UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDIICNA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDIICNA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

EXPRESSÃO DE C-MYC, NKX3.1 E E-CADERINA POR

IMUNO-HISTOQUÍMICA EM MICROARRANJO DE TECIDO (TMA) DE LESÕES PRÉ-NEOPLÁSICAS E PRÉ-NEOPLÁSICAS NA PRÓSTATA DE CÃES

CARLOS EDUARDO FONSECA ALVES

Botucatu-SP 2013

EXPRESSÃO DO C-MYC, NKX3.1 E E-CADERINA POR

IMUNO-HISTOQUÍMICA EM MICROARRANJO DE TECIDO (TMA) DE LESÕES PRÉ-NEOPLÁSICAS E PRÉ-NEOPLÁSICAS NA PRÓSTATA DE CÃES

CARLOS EDUARDO FONSECA ALVES

Orientador: Profa Drª. Renée Laufer Amorim Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre.

ii Nome do Autor: Carlos Eduardo Fonseca Alves

Título: EXPRESSÃO DE C-MYC, NKX3.1 E E-CADERINA POR IMUNO-HISTOQUÍMICA EM MICROARRANJO DE TECIDO (TMA) DE LESÕES PRÉ-NEOPLÁSICAS E PRÉ-NEOPLÁSICAS NA PRÓSTATA DE CÃES

COMISSÃO EXAMINADORA

ProfªDrª Renée Laufer Amorim Presidente e Orientadora

Departamento de Clínica Veterinparia FMVZ – UNESP - Botucatu

ProfªDrª Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura Membro

Departamento de Medicina Veterinária EVZ – UFG - Goiânia

Drª Marcela Marcondes Pintos Rodrigues Membro

Departamento de Anestesiologia FMB – UNESP – Botucatu

Aos meus pais e irmãos, por toda a confiança, dedicação, amor e por acreditarem no meu potencial.

Dedico este trabalho a vocês. AGRADECIMENTOS

iv

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão da bolsa de mestrado.

Ao Hospital AC Camargo e o Centro Internacional de Pesquisas (CIPE) pela realização da técnica de Imuno-histoquímica para os anticorpos c-MYC e NKX3.1.

À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade Estadual Paulista – Campus Botucatu pela oportunidade concedida.

À minha família (Carlos Alberto, Roseli Fonseca, Ricardo Henrique e Guilherme Augusto), foi graças a vocês que eu estou hoje terminando meu mestrado e concluindo mais essa etapa de uma longa jornada. Obrigado por sempre me apoiarem e estarem ao meu lado. Sei que não é fácil morar longe, e sei como foi difícil ajudar a me manter em outras cidades todos esses anos. Sei que fizeram por mim, tudo que vocês podiam fazer e também tudo aquilo que vocês não conseguiram ter. Gostaria de dizer que sinto muito orgulho de vocês, e sempre vou ser grato pelo esforço de vocês com a minha formação. Vocês são o exemplo para minha vida! Obrigado!

À minha orientadora, Profª. Drª. Renée Laufer Amorim, inicialmente agradeço pelo voto de confiança ao me orientar durante o curso de mestrado. Gostaria de agradecê-la por sua paciência em ouvir problemas alheios e por me ensinar a sempre olhar o lado bom das pessoas. Por me apoiar nas oportunidades que surgiram e por todos seus ensinamentos. Obrigado por sempre apostar comigo quando discordávamos em algum ponto, afinal eu perdia todas as apostas, mas foram ensinamentos que nunca vou esquecer. Por ser uma pessoa íntegra e imparcial, obrigado por esses anos de convivência.

À Profª. Drª. Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura, pela amizade e pela disposição em ouvir e me aconselhar sempre que preciso. Se hoje estou alcançando meus objetivos e defendendo o mestrado foi porque você ajudou a regar uma sementinha que um dia pode ser uma árvore. Obrigado por acreditar no meu potencial.

À Drª. Marcela Marcondes, gostaria de agradecê-la por toda a amizade e confiança depositada. Sabe quando encontramos uma pessoa e não sabemos explicar o porquê, mas essa pessoa já inspira bons sentimentos e você já a considera uma amiga? Acho que é assim que posso defini-la. Talvez já nos

conhecêssemos de outra vida! Obrigado pela amizade e por sempre me “defender”.

Aos meus amigos Aline Gonçalves, Cynthia Viana, Hérika Xavier, Robson Moreira e Sabryna Calazans. Sempre que vou falar do assunto “amizade” com outras pessoas, nunca consigo chegar a uma conclusão. Todos sempre dizem: “amigos temos poucos na vida”; “Somente nossos pais são nossos verdadeiros amigos” ou que se tivermos “um ou dois amigos durante a vida é muito”. Com isso, só consigo chegar as seguintes conclusões: “Ou todas as pessoas tem azar em não encontrar amigos” ou eu tenho “muita sorte em achar amigos verdadeiros na minha vida”. Gostaria de agradecê-los por fazer parte da minha vida e por sempre me apoiar em todos os momentos. Estou concluindo mais uma etapa na minha vida e só estou conseguindo isso porque tive ajuda de vocês. Obrigado!

A toda a equipe do Laboratório NeoGene, em especial, Profª. Drª. Silvia Regina Rogatto, Drª. Sandra Drigo, Renata Bueno e a Ana Carolina, por toda a ajuda a entender o mundo da biologia molecular, por todos os ensinamentos e pelos momentos de descontração.

Ao Igor Simões, pela amizade, pelas longas conversas, por sempre ouvir as minhas lamentações e pelo auxílio na correção das referências bibliográficas dos meus projetos. Obrigado pela amizade e pela paciência. Com certeza um amigo que vou lembrar sempre!

À Drª. Kellen Oliveira, pela amizade, companheirismo, pelo auxílio na coleta do material e por sempre estar de bom humor e alegrar o ambiente. Sempre tem um conselho bem humorado nos momentos certos! Obrigado por toda a ajuda e paciência.

Um agradecimento especial à Valéria Aparecida Savagim. Na vida todas as etapas e momentos que passamos são difíceis, afinal se fosse fácil não teria graça alguma. Chegar em Botucatu sem conhecer ninguém e sem ter “nada” foi muito difícil, no entanto, sua ajuda foi essencial para tornar essa caminhada mais suave. Gostaria de agradecê-la, pois mesmo me conhecendo tão pouco, abriu as portas da sua casa e me ajuda de forma incondicional. Sempre me apoiou e esteve ao meu lado durante esses dois anos. Uma amiga que sempre vou levar no coração! Obrigado!

vi Às amigas Tatiane Giovanini, Érika Terra e Talita Raposo, pela amizade e pelos momentos de descontração. Pessoas especiais que conheci e que vou levar para toda a vida.

Aos funcionários e amigos do serviço de Patologia Cláudia, Diogo, Priscilla, Maury e Valéria, pela paciência e ajuda relacionada ao desenvolvimento dos nossos projetos. Obrigado pelos cafés da manhã, pelas conversas matinais e por sempre estarem dispostos a ajudar!

