i AGRADECIME TOS
O meu reconhecimento a todos aqueles que de uma forma contribuíram para a realização deste trabalho. Porem não posso deixar de referenciar, os que mais de perto colaboraram.
Ao Professor Doutor Pedro Vitor Lemos Cravo, Professor Auxiliar do Instituto de Higiene e Medicina Tropical e membro do Centro de Malária e Outras Doenças Tropicais (CMDT-LA), orientador deste dissertação, agradeço a confiança depositada no meu trabalho, todo o apoio e sua permanente disponibilidade no esclarecimento de dúvidas e generosidade muito me tem ensinado, os quais foram fundamentais na execução deste trabalho.
À Doutora Ana Paula Arez, Investigadora do Instituto de Higiene e Medicina Tropical e membro do CMDT-LA, que Co-orientou esta dissertação, pela paciência, apoio e ensinamentos que dispensou, o meu muito obrigado.
Ao Professor Doutor Virgílio E. do Rosário, Professor Catedrático do Instituto de Higiene e Medicina Tropical e Director da UEI Malária e membro do CMDT-LA, agradeço por ter acedido fazer parte da Comissão tutorial, a sua disponibilidade incondicional ao longo deste trabalho, pelo apoio e facilidades prestadas na execussão deste trabalho.
À Professora Doutora Maria Amélia Afonso Grácio, Professora Catedrática do Instituto de Higiene e Medicina Tropical e Directora da UEI Helmintologia e Malacologia Médica, a minha gratidão pela gentileza com que me acolheu no Curso de Mestrado e Doutoramento.
Ao Professor Doutor Benjamim de Araújo Corte Real, Reitor da Universidade Nacional de Timor Lorosae, não posso deixar de expressar o meu profundo agradecimento pelo apoio decisivo na concorrência da bolsa de estudo.
Ao Ministério de Saúde da RDTL, pessoal técnico do laboratório nos seis Distritos: Díli, Liquiça, Suai, Same, Viqueque e Lospalos, testemunha o meu agradecimento pela autorização e colaboração prestada na colheita das amostras utilizada neste estudo.
Ao Professor Doutor João Cancio Freitas, Ministro de Educação da RDTL, o meu sincero agradecimento pelo apoio na extensão da bolsa nos ultimos seis meses.
À Drª Maria Teresa Abrantes Pereira Bettencourte Ávila, pelo estímulo e apoio nas fases difíceis desde a minha chegada a Portugal até à realização deste curso e pela generosidade à minha família, quero aproveitar para expressar o meu vivo agradecimento.
A todo a equipa do CMDT-L, o meu agradecimento, pela sã convivência, pelo ajuda e pela amizade que me sempre dedicaram.
Devo ainda uma palavra de agradecimento a todos aqueles que, embora não referenciados, contribuíram directa e indirectamente, para a concretização deste trabalho. A todos os colegas e amigos da Universidade Nacional de Timor Lorosae (UNTL) que estiveram comigo em Lisboa, pelo apoio ao nível pessoal, agradeço o estímulo e a amizade demonstrada.
Aos meus pais, Augusto (Falecido) e Agostinha, expresso a minha profunda gratidão POR TUDO, sem os quais nada na minha vida teria sido possível.
Aos meus familiares, irmãos e amigos, pelo amizade, incentivo e paciência com que me acompanharam nesta caminhada. Muito obrigado.
Aos meus filhos, Anacleto e Ana Patrícia, pelo pai ausente que posso ter sido pela forma como me dediquei este trabalho de Doutoramento.
À minha mulher (Anastasia), pela paciência, atenção, força, estímulo e carinho demonstrado desde os primeiros tempos difíceis em Portugal até a concretização deste trabalho. A ela devo a execução mais esta etapa da minha vida.
