PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA EVOLUTIVA E BIOLOGIA MOLECULAR
UESLEI DA CONCEIÇÃO LOPES
Caracterização genético-populacional
de Prochilodus nigricans (Prochilodontidae)
na sub-bacia do rio Tapajós
São Carlos 2018
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA EVOLUTIVA E BIOLOGIA MOLECULAR
UESLEI DA CONCEIÇÃO LOPES
Caracterização genético-populacional
de Prochilodus nigricans (Prochilodontidae)
na sub-bacia do rio Tapajós
São Carlos 2018
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular da Universidade Federal de São Carlos, como parte dos pré-requisitos para a obtenção do título de Doutor em Ciências, Área de Concentração: Genética e Evolução Orientadora: Profa. Patrícia Domingues de Freitas
97 f. : 30 cm.
Tese (doutorado)-Universidade Federal de São Carlos, campus São Carlos, São Carlos
Orientador: Patrícia Domingues de Freitas
Banca examinadora: Patrícia Domingues de Freitas, Orlando Moreira Filho, Luiz Antonio Carlos Bertollo, Evoy Zaniboni Filho, Luís Fernando Carvalho Costa
Bibliografia
1. Genética de populações. 2. Genética da Conservação. 3. Barragens. I. Orientador. II. Universidade Federal de São Carlos. III. Título.
Ficha catalográfica elaborada pelo Programa de Geração Automática da Secretaria Geral de Informática (SIn). DADOS FORNECIDOS PELO(A) AUTOR(A)
Dedico este trabalho aos meus pais, os melhores pais que um filho poderia ter, e às minhas avós (in
Um agradecimento muito especial à minha querida orientadora, Pat! Muito obrigado por todos esses anos de apoio, orientação, pelos puxões de orelha tão importantes para o meu crescimento profissional e pessoal, pela confiança depositada e, sobretudo, pela amizade. Gostaria que soubesse que sinto uma imensa gratidão por tudo que você fez por mim e por ter me dado a oportunidade de fazer parte da turma do LabBMC, onde tive a chance de aprender muito e, também, a sorte de fazer amigos para uma vida inteira.
Ao professor Pedro pela confiança depositada, pelas discussões do meu trabalho e valiosíssimas contribuições. Ter estado em seu laboratório foi uma experiência muito enriquecedora para mim. É sempre muito cativante e inspirador ver a sua empolgação e brilho nos olhos com os nossos resultados!
Ao meu grande amigo Bruno Saranholi, um irmão que a vida me presenteou! Sou extremamente grato por todos esses anos de amizade, apoio, incentivo e, sobretudo, pela sua generosidade sem tamanho! Obrigado por ter me ajudado a coletar os peixes no Mato Grosso e, também com alguns programas. Aprendi e sempre aprendo muito com você! Obrigado por tudo!
Aos meus queridos amigos Alexandra (Lelê) e Luiz Fernando (Luizão), um casal nota mil! Agradeço a Deus por tê-los em minha vida e pela belíssima amizade que construímos nesses anos! Agradeço por todo cuidado, pelo carinho e pela amizade. Agradeço por todo apoio que vocês sempre me deram e dão, por comemorarem comigo as minhas vitórias, por torcerem por mim. Muito obrigado por tudo. De coração!
Um agradecimento especial à minha amiga Josi Ribolli pelas fantásticas discussões e
insights, os quais foram essenciais para a construção do meu pensamento crítico. Obrigado por
despender parte do seu tempo para ler meus manuscritos e contribuir para sua melhora. Além disso, agradeço pelas longas e inúmeras discussões por telefone e WhatsApp. Você tem uma participação muito especial em meu trabalho! Muito obrigado!!
Aos amigos da faculdade Thaís Dória e Gustavo Moura pelo companheirismo e amizade, por estarem sempre presentes.
Ao meu amigo Pedro Gallo, por toda sua ajuda, disposição e boa vontade em fazer a minha coleta acontecer. Não tenho dúvidas de que, sem seu apoio, dificilmente teria conseguido
A Pati e ao Luciano por toda força, carinho e amizade ao longo de todos esses anos, mesmo eu ainda devendo aquela moqueca de camarão... Que irei pagar! rs
À Carolina Machado, essa pesquisadora recifense arretada que muito me ajudou e que tanto me inspira. Quando eu crescer, quero ser igual a você! Obrigado por me ajudar com alguns programas e por discutir comigo o meu trabalho!!
À Carmen Helena pela superajuda com o QGIS! Gracias Carmencita!!!
À Rosane Santos (Rosaninha, Carnaval Cidade) pela amizade e por toda sua alegria que animavam os sábados, domingos e feriados de trabalho no lab.! Obrigado pela força nessa reta final de nossos doutoramentos e por sempre repetir a célebre frase “A gente vai vencer,
Snipes!”.
À Eliana Paviotti-Fischer e Andreia Magro, minhas grandes parceiras de bancada nesse trabalho sem fim que são os microssatélites ! Obrigado pela companhia nos finais de semana e por sempre conseguirem uns espaços nas placas de genotipagem para mim!
À Carolina Machado, Jorge Ramirez, Carmen Helena, Karen Rodriguez, Rosane Santos, Carla Gestich e Gilmar Perbiche por terem lido meus textos e me dado valiosas sugestões para a sua melhoria.
Ao Prof. Orlando Moreira Filho por todo seu apoio e torcida pelo meu sucesso! Muito obrigado pelas palavras de incentivo, professor!
Ao Dr. Paulo Venere, Dr. Luís Fernando Carvalho Costa, Dra. Solange Arrolho, Dr. Jorge Porto, Dr. Marcelo Brito, Dra. Carolina Dória, Dr. Mário de Pinna e Michel Donato, Miliany Campos, Rômulo Paixão pela doação e/ou empréstimo de amostras biológicas.
