Macrófago: biologia, diversidade e função

Macrófago: Biologia, Diversidade e Função

Universidade Fernando Pessoa Porto

Emília Maria dos Santos Ferreira Trindade Neves

Macrófago: Biologia, Diversidade e Função

Universidade Fernando Pessoa Porto

Emília Maria dos Santos Ferreira Trindade Neves

Macrófago: Biologia, Diversidade e Função

Assinatura:

Trabalho apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas

Sumário:

O macrófago é uma importante célula do sistema imunitário, proveniente da linhagem mieloide do sistema hematopoiético, tendo como percursor o monócito. Tem capacidade fagocítica estando envolvida na eliminação de células/partículas estranhas ao organismo. Esta célula encontra-se largamente distribuída pelo organismo, tomando diferentes designações de acordo com o local que ocupa, podendo apresentar diferentes fenótipos, dependentes da sua via de ativação, resultando em diferentes propriedades. O macrófago tem um importante papel na patogénese de algumas doenças, podendo ser estimulador ou inibidor da patologia. A presente revisão pretende fazer uma abordagem sobre as propriedades e funções relacionadas com este importante tipo celular, bem como sobre o seu papel em diferentes patologias.

Abstract:

Macrophages are important cells of the immune system, resulting from the myeloid lineage of the hematopoietic system, having monocytes as precursors. Macrophages show phagocytic capacity and are involved in eliminating foreign cells/particles. These cells are widely distributed throughout the body, having different designations according to the body site occupied. Macrophages may present different phenotypes, dependent upon its activation pathway, resulting in different properties. Macrophages have an important role in pathogenesis and may have either a stimulatory or inhibitory role in pathology. This revision aims to address some characteristics and functions of this important cell type, as well as its role in different pathologies.

Dedicatórias:

Queria agradecer todo o apoio e disponibilidade da minha orientadora a professora Amélia Assunção, que se mostrou sempre disponível, para me ajudar e me orientar durante todo o período de elaboração desta tese de dissertação.

Quero também agradecer a todos os meus professores que durante a minha vida académica me ajudaram a desenvolver os meus conhecimentos.

Índice

I. Introdução... 1

II. Pressupostos Históricos ... 4

III. Células fagocíticas... 5

IV. Hematopoiese ... 6 V. O Monócito ... 8 VI. Os Macrófagos ... 10 1. Estrutura intracelular ... 10 2. Recetores de superfície ... 10 3. Diversidade Fenotípica ... 14

VII. Função dos macrófagos ... 17

1. Fagocitose ... 17

2. Apoptose ... 18

4. Interação com a imunidade adaptativa ... 20

a) Imunidade inata e adaptativa ... 20

b) Papel do macrófago na interação com a imunidade adaptativa ... 21

VII. Relação com parasitas intracelulares... 21

1. Leishmania ... 22

2. M. Tuberculosis ... 23

3. Vírus da imunodeficiencia humana ... 24

1. Cancro ... 28

2. Doenças autoimunes ... 34

3. Associação com aterosclerose ... 36

IX. Conclusão ... 40

Índice de Figuras:

Figura 1-Metchickoff e os seus desenhos ... 5

Figura 2-O macrófago e os seus percursores ... 7

Figura 3-Diferenças estruturais entre monócitos e macrófagos ... 9

Figura 4- Os diferentes membros da família de recetores toll-like ... 12

Figura 5-Famílias de recetores SR e outros funcionalmente relacionados ... 13

Figura 6-Via clássica de ativação ... 15

Figura 7-Subtipos de macrófagos M2 ... 16

Figura 8-O equilíbrio entre macrófagos M1 e M2 ... 17

Figura 9- A Importância da remoção de neutrófilos... 19

Figura 10- O ciclo de vida da leishmânia ... 23

Figura 11-Transmissão do Nef às células B ... 25

Figura 12--Subtipos macrofágicos e a sua relação com diferentes doenças... 28

Figura 13- O TAM e as suas ações promotoras do crescimento tumoral ... 31

Figura 14- O TAM e as suas ações contra o desenvolvimento tumoral ... 33

Índice de Tabelas:

Tabela 1-Exemplos de macrófagos tecidulares e suas diversas designações………2 Tabela 2-Os diferentes fenótipos de macrófagos e os seus estímulos………...16

I. Introdução

O macrófago é uma importante célula do sistema imunológico que participa na imunidade inata e condiciona a adaptativa, através da fagocitose de partículas estranhas ao hospedeiro, da sua função de apresentação de antigénios, da sua ação microbicida (Elomaa et al., 1998) e da sua capacidade de produzir mediadores que interferem na função imunológica (de la Torre et al., 2008). É uma célula que tem associadas propriedades como a mobilidade, a promoção da citotoxicidade (Geissmann et al., 2010) e a elevada capacidade biossintética (Appelberg, 2005), permitindo a secreção de uma vasta gama de citocinas (pequenas proteínas secretadas que promovem a comunicação célula-célula e podem atuar sobre o seu crescimento e diferenciação (Geissmann et al., 2010)), fatores de crescimento, lisozimas, proteases, componentes do complemento, fatores de coagulação e prostaglandinas (Woods et al., 2000). Desde a descoberta da sua finalidade na segunda metade do século XIX, o papel destas células tem-se vindo a revelar (Metchnikoff, 1989).

Os macrófagos são células hematopoiéticas fagocíticas proveniente da medula óssea, através da linhagem mieloide/fagocítica mononuclear, tendo como percursores os monócitos que circulam temporariamente na corrente sanguínea e que migram depois para os tecidos, onde se diferenciam (Appelberg, 2005). Apesar de muitas vezes os monócitos e os macrófagos serem considerados como um único tipo celular devido às suas muitas semelhanças, estas apresentam também diferenças das quais se destacam a potência da atividade fagocítica e o tamanho, tendo o macrófago, relativamente ao monócito, uma proporção maior e uma atividade fagocítica mais elevada, dependente do seu fenótipo (Pacheco e Cardoso, 2012).

Os macrófagos são importantes para assegurar um normal funcionamento do hospedeiro através do controlo dos processos inflamatórios (podendo inibi-los ou promovê-los), do desenvolvimento de tecidos e da sua cicatrização, bem como da morfogénese óssea (de la Torre et al., 2008; Epelman et al., 2014). Todas as ações desempenhadas pelos macrófagos encontram-se dependentes de sinais específicos, tais como condições de hipoxia, certos lípidos e citocinas (Woods et al., 2000).

Apesar da sua importância, a ação dos macrófagos pode ter também um importante impacto no agravamento de certas patologias uma vez que alguns fenótipos promovem a angiogénese (importante no desenvolvimento de tumores) e a geração de tecido adiposo

(relacionada com a obesidade) podendo, no entanto, ter também uma ação anti-tumoral (Pollard, 2004; Obeid et al., 2010).

Os macrófagos podem ser encontrados numa grande variedade de organismos,incluindo organismos multicelulares mais primitivos (Pacheco e Cardoso, 2012) e encontram-se amplamente distribuídos por quase todos os tecidos do organismo, estando presentes, nomeadamente, na medula óssea, no sangue, nos tecidos linfoides, no fígado e nos pulmões, adquirindo diferentes particularidades dependentes do microambiente tecidular onde se encontram (Zellforsch et al., 2012). Consoante os tecidos que ocupam podem tomar diferentes designações (tabela 1) (Obeid et al., 2010). A sua migração para os tecidos pode ser aumentada por estímulos inflamatórios, especialmente das quimiocinas geradas localmente por mecanismos humorais e celulares (Taylor et al., 2005; Shi e Pamer, 2011; Koppensteiner et al., 2012).