Finalmente, à FU DAÇÃO CALOUSTE GULBE KIA , testemunho o meu agradecimento pela atribuição da bolsa de Doutoramento.
iii PUBLICAÇÕES
A partir do conjunto de resultados, apresentados nesta dissertação, foram efectuadas apresentações em congressos e foram publicados os seguintes artigos científicos:
de Almeida, A, Arez, AP., Cravo, P., do Rosario, VE.. 2009. Analysis of genetic mutations associated with anti-malarial drug resistance in Plasmodium falciparum from the Democratic Republic of East Timor. Malar J, 8: 59.
de Almeida, A, Arez, AP., Cravo, P., do Rosario, VE.. 2006. Estudos Epidemiológicos e Resistência aos Antimalaricos em Timor Leste. X Congresso
Português de Parasitologia. Instituto de Higiene e Medicina Tropical, 23 - 24 de
Novembro de 2006 em Lisboa.
de Almeida, A, Arez, AP., do Rosario, VE., Cravo, P. 2008. Epidemiologia da Malária e Resistência aos anti-malaricos em Timor Leste. I Congresso de Ciências
SUMÁRIO
A malária constitui um grave problema de saúde pública na República Democrática de Timor Leste (RDTL), caracterizada por ser uma doença endémica em todos os distritos, com as mais elevadas taxas de mortalidade e morbilidade nas crianças e mulheres grávidas. Desde a independência em 2002, o número de casos da malária tem vindo a aumentar e a inexistência de dados epidemiológicos e poucos estudos ligados à resistência aos antimaláricos alertaram para a necessidade de actualizar o conhecimento da situação, com o objectivo de fomentar uma política de intervenção no domínio da vigilância e controlo da malária no país. Deste modo, este trabalho teve como finalidade avaliar a frequência da malária em cada distrito estudado, identificar e caracterizar os factores causais da sua distribuição e os diversos factores socio-económicos envolvidos na transmissão e determinar a prevalência de mutações nos genes pfcrt, pfmdr1, pfdhfr, pfdhps em Plasmodium
falciparum e pvdhfr e pfdhps em Plasmodium vivax, responsáveis pela resistência aos
fármacos oficialmente em uso no país.
Neste contexto, foi efectuado um estudo epidemiológico onde foram colhidas amostras sanguíneas por Busca Passiva (BP) nos Hospitais/Clínicas e Busca Activa (BA) em domicílios individuais, distribuídos por seis distritos da RDTL, nos quais se pesquisou posteriormente a presença dos parasitas P. falciparum e P. vivax, recorrendo as duas técnicas laboratoriais distintas: microscopia óptica e Polymerase
Chain Reaction (PCR).
Relativamente aos resultados obtidos no levantamento epidemiológico, a frequência e a distribuição da malária observada na população traduzem uma prevalência de 25,8% (112/434, na BP) e 5,1% (11/216, na BA), tendo-se observado maior prevalência nos grupos etários com menos de 14 anos de idade em relação aos indivíduos com idade superior ou igual aos 15 anos de idade. Verificou-se maior predomínio de infecção no sexo masculino relativamente ao sexo feminino.Adicionalmente, confirmou-se que várias características socio-económicas estão associadas à ocorrência de malária, tais como: tipo e condições precárias de habitação, criação de animais junto das habitações, trabalho/ocupação que expõe mais ao contacto com o mosquito vector. Por outro lado, os indivíduos que não utilizam redes mosquiteiras como protecção têm maior probabilidade de se
v
encontrarem infectados. A proporção dos indivíduos com infecção da malária entre as zonas de residência foi analisada e comparada, não tendo sido demonstradas diferenças significativas, o que possibilitaria acções semelhantes a implementar para o controlo da malária no País.
