar exercício físico (PILIS et al., 1993).
A oxidação da glicose e a produção de ATP estão associadas à redução de NAD+. Como o NAD+ existe nas células em concentrações limitantes, a manutenção do funcionamento da glicólise depende da reoxidação do NADH. A disponibilidade de NAD+ ocorre através de dois processos diferentes, segundo a disponibilidade de oxigênio. Em aerobiose, em que se utiliza o oxigênio para oxidar o NADH; e em anaerobiose, onde o piruvato produzido pela glicólise serve como aceptor dos elétrons do NADH, sendo reduzido a Lactato (PILEGAARD et al., 2005).
A produção de ATP pela via aeróbia apresenta melhor eficiência em relação à via anaeróbia, pois a via aeróbia é capaz de produzir maior número de ATPs por molécula de glicose degradada. Dessa maneira, quanto menor a ativação da via anaeróbia, maior é a otimização de energia. A hiperativação da via metabólica anaeróbia traz também como consequência uma série de alterações sistêmicas e locais causadas pelo aumento da concentração de lactato sangüíneo, prejudicando a continuidade do exercício físico e tornando-se então, um fator limitante na realização da atividade física. A proporção de ativação da via metabólica responsável pela geração de energia está diretamente relacionada à intensidade do exercício. De maneira geral, exercícios físicos realizados em intensidades baixas utilizam predominantemente energia produzida pela via aeróbia, ativando o ciclo de Krebs na produção de NADH e utilizando oxigênio como aceptor final de elétrons na regeneração do NAD+ (SVEDAHL et al., 2003).
Com o aumento da intensidade do exercício físico, há uma maior ativação do sistema e maior demanda de oxigênio, porém existe uma intensidade ideal onde a captação e utilização de oxigênio pela musculatura esquelética alcança um patamar, ou ativação ótima. A partir deste ponto o oxigênio torna-se um elemento limitante na produção de energia pela via aeróbia. Dessa forma, a ativação da via metabólica anaeróbia age com o intuito de compensar a ineficiência da via aeróbia em regenerar NAD+, pois a constância na regeneração de NAD+ em NADH é primordial na manutenção da oferta energética. Assim sendo, quanto maior a intensidade do exercício físico, maior a ativação da via metabólica anaeróbia para a manutenção da oferta energética, causando como consequência o aumento das concentrações de lactato tanto local quanto circulante, levando à fadiga muscular (GOEDECKE et al., 2000).
O ácido lático é capaz de promover a redução do pH devido sua rápida dissociação (aumento de íons H+), promovendo algumas alterações não compatíveis com a atividade física. Dentre elas podemos citar a inibição da atividade enzimática glicolítica-glicogenolítica, o deslocamento de Ca+ do complexo troponina-tropomiosina impedindo a formação do complexo actinomiosina e, ainda, a estimulação de receptores de dor, resultando em manifestação de fadiga (PLISK, 1991). Os músculos esqueléticos produzem lactato durante o exercício físico, o qual é liberado na corrente sanguínea ou acumulado nas fibras musculares.
Não se conhece efeito inibitório direto do ácido lático no metabolismo energético intramuscular, assim como nos processos de contração (PILEGAARD et al., 2003). Porém, o aumento da concentração de lactato no tecido muscular eleva a osmolaridade, acumulando água no interior das células. Este da pressão intramuscular pode reduzir a circulação sanguínea local, assim como promover a diluição iônica (ROBERTS e SMITH, 1989).
Como citado anteriormente, a concentração intramuscular elevada de ácido lático promove aumento de íons H+ com redução do pH, o que deprime as propriedades contráteis das miofibrilas musculares e a atividade de algumas enzimas-chave dos sistemas energéticos, das vias glicolíticas e oxidativas. A acidose, portanto, reduz a utilização do glicogênio e da glicose intramusculares, assim como a liberação de lactato em músculos estimulados (ROTH, 1991). Dessa maneira, a eficiência pela qual as fibras musculares controlam a liberação do lactato produzido para o sangue deve desempenhar um importante papel na resistência muscular à fadiga (PILEGAARD et al., 2003).