Tabela 1- Exemplos de macrófagos tecidulares e suas diversas designações (tabela adaptada de(Obeid et al., 2010)

Compartimento Designação

Pulmões Macrófagos alveolares

Fígado Células de Kupffer

Rins Células Mesenquiais

Sistema Nervoso Células Microgliais

Tecido conjuntivo Histiócitos

A função dos macrófagos está adaptada aos tecidos onde reside. Assim, as células de Kupffer presentes no fígado contribuem para a regeneração hepática após lesão, enquanto que as células de Langerhans na pele são células sentinela importantes mediando a vigilância imunológica. Os osteoclastos mediam a morfogênese óssea, a microglia presente no cérebro apoia o desenvolvimento e a manutenção de redes neuronais (Kedzierska e Crowe, 2014) e os macrófagos intestinais (órgão que constitui o maior reservatório destas células no organismo humano) são essenciais para a manutenção da mucosa, para a sua homeostasia face ao microbiota, para a renovação epitelial. Os macrófagos intestinais são também importantes componentes da imunidade protetora, encontrando-se envolvidos na patologia da doença inflamatória do intestino, quando a sua função está comprometida (Bain e Mowat, 2014).

O tempo de vida desta célula é muito variável, dependendo das suas funções imunológicas e da sua localização no tecido (Shi e Pamer, 2011), tendo os macrófagos inflamatórios, uma duração mais reduzida de apenas alguns dias, enquanto, os macrófagos alveolares e as células da microglia, podem apresentar uma duração que pode atingir anos (Koppensteiner et al., 2012). O objetivo desta tese de dissertação é realizar uma revisão bibliográfica relativa aos principais aspetos da origem, diversidade e biologia dos macrófagos. Serão igualmente consideradas a grande diversidade de funções que este fagócito apresenta no sistema imunitário e a sua relação com algumas doenças das mais diversas etiologias.

Esta revisão foi alvo de grande motivação, uma vez que é relativa a uma importante célula do sistema imunitário que contribui para o perfeito funcionamento deste sistema. Para desenvolvimento desta revisão foi necessário realizar uma recolha exaustiva de dados provenientes, principalmente, de artigos científicos e livros que incidem sobre a temática descrita, utilizando fontes fidedignas e mais recentes.

II. Pressupostos Históricos

Os macrófagos começaram a ser descritos na segunda metade do seculo XIX, quando Elie Metchnikoff, um zoologista de nacionalidade russa (Pacheco, 2012), constatou durante as suas observações a larvas de estrelas-do-mar, que estas continham umas células que apresentavam um importante papel na luta contra microrganismos que as invadissem (Appelberg, 2005; Pacheco, 2012).

As células que Metchnikoff observou eram dotadas de capacidade de ingestão de partículas, nomeadamente infecciosas, tendo-as então denominado de micrófagos e macrófagos, de acordo com o seu tamanho (Pacheco, 2012).

Com estas observações Metchnikoff formulou uma nova teoria, baseada na capacidade dos macrófagos ingerirem partículas estranhas, mecanismo denominado de fagocitose. A sua teoria, batizada de teoria celular da imunidade, foi comprovada quando introduziu numa das suas larvas um espinho de roseira, verificando que após esta invasão o espinho ficou rodeado por macrófagos (Pacheco, 2012).

Na Figura 1, que representa Metchnickoff e os desenhos que este realizou para descrever as suas observações, podemos ver macrófagos rodeados por patogénios e também patogénios no interior dos macrófagos. Estas observações permitiram-lhe deduzir que os macrófagos tinham algum papel no sistema imune e que estes participavam ativamente na eliminação de partículas estranhas ao hospedeiro.

Metchnikoff verificou ainda que estas células fagocíticas se encontravam distribuídas no sistema circulatório e linfático e tinham a capacidade de migrarem para locais de inflamação, podendo também se encontrar fixas num local (Metchnikoff, 1989; Appelberg, 2005).

Figura 1-Metchickoff e os seus desenhos (figura adaptada de (Kaufmann, 2008))

Apesar de inicialmente esta teoria ter criado controvérsia por parte da comunidade científica, mais tarde foi aceite juntamente com a teoria humoral da imunidade, que tinha sido formulada anos antes por Paul Ehrlich e que era a teoria aceite nesse período (Pacheco, 2012). Ambas as teorias acabavam por se complementar (Metchnikoff, 1989; Kaufmann, 2008).

III. Células fagocíticas

Atualmente consideram-se quatro tipos de células fagocíticas, os monócitos, os macrófagos, as células dendríticas e os neutrófilos. Todas removem as células mortas, tecidos e partículas estranhas ao hospedeiro por sua incorporação e digestão (Strauss, 2010; Pacheco e Cardoso, 2012).

Os neutrófilos encontram-se no sangue periférico, embora a maior parte (90%) esteja em estreita relação com o revestimento endotelial dos vasos, podendo assim desta forma migrar facilmente para o espaço extravascular, atravessando o endotélio sempre que seja atraído por agentes químicos gerados nos focos da inflamação (Strauss, 2010). Além da sua função fagocítica, possuem mecanismos antimicrobianos muito eficazes, mas são células de vida curta, sobrevivendo apenas algumas horas. Os monócitos circulam igualmente no sangue periférico, onde para além da função fagocítica desempenham importantes funções fisiológicas, das quais se destaca a sua capacidade de se diferenciarem em macrófagos ou células dendríticas ao migrarem para os tecidos (Appelberg, 2005; Cardoso, 2012). Quer os macrófagos, quer as células dendríticas são

células de vida mais longa e desempenham a função da apresentação de antigénio aos linfócitos T, sendo designadas de células apresentadoras de antigénio (APC). A atividade das células fagocíticas é um fator primário dos mecanismos de defesa do hospedeiro, sendo a ação dos fagócitos controlada pelo sistema imunológico, nomeadamente pelos linfócitos T, uma vez que, como referido acima, aqueles possuem uma grande variedade de recetores à sua superfície, capazes de interagir com diferentes ligandos (Schindl et al., 2006).

IV. Hematopoiese

Os macrófagos são um importante componente do sistema reticuloendotelial e têm a sua origem em órgãos hematopoiéticos, como o saco vitelino, a medula óssea e também o baço. Após o nascimento, a sua formação ocorre na medula óssea (Appelberg, 2005). As células do sistema hematopoiético apresentam um tempo de vida relativamente curto, sendo necessária uma reposição continua, garantida pelas células estaminais hematopoiéticas (Appelberg, 2005). Estas tem a capacidade de se renovarem e de originarem todos os tipos celulares, diferenciando-se num dado tipo celular quando convenientemente estimuladas, sendo por isso também designadas de células estaminais hematopoiéticas pluripotentes. Na medula óssea, o equilíbrio entre a auto renovação e a diferenciação celular tem de ser mantido (Domen et al., 2011).

As células estaminais hematopoiéticas dão origem a células progenitoras multipotentes antes de se diferenciarem e se subdividirem em células progenitoras mieloides e células progenitoras linfoides (Domen et al., 2011). A diferenciação é orientada por uma vasta rede de fatores de crescimento e citocinas (Rodtke et al., 2013).

As duas linhagens celulares específicas, a linfoide e a mieloide, dão origem a células linfoides e mieloides, respetivamente, ocorrendo em paralelo a sua diferenciação (Douce et al., 2010; Domen et al., 2011).

Assim, os macrófagos e monócitos derivam de um tipo de célula estaminal hematopoiética (Domen et al., 2011), que dá igualmente origem às células dendríticas, sendo a sua diferenciação dependente de TNF-α ("tumor necrosis factor-alpha") (Ryncarz e Anasetti, 1998; Geissmann et al., 2010; Ley et al., 2011) (Perdiguero e Geissmann, 2013).

O precursor linfoide pode dar origem às células B na própria medula óssea, mas pode também originar células T imaturas, que migram para o timo, onde vão ser sujeitas a um processo de seleção e maturação (Appelberg, 2005; Pacheco e Cardoso, 2012). O precursor mieloide dá origem à linhagem fagocítica-mononuclear, tendo como primeiro tipo celular os monoblastos. A sua divisão, com consequente diferenciação, origina promonócitos e posteriormente monócitos que são libertados para a corrente sanguínea, onde circulam temporariamente até migrarem para os tecidos, diferenciando-se aí em células dendríticas ou macrófagos, como se pode ver na figura 2 (Douce et al., 2010; Rodtke et al., 2013). A diferenciação em monócitos ocorre em resposta a citocinas hematopoiéticas, tais como a IL-3 (interleucina-3), GM-CSF ("granulocyte-macrophage colony-stimulating factor"), M-CSF ("macrophage colony-stimulating factor"), IL-1, IL-6 e TNF- entre outras (Rodtke et al., 2013). O fator de transcrição mieloide (PU.1) é necessário para os primeiros passos de compromisso da linhagem mieloide das células estaminais hematopoiéticas e a sua ausência resulta em deficiência desta linhagem (Douce et al., 2010; Geissmann et al., 2010; Bain e Mowat, 2014).