Ao senhor Ademir, Sr. Erzídio, Seu Gaúcho da Ponte, Seu Miguel Pires, Dona Julita da Colônia de Pescadores de Sinop, Seu Walter Bioldi, ao Rogério de Juína por toda ajuda no campo e, também, por colaborarem com o meu projeto.
Aos companheiros da Lagoa do Sino, Thales Medeiros, Leonardo Niero, André Pereira, Caetano Troiani, Thiago Calsolari e Sinara Dal Farra por terem me auxiliado durante o período que em precisei me afastar para finalizar as atividades do meu doutoramento.
Niero e Leandro Silva pelas incontáveis e longas caronas até São Carlos e, sobretudo, pelas muitas horas de risadas.
Ao Gustavo Mastrodomenico e toda “galera da SIn” por, de tempos em tempos, me socorrem quando o computador resolvia não querer colaborar! Vocês são feras!
Aos meus chefes Luiz Manoel e Alberto Carmassi por todo o apoio!
Agradeço também aos queridos amigos Alexandra Sanches, Gilmar Perbiche, Roberta Lovaglio, José David, Juliano Baltazar, Fabiana Cotrim e Vinícius São Pedro por todo o suporte e compreensão nessa fase final do doutorado!
Aos professores, à Ivanildes e ao Programa de Pós-Graduação em Genética Evolut iva e Biologia Molecular (PPGGEv) por toda assistência.
A todos os amigos do LabBMC, velhos e novos. Gostaria de nominalmente agradecer um por um, mas não quero esquecer ninguém. Muita gente passou por aqui ao longo desses quase sete anos que morei em São Carlos, e cada um teve uma participação especial na minha história. Obrigado a todos pela ótima convivência e pelo espírito de equipe, marcas registradas de nosso laboratório.
Aos membros da banca pelas valiosíssimas contribuições.
À ONG IDEA WILD pelo fornecimento de equipamentos e software.
À CAPES pela concessão da bolsa, a qual foi extremamente importante para a minha manutenção em São Carlos.
E, por fim, a toda minha família, meus queridos pais e amigos, que mesmo estando longe fisicamente, sempre fizeram as distâncias parecerem menores. Agradeço a todos vocês pelo amor incondicional, amizade e carinho. Obrigado!
“The saddest aspect of life right now is that science gathers knowledge faster than society gathers wisdom”
Isaac Asimov
“A menos que modifiquemos nossa maneira de pensar, não seremos capazes de resolver os problemas causados pela forma como nos acostumamos a ver o mundo”
coloração cinza prateada, com faixas transversais escuras e inconspícuas na nadadeira caudal. Esta espécie possui ampla distribuição nas bacias do rio Amazonas e do rio Tocantins, e destaca-se pela grande importância econômica e social em virtude da pesca de subsistênc ia. Devido às incertezas recentemente levantadas acerca da validade da espécie, este trabalho se propôs a acessar a diversidade genética de P. nigricans na região do escudo brasileiro e caracterizar parâmetros genético-populacionais dessa espécie na sub-bacia do rio Tapajós durante um período não reprodutivo. Para testar a ocorrência de diversidade oculta, utiliza mos os marcadores mitocondriais COI e ATP6/8 em amostras oriundas das sub-bacias dos rios Tapajós, Xingu e Tocantins-Araguaia, e conduzimos uma análise de GMYC com o COI, considerando as sequências geradas no presente estudo e sequências do Genbank de indivíd uos amostrados em outras regiões da bacia Amazônica. As análises de estrutura populacional e diversidade genética foram realizadas para oito loci de microssatélites e para os genes ATP6/8 e a região controle do DNA mitocondrial. Tanto para o COI quanto para o ATP6/8 evidencio u-se significativa divergência entre indivíduos amostrados no rio Tapajós, com valores de distância variando entre 1% e 1,9% entre esse grupo e os demais indivíduos amostrados no escudo brasileiro. A análise do GMYC identificou que esses indivíduos constituem outra MOTU (unidade taxonômica operacional molecular), os quais foram excluídos das análises populacionais conduzidas na sub-bacia do rio Tapajós. Os dados mitocondriais e de microssatélites evidenciaram três populações geneticamente diferenciadas, Tapajós, Teles Pires e Juruena, sendo esta última a que se apresentou geneticamente mais diferenciada. As três populações avaliadas apresentaram valores de diversidade genética elevados e similares aos de outras espécies de Prochilodus, não demostrando sinais de expansão ou declínio populaciona l nos últimos 200 mil anos. Os resultados obtidos no presente estudo acerca da diversidade de P.
nigricans possuem especial relevância, uma vez que possibilitam um diagnóstico prévio do
status genético das populações de P. nigricans nos afluentes e calha principal do rio Tapajós, antes dos eventuais efeitos ocasionados pela implantação de barragens. Tais dados servirão de base para estudos futuros que visem avaliar o impacto dessas construções sobre o padrão de distribuição da diversidade genética de espécies migradoras, servindo como um importante instrumento para observar modificações na estrutura genética das populações em áreas fragmentadas por barragens, e subsidiar programas de manejo que visem a conservação da ictiofauna nestas regiões.