2.3.2 Prescrição de treinamento físico pela concentração de lactato sanguíneo
Concentrações de lactato sanguíneo têm sido utilizadas como índice de prescrição de exercício físico devido à grande capacidade de expressar tanto as atividades centrais, como oferta de oxigênio e substratos, quanto às atividades periféricas na musculatura específica em determinado esforço, sendo que as concentrações de lactato circulante são melhores indicadores de adaptações ao treinamento físico de endurance quando comparados com VO2 máx (ROBERTS et al., 1989).
Em humanos, a concentração de lactato sanguíneo aumenta exponencialmente com a intensidade do exercício. O ponto onde ocorre a perda da exponencialidade da curva do lactato sanguíneo versus a carga durante o exercício progressivo é considerado o limiar de lactato sanguíneo ou limiar anaeróbio (LA), embora a anaerobiose como causa da produção acelerada de lactato vem sendo questionada (BROOKS, 1986). O LA ocorre numa frequência entre 50 e 80% da máxima carga, numa concentração de lactato sanguíneo em aproximadamente 4 mmol/L (MADER e HECK, 1986).
A determinação do limiar anaeróbio tem grande aplicabilidade na avaliação da capacidade de endurance (VOLTARELLI et al., 2002). Atualmente, as medidas de limiar anaeróbio são muito populares para a avaliação da eficiência do treinamento para o atleta, assumindo que quanto maior o LA, maior a capacidade de endurance do indivíduo (JONES e CARTER, 2000).
2.3.3 Testes exaustivos com coletas sanguíneas para dosagem de lactato e análise da glicemia
As concentrações circulantes de lactato são relativamente proporcionais à intensidade do exercício físico realizado, sendo que após o limiar anaeróbio ou limiar de lactato, ponto onde ocorre um aumento brusco da razão de produção e remoção do lactato, as concentrações de lactato se elevam rapidamente, resultado de uma maior participação da via anaeróbia na produção de ATP (BROOKS, 1986). Desta forma, a realização de exercícios progressivos máximos até a exaustão, utilizando incrementos constantes, torna-se extremamente importante na análise do comportamento do lactato sanguíneo, possibilitando apontar a fase em que ocorre a descompensação entre produção e remoção do lactato.
Heck e colaboradores (1985) descreveram sucintamente a cinética do lactato em humanos, padronizando a concentração de 4 mmol/L como o limiar anaeróbio. Dessa forma, o lactato pode contribuir como parâmetro fisiológico para a prescrição de treinamento físico, pois se acredita que as maiores adaptações ao treinamento físico de endurance estão diretamente relacionadas a exercícios físicos realizados na intensidade do LA. Stegmann e colaboradores (1981) observaram que o LA pode variar numa escala de 2 a 7,5 mmol/L. Dessa maneira, definiu-se como limiar a maior intensidade de exercício físico que pode ser mantida sem um aumento da concentração de lactato durante 30 minutos de exercício físico.
2.3.4 Determinação do máximo estado estável do lactato sanguíneo através de testes contínuos com cargas independentes e análise da glicêmia
Segundo La Fontaine et al., (1981), o máximo estado estável do lactato representa a intensidade máxima de exercício onde a capacidade de remoção do lactato sanguíneo permite compensar sua produção, sendo considerada a intensidade de esforço que promove maiores adaptações fisiológicas ao treinamento aeróbio.