“A vida não exige das pessoas o que elas ainda não têm condições de dar.” (Zíbia Gasparetto)

viii SUMÁRIO RESUMO ... ix ABSTRACT... xi INTRODUÇÃO... 1 REVISÃO DE LITERATURA... 4 CAPÍTULO 1 Trabalho Científico... 14 DISCUSSÂO GERAL... 33 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 41

FONSECA-ALVES, C.E. Expressão de c-MYC, NKX3.1 e E-Caderina por Imuno-Histoquímica em Microarranjo de Tecido (TMA) de Lesões Pré-Neoplásicas e Pré-Neoplásicas na Próstata De Cães. Botucatu, 2013. 52p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho.

RESUMO

A próstata canina pode utilizada como modelo para estudo comparativo de afecções desta glândula no homem, constituindo as únicas espécies em que o carcinoma de próstata (CaP) se desenvolve espontaneamente. A próstata canina é sede de diversos processos patológicos que comumente acometem cães adultos e idosos. O papel do oncogene c-MYC e supressores tumorais NKX3.1 e E-caderina são bem estabelecidos no processo de carcinogênese da próstata humana, no entanto, não há pesquisas que relatem a expressão proteica dessas proteínas na progressão do CaP canino. Neste contexto, este estudo teve por objetivo avaliar a expressão proteica de c-MYC, NKX3.1 e E-caderina na próstata normal, com Hiperplasia Prostática Benigna (HPB), Atrofia Inflamatória Proliferativa (PIA) e CaP e avaliar o papel dessas proteínas no processo de gênese tumoral. O presente estudo foi realizado em uma plataforma de Microarranjo de Tecido (TMA) contendo diferentes lesões prostáticas. Foi realizada Imuno-histoquímica com os anticorpos c-MYC, NKX3.1 e E-caderina pelo método da peroxidase e DAB. A análise estatística foi realizada pelo teste de Qui-quadrado ou teste de Fischer para determinar associação entre as variáveis. A proteína c-MYC apresentou maior expressão no CaP e na PIA quando comparada com a próstata normal e com HPB (p= 0,0068). Observou-se maior número de amostras com ausência da expressão do NKX3.1 no CaP (94.75% ) e PIA (100%) quando comparando com a próstata normal e HPB (p=0,0022). Em relação a E-caderina houve maior número de amostras positivas na HPB e próstata normal quando comparado CaP e a PIA, no entanto sem diferença estatística. O processo de gênese tumoral na próstata canina esta associado com o aumento de expressão proteica do c-MYC e a perda da expressão proteica do NKX3.1.

x

FONSECA-ALVES, C.E. Imunohistochemistry evaluation of C-MYC, NKX3.1 and E-cadherin in tissue microarray (TMA) in pre-neoplastic and neoplastic lesions in canine prostate. Botucatu, 2013. 52p. Dissertação

(Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho.

ABSTRACT

The dog is the only species besides humans that develop spontaneous and naturally prostatic carcinoma (PCa) with high frequency. The canine model is primarily used for studies of molecular mechanisms of PCa and provides a natural animal model for studies of potential therapies. PCa in men presents C-MYC oncogene mutation and reduced E-cadherin and NKX3.1 protein expression. In this context our objective was to evaluate NKX3.1, C-MYC and E-cadherin expression in benign prostatic hyperplasia (BPH), prostatic inflammatory atrophy (PIA) and PCa in dogs and verify the role of these proteins in the progression to prostate cancer. A tissue microarray (TMA) slide was constructed and immunohistochemistry with antibodies C-MYC, NKX3.1 and E-cadherin was performed with peroxidase method and DAB. Chi-square or Fisher exact test was used to determine the association between the categorical variables. The evaluation of the C-MYC oncogene protein showed higher cytoplasmic positivity in canine PCa and PIA compared to BPH (p= 0.0068). We observed a decrease of NKX3.1 expression in 94.75% of PCa, 100% of PIA in comparison to BPH (p=0.0022). E-cadherin expression was higher in BPH and PIA in comparison to PCa, with no statistical difference. The carcinogenesis process of canine prostatic lesion may be related to gain of C-MYC and loss of NKX3.1.

INTRODUÇÃO

O câncer pode ser considerado uma consequência de alterações moleculares que conferem um fenótipo atípico, devido a múltiplas alterações no material genético de uma célula. Acomete pessoas em todo o mundo, sendo que, no ano de 2008, 7,6 milhões de pessoas morreram devido à doença (WHO, 2012). A incidência de câncer chega a ser três vezes maior nos países desenvolvidos (IARC, 2012), no entanto, 70% das mortes por câncer ocorrem em países subdesenvolvidos (UICC, 2012).

Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA) para o ano de 2012 eram esperados 60.180 novos casos de Carcinoma Prostático (CaP) no Brasil, classificado como a segunda causa de morte relacionada ao câncer em homens com mais de 50 anos de idade. A última estimativa mundial apontou um crescimento de 25 vezes na incidência do CaP, parte disso pode ser resultante da prática de rastreamento por meio do teste Antígeno Prostático Específico (PSA) (INCA, 2012).

Atualmente as principais modalidades terapêuticas disponíveis para o CaP andrógeno resistente em humanos são a cirurgia, quimioterapia e a radioterapia. Apesar dos inúmeros estudos envolvendo o CaP em humanos, não se obteve sucesso nos testes clínicos envolvendo terapias moleculares alvo dirigidas. O desenvolvimento bem sucedido de uma nova droga depende de vários estudos pré-clínicos rigorosos, e uma das fases mais importantes é a dos testes em modelos clínicos (GORDON & KHANNA, 2010). Os testes de medicamento in vitro são altamente controláveis, reprodutíveis e com custo relativamente baixo quando comparado a outros modelos, no entanto, esse modelo não consegue reproduzir características complexas dos tumores humanos. O uso dos cães como modelo para estudos clínicos de novas drogas pode trazer maior acurácia na resposta dos tumores as respectivas drogas testadas, partindo do pressuposto que o cão é um modelo natural da doença e divide o mesmo ambiente que o homem (GORDON & KHANNA, 2010).

O estudo de neoplasias esporádicas em modelos animais tem auxiliado nossa compreensão no desenvolvimento do câncer. Modelos animais demonstram ser úteis no estudo da oncogênese (MARTIN, 2001), de mecanismos moleculares de iniciação e promoção (LOECHLER et al., 2001),

2 angiogênese (NORRBY, 2006) e desenvolvimento de metástase (LOECHLER et al., 2001).

Para o estudo do CaP em homens há poucos modelos animais utilizados na prática experimental, considerando que a espécie canina é a única, além da humana, em que o carcinoma prostático ocorre de forma espontânea (BELL et al., 1991; BOSTWICK & QIAN, 2004). A manipulação genética de camundongos e ratos de laboratório forneceu uma série de modelos animais para o estudo da progressão do câncer a partir do estudo da neoplasia intraepitelial prostática (PIN) até o CaP invasivo, no entanto, tratam-se de modelos geneticamente modificados com o processo carcinogênico induzido, não retratando as alterações espontâneas que ocorrem no homem (Lamb & Zhang, 2005). O CaP canino compartilha muitas características com o de humanos, como a morfologia, presença concomitante de focos de PIN e metástases ósseas (BELL et al., 1991; BOSTWICK & QIAN, 2004).