dark, irregular, wavy, bar-like patterns on the caudal-fin lobes. This species is widely distributed in the Amazon and Tocantins river basins and stands out for its great economic importance and social relevance due to subsistence fisheries. Because of the uncertaint ies recently raised regarding the validity of the species, the aims of this work were to access the genetic diversity of P. nigricans in the region of the Brazilian shield and to characterize the genetic-population parameters of this species in the sub-basin of the Tapajós river during a non-reproductive period. In order to test the occurrence of hidden diversity, we used the mitochondrial markers COI and ATP6/8 in samples from the Tapajós, Xingu and Tocantins-Araguaia sub-basins, and conducted a GMYC analysis with COI, considering the sequences generated in the present study and Genbank sequences of individuals sampled in other regions of the Amazon basin. Population structure and genetic diversity analyzes were performed using eight microsatellite loci and, the ATP6/8 genes and the mitochondrial DNA control region. For both COI and ATP6/8, there was a significant divergence between individuals sampled in the Tapajós river, with genetic distance values ranging from 1% to 1.9% between this group and the other individuals sampled in the Brazilian shield. The GMYC analysis identified that these individuals constitute another MOTU (molecular operational taxonomic unit), which were excluded from the population analyzes conducted in the Tapajós sub-basin. Mitochondrial and microsatellite data evidenced three genetically differentiated populations, Tapajós, Teles Pires and Juruena, the latter of which was genetically more differentiated. The three evaluated populations presented high and similar genetic diversity values to those of other species of
Prochilodus and showed no signs of population expansion or decline in the last 200 thousand
years. The results obtained in the present study on the diversity of P. nigricans are of particular relevance, since they make possible a previous diagnosis of the genetic status of P. nigricans populations in the tributaries and the main channel of the Tapajós river, before the eventual effects caused by the implantation of dams. Such data will serve as a basis for future studies to evaluate the impact of these constructions on the distribution pattern of the genetic diversity of migratory species, serving as an important tool to observe changes in the genetic structure of populations in areas fragmented by dams, and to subsidize management programs that aim at the conservation of the ichthyofauna in these regions.
Página INTRODUÇÃO GERAL
Figura 2.1 Mapa da sub-bacia do rio Tapajós. 21
Figura 2.2 Exemplar de curimbatá, Prochilodus nigricans. 24
CAPÍTULO I
Figura I.1 Mapa com os pontos de amostragem nas sub-bacias dos rios Tapajós, Xingu e Tocantins-Araguaia.
35
Figura I.2 Inferência Bayesiana usada para delimitar linhagens de Prochilodus
nigricans na bacia Amazônica usando a análise GMYC. Os clados
azul e verde representam, respectivamente, os clados do oeste e do leste da Amazônia. Clado laranja representa a linhagem recém-detectada (Cluster 2). Valores de probabilidade posteriores (> 0,99) são representados por asteriscos acima dos nós.
39
Figura I.S1 Redes haplotípicas de Prochilodus nigricans amostrados dentro das sub-bacias dos rios Tapajós, Xingu e Tocantins-Aragua ia, mostrando a relação de amostras por haplótipo. (A) ATP6/8. (B) COI.
51
CAPÍTULO II
Figura II.1 Mapa da área de estudo com destaque para os pontos de coleta de
Prochilodus nigricans.
56
Figura II.2 Prancha com imagens das atividades de coleta. A= Rio Teles Pires, município de Sorriso. B= Ponte sobre o rio do Sangue, afluente do rio Juruena. C e D= Fixação da rede de emalhar. E= Captura e
Marcas de ranhuras nas rochas resultantes do hábito detritívoro de
Prochilodus nigricans.
Figura II.3 Gráficos de estruturação genética realizados no programa BAPS com os marcadores ATP6/8 e d-loop e de dinâmica populaciona l realizado no BEAST somente com os dados de d-loop. A= Estrutura populacional de Prochilodus nigricans utilizando o marcador ATP6/8. B= Estrutura populacional de Prochilodus nigrica ns utilizando o marcador d-loop. C= Gráfico do BSP da população Juruena. D= Gráfico do BSP da população Teles Pires. E= Gráfico do BSP da população Tapajós. As barras de mesma cor nos gráficos de estruturação representam o mesmo grupo populacional e os números de cada grupo representam os locais de coleta (1-rio Sangue, 2-rio Arinos, 3-rio Vermelho, 4-Cotriguaçu, 5-Sorriso, 6-Sinop, 7-Colíder, 8-rio Apiacás e 9-rio Tapajós). Nos gráficos de dinâmica populacional, o eixo y representa tamanho populacional x tempo de geração (medido em milhões de anos) e o eixo x representa o tempo (indicado em mil anos atrás). O tempo de geração é medido em milhões de anos.
65
Figura II.4 Rede de haplótipos baseada na variação dos genes ATP6/8 nas populações amostrais de Prochilodus nigricans da sub-bacia do rio Tapajós. As cores referem-se aos pontos amostrais ao longo da sub-bacia e os traços transversais correspondem à quantidade de passos mutacionais entre os haplótipos.
68
Figura II.5 Rede de haplótipos baseada na variação do marcador d-loop nas populações amostrais de Prochilodus nigricans da sub-bacia do rio Tapajós. As cores referem-se aos pontos amostrais ao longo da sub-bacia e os traços transversais correspondem à quantidade de passos mutacionais entre os haplótipos.
probabilidade médio e valores de DeltaK, segundo Evanno (2005).
Figura II.7 Gráficos da probabilidade de atribuição de indivíduos de
Prochilodus nigricans. As linhas verticais representam a probabilidade de os indivíduos pertencerem aos grupos inferidos, sendo estes indicados pelas diferentes cores. A) K=2. B) K=3.
72
Figura II.8 Gráfico com o número de clusters (K=3) mais provável fornecido pelo pacote Geneland
73
Figura II.9 Mapas de probabilidade posterior de atribuição espacial das populações amostrais de Prochilodus nigricans na sub-bacia do rio Tapajós. Agrupamento espacial sugere três clusters distintos ao longo da área geográfica estudada (Membership).
74
Figura II.10 Gráfico da análise discriminante de componentes principa is evidenciando a existência de três populações distintas de
Prochilodus nigricans dentro da sub-bacia do rio Tapajós. JUR=
Juruena. TEL= Teles Pires. TAP= Tapajós.
75
Figura A Gráfico da probabilidade de atribuição de indivíduos de
Prochilodus nigricans, considerando indivíduos coletados no rio
Apiacás. As linhas verticais representam a probabilidade de os indivíduos pertencerem aos grupos inferidos, sendo estes indicados pelas diferentes cores.
Página CAPÍTULO I
Tabela I.S1 Dados de coleta das amostras utilizadas no presente estudo. aAmostra amplificada com o COI. bAmostra amplificada com o ATP6/8.