Tendo em vista a importância da determinação do LA para a prescrição do treinamento físico para ratos, buscou-se através deste experimento conhecer e padronizar a curva de lactato sanguíneo durante testes físicos exaustivos e do máximo estado estável do lactato durante o exercício físico em ratos (BILLAT, 2003). Para avaliação aeróbia de animais corredores, o máximo estado estável do lactato, é interpretado como o método padrãoouro, embora os testes de lactato mínimo e de duplos esforços não exaustivos propostos na literatura são capazes de estimar a máxima intensidade com predominância aeróbia de maneira muito satisfatória, haja vista sua padronização com base nomáximo estado estável do lactato (VOLTARELLI et al., 2002). Observa-se ainda em caso de impossibilidade de análise lactacidêmica, a utilização do modelo exaustivo de potência crítica para avaliação aeróbia e anaeróbia de ratos, já que esse método necessita apenas de umergômetro e um cronômetro.
Beneke (1995) determinou a lactacidemia sanquínea, onde definiu o máximo estado estável do lactato como a mais alta intensidade na qual o metabolismo aeróbio ainda prepondera sobre o anaeróbio, sendo considerada atualmente, o método padrão-ouro para a determinação da intensidade de transição dos substratos energéticos, que entram na via do metabolismo aeróbio. A resposta lactacidêmica para mensuração da intensidade é dependente do ergômetro, ou mesmo do tipo de exercício utilizado por esses indivíduos, o que implica cuidados na generalização da prescrição do treinamento pela concentração de lactato sanguíneo (MANCHADO et al., 2006). Dessa forma, éconsiderado um método seguro para identificação da capacidade aeróbia, o que justifica em muitos estudos a utilização desse procedimento na avaliação de indivíduos ativos e atletas de altorendimento.
A padronização de protocolos de avaliação experimental em laboratório envolvendo exercício em circuitos de esteira ou em piscina adaptada pode ser determinada por avaliações de esforços físicos ao comportamento da lactato (VOLTARELLI et al., 2004). Avaliações ergométricas através de esteira rolante em circuito adaptado foram utilizadas para detecção do LA, objetivando observar a resposta lactacidêmica para mensurar o nível de aptidão física em animais e humanos (PILIS et al., 1993). Animais realizaram teste com aumento progressivo de velocidade em esteira, com coletas de sangue a cada cinco minutos, com posterior determinação do LA por análise do comportamento exponencial da curva de lactacidêmica. O LA foi obtido a 25 m/min com concentração de lactato a 4 mM. A
concentração de lactato encontrada nos animais assemelha-se a concentração encontrada em seres humanos. Não foi encontrado comportamento exponencial da curva de lactato sanguíneo em exercício envolvendo natação (GOBATTO et al., 2001), o que sugere a necessidade de maior preocupação acerca dos estudos e validação dos protocolos utilizados com animais e consequente distinção das respostas do lactato em diferentes ergômetros.
2.4 ATIVIDADE MÁXIMA ENZIMÁTICA: CITRATO SINTASE
A enzima citrato sintase é uma enzima transferase que controla o primeiro passo ciclo de krebs também conhecido como ciclo do ácido cítrico ou tricarboxílico. A citrato sintase (CS) está localizada no interior das células, mais especificamente na matriz mitocondrial, na qual é codificada pelo DNA nuclear. É sintetizada utilizando-se dos ribossomos do citoplasma sendo posteriormente transportada para a matriz mitocondrial. É comumente utilizada como marcador quantitativo da enzima pela presença intacta da mitocôndria. A enzima cataliza a reação de condensação de um resíduo de acetato contendo dois carbonos de uma acetil coenzima A com uma molécula de oxaloaceto contendo quatro carbonos para formar um citrato de seis carbonos (WILMORE, 2001). O oxaloacetado será regenerado após completada uma volta no ciclo de Krebs. Exemplo: Acetil-CoA + Oxaloacetato + H2O - Citrato sintase – Citrato + CoA-SH.