Devido à elevada prevalência das alterações prostáticas na espécie canina e considerando as semelhanças entre a patogenia das afecções prostáticas no homem e no cão, estudos avaliando a carcinogênese prostática em cães são essenciais para definição das bases moleculares da doença e para definir o cão como modelo experimental ideal. Atualmente poucos estudos comparados são realizados, e as principais justificativas são a falta de informação sobre a doença no cão e o custo do cão como modelo experimental.

Frente a escassez de dados na literatura acerca do processo neoplásico da próstata do cão e a fim de verificar as semelhanças da doença prostática no cão e no homem, o presente trabalho teve o objetivo de avaliar, nas lesões prostáticas do cão, a expressão de importantes proteínas envolvidas no processo carcinogênico da próstata do homem.

Os objetivos específicos foram:

 Avaliar a expressão imuno-histoquímica do NKX3.1 em próstatas com a PIA e o CaP;

 Avaliar a expressão imuno-histoquímica do C-MYC em próstatas a PIA e o CaP;

 Avaliação a expressão imuno-histoquímica da E-caderina em próstatas comparar com a PIA e o CaP;

 Comparar as alterações de expressão proteica nas diferentes lesões prostáticas caninas e comparar com alterações descritas no homem.

REVISÃO DE LITERATURA

Anatomia

Histologia Prostática

Histologicamente, a próstata é formada por lóbulos e estes de ácinos glandulares sustentados por um estroma de tecido conjuntivo e musculatura lisa, envoltos por uma cápsula fibromuscular espessa (COTRAN et al., 2000). O epitélio glandular colunar muda para transicional nos ductos excretores que se abrem no interior da uretra. No parênquima prostático as células são de dois tipos, epitelial e estromal. As células epiteliais são colunares altas, com função secretória e células basais, precursoras de epitélio secretório. As células estromais compreendem os fibroblastos e células musculares lisas envolvidas em tecido colagenoso, vasos sanguíneos e nervos (BARSANTI & FINCO, 1992).

Hiperplasia Prostática Benigna (HPB)

A hiperplasia prostática benigna (HPB) ocorre em cães adultos e idosos, sendo considerada a alteração mais comum da próstata canina. Compreende aumento progressivo e induzido por hormônios, sendo que 100% dos cães adultos não castrados desenvolvem evidências histológicas de hiperplasia com o avançar da idade (Johnston et al., 2000).

As espécies canina e humana, com o decorrer da idade, desenvolvem HPB. No humano é um processo nodular que se origina na zona de transição, ocorrendo proliferação estromal em direção a uretra (VICHERAT, et al., 2003). Em contrapartida, no cão a HPB é um processo difuso em que há aumento do epitélio secretório de ácinos pré-existentes, com expansão centrípeta; a proliferação estromal nessa espécie ocorre na forma complexa da HPB (LOWSETH et al., 1990).

5 As hiperplasias podem ser classificadas em epitelial cística, epitelial papilífera e estromal, destacando que, em alguns casos, pode ocorrer associação entre essas. Para a classificação da hiperplasia estromal considera-se a proliferação do estroma fibroso ou muscular, associada, com frequência, à atrofia glandular e infiltrado inflamatório mononuclear. A forma epitelial cística ocorre quando o epitélio glandular cúbico se apresenta hiperplásico e com formação de grandes cavidades císticas. Já a hiperplasia epitelial papilífera caracteriza-se por múltiplas projeções digitiformes do epitélio glandular ao lúmen, com aumento do número de camadas de células secretoras (FONSECA-ALVES et al., 2010).

Atrofia Inflamatória Proliferativa (PIA)

No processo de carcinogênese prostáticas, algumas lesões pré-neoplásicas são estudadas devido ao seu potencial de progressão para o CaP, como a atrofia inflamatória proliferativa (proliferative inflammatory atrophy ou PIA), seja por similaridades morfológicas com o câncer ou por envolverem fatores potencialmente carcinogênicos (Toledo et al., 2010).

A PIA é uma alteração do epitélio glandular prostático que ocorre concomitante a diferentes graus de inflamação mononuclear intersticial adjacente, é uma lesão comumente observada na próstata humana (DE MARZO et al., 1999) e também descrita em cães (Toledo et al., 2010). A denominação PIA foi proposta por DE MARZO et al. (1999) para designar focos de epitélio glandular proliferativo com o aspecto morfológico de atrofia simples ou hiperplasia pós-atrófica, ocorrendo em associação à inflamação. Os mesmos autores explicam que apesar da proliferação, a lesão não cresce em volume devido a uma possível perda celular que compensa a proliferação. Além disso, esses autores acreditam que o epitélio em regeneração suprima a morte celular programada, ao menos temporariamente, para substituir as células perdidas, o que embasa o conceito de que a PIA é uma lesão regenerativa.

A PIA ocorre adjacente à HGPIN e/ou ao câncer e apresenta anormalidades genéticas semelhantes (Sugar, 2006; Karaivanov, 2007). A

PIA pode progredir para HGPIN e, subsequentemente, para carcinoma prostático (Tomas et al., 2007; De Marzo et al., 2007; Karaivanov et al., 2007).

A relação entre imunidade inata, inflamação e câncer é alvo de muitos estudos, no entanto, a maioria dos mecanismos moleculares e celulares que mediam essa relação não foram elucidados (Rodrigues, 2007). A hipótese para o desenvolvimento da PIA se relaciona com a produção de radicais livres tóxicos, células inflamatórias, responsáveis por causar danos teciduais e permanente lesão no DNA (Wagenlehner et al., 2007).

Neoplasia Prostática

Nos seres humanos e cães, o adenocarcinoma prostático é a neoplasia prostática mais comum. Nessas espécies, acomete indivíduos de meia idade a idosos, sendo que nos cães parece haver uma ocorrência maior de casos em animais de médio à grande porte (SWINNEY, 1998). O carcinoma prostático é clinicamente agressivo, apresentando frequentemente metástase em linfonodos regionais, pulmão e ossos (BELL et al., 1991). O carcinoma prostático nos cães compartilha várias características com o de humanos, como a morfologia, presença concomitante de focos de PIN e metástases pulmonares e ósseas (TESKE et al., 2002).

Alguns autores sugerem que a grande maioria dos casos ocorre em cães a partir de 8 anos de idade, em média de 8,9 anos (KARR et al., 1995). Na espécie humana a neoplasia prostática também é considerada uma doença senil, sendo responsável por mais de 50% de mortes em homens acima de 70 anos (ARMBRUSTER, 1993). A similaridade na patogenia do câncer prostático entre cães e humanos têm tornado a espécie canina modelo natural para estudo dessa afecção, apesar de neoplasias prostáticas não serem tão comuns em cães como o são no

7 homem, mas é uma lesão extremamente rara em qualquer outra espécie animal (LOWSETH et al., 1990; KARR et al., 1995).