Figura 2-O macrófago e os seus percursores (figura adaptada de (King e Goodell, 2011))

Em algumas situações excecionais, a diferenciação ocorre quase exclusivamente durante o desenvolvimento embrionário, como no caso dos macrófagos da microglia, que são diferenciados a partir do saco vitelino (Epelman et al., 2014)

V. O Monócito

O monócito é, normalmente, a maior população de células brancas do sangue periférico, apresentando limites irregulares, com um núcleo igualmente irregular, muitas vezes lobulado, podendo o seu citoplasma ser vacuolizado. Comparativamente ao macrófago apresenta uma dimensão mais reduzida e ausência de expressão de CCR2 ("C-C chemokine receptor type 2") e L-seletinas, sendo contudo superior a expressão de recetores de quimiocinas e integrinas. Os monócitos são libertados da médula óssea para a corrente circulatória e linfática, quando estimulados por estímulos inflamatórios e imunológicos (Bain e Mowat, 2014).

Os monócitos são heterogéneos, podendo ser divididos em três subtipos baseados nos seus marcadores de superfície, especificamente os recetores CD14 e CD16 (Straus-Ayeli et al., 2007). Cada subtipo exibe funções específicas, diferindo entre si relativamente ao seu tamanho, tráfego, expressão de recetores imunes e capacidade de se diferenciarem quando estimulados. Apresentam também um papel distinto na fisiopatologia de determinadas doenças (Taylor et al., 2005; Shi e Pamer, 2011). Assim, temos os monócitos inflamatórios clássicos, com alta expressão de CD14 e baixa de CD16 (CD14++CD16-) que são equipados por um conjunto de recetores TLR e que expressam genes envolvidos na angiogénese, na cicatrização de feridas, e na coagulação (Hallam e Hagemann, 2012; Yang et al., 2014). Os monócitos inflamatórios não clássicos, também designados de pro-inflamatórios, apresentam uma expressão reduzida de CD14 e uma alta expressão de CD16, que leva a que produzam baixos nível de IL-10 (Straus-Ayeli et al., 2007). Os monócitos intermédios expressam largamente ambos os recetores, tendo associada uma reduzida capacidade fagocítica, uma vez que apresentam baixa expressão de citocinas pró-inflamatórias (Hallam e Hagemann, 2012; Yang et al., 2014). Os subtipos inflamatórios são valiosos biomarcadores para doenças inflamatórias, onde se incluem as doenças cardiovasculares (Hilgendorf e Swirski, 2012).

Durante a diapedese os monócitos associam-se a células endoteliais vasculares através interações com ligandos específicos. Nos tecidos encontram diferentes ambientes que levam a alteração da sua função e promovem a sua posterior diferenciação em macrófagos ou células dendríticas (Geissmann et al., 2010; Shi e Pamer, 2011), dependendo dos estímulos a que esteja sujeito. De facto, os monócitos são precursores

hematopoiéticos bipotenciais, comprometidos com a linhagem de macrófagos e a de células dendríticas, esta dependente da exposição aos fatores TNF-α e IL-4 (Ryncarz e Anasetti, 1998; Geissmann et al., 2010). Os monócitos são atraídos para os tecidos inflamados por mediadores quimiotáticos, tais como produtos da histamina, do complemento, leucotrienos, IP-10 ("Interferon-gamma-induced protein 10"), e MIP-1 e 2 ("macrophage-inflammatory protein-1 e 2"). A concentração destes fatores aumenta durante a inflamação (Woods et al., 2000; Epelman et al., 2014). O M-CSF é necessário para o processo de diferenciação em macrófagos e encontra-se igualmente envolvido na regulação da sobrevivência, da proliferação e diferenciação de fagócitos mononucleares (Gordon, 2003; Appelberg, 2005)

Quando o monócito se converte em macrófago ocorrem algumas transformações que lhe permitem assegurar importantes funções fisiológicas, aumentando a sua capacidade fagocítica e antimicrobiana, devido ao macrófago apresentar um maior número de lisossomas (Yang et al., 2014).

VI. Os Macrófagos 1. Estrutura intracelular

Os macrófagos apresentam uma forma variável, geralmente oval, com contornos irregulares, núcleo numa posição descentrada e citoplasma abundante com grau de vacuolização variável, dependente da formação de vesiculas de pinocitose ou fagocitose. Podem apresentar pseudópodes que resultam da emissão de sistemas de microtúbulos, conferindo-lhes um movimento ameboide e permitindo-lhes direcionar o seu movimento (Zellforsch et al., 2012). Como células fagocíticas que são, apresentam no seu citoplasma uma quantidade apropriada de lisossomas, facilmente identificáveis, onde se acumulam numerosas enzimas hidrolíticas como sejam as lipases, as nucleases e as glicosilases, com atividade óptima a pH acídico, permitindo a digestão de partículas (Appelberg, 2005). Algumas enzimas permitem a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) e azoto (RNI), também com atividade antimicrobiana. O seu núcleo pode-se apresentar uma forma ovalada ou irregular, sendo menos opaco quando comparado com as células epiteliais. O número de poros nucleares é limitado, e o material filamentoso do núcleo apresenta muitas vezes densidade moderada na região central, ocasionando pequenos grânulos (Pacheco e Cardoso, 2012; Zellforsch et al., 2012). A estrutura dos macrófagos, bem como o seu perfil de citocinas secretadas, enzimas e marcadores de superfície, apresenta ligeiras variações que dependem da função e estádio de maturação. Contêm centríolos e complexos de Golgi, constituídos por sacos achatados rodeados por inúmeras vesiculas lisas revestidas e não revestidas, de tamanho e densidade variável. Os ribossomas são numerosos, encontrando-se tanto na sua forma livre, como associados à superfície do reticulo endoplasmático rugoso. Em menor número, encontram-se as mitocôndrias. O citoplasma contem ainda microfilamentos com cerca de 8-10 nm de diâmetro (Murray e Wynn, 2011; Zellforsch et al., 2012). Os macrófagos são metabolicamente ativos, influenciando as funções locais e sistémicas pela secreção de uma grande diversidade de moléculas onde se incluem as citocinas, quimiocinas e factores de crescimento (Taylor et al., 2005).

2. Recetores de superfície

Os recetores de superfície são importantes para a regulação de uma grande diversidade de funções e atividades celulares, incluindo a diferenciação, o crescimento e a sobrevivência celular, a adesão, a migração, a fagocitose, a ativação e o

desenvolvimento da citotoxicidade (Gordon, 2003; Taylor et al., 2005). As famílias de recetores apresentam diferentes afinidades para os respetivos ligandos e uma diversidade muito ampla que lhes permite atuar até mesmo nos microambientes mais específicos (Taylor et al., 2005; Londrigan et al., 2011; Sieweke e Allen, 2013). Assim, existem recetores para reconhecimento de microrganismos, fatores de coagulação, componentes da matriz extracelular, diversas proteínas de transporte, fatores de crescimento, hormonas e citocinas, que conferem a capacidade de reconhecer e responder a uma grande variedade de estímulos (Ezekowitz e Gordon, 2006; Geissmann et al., 2010). A colaboração entre as diferentes famílias de recetores influencia a resposta macrofágica (Perdiguero e Geissmann, 2013).