Vários estudos têm utilizado a atividade de enzimas mitocondriais para confirmar ou não a influência do exercício físico na adaptação oxidativa do músculo esquelético de ratos. Porém, alguns estudos têm demonstrado respostas inconsistentes quanto à atividade da citrato sintase (CS) submetidos a treinamento de endurance. Em (2006), Ricardo e colaboradores, encontraram um aumento significativo na atividade da CS no músculo sóleo de ratos, após o programa de treinamento. Da mesma forma, o clássico estudo de Alessio e Goldfarb (1988), verificou que o treinamento em esteira aumentou a atividade da CS no músculo gastrocnêmio dos animais duas vezes a mais do que o grupo controle sedentário. Em outro estudo, foi demonstrado um importante aumento na atividade da CS em diferentes músculos esqueléticos de ratos jovens e de meia-idade, após nove semanas de treinamento em protocolo de natação (RÁDAK et al., 1999).
No entanto, Pereira et al., (1994) observou atividade da CS diminuída após estímulo crônico. As diferenças analisadas entre os estudos estão possivelmente relacionadas aos diferentes tipos de fibras musculares utilizadas; aos diferentes protocolos de treinamento variando quanto aos aspectos de intensidade, duração, tipo de exercício e parâmetros de progressão de treinamento; ou a diferentes métodos para determinação da atividade CS; ou ainda, com as adaptações moleculares diferenciadas (modificações translacional e/ou pós-translacional) na adaptação da CS durante e após treinamento físico (LEEK et al., 2001).
A escolha do músculo sóleo, na maioria das investigações, deve-se ao fato deste músculo possuir uma grande quantidade de fibras vermelhas (aproximadamente 95%), as quais caracterizam o uso predominante da via oxidativa. A atividade da enzima CS foi determinada a partir da quantificação do complexo formado. O treinamento físico de natação levou a um aumento de 52% na atividade máxima da enzima citrato sintase (103,75±2,57 vs. 157,81±2,2 nmol/ mg.proteína) nos ratos sedentários e treinados, respectivamente (SILVA et al., 1997). Com relação à adaptação músculo esquelética crônica ao treinamento físico de natação, observou-se que os ratos aumentaram a atividade máxima da CS (VIEIRA et al., 1988). De fato, outros autores já haviam demonstrado que o treinamento físico aeróbio com natação é eficiente em aumentar a atividade máxima enzimática (LANCHA, 1991).
Vários estudos têm sido realizados para determinar a influência do treinamento físico na adaptação das enzimas mitocondriais no músculo cardíaco (OSCAI et al., 1971; POWERS et al., 1998). Embora a maioria dos estudos sugira que o treinamento não induza alterações enzimáticas mitocondriais perceptíveis no músculo cardíaco (ABDELMALKI et al., 1996; ZONDERLAND et al., 1999). A análise das respostas crônicas da CS na atividade enzimática na musculatura esquelética, cardíaca e no fígado, torna-se importante uma vez que possibilita confirmar e esclarecer possíveis melhoras adaptativas ao desempenho em testes físicos.
2.5 CONTEÚDO DE GLICOGÊNIO
O exercício físico demanda intenso consumo de trifosfato de adenosina (ATP) que pode aumentar em dezenas de vezes dependendo da intensidade e duração do esforço. Nos
músculos esqueléticos, há sistemas muito eficientes que possibilitam a ressíntese constante do ATP que está sendo utilizado para a contração muscular. Estes sistemas são os da fosfocreatina, glicólise e o da fosforilação oxidativa. O glicogênio é preservado havendo maior utilização de ácidos graxos (AG) como substratos energéticos (WEGENER et al., 1996).
Essa preferência dos músculos esqueléticos pelos AG é muito importante em exercícios físicos de longa duração ou endurance, já que os lipídios armazenados no organismo na forma de triacilglicerol (TG) representam o principal estoque de energia disponível (NEWSHOLME e LEECH, 1983). Por outro lado, o glicogênio, imprescindível durante o exercício físico, possui um estoque relativamente limitado, que necessita ser preservado para continuar sendo utilizado concomitantemente aos AG, porém, em menor proporção, até o final do esforço.