Os sinais clínicos frequentemente encontrados são tenesmo e disúria, podendo ocorrer hematúria, anorexia e perda de peso (CORNELL et al., 2000). O prognóstico do paciente acometido pelo carcinoma prostático é desfavorável, pois não se utiliza marcadores bioquímicos como o PSA para detecção precoce, assim como no homem. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), as neoplasias prostáticas em cães são classificadas em 2 grupos: adenocarcinoma e carcinoma pouco diferenciado (OWEN, 1980). Os adenocarcinomas são classificados em intra-alveolar e acinar. Histologicamente os CaP caninos apresentam padrão intra-alveolar e morfologia heterogênea, cariando de pequenos focos de células bem diferenciadas a camada de células pouco diferenciadas (Leroy & Northrup, 2009). No homem o CaP é classificado de acordo com o grau de Gleason, que atribui diferentes escores aos CaPs de acordo com a diferenciação celular, no cão essa classificação não é utilizada (CORNELL et al., 2000).

Carcinogênese

A lesão genética não-letal constitui o cerne da carcinogênese. Essa alteração genética pode ser adquirida pela ação de determinados agentes ambientais, como substâncias químicas, radiação ou vírus, ou pode ser herdada na linhagem germinativa. A hipótese do câncer implica que a massa tumoral resulta de uma única célula progenitora que sofreu lesão genética (COTRAN et al., 2000).

Três classes de genes reguladoras normais constituem os principais alvos da lesão genética: proto-oncogenes (promotores de crescimento), os genes supressores do crescimento e genes que regulam a morte celular programada ou apoptose (FARIA & RABENHORST 2006). Os alelos mutantes dos proto-oncogenes são considerados dominantes, visto que transformam as células, a despeito da presença de seu equivalente normal. Por outro lado, ambos os alelos normais dos genes supressores tumorais devem ser lesados para que ocorra transformação,

de modo que essa família de genes é algumas vezes descrita como oncogenes recessivos. Os genes que regulam a apoptose podem ser dominantes, da mesma forma que os proto-oncogenes, ou podem comportar-se como genes supressores do câncer (CHEN, 2007).

A transformação neoplásica consiste num processo multifatorial no qual os controles normais da proliferação celular e da interação célula-célula são perdidos. A ativação aberrante dos proto-oncogenes em conjunto com a inibição não-regulada dos genes supressores tumorais representam os fundamentos desse processo. Mais de 100 genes já foram catalogados como pertencentes a essas categorias nos cânceres humanos, embora se estime que muitos outros ainda estão por ser identificados (GOVINDARAJAN et al., 2002).

Usualmente, um conjunto de alterações moleculares em diferentes níveis de regulação é responsável pelo estabelecimento do câncer, de modo que uma simples modificação numa célula normal raramente é suficiente para deflagrar o processo carcinogênico. Todavia, a alteração de alguns genes com papel central em múltiplos canais regulatórios revela o potencial impacto de uma única desordem molecular para a promoção da neoplasia (FARIA & RABENHORST 2006).

Gene C-MYC

O oncogene C-MYC é apontado como peça central no processo tumorigênico em diversas neoplasias humanas (FRANK et al., 2001). Recentes evidências reforçam a participação direta e indireta da proteína C-MYC na regulação do ciclo celular, diferenciação, metabolismo, crescimento celular, apoptose, instabilidade genômica, imortalidade e angiogênese (FARIA & RABENHORST 2006). Pesquisas estão sendo direcionadas para identificar os genes-alvo regulados pelo C-MYC e elucidar os mecanismos moleculares implicados na transformação neoplásica. O maior desafio, todavia, consiste no desenvolvimento de ferramentas capazes de modular a interação entre a proteína C-MYC e os seus alvos moleculares, desvendando potenciais estratégias terapêuticas (MADY et al., 2001)

9 O C-MYC é um dos genes envolvidos no processo de gênese tumoral. Localizado no cromossomo 8 (8q23-24) no homem, é um proto-oncogene que atua de forma complexa na carcinogênese humana, estando presente, nos processos de proliferação e crescimento celular e na apoptose (GARTE, 1993; LIU et al., 2004). Na regulação do ciclo celular, o C-MYC é necessário para progressão das células primárias da fase G1 para fase S. A indução da expressão do C-MYC estimula células quiescentes a atravessarem a fase G1 e entrarem na fase S. Além de possuir papel chave na transcrição G0/G1 para S, a expressão contínua em baixos níveis de C-MYC ao longo do ciclo celular sugere que este gene seja requerido também em outras fases (TELEPIS et al., 2003)

A ativação inadequada do gene C-MYC, que contribui para o desenvolvimento das neoplasias humanas, pode ocorrer por diferentes mecanismos: translocações cromossômicas, como verificado no linfoma de Burkitt, através da justaposição da região promotora do gene de cadeia pesada de imunoglobulina, altamente expressa em células B, ao lado do sítio gênico do C-MYC; amplificação gênica, pelo aumento do número de cópias do C-MYC e, consequentemente, de sua expressão; estímulo da transcrição gênica, como observado nos carcinomas do cólon; inserção de retrovírus adjacente ao gene C-MYC, ativando sua expressão via seqüências regulatórias virais, entre outros (RYAN & BIRNIE, 1996).

Os progressos obtidos no entendimento da regulação do gene C-MYC e na identificação dos seus "genes-alvo" evocam também a possibilidade da elaboração de estratégias direcionadas à manipulação das vias reguladas por esse gene em células neoplásicas (EISENMAN, 2001). Manobras moleculares realizadas in vitro, como o uso de RNA antisense em gliomas, já demonstraram a capacidade de inibição da expressão do C-MYC, suprimindo a atividade proliferativa dos tumores (BROADDUS et al., 1997). Outras vias passíveis de intervenção consistem nos diferentes níveis de regulação dos mecanismos de transcrição, tradução e ativação transcricional da oncoproteína C-MYC, bem como sua interação com o DNA e com outras proteínas reguladoras associadas (LUSCHER & EISENMAN, 1990)

A proteína C-MYC também apresenta importante papel na diferenciação celular. Demonstrou-se que a baixa expressão de C-MYC é acompanhada de diferenciação precoce e parada permanente do ciclo celular (CANELLES et al., 1997). Por outro lado, a expressão ectópica de C-MYC é suficiente para bloquear os mecanismos de diferenciação celular (ONCLERCQ et al., 1999).

As recentes evidências acerca do intrigante oncogene C-MYC reforçam sua atuação como modulador da transcrição gênica e apresentam sua participação em outros mecanismos potencialmente relevantes no processo tumorigênico (FARIA & RABENHORST, 2006). A identificação dos numerosos alvos gênicos do C-MYC, assim como a compreensão de suas complexas vias regulatórias configuram o desafio final na busca da sua completa elucidação.