49
Tabela I.S2 Números de acesso das sequências de COI de Prochilodus nigricans obtidas no GenBank.
50
CAPÍTULO II
Tabela II.1 Informações sobre os pontos de coleta de Prochilodus nigricans ao longo da sub-bacia do rio Tapajós. As coordenadas geográficas são dadas em graus decimais. N= número de indivíduos utilizados no presente estudo.
57
Tabela II.2 Quantidade de indivíduos de Prochilodus nigricans empregados nas análises com mtDNA, por ponto de coleta ao longo da sub-bacia do rio Tapajós.
60
Tabela II.3 Diferenciação genética par-a-par entre indivíduos de Prochilodus
nigricans na sub-bacia do rio Tapajós, estimada através de
marcadores mitocondriais. Para cada combinação são fornecidos os valores de ΦST (com o p e o desvio-padrão). JUR = Juruena, TEL= Teles Pires, TAP = Tapajós. Valores significativos (p < 0,05) encontram-se com asterisco.
66
Tabela II.4 Análise de Variância Molecular (AMOVA) das populações estudadas de Prochilodus nigricans da sub-bacia do rio Tapajós utilizando os marcadores mitocondriais ATP6/8 e d-loop, com os valores de porcentagem da variação dentro e entre as populações.
são fornecidos o número de sequências analisadas (N), número de sítios polimórficos (S), número de haplótipos (h), diversida de haplotípica (Hd) e diversidade nucleotídica (π).
Tabela II.6 Diferenciação genética par-a-par entre indivíduos de Prochilodus
nigricans na sub-bacia do rio Tapajós, estimada através de
marcadores microssatélites. Para cada combinação são fornecidos os valores de FST (com o p e o desvio-padrão), FST calculado com a correção ENA (IC 95%) no software FreeNA e DEST (com o p). JUR = Juruena, TEL= Teles Pires, TAP = Tapajós. Valores significat i vos (p < 0,05) encontram-se destacados em negrito.
75
Tabela II.7 Análise de Variância Molecular (AMOVA) das populações estudadas de Prochilodus nigricans da sub-bacia do rio Tapajós com oito locos microssatélites, com os valores de porcentagem da variação dentro e entre as populações.
75
Tabela II.8 Parâmetros de variação genética nas populações amostrais de
Prochilodus nigricans baseados em oito locos microssatélites. Para
cada loco são apresentados o número de indivíduos (N), número de alelos (Na), número de alelos efetivos (Ne), número de alelos privados (Ap), riqueza alélica (Ra), heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He), conteúdo de informação polimórfica (PIC), coeficiente de endogamia (FIS), valores de p para déficit de heterozigotos (pL), valores de p para excesso de heterozigoto (pS), desvios no equilíbrio de Hardy-Weinberg (pHWE). Valores significativos para FIS encontram-se em itálico (p= 0.00208); valores significativos de p para EHW (0,006 < α <0,05) após correção sequencial de Bonferroni encontram-se com asteriscos.
anelamento.
Tabela B Painel de loci microssatélites polimórficos para espécies de
Prochilodus utilizados no presente trabalho. N= número de alelos.
95
AMOVA Análise de variância molecular
ATP6/8 Subunidades 6 e 8 da ATP sintase
BIC Critério de informação Bayesiana
BSP Bayesian Skyline Plot
CEUA Comitê de Ética em Uso Animal da UFSCar
COI Subunidade I da citocromo c oxidase
DAPC
Análise discriminante de componentes principais (Discriminant
Analysis of Principal Components)
DNA Ácido desoxirribonucleico
EHW Equilíbrio de Hardy-Weinberg
EPE Empresa de Pesquisas Energéticas
ESS Tamanho efetivo da amostragem (Effective Sample Size)
FIS Coeficiente de endogamia
FST Índice de fixação de Wright
GMYC Generalized Mixed Yule-coalescent
He Heterozigosidade esperada
Ho Heterozigosidade observada
IUCN
União Internacional para Conservação da Natureza (World
Conservation Union)
IB Inferência Bayesiana
IBD Isolamento por distância (Isolation by distance)
ICMBio Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade
K2P Kimura 2-parâmetros
MCMC Monte Carlo via Cadeias de Markov (Markov chain Monte Carlo)
Na Número de alelos
pb Pares de base
PCH Pequena central hidrelétrica
PCR Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction)
PEG Polietilenoglicol
PHE Plano Hidroviário Estratégico
PIC Conteúdo de informação polimórfica
SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade
SSRs Sequências simples repetidas (Simple Sequence Repeats)
UFSCAR Universidade Federal de São Carlos
1 APRESENTAÇÃO ... 18
2 INTRODUÇÃO GERAL ... 19
2.1 Genética da Conservação ... 20
2.2 Área de estudo: Sub-bacia do rio Tapajós ... 21
2.3 A espécie Prochilodus nigricans Agassis, 1829 ... 23
3 REFERÊNCIAS ... 25
CAPÍTULO 1: Diversidade oculta em Prochilodus nigricans: detecção de uma nova linhagem na sub-bacia do rio Tapajós ... 30
Resumo ... 32
I.1 Introdução ... 33
I.2 Material e métodos ... 34
I.2.1 Amostragem e requerimentos éticos ... 34
I.2.2 Extração, amplificação e sequenciamento de DNA ... 36
I.2.3 Análises moleculares ... 36
I.3. Resultados e discussão... 38
Materiais Suplementares ... 40
Agradecimentos ... 40
Contribuições do autor ... 41
Conflitos de interesse ... 41
Referências ... 42
CAPÍTULO II: Estrutura genético-populacional de Prochilodus nigricans na sub-bacia do rio Tapajós ... 52
II.1 Introdução ... 53
II.2 Hipóteses e objetivos ... 54
II.2.1 Hipóteses ... 54
II.2.2 Objetivo geral ... 55
II.2.2 Objetivos específicos ... 55
II.3 Material e métodos... 56
II.3.1 Amostragem ... 56
II.3.2 Conduta ética e legal ... 59
II.3.3 Extração de DNA e amplificações ... 59
II.3.4.1 Análise com DNA mitocondrial ... 60