O total de energia estocado na forma de TG é cerca de 60 vezes maior que aquele como glicogênio. Desta forma, o aprimoramento da oxidação dos AG durante o exercício possibilita manter a atividade física por períodos mais prolongados e retarda a depleção do glicogênio e a hipoglicemia. Por exemplo, no homem, uma massa aproximada de 9.000 g de lipídios é suficiente para fornecer 81.000 Kcal. Este estoque permitiria um homem adulto andar 259 horas ou correr durante 67 horas. Por outro lado, o estoque de glicogênio muscular (350 g) fornece 1.400 Kcal, o que permitiria caminhar por apenas 4,8 horas ou correr durante 1,2 horas (WEGENER et al., 1996). Outra vantagem dos AG é sua eficiência energética (9 Kcal.g-1 ), mais que 2 vezes a do glicogênio/glicose (4 Kcal.g-1). Pelos motivos acima e de acordo com a lei da conservação de energia, todo excesso de energia proveniente da alimentação, incluindo gorduras, carboidratos e proteínas, é armazenado na forma de TG.
O estoque de glicogênio muscular é suficiente para pouco mais de uma hora de esforço de intensidade moderada, fazendo com que os músculos dependam também da captação de glicose circulante para manter a contração. Por sua vez, a manutenção da glicemia é fundamental, principalmente para preservar a função cerebral, uma vez que sua depleção esta diretamente ligada à exaustão (IVY et al., 1980). Por isso, analisar os ajustes que ocorrem com o treinamento quanto ao aumento da eficiência na mobilização dos AG e a elevação dos estoques de glicogênio muscular, tornam-se importantes para explicar os mecanismos de melhoria da performance.
2.6 CONTRATILIDADE E ATIVIDADE ATPase
No decorrer de décadas, estudiosos vem se debruçando em pesquisas objetivando esclarecer os reais mecanismos funcionais da musculatura esquelética quando submetidas a aumento de intensidade durante exercício, visto que estes promovem aumento da tensão muscular esqueletal, tornando o tecido muscular suscetível a adaptações quanto a habilidade contrátil rápida e lenta (mATPase) (TAKEKURA et al., 2001).
As fibras musculares têm a capacidade de alterar suas propriedades morfológicas e bioquímicas de acordo com os estímulos a que são submetidas, refletindo na quantidade ou tipo de proteína muscular. Esta capacidade adaptativa (plasticidade muscular) envolve diferentes componentes da fibra. O músculo de mamíferos é composto por uma população heterogênea de tipos de fibras musculares. Esta diferença constitui a base da variedade e eficiência na funcionalidade do músculo. As formas para a classificação das fibras musculares que oferecem maior fidelidade baseiam-se no perfil protéico da cadeia pesada da miosina, sendo que as técnicas mais utilizadas são: o método histoquímico (tipagem de fibras) através de análise da atividade ATPase (STARON, 2000). O fundamento da análise histoquímica baseia-se no fato de que a enzima ATPase tem como função hidrolisar o ATP durante o processo de contração muscular. A análise da atividade ATPase na cadeia de miosina pesada (MHC) em diferentes pHs, permite que as fibras sejam classificadas como sendo de contração lenta as do tipo I e contração rápida as do tipo II (PETTE; STARON, 2000).
Alterações no predomínio de um ou outro tipo de fibra servem como base fisiológica para as numerosas intervenções destinadas a aumentar o desenvolvimento da força e da sustentação do músculo, por outro lado, alterações na composição do tipo de fibra de um músculo também podem ser responsáveis por algumas das alterações ou disfunções vistas em indivíduos que ficaram sujeitos a grandes períodos de imobilidade, inatividade, ou desnervação do músculo, indicando a capacidade de resposta muscular a um estímulo, decorrente de alterações das isoformas manifestadas pelas alterações na expressão das isoformas da Cadeia Pesada de Miosina. São vários os estímulos que atuam sobre o músculo esquelético promovendo alterações fisiológicas e moleculares. Dentre elas utilizaremos em nosso estudo o treinamento com exercício físico em esteira adaptada. Pois que analisaremos através deste estímulo as modificações ocorridas à atividade contrátil do músculo. Dentre as várias alterações decorrentes dos diversos estímulos aplicados sobre o músculo, temos a
transição das fibras rápidas (tipo II) para lentas (tipo I), no exercício aeróbio (HADDAD, 2006).