A super expressão da proteína C-MYC é amplamente relatada em CaPs humanos. A amplificação do gene foi relatada em tumores metastáticos e refratários à ação hormonal (Yang et al., 2012). Em estudos recentes o ganho de C-MYC isoladamente foi associado ao desenvolvimento do PIN de alto grau, no entanto, essa alteração isolada não é suficiente para o desenvolvimento do CaP (Williams et al., 2005).

Yang et al. (2012) associaram a proteína C-MYC com a progressão do PIN para CaP agressivo mediado pela caveolina 1. O Gene C-MYC isoladamente foi responsável pelo desenvolvimento de PIN de alto grau e quando associado com a super expressão da caveolina 1 progrediu para CaP invasivo. Esses autores relataram o aumento da expressão do C-MYC como chave no desenvolvimento do CaP invasivo.

Em cães, não foram encontrados trabalhos na literatura avaliando a expressão do C-MYC em diferentes lesões prostáticas.

11 Gene NKX3.1

A oncogênese tem sido relacionada por vários pesquisadores com o desenvolvimento embrionário, já que ambos os processos são dependentes, de forma diferente, da proliferação e diferenciação celular (GRIER et al., 2005). Os genes do desenvolvimento embrionário, como os da família homeobox, aparecem como alvos interessantes de pesquisas científicas. Os genes membros da subfamília NK homeobox participam da organogênese e fisiologia de alguns tecidos, principalmente no sistema urogenital (SHEN & ABATE-SHEN, 2003).

O NKX3.1 é um gene de supressão tumoral localizada no lócus cromossômico 8p21.2 em humanos. A expressão proteica ocorre principalmente nas células epiteliais do lúmen prostático, possui uma estrutura tridimensional preservada devido a aminoácidos que se mantiveram conservados durante a evolução (GELMANN et al., 2002). Há intima relação entre a expressão de NKX3.1 e a regulação hormonal. Sabe-se que esse gene esta intimamente relacionado com a expressão androgênica, fato este comprovado em estudo anterior, onde animais castrados apresentaram menor expressão desta proteína gênica (SCIAVOLINO et al., 1997).

Nos estágios iniciais da embriogênese, o esclerótomo e células musculares lisas do endotélio vascular expressam NKX3.1; em fases posteriores ele se expressa especificadamente em células epiteliais prostáticas (GELMANN et al., 2002; SONG et al., 2009), constituindo um gene importante para desenvolvimento e funcionamento fisiológico da glândula. Alterações neste gene induzem defeitos na morfogênese ductal, na secreção de proteínas e contribui para carcinogênese prostática (KORKMAZ et al., 2004; ZHENG et al., 2006; ZHANG et al., 2008).

No processo de oncogênese prostática, estudos prévios constataram que o NKX3.1 não sofre mutações, ocorre inativação epigenética com a perda de expressão desta proteína, desencadeando assim alterações histológicas semelhantes a PIN. Alterações neste gene induzem defeitos na morfogênese ductal, na secreção de proteínas e contribui para carcinogênese prostática (STEADMAN et al., 2002).

O NKX3.1 é considerado um potencial marcador molecular para tumores prostáticos. Em humanos foi mapeado no cromossomo 8p21 e um estudo conduzido por Li e colaboradores (2002) demonstraram que 80% dos tumores prostáticos apresentam diminuição da expressão desse gene, levantando assim a hipótese do envolvimento do NKX3.1 na oncogênese.

E-caderina

O gene CDH1, em humanos, está localizado no braço longo do cromossomo 16 (16q22.1), sendo responsável pela codificação da proteína E-caderina. A proteína E-caderina é membro da família das caderinas, molécula de adesão intercelular dependente de cálcio (Takeichi, 1991), localizada na superfície basolateral das células epiteliais. O gene da E-caderina possui uma sequência codificadora que dá origem a um peptídeo de sinal de 27 aminoácidos (éxons 1 e 2), um peptídeoprecursor de154 aminoácidos (éxons 2 a 4) e uma proteína madura de 728 aminoácidos (Berx et al, 1998).

As caderinas têm um papel importante na determinação do fenótipo do tecido epitelial, sendo responsável pela regulação da migração e diferenciação celular. Na carcinogênese dos tecidos epiteliais as caderinas tem um importante papel relacionado com invasão de tecidos adjacentes e ao processo de metástase. Dentre elas, destaca-se a E-caderina que está relacionada a junções intercelulares (tipo aderente) do epitélio (PAREDES et al., 2001). O papel da E-caderina na progressão tumoral tem sido extensivamente estudado; os resultados disponíveis sugerem uma correlação entre a perda ou redução da E-caderina e a progressão neoplásica (PALACIOS et al., 1995).

Algumas neoplasias em humanos já foram relacionadas à perda completa ou parcial da expressão da E-caderina, dentre elas, carcinomas de pâncreas, mama (PARKIN et al., 2001), rim, fígado, estômago, tireóide, cólon, ovário e próstata (SAHA, et al., 2008), ocorrendo uma relação direta entre a diminuição da expressão e perda da diferenciação e menor sobrevida dos pacientes, sendo consideração assim por estes autores como potencial marcador prognóstico nestes tumores.

13 Em cães, alterações nos padrões de expressão da E-caderina foram relatados em tumores mamários (MATOS et al., 2006; Gama & Schmitt, 2012) e carcinoma de células escamosas (JOÃO et al., 2011). Nosso grupo de pesquisa realizou avaliação da E-caderina e β-catenina em tumores prostáticos caninos e encontramos perda da expressão dessas proteínas no CaP canino (dados não publicados). Não há outros trabalhos na literatura que relaram alterações nos padrões da E-caderina em tumores prostáticos caninos.

Assim a caracterização desses marcadores nas diferentes lesões prostáticas do cão é importante para definição das alterações significativas no desenvolvimento do CaP, consolidando o cão como modelo natural da doença no homem, além de contribuir o entendimento da progressão tumoral prostática em cães.

14

The role of C-MYC, NKX3.1 and E-cadherin in canine prostate

carcinogenesis process

C-MYC, NKX3.1 and E-Cadherin in canine prostatic pre neoplastic and neoplastic lesions

Carlos E. Fonseca-Alves1, Marcela M. P. Rodrigues2, Veridiana M. B. D. De Moura3 Silvia R. Rogatto4 and Renee Laufer-Amorim1*

1. Department of Veterinary Clinic, School of Veterinary Medicine and Animal Science, Univ. Estadual Paulista, Botucatu, SP, BRA.

2. Department of Anesthesiology, Botucatu Medical School, Univ. Estadual Paulista, Botucatu, SP, BRA.

3. Department of Veterinary Medicine, School of Veterinary and Zootechny, Federal University of Goias, Goiânia, Brazil.

4. Department of Urology, Botucatu Medical School, Univ. Estadual Paulista, Botucatu, SP, BR and International Center for Research (CIPE), AC Camargo Hospital, SP, BRA. Correspondence:

Renée Laufer Amorim

Department of Veterinary Clinic Univ. Estadual Paulista

Distrito de Rubião Jr. s/n Botucatu – Sao Paulo

Brazil. Postal Code: 18618-970 Tel. +551438802066

Fax: +55143811 6067

Email: renee@fmvz.unesp.br

This work was supported by a grant from the Foundation for Research Support of São Paulo – FAPESP (No 2010/13774-6 and No 2012/16068-0).