II.3.4.2 Análises dos locos microssatélites ... 62
II.4. Resultados ... 64
II.4.1 DNA mitocondrial ... 64
II.4.1.1 Edição de sequências, estruturação populacional e demografia histórica ... 64
II.4.1.2 Diversidade genética e redes haplotípicas ... 66
II.4.2 Microssatélites ... 70
II.4.2.1 Estruturação genética ... 70
II.4.2.2. Estimativa de diversidade genética ... 76
II.5 Discussão ... 78
II.5.1. Implicações para a conservação ... 82
II.6 Considerações finais ... 84
Referências ... 85
Anexo ... 95
1 APRESENTAÇÃO
Para melhor posicionar o leitor e apresentar o conteúdo de nosso estudo, esta tese foi organizada em uma Introdução Geral e dois capítulos, sendo que o primeiro deles apresentado na forma de artigo científico, aqui traduzido para o português. No Capítulo I, intitulado “Diversidade oculta em Prochilodus nigricans: detecção de uma nova linhagem na sub-bacia do rio Tapajós” objetivamos testar a hipótese de que o escudo brasileiro abriga diferentes linhagens de P. nigricans, sendo os indivíduos dessa região pertencentes a mais de uma unidade taxonômica molecular operacional. Os achados do Capítulo I foram extremamente importantes para condução das análises posteriores que estão apresentadas no Capítulo II. Além de um melhor conhecimento acerca da real diversidade existente, a detecção e delimitação de unidades moleculares distintas elimina eventuais ruídos nas análises e favorece uma interpretação adequada dos resultados, uma vez que a diversidade populacional verificada pode ser atribuída a uma única MOTU.
Em um cenário de grandes transformações e de perda de diversidade promovidas pelas implantações de empreendimentos hidrelétricos, estudos que tem por finalidade avaliar o status de populações, especialmente de peixes, são extremamente importantes pois geram subsídios para que ações de manejo mais eficazes sejam tomadas. Nesse contexto, o Capítulo II, intitulado “Estrutura genético-populacional de Prochilodus nigricans na sub-bacia do rio Tapajós” teve por objetivo estimar parâmetros genético-populacionais e avaliar a estrutura genética de populações dessa espécie de peixe em uma sub-bacia Amazônica que ainda não sofreu severamente os impactos promovidos pelos barramentos, mas que, devido ao seu elevado potencial energético, tem ocupado uma posição de destaque no cenário nacional no que tange à construção desses empreendimentos.
Essa pesquisa ressalta não apenas a importância de estudos diagnósticos prévios, como também traz algumas considerações importantes sobre P. nigricans e as implicações desses estudos para a conservação da ictiofauna, em especial, na área de estudo. Para cada uma das seções apresentadas nesta tese, nós disponibilizamos suas próprias referências bibliográficas. Por fim, sumarizamos nossas conclusões com relação à pesquisa desenvolvida.
2 INTRODUÇÃO GERAL
Apesar de toda a água doce do mundo representar apenas 0,01% do total e estar distribuída em uma faixa equivalente a 0,8% da superfície do planeta, os ambientes dulcíco las abrigam uma porção significativa da biodiversidade (DARWALL et al., 2008; DUDGEON et al., 2006), com estimativas superiores a 126 mil espécies (BALIAN et al., 2008). Estes ecossistemas, no entanto, encontram-se extremamente ameaçados devido a fatores como a superexploração, a poluição, a introdução de espécies exóticas, a alteração do curso de rios, a proliferação de barragens, além das mudanças climáticas (BECKER; CRICHIGNO; CUSSAC, 2017; CUCHEROUSSET; OLDEN, 2011; SALA et al., 2000; TANIWAKI et al., 2017). A biodiversidade nesses ambientes tem apresentado sinais de declínio (GARDNER et al., 2015; GLEICK; PALANIAPPAN, 2010), sendo o grupo dos peixes de água doce aquele cujo número de espécies extintas é o mais expressivo em comparação com os demais vertebrados (BURKHEAD, 2012).
O estabelecimento de medidas que visem mitigar os efeitos das ações antrópicas negativas sob a biodiversidade configura um tema de extrema importância (MATTHEWS, 2016), sobretudo em países megadiversos, tais como algumas nações africanas, asiáticas e latino-americanas (WINEMILLER et al., 2016). Nesse contexto, o Brasil atrai a atenção mundial por despontar como uma das principais nações quando o quesito é diversidade biológica (COLLEN et al., 2014; MYERS et al., 2000). Segundo o Ministério do Meio Ambiente (MMA, 2012), o país detém 9% da biodiversidade do planeta, tendo sido registradas no Catálogo Taxonômico da Fauna Brasileira, até o momento, mais 118 mil espécies válidas (BRASIL, 2018). Os registros mostram que a grande maioria dos taxons identificados pertence ao filo Arthropoda (com quase 94 mil espécies), sendo este seguido pelos cordados, os quais representam 10% do total. Já para os peixes ósseos marinhos e continentais, existem cerca de 4400 espécies registradas.
Apesar da riqueza de espécies da ictiofauna brasileira, e do crescente número de novas descrições, tendo mais de 260 taxons sido descritos apenas entre os anos de 2001 e 2005 (BUCKUP; MENEZES; GHAZZI, 2007), aspectos da biologia, comportamento, ecologia e genética de diversas espécies de peixes ainda são incipientes ou completamente desconhecidos. Além disso, a rapidez com que os ambientes dulcícolas têm sido impactados tem levado diversas espécies a figurar listas de espécies ameaçadas de extinção (ICMBIO, 2016) ou mesmo a desaparecerem da natureza sem ao menos terem sido efetivamente estudadas.