No que respeita à pesquisa de mutações em genes de plasmódio previamente apontados como moduladores de fármaco-resistência, foram detectadas elevadas prevalências de alelos mutantes em ambas as espécies, P. falciparum e P. vivax, sugerindo que a resistência pode ser igualmente prevalente. Neste âmbito, realça-se a observação de que um grande número de amostras de P. falciparum (82,5%) era portador de 4 mutações distribuídas pelos genes dhfr e dhps, padrão este previamente associado à falência terapêutica com sulfadoxina-pirimetamina (SP). Adicionalmente, demonstrou-se a existência da mutação pfcrt K76T, associada à resistência à cloroquina, em todos os isolados analisados, demonstrando que a mesma atingiu a fixação. Relativamente às amostras de P. vivax, a prevalência dos alelos mutantes 58R e 117N no gene pvdhfr foi de 79% e 81,6%, respectivamente, enquanto que 73,7% dos parasitas continham ambas mutações em simultâneo (“duplos mutantes”). Colectivamente, conclui-se que utilização continuada dos fármacos cloroquina e SP poderá contribuir para o contínuo aumento de mutações nos genes supracitados e consequente ineficácia clínica dos mesmos no tratamento do Plasmodium falciparum e Plamodium vivax.
Em conclusão, a detecção da prevalência dos polimorfismos genéticos de resistência constitui uma ferramenta acessória de fármaco vigilância e a identificação de características sócio-economicos envolvidas na transmissão da malária permitirá a elaboração e implementação de campanhas melhoradas de prevenção e/ou controlo da malária na RDTL.
ABSTRACT
Malaria is one of the Democratic Republic of East Timor (DRET) major public health problems. This disease is endemic in all districts, with the highest morbidity and mortality rates reported in children and pregnant women. Since the country’s independence in 2002, the number of malaria cases has increased and the absence of epidemiological data and few studies linked to antimalarial resistance highlighted the need to update knowledge on the situation, with the objective of stimulating improved intervention policies, towards better drug surveillance and malaria control. Under this circumstances, the objectives of this study were to evaluate malaria frequency in each district studied, to identify and to characterize the casual factors of its distribution and the several socio-economics factors involved in its transmission and to determine the prevalence of mutations in the pfcrt, pfmdr1,
pfdhfr, pfdhps genes of P. falciparum and the pvdhfr and pfdhps genes in P. vivax,
previously involved in resistance to the drugs in official use in the country.
In this context, blood sample collections were carried out by Passive Case Detection (PCD) in hospitals/clinics or Active Case Detection (ACD) in individual households, distributed among six districts of the RDTL. Each sample was inspected for presence of P. falciparum and P. vivax parasites through two different experimental approaches: optical microscopy and Polymerase Chain Reaction. The epidemiological survey for frequency and malaria distribution in the population demonstrated a prevalence of 25,8% (112/434) and 5,1% (11/216), using PCD and ACD, respectively. Higher malaria prevalence occurred in the age groups of less than 14 years of age in relation to individuals with age equal or above 15 years. Additionally, malarial infection was shown to be more predominant in males than in females. Several socio-economic parameters were associated to malaria occurrence, such as: type and precarious household conditions, animal keeping near households and type of work/occupation more prone to mosquito vector exposure. Also, individuals that didn't use protective bed-nets were shown to have a higher probability of being infected. The proportion of malaria-infected individuals among different geographical areas was analyzed and compared, but no significant differences were detected. This scenario should facilitate the implementation of a
vii
global malaria control in the Country based on similar measures for the different regions.
Inspection of mutations in plasmodium genes previously proposed as drug response modulators, highlighted high prevalence of mutant alleles in both P.
falciparum and P. vivax, suggesting that in vivo resistance may be equally prevalent.
In this context, it is noted that a high percentage of P. falciparum isolates (82.5%) carried 4 mutations distributed among the dhfr and dhps genes, known to be directly related to sulphadoxine + pyrimethamine (SP) treatment failure. Additionally, it was demonstrated that the pfcrt K76T mutation, associated to chloroquine resistance, was present in all isolates analyzed, demonstrating that it has reached fixation. For P.
vivax, the prevalence of mutations in the pvdhfr gene was of 79% and 81.6% for the
for 58R, 117N alleles, respectively, whilst 73.7% of the samples harboured both mutation in simultaneous (“double mutants”) Collectively, it may be conjectured that that the constant use of SP and chloroquine will contribute to the continuous increase of mutations in the above-mentioned genes and consequent clinical inefficacy of these drugs in the treatment of P. falciparum and P. vivax.