All authors listed meet the ICMJE authorship criteria and nobody who qualifies for authorship has been excluded.

Summary

The canis lupus familiaris is the only species besides humans that develop spontaneous and naturally prostatic carcinoma (PCa) with high frequency. The canine model is primarily used for studies of molecular mechanisms of PCa and provides a natural animal model for studies of potential therapies. PCa in men presents C-MYC oncogene mutation and reduced E-cadherin and NKX3.1 protein expression. In this context the objective of the study was to evaluate NKX3.1, C-MYC and E-cadherin expression in normal prostate, hyperplastic (BPH), prostatic inflammatory atrophy (PIA) and PCa in dogs and verify the role of these proteins in the progression to prostate cancer. A tissue microarray (TMA) slide was constructed and immunohistochemistry with antibodies C-MYC, NKX3.1, E-cadherin and p63 was performed with peroxidase method and DAB. Chi-square or Fisher exact test was used to determine the association between the categorical variables. The evaluation of the C-MYC oncogene protein showed higher cytoplasmic positivity in canine PCa and PIA compared to normal prostate (p= 0.0068). It was observed a decrease of NKX3.1 expression in 94.75% of PCa, 100% of PIA in comparison to normal prostate (p=0.0022). E-cadherin expression was higher in normal prostate and PIA in comparison to PCa, with no statistical difference. Immunohistochemistry p63 positive basal cells were more frequent in PCa and PIA when compared to normal prostate (p=0.0002). The carcinogenesis process of canine prostatic tissue may be related to basal cells proliferation, gain of C-MYC and loss of NKX3.1 protein expression.

Keywords: dog, prostatic carcinoma, immunohistochemistry, protein expression.

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Introduction

Cancer is a major public health problem in many parts of the world. 241.740 new cases of prostate cancer in men are estimated in the United States for the year 2012 (Siegel et al. 2012). The latest global estimate of PCa incidence showed an increase rate, what may be due to the use of prostate specific antigen (PSA) exam as a routine procedure. PCa is the most common tumor in men and is a rapidly growing cause of morbidity and mortality in the Western world (Leroy et al. 2004).

The study of spontaneous tumors in animal models has furthered our understanding of the pathogenesis, development, angiogenesis and progression of cancer (Leroy et al. 2009). Animal models of prostate cancer are critically important for defining the molecular basis of the disease elucidate the biology of tumor progression, mechanisms of metastasis and develop of effective treatment strategies (Winter et al. 2003; Costa et al. 2012). However, until recently few animal models for PCa existed, in part, because of the complexity of the carcinogenesis process and our relative inability to recapitulate these changes through genetic manipulation (Dolores et al. 2005). The dog is the only species besides humans that develop spontaneous and naturally PCa with high frequency (Winter et al. 2003). The canine model is primarily used for studies of initiation and promotion molecular mechanisms in PCa and provides a natural animal model for studies of potential therapies (Dolores et al. 2005).

Beyond animal models, several techniques have been developed in recent years for the best study of cancer. Among these techniques the tissue microarray (TMA) is the most used (Rimm et al. 2001). TMA is a method of relocating tissue from conventional histologic paraffin blocks simultaneously in a single histological section. Commonly the technique of TMA is employed for the study of prostatic disease in man and the evaluation method most used in slide TMA is immunohistochemistry (Rimm et al. 2001).

PCa in men has strong correlation between C-MYC oncogene mutation and CDH1 and NKX3.1 epigenetic silencing. C-MYC is an oncogene that encodes the C-MYC transcription factor and physiologically is broadly express during embryogenesis process (Pelengaris et al. 2002). NKX3.1 is a homeodomain protein correlated with the development of the normal prostate. Loss of this protein has been suggested to play a role in progression of preneoplastic lesions (Gallucci et al. 2009). E-cadherin is a cell adhesion molecule used to monitor the epithelial phenotype and its loss is suggestive of epithelial-mesenchymal transition (Mani et al. 2008).

In humans, elevated levels of the C-MYC transcripts was detected in 87% of PCa, and was significantly increased when compared to normal and non-neoplastic prostatic tissue (Song et al. 2009; Iwata et al 2010). The role of C-MYC protein in PCa is controversial, with reports of decrease protein expression (Williams et al. 2005) or C-MYC higher levels (Koh et al. 2010) in human PCa. In the human prostate, there is compelling evidence that deregulation of C-MYC gene is involved in tumorigenesis. It also has been suggested that C-MYC deregulation contributes to the progression of prostate

18 carcinoma. C-MYC gene amplification was identified in 30–50% of PCa in human specimens (Williams et al. 2005).

NKX3.1 expression in human prostate lesions showed a decrease of this protein in intra prostatic neoplasia (PIN) foci and total loss in metastatic PCa. NKX3.1 protein expression is diminished in human PCa, and the loss of NKX3.1 correlates with disease progression (Song et al. 2009).

On progression to PCa, tumoral cells acquire qualities that enable them to invade neighboring tissues and metastasize (Gupta et al. 2006) and the loss of E-cadherin is important in this context (Rubin et al. 2001). In human cancer, loss of E-cadherin expression can be caused by chromosomal deletions, proteolytic cleavage, somatic mutations and, ultimately, silencing of the CDH1 promoter (Onder et al. 2008).

There is no information about the role of C-MYC, NKX3.1 and E-cadherin in canine prostate tissue and the role of these oncogenes and tumor suppressor proteins in the prostatic carcinogenic process. Since these proteins have an important role in prostatic carcinogenic process in humans, the objective of this study was to evaluate NKX3, C-MYC and E-cadherin protein expression in proliferative, pre-neoplastic and neoplastic prostatic lesions in dogs, using tissue microarray technique.

Material and Methods Subjects

A total of 63 prostatic tissues from dogs (aged 1–15 years of pure or mixed breeds) were taken from the archives of the Veterinary Pathology Service, Univ Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP, Brazil and

the School of Veterinary Medicine, Federal University of Goiás (UFG), Goiania, Brazil. HE slides were reviewed for the histological diagnosis that was established by three pathologists, at the same time in a multi-head microscope. The diagnosis was made according to literature for BPH (FONSECA-ALVES et al. 2010), PCa (Foster et al. 2007) and PIA (Toledo et al. 2010).

From each slide, the more representative area of the lesion (BPH, PIA and PCa) was circumscribed and arrayed in a TMA slide, containing 149 samples. This technique was developed using the equipment Tissue Microarrayer (Beencher Instruments, Silver Spring, USA). The TMA slide was composed of 19 PCa, 22 PIA and 18 BPH and 4 normal prostatic tissue. Each lesion corresponded one animal.