O reconhecimento dá-se quando o recetor reconhece um determinado estímulo, levando a alterações na superfície celular de modo a promover a captação de uma partícula, ou a sinalização e a expressão de determinados genes. Este reconhecimento contribui para a homeostase e defesa do hospedeiro, uma vez que vai resultar em processos como a eliminação de células apoptóticas ou microrganismos, bem como a captação de lipoproteínas modificadas, que contribuem para o processo inflamatório e para a reparação associada a aterosclerose (Woods et al., 2000; Teo, 2003; Taylor et al., 2005; Ezekowitz e Gordon, 2006; Geissmann et al., 2010).

Os macrófagos expressam uma ampla gama de PRR ("pattern-recognition receptors") que medeiam interações do tipo recetor-ligando com antigénios microbianos (Appelberg, 2005; Taylor et al., 2005). Destes, muitos pertencem à família de recetores "Toll-like" (TLR).

Os recetores TLR são uma grande família de recetores transmembranares, com cerca de onze membros, distribuídos diferencialmente pela célula, encontrando-se envolvidos na imunidade inata (Taylor et al., 2005). São importantes para a detecção da invasão de agentes patogénicos microbianos e transdução de sinais moleculares. O reconhecimento via TLR promove a iniciação de vias de transdução de sinal, que podem estar envolvidas no desenvolvimento da imunidade adquirida e resposta inflamatória (Takeda e Akira, 2005). Os diferentes membros da família TLR apresentam domínios semelhantes às imunoglobulinas e desempenham papéis importantes no reconhecimento de componentes microbianos específicos derivados de organismos patogénicos, incluindo bactérias, fungos, protozoários e vírus (Peters et al., 2005). O recetor TLR2 reconhece uma grande variedade de componentes microbianos, onde se inclui o

peptidoglicano, o TLR3 está implicado no reconhecimento de dsRNA viral, enquanto que o TLR4 reconhece LPS, o TLR5 reconhece flagelina (componente dos flagelos bacterianos), o recetor TLR6 dimeriza com o TLR2 e reconhece lipoproteínas, os TLR7 e TLR8 e estão implicadas no reconhecimento de ssRNA viral, e o TLR9 é essencial para o reconhecimento de DNA (Takeda e Akira, 2005). Os recetores TLR1, TLR2 e TLR4 a 6 são expressos na superfície da célula. Em contraste, os recetores TLR3, TLR7, TLR8 e TLR9 são expressos em compartimentos intracelulares, tais como endossomas (Figura 4) (Peters et al., 2005; Takeda e Akira, 2005). A estimulação destes recetores despoleta a expressão de diversos genes que estão envolvidos na resposta imunitária, induzindo a produção de citocinas inflamatórias, tais como a TNF-α, a IL-6 e a IL-12. (Takeda e Akira, 2005).

Figura 4- Os diferentes membros da família de recetores toll-like (figura adaptada de (Takeda e Akira, 2005))

Outras moléculas de adesão incluem as integrinas, selectinas e recetores para fatores de crescimento. Controlam a migração de células do sangue através do endotélio, estando também envolvidas nas interações com outras células, como sejam linfócitos e outros fagócitos (Gordon, 2003; Appelberg, 2005)

O recetor macrofágico de manose (MR) é importante para a manutenção dos níveis desta glicoproteína endógena e para a eliminação de hidrolases lisossomais em condições normais e inflamatórias (Taylor et al 2005). Está também envolvido no reconhecimento de patogénios e na apresentação de antigénios. É modulado positivamente pela IL-4, IL-13 e IL-10 e negativamente pelo IFN-γ (Taylor et al., 2005).

Os "scavenger receptors" (SR) são importantes receptores não opsónicos de lipoproteínas de baixa densidade, tendo um papel na formação de células de espuma

(macrófagos modificados, com elevado teor lipídico) e no desenvolvimento da aterogénese (Taylor et al., 2005). Os SR estão também envolvidos na defesa do hospedeiro, e a sua expressão é aumentada por M-CSF ("macrophage colony-stimulating factor"). Um dos membros desta família é o recetor MARCO, também induzido, facilmente, por microrganismos e outros estímulos (Elomaa et al., 1998). Na figura abaixo encontram-se representados alguns tipos de receptores SR e outros funcionalmente relacionados (Taylor et al., 2005).

Figura 5-Famílias de recetores SR e outros funcionalmente relacionados (figura adaptada de (Taylor et al., 2005))

A família dos recetores transmembranares "7-span" (TM) é a maior família de recetores, compreendendo cerca de 1% dos genes do genoma humano e estão envolvidos na transdução de sinal de uma grande variedade de estímulos, incluindo produtos microbianos, peptídeos e derivados de aminoácidos (Taylor et al., 2005; Londrigan et al., 2011).

Os macrófagos apresentam ainda outros recetores envolvidos no reconhecimento de patogéneos, como os recetores de reconhecimento de ácido siálico e de lectina tipo C, bem como recetores hormonais, de citocinas e quimiocinas e recetores que reconhecem complemento e o fragmento Fc das imunoglobulinas, importantes para a fagocitose de partículas opsonizadas, ou seja, que se apresentam revestidas por imunoglobulinas e/ou fragmentos de componentes do sistema de complemento (Schindl et al., 2006). Às

moléculas (imunoglobulinas e complemento) que facilitam a fagocitose chamam-se opsoninas (Shi e Pamer, 2011; Yang et al., 2014).

Os macrófagos apresentam também antigénios das duas classes do complexo major de histocompatibilidade (MHC), importantes para a apresentação de antigénios a linfócitos (Yang et al., 2014).

3. Diversidade Fenotípica

Os macrófagos podem ser estimulados a aumentar as suas funções efetoras (Solinas et al., 2009). Essa ativação é necessária para que os monócitos circulantes terminem a sua diferenciação em macrófagos, quando recrutados pelos tecidos, sendo os monócitos muito suscetíveis de sofrerem alterações quando sujeitas a algum estímulo (Benoit et al., 2008). O estado de ativação é altamente flexível e depende da localização do tecido e do microambiente (Pixley e Stanley, 2004; Solinas et al., 2009).

Os macrófagos podem ser ativados por duas vias distintas, a via clássica e a via alternativa (Solinas et al., 2009). Estas duas vias dão origem a macrófagos com diferentes designações e finalidades, devendo se encontrar num estado de equilíbrio para um conveniente funcionamento do sistema imunitário. Os macrófagos podem tomar a designação de macrófagos M1 ou macrófagos M2, consoante a ativação ocorrer pela via clássica ou pela via alternativa (Mosser e Edwards, 2008; Geissmann et al., 2010). Os macrófagos M1 desempenham um papel preponderante na proteção a agentes patogénicos intracelulares e a células cancerígenas em virtude da sua grande atividade citotóxica e da resposta imune que despoletam (Solinas et al., 2009; Geissmann et al., 2010). A ativação clássica (M1) é mediada por estímulos como IFN-γ, TNF-α, recetores TLR e lipopolissacáridos (LPS), enquanto que a alternativa é mediada pela interleucina-4 (IL-interleucina-4) e IL-13, atuando através do receptor IL-interleucina-4R (Gordon, 2003). A ativação clássica leva a produção de IL-1, IL-12, IL-23, TNF-α e CXCL10, bem como de ROS e RNI, como o oxido nítrico (NO), com uma potente atividade microbicida. Além disso, os macrófagos M1 expressam altos níveis de antigénios das classes I e II do MHC, o que lhes permite funcionar como células apresentadoras de antigénios (Clark et al., 2007). Na Figura 6 encontra-se uma representação esquemática da ativação de macrófagos pela via clássica, como resultado da presença de IFN-γ e de patogéneos, levando à libertação de fatores citotóxicos.

Figura 6-Via clássica de ativação (figura adaptada de (Solinas et al., 2009))

A ativação alternativa do macrófago origina o macrófago M2, considerado o trabalhador do hospedeiro uma vez que promove a limpeza de possíveis detritos. Este segundo modo de ativação é importante para a resolução da inflamação e tem sido implicado na tumorigénese, uma vez que promove crescimento de tumores e o desenvolvimento de metástases. Os macrófagos M2 estão também envolvidos no aumento da contratibilidade do musculo liso, o que contribui para a expulsão de patogénios (Pixley e Stanley, 2004; Chanmee et al., 2014; Nathan, 2014).