Definida como aumento do número de fibras, a hipertrofia, sendo uma resposta regulatória ao exercício, é encontrada principalmente no decorrer das fases mais adiantadas do exercício, dado que o maior sobrepeso promove uma adaptação regenerativa notável nas fibras musculares esqueléticas, de acordo com trabalhos de (ARGAW et al., 2004), corroborando dessa forma com os estudos realizados por (JACKSON et al., 1990), quando encontraram respostas hipertróficas em músculo quadríceps submetidos a treinamento de resistência e força.
O treinamento físico causa adaptação metabólica às fibras musculares esqueléticas, de forma que como essas miofibrilas não proliferam, a única maneira de elevar positivamente o tecido muscular é elevando a espessura das mesmas, isso ocorre com o surgimento de novas miofibrilas. De modo geral, o estresse mecânico causado pelo exercício intenso ativa a expressão do RNA mensageiro (RNAm) e conseqüentemente a síntese protéica muscular. As proteínas, estruturas contráteis do músculo, principalmente actina e miosina, são necessárias para que as fibras musculares produzam mais miofibrilas. A célula muscular é multinucleada, mas esses núcleos não proliferam, fazendo-se necessária a fusão de núcleos provenientes de outras células com a fibra muscular. As células responsáveis por esta fusão são as células satélites, onde estas se localizam entre a lâmina basal e o sarcolema das fibras musculares e possuem o mesmo tamanho de um núcleo da célula muscular. Estas células são células-tronco e desempenham um papel importante na regeneração do músculo (ANDERSEN et al., 2000).
As células satélites possuem um núcleo que pode proliferar em resposta às micro-lesões causadas pelo exercício no músculo esquelético. Estas micro-micro-lesões atraem as células satélites que se fundem e dividem o seu núcleo com a fibra muscular, dando o suporte necessário para a transição do metabolismo energético dessas fibras. Como o número de núcleos novos é maior do que o necessário para preencher o espaço deixado pelas micro-lesões, a fibra muscular produz um número maior de miofibrilas, resultando em adaptação muscular (LIEBER, 2002).
Existem basicamente dois tipos de hipertrofia, a aguda e a crônica. A hipertrofia aguda, sarcoplasmática e transitória, pode ser considerada como um aumento do volume muscular durante uma sessão de treinamento, devido principalmente ao acúmulo de líquido nos espaços intersticial e intracelular do músculo. Outra teoria seria a do aumento no volume de líquido e conteúdo do glicogênio muscular no sarcoplasma. Já a hipertrofia crônica pode ocorrer durante longo período de treinamento de força, e está diretamente relacionada com as modificações na área transversa muscular. Considera-se também o aumento de miofibrilas, do número de filamentos de actina-miosina, conteúdo sarcoplasmático, tecido conjuntivo ou combinação de todos estes fatores (ANDERSEN et al., 2000).