Among prostatic samples, 29 had one sample represented in the TMA, 17 patients had samples in duplicate, 11 patients had samples in triplicate and 10 patients had more than four samples, with the same diagnosis. Only one core, with the worst result (higher C-MYC expression, lower NKX3.1 and E-cadherin expression) for each protein was considered.

Sections (3 μm) were cut and distended on to specific glass slides for TMA (Fischerbrand-Color Frost™; Fischer Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania) and were kept at −20°C until used for immunohistochemistry (IHC). Two slides were used for HE stain (first and last slide) to confirm the diagnosis. Primary antibody p63 was used to evaluate the basal cells layer integrity.

Immunohistochemistry stain

The immunohistochemical staining was performed using peroxidase method and DAB. Four slides were dewaxed in xylol and rehydrated in graded

20 ethanol. For antigen retrieval the slides were incubated in citrate buffer (pH 6.0) for 30 s in a pressure cooker (Pascal®; Dako, Carpinteria, CA, USA). The sections were treated with freshly prepared 3% hydrogen peroxide in methanol for 20 min to inhibit endogenous peroxidase activity and washed in Tris-buffered saline.

The primary antibodies, C-MYC (anti-human monoclonal mouse, Neomarkers, Fremont, CA, USA), NKX3.1 (anti-human polyclonal rabbit, Abcam, Cambridge, UK), E-cadherin (anti-human monoclonal rabbit, , Leica Microsystems, Bretton, Peterborough, UK) and p63 (anti-human monoclonal mouse, Dako, Carpenteria, CA, USA) were applied at dilutions of 1:100, 1:25, 1:50 and 1:250, respectively, at 4°C, overnight. A Polymer system (Advance, Dako, Carpenteria, CA, USA) was applied as the secondary antibody with peroxidase.

After each step of the process, the slides were rinsed with Tris-buffered saline. The slides were developed with 3´-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB+, Dako, Carpenteria, CA, USA) for 5 min and counterstained with Harris haematoxylin. Negative controls were performed for all antibodies by omitting the primary antibody and replacing by Tris-buffered saline. Staining of Burkitt's human lymphoma was used as positive control for C-MYC expression, normal prostate was used a positive control for NKX3.1 and E-cadherin and canine prostate (known positive) used as positive control for p63 expression.

The percentage of C-MYC, E-Cadherin and p63 positive cells per lesion was evaluated in scores: score 1: <25%, 2: 26% to 50%, 3: 51% to75% and 4: >76% positive cells (Table1). For NKX3.1 the result was recorded as positive or negative cytoplasmic staining. The results from the immunohistochemical

staining were interpreted and recorded by two of the collaborators on this study, at the same time.

Table 1: Evaluation and immunolocalization of primary antibody used in canine prostate lesions in tissue microarray slide.

Primary antibody Evaluation immunolocalization

C-MYC Extent Cytoplasmic

NKX3.1 positive or negative Cytoplasmic

E-caderina Extent Membranous

P63 Extent Nuclear

Statistical analysis

The Chi-square or Fisher exact test was used to determine the association between the categorical variables using GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Statistical significance was defined as p<0.05.

Results

The percentage of the immunohistochemistry score in the lesions studied, for each antibody, is summarized in table 2. The evaluation of C-MYC oncogene (Figure 1A) showed higher cytoplasmic positivity in PCa (Figure 1E) and PIA (Figure 1C) compared to BPH (Figure 1A) (p= 0.0068). There was a higher number of samples with C-MYC positive in PIA when compared to BPH (p= 0.0095).

22

Table 2. C-MYC, E-cadherin, p63 and NKX3.1 protein expression results in canine prostatic lesions.

SCORE BPH PIA PCa N P

1 16.65% 0.00% 0.00% 75% C-MYC 2 22.35% 0.00% 0.00% 25% P=0.0068 3 5.55% 4.5% 0.00% 0.00% 4 55.55% 95.5% 100% 0.00% 1 6.25% 14.25% 27.75% 0.00% E-cadherin 2 12.5% 7.20% 16.70% 25% P>0.05 3 6.25% 21.40% 11.10% 25% 4 75% 57.20% 44.45% 50% 1 72.30% 0.00% 22.20% 25% P63 2 13.85% 12.50% 11.10% 50% p=0.0002 3 13.85% 25.00% 55.60% 25% 4 0.00% 62.50% 11.10% 0.00% NKX3.1 P 81.25% 0.00% 5.25% 100% p=0.0022 N 18.50% 100% 94.75% 0.00%

BPH – Benign prostic Hyperplasia; PIA- Prostic inflammatory atrophy; PCa – prostatic adenocarcinoma; N – Normal prostate

1: less than 25% of positive cells; 2: 26-50% of positive cells; 3: 51-75% of positive cells; 4:>76% of positive cells

P: positive immunostaining; N: negative immunostaining

An interesting finding was a positive C-MYC cytoplasmic staining of PCa (Figure 1F) and PIA basal cells and stromal cells, in 31.6% (6/19) of the tumors and 63.6% (14/22) PIA (Figure 1D), in contrast, there was no staining of basal and stromal cells in BPH lesions (0/18) (Figure 1B).

For the tumor suppressor NKX3.1 protein the cytoplasmic staining was considered, as positive and negative. Normal prostate and BPH had higher

number of positive samples, PIA have no one positive sample and PCa presented 5,25% of positive samples. PIA samples showed lower number of positive cases for NKX3.1 protein when compared to normal prostate (p=0.0005) and PCa had lower number of positive cells than normal prostate (p=0.0025).

E-cadherin expression had no statistical difference among diagnosis, but we found a higher number of positive cases, with more than 51% of positive immunostaining in BPH (Figure 1A). and PIA (Figure 1C) (81.25% and 78.60% of the cases, respectively) than in PCa (55.55% of the cases) (Figure 1E).

Concerning the p63 protein, we found higher number of cases with more than 75% of positive basal cells in PCa (Figure 1F) and PIA (Figure 1D) when compared to BPH (p=0.0002) (Figure 1B).

Discussion

The prostate is of high importance for human disease due to the increasing incidence of BPH and PCa with the progression of age (Fonseca-Alves et al. 2012). The canine prostate also is an organ with great importance, since 100% of the adult dogs have histopathological evidence of prostatic diseases (Fonseca-Alves et al. 2010).