In conclusion, assessing the prevalence of genetic polymorphisms associated to drug resistance can be used as an accessory tool for drug surveillance, and the identification of socio-economic factors involved in malaria transmission will allow the elaboration and implementation of improved malaria control and/or prevention campaigns in the DRET.
LISTA DE ABREVIATURAS
ACT : Artmisinin-based combination therapy AQ : Amodiaquina
BSA : Albumina de soro bovino
CMDT : Centro de Malária e Outras Doenças Tropicais CQ : Cloroquina
DDT : Dicloro Difenil Tricloroetano
DHFR-TS : Dihdrofolato redutase-timidilato sintetase
DHF : Dihidrofolato
dNTP : 3’-desoxinucleósida-5’-triposfato dTMP : Timidina monofosfato
dUMP : urasina monofosfato
DHFR : Dihidrofolato reductase
DHPS : Dihidropteroato sintetase
DNA : Ácido desoxirribonucleico EDTA : Ácido etilenodinitrilotetracético Hb : Hemoglobina FP IX : Ferriprotoporfina IX GPx : Glutatião peroxidase GSH : Glutatião GSSG : Glutatião oxidado GR : Glutatião reductase GTP : Guanosina trifosfato
GPD : Glico fosfato desidrogenase
γGCS
: γ glutamilcisteinil sintetase GSSH : Dissulfito de glutatião GST : Glutationa S-transferase HAL : Halofantrina HMS : Hexose monofosfato HZ : HemozoínaIHMT : Instituto de Higiene e Medicina Tropical ITNs : Insecticide-treated mosquito nets kDa : Kilo dalton
m-THF : metil-Tetrahidrofolato MgCl2 : Cloreto de magnésio
MDR : Multi drug resistance mil : mililitro min : Minutos MO : Microscopia Óptica MEF : Mefloquina mg : miligrama N : Número
ix
NADPH : Nicotinamida adenina dinucléotido fosfato (forma reduzida) NGOs : Organizações não governamentais
nM : Nanomolar
OMS : Organização Mundial de Saúde
P : valor da significância estatística pABA : Ácido p-aminobenzóico
pb : Pares de bases
PBS : Phosphate buffered saline (Tampão fosfato)
PCR : Reacção de polimerização em cadeia (Polimerase Chain Reaction)
pfcrt : Gene Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter
Pf DHFR : Plasmodium falciparum dihdrofolato redutase
Pf DHPS : Plasmodium falciparum dihdropteroato sintetase
pfMDR1 : Gene Plasmodium falciparum multidrug resistance 1
PG : Proguanil
PRIM : Primaquina
Pv DHFR : Plasmodium vivax dihdrofolato redutase
Pv DHPS : Plasmodium vivax dihdropteroato sintetase
p/v : Peso/volume Pyr : Pirimetamina; QUIN : Quinino
RDTL : República Democrática de Timor Leste RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SHMT : Serina hidroximetiltransferase
SDS : Dodecil sulfato de sódio SDX : Sulfadoxina
S-P : Sulfadoxina-Pirimetamina (Fansidar®) SNP : Single nucleotide polymorphism
Tag : ADN polimerase de Thermus aquaticus
TBE : Tampão constituído por Tris, ácido bórico e EDTA TE : Tampão de eluição constituído por Tris EDTA THF : Tetrahidrofolato
Tris : Tris (hidroximetil) aminometano TS : Timidilato sintetase
U : Unidade de actividade enzimática UEI : Unidade de Investigação e Ensino UNL : Universidade Nova de Lisboa
UNTAET : Administração Transitória das Nações Unidas em Timor Leste UV : Ultra violeta
V : Volt
v/v : Volume/volume