A ativação alternativa dá-se quando os macrófagos estão expostos a um microambiente constituído por interleucinas do tipo IL-4, IL-13, IL-10 ou corticosteroides, podendo ter a influência de TGF-β ("transforming growth factor-beta") e de PGE2 (prostaglandina E2). Esta via de ativação leva a secreção de interleucinas (IL-10, IL-1ra) e das quimiocinas CCL17 e CCL22, bem como a expressão aumentada do recetor IL-1R "decoy", dos recetores de manose e dos recetores scavenger e da galactose (Solinas et al., 2009). Este subtipo de macrófago apresenta alterações em algumas vias metabólicas, como no metabolismo de arginina, levando a que haja uma produção de ornitina e poliamina em vez da produção de citrulina e NO, o que seria de esperar normalmente. Os macrófagos M2 apresentam também uma baixa capacidade para promoverem a apresentação de antigénios e a cicatrização (Mosser e Edwards, 2008; Solinas et al., 2009). As células ativadas por via alternativa podem-se ainda subdividir em três classes distintas. Essas classe tomam a designação de M2a, M2b e M2c quando o monócito ou macrófago é estimulado, respetivamente, pelas IL-4 e IL-13 (M2a), pelos complexos imunes e ligandos TLR (M2b), e pelas IL-10 e glucocorticoides (M2c), estando o ultimo subtipo relacionado com a supressão da inflamação como se pode ver representado na figura abaixo (Montovani et al., 2002; Obeid et al., 2010).

Figura 7-Subtipos de macrófagos M2 (figura adaptada de (Obeid et al., 2010))

A tabela abaixo representa de modo esquemático os diferentes fenótipos e os estímulos envolvidos na sua diferenciação.

Tabela 1-Os diferentes fenótipos de macrófagos e os seus estímulos

Fenótipo de macrófago Indutores

M1  IFN-γ  TLR  LPS M2a  IL-4  IL-13 M2b  TLR  Complexos imunes M2c  Il-10  Glucocorticoides

As populações de macrófagos M1 e M2 devem ser equilibradas para um correto funcionamento do organismo e proteção do hospedeiro, originando em caso de desequilíbrio situações patológicas. Se o desequilíbrio pender para um número de células M1 superior, leva a indução de doença inflamatória crónica; no entanto, se o desequilíbrio se der no sentido contrário proporciona imunossupressão, como se pode observar na figura abaixo representada (Mosser e Edwards, 2008; Pollard, 2009).

Figura 8-O equilíbrio entre macrófagos M1 e M2 (Figura adaptada de (Miron et al., 2013)) Além destes dois subtipos, pode existir um terceiro subtipo denominado de M3, que exerce um papel na produção de PGE2 (de la Torre et al., 2008).

VII. Função dos macrófagos 1. Fagocitose

A fagocitose é um dos principais mecanismos de suporte da imunidade inata e é um processo onde células mortas e partículas estranhas são captados e posteriormente ingeridos por células fagocíticas, sendo também um processo importante para a eliminação de células tumorais (Pacheco, 2012). Apenas os fagócitos profissionais são funcionalmente dotados de capacidades fagocíticas importantes. A ligação aos recetores SR, MR e TLR, bem como a ligação de partículas opsonizadas a recetores de complemento e do fragmento Fc, estimulam a fagocitose. No entanto, este processo é regulado negativamente por outros recetores, tais como os recetores para a cisteína, bem como por alguns patogénos que inibem este mecanismo dos macrófagos (Takeda e Akira, 2005; Ezekowitz e Gordon, 2006). Durante a fagocitose é desencadeada a degradação do patogéno e posterior apresentação dos seus antigénios, associados ao MHC, conduzindo ao desenvolvimento da imunidade adquirida (Teo, 2003; Strauss, 2010).

A fagocitose é um processo que ocorre seguindo uma serie de etapas. Esta é iniciada, por um processo não dependente de energia, quando se dá a ligação de uma determinada partícula à membrada da célula fagocítica. Após esta ligação pode-se dar ou não a transmissão de um sinal que leva (ou não) a posterior ingestão da partícula que se adere

ao fagócito. Os antigénios microbianos são reconhecidos por PRR, como os TLR, e uma ampla gama de recetores não-opsónicos. Quando se dá a ingestão resultante da interação entre recetores da e a superfície da partícula, ocorre a emissão de pseudópodes (extensões provenientes do citoplasma, constituídos por filamentos de actina e miosina) que envolvem a partícula, resultando na fusão que origina um vacúolo fagocítico, no interior da célula. O vacúolo fagocítico (fagossoma) passa por um processo de maturação até, num estadío final, fundir com lisossomas, onde as enzimas hidrolíticas, ROS e RNI contribuem para a degradação microbiana (Appelberg, 2005; Pacheco e Cardoso, 2012).

A fagocitose leva a ativação dos macrófagos e à indução da libertação de uma serie de moléculas onde se incluem as citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1, IL-6 e TNF, bem como outras toxinas mediadoras que promovem o dano nos tecidos, se produzidas em excesso. Normalmente, a resposta inflamatória é seguida por uma resposta anti-inflamatória, conduzindo a um equilíbrio (Pacheco e Cardoso, 2012).

Durante a fagocitose ocorre a estimulação de uma série de processos bioquímicos e metabólicos, onde se inclui o aumento da utilização da glucose e do consumo de oxigênio (Schindl et al., 2006).

2. Apoptose

A apoptose é um processo natural, que pode tomar a designação de morte celular programada e que se desenrola durante o desenvolvimento, promovendo a remodelação tecidular e o desenvolvimento da homeostase. De facto, a apoptose é essencial para a regulação do número de células no hospedeiro, de modo a haver um equilibrio entre o número de células eliminadas e as que sofrem divisão celular. É também importante para o a função do sistema imunitário e, particularmente no desenvolvimento embrionário (Elmore, 2007).

O processo da apoptose recorre a uma serie de mecanismos bioquímicos e alterações morfológicas (Albert et al., 2002; Elmore, 2007). Depende de uma família de proteases, as quais apresentam um grupo cisteína no seu local ativo. Estas proteínas são proteases que clivam outras proteínas nos locais que contêm resíduos de ácido aspártico e tomam a designação de caspases. A ação das caspases na degradação de porções especificas da célula, num processo contínuo, envolvendo a ativação em cascata de diversas caspases (Albert et al., 2002). Com o avançar do processo a célula vai tomando

dimensões mais reduzidas, ocorre fragmentação nuclear, o citoplasma fica mais denso e os organelos ficam mais agrupados, levando a formação de corpos apoptóticos, após formação e libertação de "bolhas" a partir da membrana das células (Elmore, 2007). Apos a morte celular por apoptose, a célula ou seus corpos apoptóticos é rapidamente fagocitada e eliminada por macrófagos (Savill et al., 2002). Embora seja comum afirmar que este é um processo neutral sob o ponto de vista imunológico, existem evidências que contrariam essa afirmação. De facto, a fagocitose das células apoptóticas pode levar à produção de mediadores anti-inflamatórios e a imunossupressão (situações de deficiente eliminação de células apoptóticas, podem conduzir a doenças autoimunes e inflamatórias). Por outro lado, noutras situações a remoção de células apoptóticas pode levar a exacerbação da inflamação (Savill et al., 2002; Teo, 2003).

Se a taxa de apoptose exceder a capacidade de remoção pelos macrófagos, as células apoptóticas podem tornar-se necróticas, resultando na libertação do conteúdo celular, levando ao dano no tecido envolvente, sendo a depuração um passo essencial para a resolução deste processo (Teo, 2003).

Figura 9- A Importância da remoção de neutrófilos (figura adaptada de (Teo, 2003))

Esta figura demonstra a importância da remoção de neutrófilos apoptóticos pelos macrófagos, pois se os neutrófilos entram em necrose derramam o conteúdo dos seus grânulos e causam uma inflamação extensa. Os macrófagos ao fagocitarem os neutrófilos impedem essa inflamação e ainda aumentam o seu arsenal microbicida, recebendo o conteúdo granular dos neutrófilos (TEO,2003). Este precesso (cooperação

neutrófilo-macrófago) desempenha um importante papel nos mecanismos de defesa contra infeções (Appelberg, 2005; Pacheco e Cardoso, 2012).