2.1 Genética da Conservação
A necessidade de conservar a diversidade genética é reconhecida pela União Internacional para Conservação da Natureza, World Conservation Union (IUCN), o maior grupo internacional de conservação, como um dos três pilares para a manutenção da biodiversidade (FRANNKHAM; BALLOU; BRISCOE, 2008). Nesse contexto, a Genética da Conservação surge como uma disciplina que se concentra nos efeitos da distribuição da variabilidade genética atual sobre a sobrevivência das espécies a longo prazo (WAN et al., 2004). O seu grande desafio consiste justamente no manejo de populações fragmentadas a fim de minimizar a depressão endogâmica e a perda de diversidade genética (ALLENDO RF; LUIKART; AITKEN, 2013).
Diversos são os grupos animais e vegetais que têm sido estudados sob a óptica da Genética da Conservação, assim como as ferramentas utilizadas. Para o grupo dos peixes, os microssatélites ou Simple Sequence Repeats (SSRs) correspondem a um dos marcadores moleculares mais amplamente empregados em estudos populacionais (PIORSKI et al., 2008). Os microssatélites consistem em sequências curtas, de poucos nucleotídeos (1-6 pares de bases) repetidos em tandem e amplamente distribuídas pelo genoma, que apresentam codominância e um alto grau de polimorfismo (TAUTZ, 1989). Esses marcadores permitem a individualização de amostras e podem fornecer informações sobre fluxo gênico, distribuição variabilidade genética, detecção de reduções recentes do tamanho populacional, além de outras abordagens (ALLENDORF, 2017; SARANHOLI; CHÁVEZ-CONGRAINS; GALETTI, 2017).
O uso de marcadores do DNA mitocondrial (mtDNA), por sua vez, também tem sido empregado em estudos que podem ter implicações sobre a conservação da biodiversidade. Aspectos que envolvem a resolução de questões taxonômicas, descrição de novas espécies (ou complexos de espécies), além da identificação de espécies a partir de amostras biológicas de tecidos (e.g. identificação molecular de fauna atropelada e de amostras de caça apreendida, etc.) (MACHADO et al., 2017; PIRES et al., 2017; RODRÍGUEZ-CASTRO et al., 2017) são extremamente importantes do ponto de vista da conservação. Somado a isso, o acesso à diversidade genética intrapopulacional, bem como o estudo de eventos populacionais como a detecção de sinais de declínio ou expansão em populações naturais (FERREIRA et al., 2017; MONDIN et al., 2018), também constituem temas estudados a partir do emprego de marcadores do genoma mitocondrial (ou mitogenoma), como é caso da região controle, da subunidade I da citocromo c oxidase (COI) e das subunidades 6 e 8 da ATP sintase (ATP6/8) (SILVA et al., 2016).
2.2 Área de estudo: Sub-bacia do rio Tapajós
A sub-bacia do rio Tapajós (Figura 2.1) destaca-se por ser uma das maiores regiões hidrográficas que compõem a bacia Amazônica, abarcando um total de 493.986 ha (ANA, 2015) e contribuindo com aproximadamente 6% de toda água doce carreada para o rio Amazonas (LATRUBESSE; STEVAUX; SINHA, 2005). Localizada na porção central da bacia Amazônica, sua área abrange parte dos estados do Amazonas, Mato Grosso e Pará, e abriga porções dos biomas Cerrado e Amazônico (SCOLES, 2016). O clima na região do Tapajós é considerado tropical úmido, sendo o período mais chuvoso compreendido entre os meses de dezembro e março, no verão e outono, ao passo que menores precipitações são detectadas no inverno e primavera, entre junho e setembro (INMET, 2018). A sazonalidade pluviométrica na porção sul da sub-bacia, no entanto, é um pouco diferente da extensão norte, apresentando uma maior estação seca (SCOLES, 2016).
Figura 2.1 Mapa da sub-bacia do rio Tapajós.
O rio Tapajós apresenta uma extensão de 780 km e sua formação se dá após a confluência dos rios Juruena e Teles Pires, os quais constituem duas sub-bacias de segunda ordem (ICMBIO, 2011a), em Barra de São Manoel, entre os estados do Mato Grosso (MT) e do Pará (PA). Já o tributário Teles Pires, assim como os demais rios da sub-bacia, apresenta águas claras e percorre uma extensão de 1.482 km desde suas nascentes, nas serras Azul e do Finca Faca, até o encontro com o e rio Juruena. Esse rio se constitui um divisor natural entre os estados do MT e PA, sendo sua região hidrográfica quase que inteiramente localizada no estado de Mato Grosso, perfazendo uma área aproximada de 142 mil km2. Dentre seus principa is tributários destacam-se os rios Verde, Paranaíta, Apiacás e Ximari na margem esqueda e os rios Paranatinga, Caiapó, Peixoto Azevedo, São Benedito e Cururu-Açu, na margem direira (EPE, 2011). No médio Teles Pires, mais precisamente à montante da foz do rio Apiacás, localiza m -se várias corredeiras, nas quais -se situava a região de Sete Quedas, a qual encontra- -se atualmente submersa devido à construção da usina hidrelétrica (UHE) Teles Pires. Já no seu baixo curso, cuja área é de aproximadamente 39.137,44km², o rio Teles Pires é mais largo e as águas são vagarosas (ICMBIO, 2011a; OHARA et al., 2017).
O rio Juruena, por sua vez, possui 1.240 km de extensão e é o que mais contribui para a vazão do rio Tapajós. Suas nascentes estão localizadas na Chapada dos Parecis, a uma altura média de 750 m, na porção mais ocidental do escudo brasileiro (ASSIS et al., 2015; OHARA; LOEB, 2016). A região hidrográfica do rio Juruena tem uma área de 188.000km2, cheia de meandros, com diversas corredeiras e cachoeiras presentes ao longo de seu curso. Seus principais tributários são os rios Arinos, Sangue e Pagagaio e, na sua porção mais baixa, os rios São Tomé, Santana e Matrinxã ou São João da Barra. Suas águas claras possuem coloração variando entre o verde e o verde-oliva (ICMBIO, 2011a, 2011b).