Aminoácidos e seus símbolos: A : Alanina (Ala) C : Cisteina (Cys) E : Glutamina (Glu) F : Fenilalamina (Phe) I : Isoleusina (Ile) G : Glisina (Gly) K : Lisina (Lys) L : Leucina (Leu) N : Asparagina (Asn) P : Prolina (Pro) R : Arginina (Arg) S : Serina (Ser) T : Threonina (Thr) Y : Tirosina (Tyr)
xi Í DICE GERAL Agradecimentos i Publicações iii Sumário iv Abstract vi Lista de Abreviaturas Índice geral viii xi
Índice de Figuras xvii
Índice de Tabelas xix
I. I TRODUÇÃO
I.1. Plasmodium spp 1
I.1.1. Ciclo de vida 1
I.1.2. Plasmodium falciparum 4
I.1.3. Plasmodium vivax 5
I.2. Vector da malária – Anopheles sp 6
I.3. Epidemiologia da malária 6
I.3.1. Distribuição geográfica 6
I.3.2. Factores de transmissão 8
I.3.3. Classificação da endemicidade 8
I.4. Controlo da Malária 11
I.5. Antimaláricos 13
I.5.1. A Resistência aos Antimaláricos 16
I.5.2. Epidemiologia e Distribuição de resistência 17
I.5.3. Multiresistência 20
I.6. Modo de acção e mecanismo de resistência aos antimaláricos 22
I.6.1. Cloroquina 22
I.6.2. Amodiaquina 27
I.6.3. Quinino e Mefloquina 28
I.6.4. Sulfadoxina-Pirimetamina (FANSIDAR®) 31
I.6.4.1. Modo de acção da Sulfadoxina-Pirimetamina em P. falciparum e P.
vivax 31
I.6.4.1.1. Resistência do P. falciparum à Sulfadoxina-Pirimetamina 33 I.6.4.1.2. Resistência do P. vivax à Sulfadoxina-Pirimetamina 35
I.7. A malária e Resistência aos Antimaláricos em Timor Leste 38
I.8. Objectivos 44
II. MATERIAL E MÉTODOS
II.1. Material biológico 45
II.1.1. Isolados de Plasmodium 45
II.1.2. Mosquitos 45
II.1.3. Clones de referência utilizado neste trabalho 45
II.1.4. Analise Genética 46
II.1.4.1. Genes Analisados 46
II. 2. Métodos 47
II.2.1. Área de Estudo e Período de Colheita 47
II.2.2. Características Gerais das Áreas Estudadas 48
II.2.2.1. Situação Geográfica 48
II.2.2.2. Situação Climática e Ambiental 49
II.2.2.3. Aspectos Demográficos 51
xiii
II.3. População Estudada 53
II.4. Colheita das Amostras 54
II.4.1. Amostras Sanguíneas 54
II.4.2. Mosquitos 54
II.5. Detecção e Identificação de Parasitas 57
II.5.1. Microscopia Óptica 57
II.5.2. Obtenção do ADN 57
II.5.2.1. Método de extracção com Fenol/Fenol-Clorofórmio 57
II.5.2.2. Método de extracção com Chelex (Resina) 58
II.5.3. PCR - Polymerase Chain Reaction 59
II.5.4. Electroforese em gel de agarose 60
II.6. Detecção das Mutações nos genes de P. falciparum e P. vivax. 61
II.6.1. Amplificação de DNA por PCR 61
II.6.2. Detecção dos Polimorfismos por PCR-RFLP 62
II.6.3. Visualização dos produtos de amplificação e da restrição em gel de
agarose 64
II.7. Análise estatística 64
II.7.1. Estatística Descritivas 64
II.7.2. Teste do Qui-Quadrado (
χ
2) 64II.7.3. “Odds ratio” 67
II.7.4. “Software” utilizado 67
III. RESULTADOS
III.1. Estudo epidemiológico da malária nos humanos e nos mosquitos,
III.1.1. Características da População Estudada. 69
III.1.2. Características da habitação. 73
III.1.3. Detecção e Identificação do Parasita nos humanos. 74
III.1.4. Prevalência de infecção por busca passiva e activa na população humana 76
III.1.5. Factores de risco de infecção por malária. 78
III.1.6. Detecção e Identificação do Parasita nos Mosquitos. 81
III.2. Pesquisa de polimorfismos genéticos de P. falciparum e sua prevalência 83
III.2.1. Gene Pfmdr1 83
III.2.2. Gene Pfcrt 85