4. Interação com a imunidade adaptativa a) Imunidade inata e adaptativa

A imunidade caracteriza-se como sendo a capacidade de resistir à invasão de microrganismos e à formação de células tumorais, que poderiam levar, numa última fase, ao desenvolvimento de dano. O grau de imunidade pode ser reduzido por vários fatores tais como um ambiente higiénico, a fadiga, a exposição a temperaturas anormais, variações na dieta, determinados fármacos, certas patologias e lesões (McConnell., 2014). O baço é um orgão central na imunidade às bactérias e fungos. Encontra-se no abdómen associado ao estômago, a sua estrutura permite a remoção de microrganismos de um modo eficiente e a sua localização permite que tenha uma exposição precoce aos patogénos, levando à promoção da homeostase imune.(Mebius e Kraal; Chanmee et al., 2014).

O processo de reação do sistema imunológico compreende dois tipos de resposta que se relacionam entre si. Uma delas é de largo espetro, designada de resposta imunológica inata ou natural. É mais imediata e com um espectro de ação alargado, atuando na presença de estruturas moleculares conservadas presentes em agentes patogénicos, os PAMP ("pathogen-associated molecular patterns" - ex. LPS), presentes à superfície dos microrganismos e que são reconhecidos pelos PRR (Appelberg, 2005; Takeda e Akira, 2005). A segunda é uma resposta imunológica mais específica designada de resposta imunológica adaptativa ou adquirida, levando mais tempo a desenvolver-se e é resultado da ativação de uma serie de células (nomeadamente linfócitos) e moléculas solúveis, que interagem e funcionam de uma forma sinérgica e específica para eliminar ou apenas neutralizar um estímulo agressor (Pacheco e Cardoso, 2012). A imunidade adaptativa é adquirida após o nascimento e pode ser activa ou passiva. A imunidade adaptativa ativa resulta da ação das células do hospedeiro na destruição de bactérias ou neutralização dos seus produtos, após infecção acidental ou inoculação de um patogéno atenuado, tal como na vacinação. A imunidade adaptativa passiva é obtida pela introdução do soro de um animal imunizado no organismo de um indivíduo, não imune (Woods et al., 2000; Teo, 2003).

b) Papel do macrófago na interação com a imunidade adaptativa

Os patogénos induzem o desenvolvimento da imunidade inata e adaptativa, estando a primeira relacionada com o desenvolvimento da segunda. Aquando de uma infeção desenvolve-se a resposta inflamatória através do extravasamento de componentes plasmáticos para os tecidos (exsudação) e simultânea migração de monócitos, que se convertem, ao chegar ao foco da inflamação, em macrófagos inflamatórios. Ao fagocitarem neutrófilos senescentes, conforme referido acima, aumentam o seu arsenal antimicrobiano (Appelberg, 2005; Pacheco e Cardoso, 2012). Os macrófagos reconhecem os patogénos, opsonizados ou não, fagocitando-os e degradando-os para posterior apresentação antigénica aos linfócitos T (Takeda e Akira, 2005; Revie e Salahuddin, 2014). Estes antigénios peptídicos podem ser expostos à superfície conjugados com moléculas do MHC-II, levando à interação com células T CD4+, ou com moléculas MHC-I, interagindo com células T citotóxicas, CD8+ (Koppensteiner et al., 2012). A interação com as células T conduz à sua ativação e secreção de citocinas, que por sua vez vão modular a atividade macrofágica. Assim, o macrófago é uma célula que se comporta como agente da resposta inata, mas também como efetor da resposta adaptativa. Neste contexto, a existência de populações heterogéneas de macrófagos dá ao sistema imune plasticidade na resposta imunitária.

A resposta imunitária, de ambos os tipos pode ser também controlada pelo sistema nervoso central, através de neuropeptídeos libertados a partir de órgãos linfoides atuando como estimuladores ou inibidores da resposta imunológica. A sua concentração é aumentada na presença de LPS e citocinas (Ezekowitz e Gordon, 2006; Romeo et al., 2010).

VII. Relação com parasitas intracelulares

Os macrófagos promovem a defesa do hospedeiro perante microparasitas (vírus e bactérias) e macroparasitas (protozoários unicelulares e pluricelulares) (Shi e Pamer, 2011). Neste capítulo apresentarei como exemplos um macroparasita (Leishmania) e dois microparasitas (Mycobacterium tuberculosis e vírus da imunodeficiência humana).

1. Leishmania

A leishmaniose é uma síndrome que engloba uma ampla gama de patologias resultantes da infeção dos macrófagos, resultando quer em lesões cutâneas (L. major, L. mexicana) quer em lesões em órgãos internos, variando desde a infeção assintomática até grave, apresentando associada uma morbilidade variável (Sacks e Noben-Trauth, 2002), estando esta dependente das espécies de Leishmania que dão origem à infeção (Kumar et al., 2014). O ciclo de vida deste parasita implica uma interação célula-a-célula e inicia-se com a infeção por promastigotas por via intradérmica transmitida pela picada de flebotomíneos fêmeas infetadas. Os promastigotas entram rapidamente nos macrófagos através da ligação entre o recetor de complemento CR3 destas células, e duas moléculas presentes abundantemente na membrana dos promastigotas, o lipofosfoglicano (GPL) e a metaloproteinase gp63 (Sacks e Noben-Trauth, 2002). Esta interação resulta na internalização e formação de vacúolos parasitóforos contendo Leishmania. Estas secretam proteofosfoglicano e replicam-se, tendo um período de cerca de uma semana para a formação de uma nova geração (Kumar et al., 2014). Os macrófagos massivamente infectados acabam por lisar, libertando os parasitas que se dividem rapidamente em amastigotas (Sacks e Noben-Trauth, 2002). Este parasita durante o seu ciclo de vida alterna a forma amastigota e promastigota (Kumar et al., 2014).

Este parasita apresenta como mecanismo de resistência à actividade microbicida dos macrófagos, a inibição da biogénese fagolisossomal, através da ação de uma metaloproteínase, designada de Gp63, que se encontra a superfície deste parasita quando este se encontra na fase promastigota, que atua no bloqueio do SNARs (N-ethylmaleimide-sensitive factor attachement protein receptor), que tem como finalidade coordenar o trafico através da membrana e quando alterado conduz a uma alteração no processo de biogénese do fagolisossoma, interrompendo deste modo a apresentação antigénica. Um outro mecanismo é através da metilação do DNA, ou seja a adição de grupos metilo, que leva ao silenciamento de genes que controlam a atividade microbicida dos macrófagos (Arango-Duque e Descotaux, 2015).

Figura 10- O ciclo de vida da leishmânia (figura adaptada de (Sacks e Noben-Trauth, 2002))

2. M. Tuberculosis

O M. tuberculosis é responsável por a patogénese de uma doença bacteriana infecciosa, que afeta preferencialmente os pulmões. Esta é transmitida pelo contacto com pessoas afetadas, podendo ser também resultante de uma nutrição pobre, bem como pelo contacto com baixas condições de higiene, contudo se o sistema imunitário se encontrar em pleno estado pode não conduzir ao desenvolvimento de doença. Os sintomas característicos são a tosse, a expetoração, podendo em alguns casos vir acompanhada por sangue, dores no peito, fraqueza, febre e perda de peso (Vyas, 2014).

O M. tuberculosis é um patogéneo predominantemente respiratório (Shi e Pamer, 2011) que infeta o macrófago, impedindo a fusão fagolisossomal (importante para promover a a destruição do patogénio) e replicando-se nos seus fagossomas (Mcdonough et al., 1993; Behar et al., 2010). M. tuberculosis tem a capacidade de inibir a apoptose dos macrófagos, através da atuação sobre a dinâmica da cascata de caspases, levando ao estabelecimento de necrose com a finalidade de facilitar a difusão e transmissão bacteriana (Butler et al., 2012). No entanto, nem todas as estirpes apresentam a mesma virulência. A virulência das estirpes afecta o nível de atuação sobre a morte celular do macrófago e sobre a capacidade para inibir a apoptose (Behar et al., 2010; Butler et al.,

2012), bem como a capacidade de estimulação da produção de iNOS e TNF (Shi e Pamer, 2011).