A sub-bacia do rio Juruena situa-se em uma região que possui 27 unidades de conservação, 35 terras indígenas, além de mais de 200 assentamentos, sendo a população humana estimada nesta área superior a 1.200.000 habitantes (MINISTÉRIO DOS TRANSPORTES, 2013). Atualmente, ela se configura como uma região de destaque no cenário nacional, sendo considerada uma área estratégica para implantação de empreendime ntos hidrelétricos, visto que seus principais rios (Tapajós, Apiacás, Jamanxin, Teles Pires e Juruena), juntos, têm um pontencial energético para gerar cerca de 17.500 MW. Somado a isso, os rios Teles Pires e Tapajós estão incluídos no Plano Hidroviário Estratégico - PHE, o qual os indica como área prioritária para navegação fluvial, uma vez que favorecerá o escoamento da produção
do estado do Mato Grosso para o rio Amazonas e, consequentemente, para o oceano Atlânt ico (ANA, 2015; MINISTÉRIO DOS TRANSPORTES, 2013), gerando mais divisas.
2.3 A espécie Prochilodus nigricans Agassis, 1829
Prochilodus nigricans, conhecida popularmente como curimbatá, destaca-se como
uma das espécies com a maior distribuição na bacia do rio Amazonas, sendo encontrada na sua calha e nos principais tributários, além da bacia do rio Tocantins (CARVALHO; MERONA, 1986). É um peixe de corpo alto, coloração cinza prateada, faixas transversais escuras e inconspícuas no dorso, podendo ultrapassar os 40 cm de comprimento (MOTA; RUFFINO, 1997) (Figura 2.2). Assim como os demais representantes da família Prochilodontidae, P.
nigricans é uma espécie que possui alterações em sua estrutura buco-faríngea (e.g. dentes
diminutos e espatulados, e lábios carnosos em forma de ventosa), que favorecem a coleta e o processamento de microorganismos, detritos, perifítons, além de matéria orgânica em decomposição, geralmente depositada no fundo dos rios (DOS SANTOS; FERREIRA; ZUANON, 2006). Essa espécie, assim como os demais peixes detritívoros migradores, tem acesso a uma abundante fonte de energia (CASTRO; VARI, 2004; FLECKER, 1996) e contribui para modular o fluxo de carbono e a produtividade dos ecossistemas (TAYLO R; FLECKER; HALL, 2006).
Trata-se de uma espécie que apresenta rápido crescimento, alta fecundidade atrelada a um período curto de desova e que não possui qualquer tipo de cuidado parental. Segundo Winemiller (1989), esses traços biológicos correspondem a uma estratégia sazonal, a qual lhe permite tirar proveito tanto das variações temporais quanto sazonais, garantindo aos indivíd uos juvenis maiores chances de crescimento e sobrevivência, além de propiciar uma rápida reposição populacional (SILVA; STEWART, 2017). Esses peixes, que são potamódramos, organizam-se em grandes cardumes para realizar migrações com fins reprodutivos, ou em resposta a fatores bióticos e abióticos (SILVA; STEWART, 2006). Segundo a pesquisa de Montreuil e Rodriguez (2001) realizada com curimbatás em uma porção peruana da bacia amazônica, os machos e as fêmeas da espécie atinge m seu comprimento médio de maturação com 23,4 e 24,3 cm, respectivamente, e apresentam um período de reprodução no rio Amazonas entre os meses de dezembro e março, com o ápice em janeiro.
Aparentemente essa espécie possui mais de um tipo de padrão migratório. Nos rios Amazonas e Madeira, indivíduos adultos de P. nigricans migram entre sucessivas áreas de várzea no período seco, deixando-as durante as cheias para desovar na entrada dos lagos. Já no
rio Tocantins, antes da construção da barragem de Tucuruí, eles abandonavam as áreas alagadas durante o período de seca e migravam rumo à montante. A desova só acontecia em uma área extensa na porção alta do rio após a elevação do nível das águas, sendo posteriormente os ovos e larvas carreados passivamente rio abaixo (ARAUJO-LIMA; RUFFINO, 2003).
Figura 2.2. Exemplar de curimbatá, Prochilodus nigricans.
Foto: Ueslei Lopes.
Conhecidas popularmente como curimbatá no Brasil e como sábalo, bocachico e
boquichico na Bolívia, Colômbia e Peru, respectivamente (ARAUJO-LIMA; RUFFINO, 2003),
as espécies viventes desse gênero estão entre as mais abundantes e amplamente distribuídas da América do Sul (SIVASUNDAR; BERMINGHAM; ORTI, 2001). Prochilodus nigricans é extremamente importante do ponto de vista econômico, destacando-se com uma das espécies mais pescadas nas águas continentais brasileiras (FERRAZ; BARTHEM, 2016; FERRAZ; LIMA; AMARAL, 2012), além de muito utilizada na pesca de subsistência (ISAAC et al., 2015; ZACARKIM et al., 2015).
De acordo com uma das maiores revisões taxonômicas da família Prochilodont idae baseada em dados morfológicos (CASTRO; VARI, 2004), o gênero Prochilodus seria constituído por 13 espécies nominais, das quais apenas três (Prochilodus britskii Castro, 1993,
Prochilodus nigricans Agassis, 1829 e Prochilodus rubrotaeniatus Jardine, 1841) têm registros
para a bacia Amazônica. Contudo, a partir do uso de marcadores nucleares e mitocondriais, a validade taxonômica de P. nigricans foi contestada, devido a detecção de duas grandes
linhagens na bacia amazônica, uma delas constituída por indivíduos das sub-bacias Tapajós e Tocantins-Araguaia e outra pelos demais indivíduos da bacia amazônica, além de representantes de P. rubrotaeniatus agrupados em ambos os clusters (MELO et al., 2016). Em outro trabalho, os autores reduziram as unidades que compõem o gênero Prochilodus a oito linhagens, sendo quatro delas formadas por quatro espécies nominais válidas e as demais constituídas por espécies que taxonomicamente requerem revisão (MELO et al., 2018).