Sabe-se atualmente da existência de inúmeros tipos de fibras esqueléticas, mas basicamente a estrutura esquelética é formada por tecido conjuntivo e por três tipos de fibras musculares: do tipo I (lentas oxidativa), IIa (intermediárias oxidativa-glicolítica) e IIb (rápidas glicolítica). Quando observadas individualmente, em resposta ao treinamento, as fibras musculares adaptam-se, regenerando o estresse causado por micro-lesões, ocorrendo alterações na velocidade de contração, oxidação, capilarização, resistência à fadiga, número e no tamanho de mitocôndrias. (CROWTER et al., 2002). Por efeito da resposta ao treinamento, as adaptações regulatórias do sistema neuromuscular sofrem mudanças no recrutamento de unidades motoras, de forma que se tornam importantes fatores relacionados ao ganho de aptidão física e desenvolvimento de força. Dessa maneira, a adaptação ao treinamento aeróbio e anaeróbio, altera o padrão de recrutamento de unidades motoras relacionadas à contração máxima voluntária (MCCARTHY et al., 2002).
2.7 MARCADORES MOLECULARES PROTÉICOS AO TREINAMENTO FÍSICO
2.7.1 Quantificação protéica de PGC-1α no músculo esquelético
A PGC-1α foi descrita inicialmente como uma co-ativadora dos receptores proliferadores ativados de peroxissomo (PPAR), sendo uma proteína chave na regulação do metabolismo energético celular; na termogênese; biogênese mitocondrial; na oxidação de ácidos graxos; e gliconeogênese hepática (SCARPULLA, 2002; ANDERSSON e SCARPULLA, 2001).
No decorrer de alguns anos, estudos realizados por pesquisadores na área do metabolismo energético vêm analisando a participação de diferentes tecidos na homeostase metabólica e as respostas da PGC-1α principalmente no músculo esquelético. Desde sua descoberta, a PGC-1α representou um marco na compreensão da base molecular da adaptação induzida pelo exercício físico na biogênese mitocondrial muscular e consequente função na regulação do metabolismo do músculo esquelético envolvidas no metabolismo das gorduras (PUIGSERVER et al., 1998; SCARPULLA, 2002). A expressão da PGC-1α tem sido relatada em tecidos com alta atividade metabólica, incluindo o tecido adiposo, fígado, cérebro, coração e principalmente músculo esquelético (ESTERBAUER et al., 1999). É comum observar a todos estes tecidos uma elevação no número e diâmetro das mitocôndrias por motivo das elevadas exigências energéticas frente ao esforço físico, sendo, portanto, capazes de responder a um aumento da necessidade metabólica através da biogênese mitocondrial. Nos músculos esqueléticos de ratos, a expressão da proteína PGC-1α está altamente correlacionada com a elevação da densidade mitocondrial e capacidade oxidativa. A expressão da proteína PGC-1α também difere marcadamente entre as fibras musculares, sendo mais elevadas em fibras tipo IIa (Intermédiárias Glicolíticas-oxidativas) em relação as fibras tipo I (Oxidativas) e tipo IIb (Glicolíticas), respectivamente, (IIa> I> IIb) (RUSSEL et al., 2003).
Apresenta-se bem caracterizado na literatura científica atualmente, os efeitos do exercício físico crônico sobre a expressão protéica da PGC-1α (IRRCHER et al., 2003) e sobre os efeitos agudos do exercício (TERADA et al., 2002, 2005; TERADA e TABATA, 2004). Normalmente, as alterações fisiológicas induzidas pela expressão da proteína PGC-1α no músculo de roedores é de (1,5 para 2,8 vezes) em uma única sessão de exercício (2,0 a 2,5 vezes); (WRIGHT et al., 2007), e ao treinamento (de 1,5 para 2,5 vezes); (AKIMOTO et al., 2005; SRIWIJITKAMOL et al., 2006).
As contrações musculares levam a um aumento rápido da ativação dos fatores de sinalização dentro do músculo esquelético e a ativação dessas moléculas de sinalização serve como o passo inicial para a expressão do gene e proteínas. Duas quinases particularmente relevantes para regulação da expressão de PGC-1α induzida pelo exercício são ativadas por mitógeno p38 proteína quinase (MAPK) e 5-AMP proteína quinase ativada (AMPK). A AMPK é ativada nas células do músculo esquelético durante a contração, e parece ser um