3. Vírus da imunodeficiencia humana

A doença crónica causada por um dos vírus com grande impacto na sociedade é a síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Este vírus é um membro do género lentivírus e para realizar o seu ciclo viral necessita de uma célula hospedeira, mas também de determinadas proteínas virais que desempenham uma importante função na patogénese viral, nomeadamente através da modulação da sinalização celular (Herbein et al., 2010). Existem dois tipos, HIV1 e HIV2, sendo o tipo 1 o mais disseminado.

A SIDA caracteriza-se por uma diminuição do número de linfócitos T e pela presença de uma população de células CD4+ com o vírus latente, podendo estas células serem do tipo células T CD4+ e/ou pertencerem a linhagem monócito/macrófago (Douce et al., 2010; Koppensteiner et al., 2012; Kumar et al., 2014). Estas células são o principal alvo da ação do HIV, uma vez que apresentam à sua superfície o receptor CD4 e o co-receptor CCR5 ou CXCR4 (Benoit et al., 2008; Douce et al., 2010; Kedzierska e Crowe, 2014). Os monócitos e os macrófagos são mais resistentes ao efeito citopático do HIV, persistindo ao longo do curso da infeção. São um importante reservatório para o HIV e como se encontram amplamente representados na maioria dos sistemas do organismo permitem a disseminação do vírus (Douce et al., 2010; Koppensteiner et al., 2012; Kumar et al., 2014). A persistência em monócitos e macrófagos é resultado da forte expressão de um fator inibidor da replicação viral nestas células e também em células dendríticas, identificado como SAMHD1 ("SAM domain and HD domain-containing protein 1") (Koppensteiner et al., 2012).

Os reservatórios são células infetadas que apresentam o vírus na sua forma latente ou com baixos níveis de replicação. Nestas células, não se dá a produção de partículas virais infeciosas, podendo esta ser ativada após um dado estímulo (Koppensteiner et al., 2012; Kedzierska e Crowe, 2014; Kumar et al., 2014)

Os macrófagos criam um ambiente protetor para o patogénio, por criação de um compartimento albergando o vírus no seu interior, que o tornam inacessível a

anticorpos. Promovem também a expansão do vírus uma vez que secretam citocinas e quimiocinas (MIP-1α, MIP-1β, MCP-1 e CCL-5) que atraem linfócitos que poderão ser infetados, e também induzem resistência a apoptose nas células infetadas (Douce et al., 2010; Koppensteiner et al., 2012).

Os macrófagos podem conter o genoma do HIV integrado no cromossoma ou na sua forma circular, não integrada. A indução da replicação do vírus, no interior desta célula, é regulada por citocinas e outros estímulos extracelulares. A maioria dos macrófagos infetados parece corresponder a um fenótipo M2, que embora possa contribuir para uma inibição da resposta imune efetora, não permite a replicação viral no interior do macrófago. No entanto, certos estímulos externos podem levar à conversão do fenótipo M2 em M1, os quais permitem a conclusão do ciclo viral (Koppensteiner et al., 2012; Kumar et al., 2014) Kedzierska e Crowe, 2014)

As proteínas virais do vírus da imunodeficiência humana (Nef, Tat, Vpr, e gp120) são libertadas por células infetadas pelo vírus e têm a capacidade de entrarem em macrófagos e de modularem as suas funções, sobretudo aquelas que afetam o ciclo de vida do vírus. A proteína viral Nef, ao atuar sobre os macrófagos infetados pelo HIV, induz a formação de projeções citoplasmáticas, permitindo aos vírus transferir essa proteína a outras células, nomeadamente às células B. A transmissão de Nef a estas células inibe as suas funções imunológicas, comprometendo a produção de IgG2a e IgA (Fig. 11). (Rudnicka e Schwartz, 2009; Herbein et al., 2010).A estimulação fisiológica de macrófagos através do recetor CD40 ou da proteína viral Nef conduz também à ativação do fator NF-kappaB que induz a libertação das formas solúveis de CD23 e ICAM, as quais vão interagir com os seus ligandos presentes nos linfócitos T, tornando-os permissivtornando-os à infeção, uma vez que permitem a entrada do vírus e a expressão de novas proteínas virais (Rudnicka e Schwartz, 2009).

Figura 11-Transmissão do Nef às células B (figura adaptada de (Rudnicka e Schwartz, 2009) O HIV altera as funções realizadas pelos macrófagos, modificando a fagocitose, a quimiotaxia e a produção de citoquinas, contribuindo tais alterações para a patogénese

da doença e permitindo o desenvolvimento de infeções oportunistas. As alterações permitem também a infeção e replicação viral (Koppensteiner et al., 2012). Os macrófagos desempenham um papel em duas vertentes nesta patologia: numa fase aguda da infecção, permitem o estabelecimento da infeção nos locais de entrada viral, e a disseminação do vírus; por outro lado, estão também envolvidos no estabelecimento da resposta imune celular e humoral adaptativa que ajuda a diminuir a carga viral. (Douce et al., 2010; Koppensteiner et al., 2012).

Os macrófagos da mucosa genital são das primeiras células a contactarem com o vírus e a serem infetadas, promovendo o desenvolvimento da resposte imune e transmitindo o vírus através de contacto de célula-célula durante a apresentação dos antigénios HIV. Estes macrófagos da mucosa recrutam células T CD4+ e contribuem para o estabelecimento da infeção. As células da microglia, apresentam um especial significado clínico nesta infeção uma vez que, quando infetadas durante a fase aguda, são responsáveis pela neuropatogénese e pela patogénese da demência associada ao HIV. Estas células tem um tempo de vida longo (vários anos), sendo um importante reservatório em pacientes infetados (Koppensteiner et al., 2012; Kumar et al., 2014). Os macrófagos intestinais induzem uma regulação negativa dos receptores de superfície envolvidos na adesão viral (CD4 e CCR5), levando a latência. Como são também APC, podem estar envolvida na orquestração da resposta primária de anticorpos que suprimem as cargas virais de HIV-1 no início da fase crónica (Douce et al., 2010; Koppensteiner et al., 2012; Kedzierska e Crowe, 2014; Kumar et al., 2014).

Na fase mais avançada da infeção desenvolve-se o estadio de SIDA caraterizado por uma desregulação do sistema imunológico e pela perda da sua capacidade em controlar o vírus, resultante do esgotamento da maioria das células T CD4 + e da presença de uma quantidade considerável de reservatórios, incluindo em macrófagos (Koppensteiner et al., 2012).

A terapêutica atualmente utilizada nesta patologia é a terapêutica HAART (Highly active antiretroviral Therapy) consistindo na associação de vários fármacos tendo como alvo as diferentes fases do ciclo de vida do vírus. Esta terapêutica melhorou significamente a qualidade de vida dos indivíduos infetados, diminuindo a carga viral. No entanto, se a terapêutica for interrompida é retomado o nível viral inicial, devido aos reservatórios, uma vez que os fármacos não os alcançam, tendo assim esta terapêutica que ser utilizada durante toda a vida. Uma vez que os reservatórios são o principal

obstáculo do tratamento, o desafio é atuar sobre a persistência para deste modo se tentar encontrar uma cura. Assim, um objetivo primordial será a eliminação dos vírus que se encontram nos reservatórios, impedindo também a formação destes reservatórios (Douce et al., 2010; Koppensteiner et al., 2012; Kumar et al., 2014).