III.2.3. Gene Pfdhfr 88
III.2.4. Gene Pfdhps 91
III.2.5. Mutações Múltiplas no gene pfdhf e pfdhps 94
III.2.6. Gene y-GCS (y-glutamil-cisteinil sintetase) 94
III.3. Pesquisa de polimorfismos genéticos de P. vivax e sua prevalência 96
III.3.1. Gene Pvdhfr 96
III.3.2. Gene Pvdhps 99
xv IV. DISCUSSÃO
IV.1. A malária nos humanos e factores socioeconómicos associados 102 IV.1.2. Infecção dos mosquitos por P. falciparum e P. vivax 109
IV. 2. Pesquisa de Polimorfismo genéticos de P. falciparum 111 IV.2.1. Pesquisa de polimorfismo de tamanho no gene pfygcs 117
IV.3. Pesquisa de Polimorfismo genéticos de P. vivax 117
IV.4. Multiplicidade da infecção malárica 121
V. CO SIDERAÇÕES FI AIS 122
V
V
VIIII.. AA EEXXOOSS
A EXO 1. Autorização do estudo pelo Ministério de Saúde. 164
A EXO 2a, b. Questionário 165
A EXO 3. Tabela: Condição de amplificação e sequências dos “primers”, utilizadas na 1ª. e 2ª. Reacção pela técnica de PCR para identificação de P.
falciparum e P. vivax em amostras de 6 distritos provenientes da República
Democrática de Timor Leste. 167
A EXO 4. Tabela: Sequências dos primers e condições de PCR, para
amplificação dos fragmentos dos genes pfcrt, pfmdr1, pfdhfr, pfdhps e pfyGCS. 168 A EXO 5. Tabela: Sequências dos primers e condições de PCR, para
amplificação dos fragmentos dos genes pvdhfr e pvdhps. 170 A EXO 6. Tabela: Resultados da análise dos polimorfismos nos isolados de P.
falciarum, pesquisados por PCR ou PCR-RFLP. 171
A EXO 7. Tabela: Resultados da análise dos polimorfismos de gene pfmdr1,
Pfcrt, Pfdhfr e Pfdhps, bem como as frequências alélicas relativos aos codões
em estudo. 173
A EXO 8. Tabela: Mutações múltiplas entre codões no gene Pfdhfr e Pfdhps. 174 A EXO 9. Tabela: Resultados da análise dos polimorfismos nos isolados de P.
vivax, pesquisados por PCR ou PCR-RFLP. 175
A EXO 10. Tabela: Resultados da análise dos polimorfismos de gene pvdhfr e
Pvdhps, bem como as frequências alélicas relativos aos codões em estudo. 177
A EXO 11. Tabela: Mutações múltiplas entre codões estudados no gene
Pvdhfr.
178
V
xvii Í DICE DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida dos parasitas causadores da malária que infectam o
homem. 3
Figura 2. Mapa da distribuição geográfica da malária. 7 Figura 3. Mapa da distribuição geográfica da resistência de P. falciparum aos
antimaláricos. 19
Figura 4. Esquema representativo do mecanismo de acção da cloroquina. 24 Figura 5. Esquema representativo da via metabólica afectada pela acção da
Sulfadoxina-Pirimetamina. 32
Figura 6. Representação gráfica dos casos de malária (incluindo casos clínicos)
entre 2000- 2006. 40
Figura 7. Mapa de Timor Leste e Localidades do estudo. 48 Figura 8. Distinção entre o género Anopheles e Culex. 55
Figura 9. Esquema do plano experimental. 56
Figura 10. Esquemática da amplificação específica obtida por nested – PCR do
gene ssrRNA para identificação das duas espécies P. falciparum e P. vivax. 60 Figura 11. Distribuição dos inquiridos por níveis de escolaridade. 70 Figura 12. Distribuição dos inquiridos por tipo de trabalho. 71 Figura 13. Gel de agarose 2% com resultados de PCR para identificação de P.