In canine prostatic lesions there are no reports of C-MYC protein expression, although immunohistochemical expression of C-MYC protein has already been assessed in canine mammary tumors (Inouea et al. 1999). We found some nuclear C-MYC staining but only in a few cases of PCa that had concomitant PIN foci. In humans there is controversial data of the importance of C-MYC immunostaining location (cytoplasmicXnuclear). Royuela et al. (2000)

24 showed higher cytoplasmic staining in human BPH and PCa. Previously, other authors [Gurel et al. 2008; Prowatke et al. 2007) described higher nuclear C-MYC staining in PCa. We found an increase cytoplasmic C-C-MYC expression in canine PCa as described in humans (Prowatke et al. 2007). These authors hypothesized that the increased expression of C-MYC in human prostate tumors promotes cellular proliferation and changes the apoptotic pathways. Gurel et al. (2008) correlated nuclear C-MYC overexpression in high grade PIN (HGPIN), the premalignant stage of human prostate cancer, with the transition of HGPIN to PCa. We also observed nuclear C-MYC staining in HGPIN foci in dogs, but we only had 5 HGPIN foci, concomitant to PCa and this low number of HGPIN don’t allow us to conclude the role of this immunostainng. An interesting finding in our study was that basal cell in PCa samples showed strong nuclear staining. This fact has not been reported in the literature before in humans or dogs.

NKX3.1 is a homeobox gene located on chromosome 8p21 in men and located on chromosome 25 in dogs. NKX3.1 is a prostate-specific protein and has potent growth-suppressing and differentiating effects on prostatic epithelium. Our data showed that NKX3.1 expression was lost in PIA and in most of the PCa. The few PCa samples that were positive to NKX3.1 (5.25% of the cases) can be correlated to the stage of carcinoma progression, as suggested by Gallucci et al. (2009). Some authors suggest that the loss of NKX3.1 is an early event in prostatic carcinogenic process, resulting in pre neoplastic lesions and subsequent genetic events are necessary for the carcinogenic process (Voeller et al. 1997; Bhatia-Gaur et al. 1999; Nelson et al. 2003). Ellowood-Yen et al. (2003) suggested that loss of NKX3.1 associated

with C-MYC increased expression could promote pre neoplastic prostatic lesion in men (PIN) to PCa. Our results indicate the same, that loss of NKX3.1 protein and increase of C-MYC expression are involved in canine prostatic carcinogenesis process, in the same manner as in men.

E-cadherin expression had no statistical difference among prostatic lesions in dog, but fewer PCa had higher E-cadherin scores when compared to BPH and PIA. E-cadherin expression is dynamic (Mani et al. 2008) throw cell life, so a neoplastic cell can lose E-cadherin expression and gain it again (Saha et al. 2008). Also to enter the cell cycle, the cell must lose this protein (Nowak et al.2007), what could have happened in proliferating PCa cells and not in resting cancer cells. Our results showed a tendency to decrease this cell adhesion protein in prostatic tumor. In our experience, prostatic tumors in dogs are less aggressive than in men, so this also could explain the higher presence of E-cadherin in our PCa samples.

We performed p63 protein immunohistochemical to assess the integrity of the basal cell layer in canine PCa (Arcolino et al. 2010). Canine PCa presented 42.85% of samples with basal cells staining, PIA presented 72.27% and BPH presented 16.66%.In human, basal cells in normal, BPH and PIA tissue selectively express p63 in their nuclei demonstrating basal cell layer integrity but in PCa cells, in both primary and metastatic lesions, lack expression of this protein (Parsons et al. 2001). Furthermore, p63 immunostaining is potentially useful to facilitate the pathologic diagnosis of human PCa. In dogs, there are few studies evaluating the integrity of the basal cell layer in PCa. Rossignol et al (Rossignol et al. 2009) described that the basal cell layer of canine prostatic tissue is normally discontinuous. From our

26 experience the basal cell layer is not continuous in dogs, so this is not a good indicator for dog prostatic lesions, as in men.

BPH and PIA in dogs had fewer samples with higher p63 scores than PCa. This must be due to the normal discontinuity of basal cell layer observed in canine prostate. PCa in dogs can be originated from the basal cells (66.70% of PCa had more than 51% of p63 positive cells) as described by Grisanzio & Signoretti (2008). Matsuzaki et al. (2010) found a higher percentage of p63 positive cells in PIN foci in dogs, suggesting a role for basal cells and possibly steam cells in the origin of PIN.

Some canine PCa can originate from the basal cells, as described by Leav et al. (2001). Their findings indicate that two biologically distinct populations of basal cells may exist in the canine prostate. From these findings we conclude that the basal cells plays an important role in the development of PCa in dogs and certain types of carcinoma may be related with C-MYC expression of the basal cells, as shown by us.

Conclusion

The carcinogenesis process regarding prostatic epithelial cells in dogs showed a strong cytoplasmic C-MYC increased protein expression associated with concomitant loss of the suppressor protein NKX3.1. Immunohistochemical staining of p63 cells in pre-neoplastic lesion and prostate carcinoma may indicate the involvement of basal cells in these lesions in dogs.

The authors declare that they have no competing interests.This study was approved by the Ethics Committee on Animal Experiments of the Veterinary Medical School, Univ. Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP, Brazil.

Acknowledgments

The authors acknowledge funding from the Foundation for Research Support of São Paulo – FAPESP (Proc. 2010/13774-6 and Proc. 2012/16068-0).

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4. DISCUSSÃO GERAL

O cão é descrito como modelo natural ideal para o estudo do CaP em humanos, no entanto, na prática esse modelo é pouco utilizado. Dentre os principais fatores estão à distância entre as metodologias das pesquisas realizadas no homem e no cão. Na literatura humana há inúmeros estudos nas bases de dados internacionais, avaliando diversos marcadores prognósticos, preditivos e diagnósticos com diversas técnicas moleculares avançadas, enquanto para o CaP canino há um reduzido número de estudos, e estes avaliam somente marcadores diagnósticos isolados principalmente por técnicas de expressão proteica. Assim temos um grande número de informações sobre a doença no homem, enquanto no cão pouco se conhece.

Outro fator importante é o custo das pesquisas que utilizam o cão como modelo, devido ao ciclo de vida mais longo que camundongos e ratos. Assim há um custo maior na manutenção dos animais. No entanto, essas pesquisas utilizam os mesmos de forma experimental em laboratórios, o que elimina a fator ambiente no desenvolvimento das lesões prostáticas que apresenta grande importância na gênese tumoral. Considerando esse cenário, um modelo natural ideal estaria relacionado com cães da rotina clínico-cirurgica de hospitais veterinários vinculados a instituições de pesquisa e ensino. Utilizando assim animais da rotina clínica, mantidos com seus proprietários participando de estudos clínicos devidamente aprovados por comitês de ética.

O CaP canino é considerado raro pela literatura internacional, limitando assim o uso deste modelo. No entanto, o nosso grupo de pesquisa apresenta um alto índice de diagnósticos de CaP em amostras prostáticas caninas. Inicialmente consideramos a possibilidade de um erro diagnóstico ao considerar as amostras como carcinoma, no entanto, buscamos confirmar nossos diagnósticos com a ajuda de renomados patologistas humanos (Prof Dr. João Lauro e Prof Dr. Athanase Billis) que apresentam grande experiência em avaliação de amostras prostáticas humanas, além de associarmos o diagnóstico histopatológico com a avaliação imuno-histoquímica das amostras, obtendo uma acurácia maior nos diagnósticos. Outra conduta importante foi a realização da técnica de hibridização genômica comparativa (CGHarray), nas