Tem-se considerado associar à terapêutica HAART fatores de restrição atuando em diferentes etapas do ciclo de replicação viral. Um exemplo é o interferão-α que exerce uma forte atividade antiviral (Koppensteiner et al., 2012). Um dos repressores da transcrição que tem sido considerado é o CTIP2 ("Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor-interacting protein 2"), que atua no estabelecimento da latência uma vez que reprime a transcrição do DNA viral. Uma forma alternativa que tem sido considerada é o uso de agentes farmacológicos que induzam a apoptose em células reservatório (Douce et al., 2010). Contudo, sendo os macrófagos relativamente resistentes a apoptose e uma vez que os macrófagos infetados apresentam alterações nos genes relacionados com a morte celular programada, esta alternativa terá que ser avaliada muito detalhadamente (Douce et al., 2010; Koppensteiner et al., 2012; Kumar et al., 2014). Combinando essas estratégias em desenvolvimento com o tratamento HAART poderia ser possível ter uma melhor perspetiva para o encontro de uma cura (Kumar et al., 2014).

VIII. Relação com patologias

Em determinadas condições, a função macrofágica está relacionada com o desenvolvimento de patologias com diferentes etiologias. O microambiente a que o macrófago está sujeito aquando da sua diferenciação (induzindo uma população M1 ou M2) é um importante fator que pode contribuir para o desenvolvimento destas patologias (figura 12).

Figura 12--Subtipos macrofágicos e a sua relação com diferentes doenças (Figura adaptada de (Canton et al., 2013))

1. Cancro

O cancro encontra-se associado a um processo inflamatório resultante da infiltração de glóbulos brancos (leucócitos) e de uma grande diversidade de citocinas e quimiocinas (Montovani et al., 2008). As células tumorais distinguem-se das células normais pela expressão de antigénios resultantes da instabilidade genómica, levando a que a expressão génica seja aberrante, tornando-as alvo dos linfócitos do hospedeiro (Clark et al., 2007). As células neoplásicas proliferam principalmente pela ativação da via arginase, levando a produção de altos níveis de prostaglandina E2 (PGE2) que promove a produção de fatores de crescimento endotelial, e deste modo a vascularização (de la Torre et al., 2008). As célula tumorais produzem várias enzimas que podem degradar a

matriz extracelular (ECM), e os produtos da degradação desta matriz agem como estímulos inflamatórios para o recrutamento de células do sistema imunológico inato e para a expressão de genes promotores da inflamação (Chanmee et al., 2014), que suprimem a resposta iniciada contra as células tumorais, permitindo-lhes crescer e dividir-se. Tais enzimas incluem várias metaloproteinases (por exemplo, MMP-2 e MMP-9) (Shih et al., 2006a; Clark et al., 2007). A dissolução do ECM leva a clivagens através das quais as células tumorais podem levar ao desenvolvimento de metástases e a angiogénese, estando relacionado com um prognóstico desfavorável em determinados tumores (Obeid et al., 2010; Chanmee et al., 2014). Os processos que levam ao aumento da agressividade dos tumores incluem a angiogénese, a hipoxia, a interacção entre os recetores de membrana e as citocinas do microambiente do tumoral, bem como a degradação da membrana basal.

A massa tumoral que se forma apresenta uma constituição com uma grande diversidade de tipos celulares, constituindo os macrófagos cerca de metade dessa massa, podendo também estar presentes células neoplásicas com origem na linhagem fagocítico-mononuclear, fibroblastos, células endoteliais, células mieloides com atividade imunossupressora que interagem entre si, apresentando um estroma reativo resultante da presença de uma grande abundancia de mediadores inflamatórios e enzimas proteolíticas (Solinas et al., 2009). Essa elevada quantidade de macrófagos desempenha um papel de grande relevância na patogénese dos tumores (Goerdt e Orfanos, 1999; Pollard, 2009; Solinas et al., 2009).

O microambiente do tumor desempenha um importante papel na agressividade dos tumores sólidos malignos, fornecendo todos os estímulos necessários para a viabilidade, crescimento e capacidade de invasão tumoral. O estado inflamatório crónico do microambiente tumoral é um promotor de dano genómico, levando a que a falta da imunovigilância impulsione a tumorigénese. As células T CD8 +, que se pensa serem mediadores da imunidade antitumoral, são escassas em tumores recentes, mas encontradas num grupo restrito de tumores avançados (Clark et al., 2007).

As células supressoras do sistema imunológico do hospedeiro aparecem precocemente durante a tumorigénese, compensando a imunidade anti-tumoral e contribuindo para a progressão da doença. A génese tumoral é iniciada por eventos genéticos e estimulada

pelo microambiente antitumoral, incluindo tanto a imunidade inata como adaptativa (Clark et al., 2007; Chanmee et al., 2014).

Durante a progressão do tumor os macrófagos são recrutados sob a influência de quimiocinas, tais como CCL2 e de citocinas, tais como o CSF-1 ("colony-stimulating factor-1"), produzidas pelas células tumorais, alterando o microambiente tumoral e acelerando a progressão do tumor (Chanmee et al., 2014)

Os macrófagos e as células neoplásicas estabelecem uma relação que promove o crescimento do tumor, através de um processo contínuo de deposição de matriz e sua consequente remodelação (Hagemann et al., 2004). Esta promoção da disseminação do tumor resulta na invasão das células tumorais malignas.

Os macrófagos associados a tumores (TAMs) são macrófagos ativados por via alternativa de fenótipo M2, e são os que mais influenciam a progressão tumoral, melhorando a progressão tumoral e o desenvolvimento de metástases (Shih et al., 2006a)(Colombo e Mantovani, 2005; Li e Flavell, 2008). Como tal, na origem dos tumores infiltrantes ocorre o recrutamento de macrófagos resultantes dos monócitos circulantes ou de uma população local de macrófagos. Para este recrutamento contribuem a quimiocina CCL2 bem como as CCL5, CCL7, CXCL8 e a CXCL12, e também citocinas como VEGF, PDGF ("platelet-derived growth factor") e M-CSF (Li e Flavell, 2008). Os macrófagos recrutados são modulados por estímulos, tais como fatores de crescimento, a baixa tensão de oxigênio, ou antigénios tumorais solúveis, e influenciam a migração de células tumorais e a sua capacidade invasiva, bem como a angiogénese tumoral, promovendo a progressão tumoral (Pollard, 2004; de la Torre et al., 2008; Obeid et al., 2010). De facto, certas moléculas secretadas por macrófagos desempenham uma ação pro-neoplásica, tais como o EGF ("epidermal growth factor"), que influencia positivamente o crescimento das células tumorais (Montovani et al., 2008; Pollard, 2009).

A diminuição da tensão de oxigénio na massa tumoral como resultado da acumulação de tecido necrótico no tumor, induz a expressão de HIF-1 (fatores de indução de hipoxia), que leva a que os TAM migrem, alastrando o tumor (Knowles e Harris, 2007; Montovani et al., 2008). Os TAM expressam elevados níveis do fator de transcrição NF-κB que regula a inflamação, induzindo modificações que potenciam a agressividade

dos tumores pela insensibilização a fatores que inibem o crescimento tumoral, a promoção da resistência a sinais apoptóticos e da angiogenese (Dunn et al., 2004; Bingle et al., 2006; Naugler e Karin, 2008). O papel pro-tumoral dos TAM vai diminuindo com a progressão do tumor uma vez que com o desenvolvimento da imunidade adaptativa os TAM expressam níveis de NF-κB mais baixos, devido à presença de fatores que anulam o NF-κB (p50), sendo tal anulação resultado de uma mudança do microambiente tumoral pela secreção de proteínas da matriz e uma grande variedade de proteases (serina, MMPs e catepsinas) (Montovani et al., 2002; Gocheva e Joyce, 2007; Naugler e Karin, 2008).

Os níveis de TAM permitem tirar conclusões relativamente ao prognóstico da doença, estando um nível elevado associado a um mau prognóstico. De facto, existe uma relação entre o elevado nível de TAM e o aumento do processo de metástases, pela ação da IL-1. (Figura 9) (Shih et al., 2006b; Clark et al., 2007; Solinas et al., 2009).

Figura 13- O TAM e as suas ações promotoras do crescimento tumoral (Figura adaptada de (Chen et al., 2005)

Os TAM estão envolvidos na angiogénese, pela secreção de fatores pró-angiogénicos (como VEGF) que levam ao desenvolvimento de uma rede de vasos que fornecem