falciparum e P. vivax nos humanos. 75
Figura 14. Relação entre prevalência de infecção, tipo de casas, com/sem
abertura e criação dos animais. 81
Figura 15. Gel de agarose 2% com resultados de PCR para identificação de P.
falciparum e P. vivax nos mosquitos. 82
Figura 16. Géis de agarose 3% com resultados típicos de PCR-RFLP para
identificação de polimorfismos no gene pfmdr1. 84
Figura 17. Prevalência dos polimorfismos no gene pfmdr1. 85 Figura 18. Géis de agarose 3% com resultados típicos de PCR-RFLP para
Figura 19. Prevalência dos polimorfismos no gene pfcrt. 88 Figura 20. Géis de agarose 3% com resultados típicos de PCR-RFLP para
identificação de polimorfismos no gene pfdhfr. 89-90
Figura 21. Prevalência dos polimorfismos no gene pfdhfr. 91 Figura 22. Géis de agarose 3% com resultados típicos de PCR-RFLP para
identificação de polimorfismos no gene pfdhps. 92
Figura 23. Prevalência dos polimorfismos no gene pfdhps. 93 Figura 24. Mutações múltiplas entre codões no gene Pfdhfr e Pfdhps 94 Figura 25. Gel agarose 3% com resultados da pesquisa do polimorfismo de
tamanho do gene Y-GCS. 95
Figura 26. Géis de agarose 3% com resultados típicos de PCR-RFLP para identificação de polimorfismos no gene pvdhfr.
Figura 27. Resultados da análise dos polimorfismos de gene pvdhfr, bem como as frequências alélicas relativos aos codões em estudo.
96-97
98 Figura 28. Géis de agarose 3% com resultados típicos de PCR-RFLP para
identificação de polimorfismos no gene pvdhps. 99
Figura 29. Resultados da análise dos polimorfismos de gene pvdhps, bem como
as frequências alélicas relativos aos codões em estudo. 100 Figura 30. Mutações múltiplas entre codões estudados no gene Pvdhfr. 102
xix Í DICE DE TABELAS
Tabela 1. Classificação da endemicidade da malária com base no Índice Esplénico (aumento do baço) ou da Taxa Parasitária em crianças dos 2 aos 9
anos de idade. 10
Tabela 2. Actuação dos fármacos de acordo com classes de antimaláricos em
diferentes estágios do ciclo de vida de P. falciparum 15 Tabela 3. Marcadores moleculares de resistência em P. falciparum e P. vivax e
sua associação com resistência clínica (in vivo). 22
Tabela 4. Clones de referência utilizados como controlo no estudo. 46
Tabela 5. Genes analisados no presente estudo 47
Tabela 6. Informações acerca de PCR-RFLP para detecção dos SNPs em P.
falciparum e P. vivax. 63
Tabela 7. Distribuição das amostras sanguíneas colhidas por BP e BA e
mosquitos capturados nos 6 distritos. 69
Tabela 8. Distribuição das amostras por sexo, grupos etário, tipo de trabalho,
nível de educação e uso/sem rede de mosquiteiras. 72
Tabela 9. Representação percentual das características de habitação. 74 Tabela 10. Prevalência de infecção detectada por MO e PCR. 75 Tabela 11. Prevalência de infecção por busca e por grupo etário. 77 Tabela 12. Prevalência de infecção por distritos, zonas de residência, tipos de