3. REFERÊNCIAS
ALLENDORF, F.; LUIKART, G.; AITKEN, S. Conservation and the genetics of
populations, 2nd edition. [s.l.] John Wiley & Sons, 2013.
ALLENDORF, F. W. Genetics and the conservation of natural populations: allozymes to genomes. Molecular Ecology, v. 26, n. 2, p. 420–430, 2017.
ANA. Conjuntura dos recursos hídricos no Brasil: regiões hidrográficas brasileiras . Brasília: [s.n.].
ARAUJO-LIMA, C. A. R. M.; RUFFINO, M. L. Migratory fishes of the Brazilian Amazon. In: CAROLSFELD, J. et al. (Eds.). . Migratory fishes of South America: biology and
conservation status. [s.l: s.n.]. p. 237–301.
ASSIS, C. et al. Hydroclimatic regionalization of the Tapajós river watershed. Revista
Geográfica Acadêmica, v. 99, n. 11, p. 32–51, 2015.
BALIAN, E. V. et al. The Freshwater Animal Diversity Assessment: An overview of the results.
Hydrobiologia, v. 595, n. 1, p. 627–637, 2008.
BECKER, L. A.; CRICHIGNO, S. A.; CUSSAC, V. E. Climate change impacts on freshwater fishes: a Patagonian perspective. Hydrobiologia, p. 1–18, 2017.
BRASIL. Catálogo Taxonômico da Fauna do Brasil. Disponível em: <http://fauna.jbrj.gov.br>. Acesso em: 21 maio. 2018.
BUCKUP, P. A.; MENEZES, N. A.; GHAZZI, M. S. Catálogo das espécies de peixes de água
doce do Brasil. Rio de Janeiro: Museu Nacional, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2007.
BURKHEAD, N. M. Extinction Rates in North American Freshwater Fishes, 1900–2010.
CARVALHO, J. L. DE; MERONA, B. DE. Estudos sobre dois peixes migratórios do Baixo Tocantins, antes do fechamento da barragem do Tucurui. Amazoniana, v. 9, n. 4, p. 595–607, 1986.
CASTRO, R. M. C.; VARI, R. P. Detritivores of the South American fish family Prochilodontidae (Teleostei:Ostariophysi:Characiformes) : a phylogenetic and revisio nary study. Smithsonian Contributions to Zoology, n. 622, p. 1–189, 2004.
COLLEN, B. et al. Global patterns of freshwater species diversity, threat and endemism. Global
Ecology and Biogeography, v. 23, n. 1, p. 40–51, 2014.
CUCHEROUSSET, J.; OLDEN, J. D. Ecological Impacts of Non-native Freshwater Fishes.
Fisheries Bethesda, v. 36, n. 5, p. 215–230, 2011.
DARWALL, W. et al. Freshwater biodiversity – a hidden resource under threat. In: VIÉ, J. C.; HILTON-TAYLOR, C.; STUART, S. N. (Eds.). . The 2008 Review of The IUCN Red List
of Threatened Species. Gland: IUCN, 2008. p. 1–11.
DOS SANTOS, G. M.; FERREIRA, E. J. G.; ZUANON, J. A. S. Peixes comerciais de
Manaus. [s.l.] IBAMA, PróVarzea, 2006.
DUDGEON, D. et al. Freshwater biodiversity : importance , threats , status and conservatio n challenges. v. 81, p. 163–182, 2006.
EPE. RIMA: Relatório de Impacto Ambiental da Usina hidrelétrica São ManoelBrasília, 2011. Disponível em: <http://www.epe.gov.br/sites-pt/publicacoes-dados-abertos/publicacoes/PublicacoesArquivos/publicacao-247/Rima - UHE São Manoel.pdf> FERRAZ, P.; BARTHEM, R. Estatística do monitoramento do desembarque pesqueiro na
região de Tefé – Médio Solimões: 2008-2010. Tefé: Instituto de Desenvolvimento Sustentáve l
Mamirauá, 2016.
FERRAZ, P.; LIMA, D.; AMARAL, E. Estatística do Monitoramento do Desembarque
Pesqueiro na Região de Tefé - Médio Solimões: Os primeiros 16 anos (1992-2007). Tefé:
Instituto de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá, 2012.
FERREIRA, D. G. et al. Genetic structure and diversity of migratory freshwater fish in a fragmented Neotropical river system. Reviews in Fish Biology and Fisheries, v. 27, n. 1, p. 209–231, 2017.
FLECKER, A. S. Ecosystem Engineering by a Dominant Detritivore in a Diverse Tropical Stream. Ecology, v. 77, n. 6, p. 1845–1854, 1996.
FRANNKHAM, R.; BALLOU, J. D.; BRISCOE, D. A. Fundamentos de Genética da
Conservação. Ribeirão Preto: Editora SBG, 2008.
GARDNER, R. C. et al. State of the World’s Wetlands and Their Services to People: A
Compilation of Recent Analyses. 12th Meeting of the Conference of the Parties to the
Convention on Wetlands (Ramsar, Iran, 1971). Anais...Punta del Leste: Ramsar Briefing Note 7, 2015Disponível em: <www.ramsar.org>
GLEICK, P. H.; PALANIAPPAN, M. Peak water limits to freshwater withdrawal and use.
Proceedings of the National Academy of Sciences , v. 107, n. 25, p. 11155–11162, 2010.
ICMBIO. Plano de Manejo do Parque Nacional do Juruena. Encarte 2. Disponível em: <http://www.icmbio.gov.br/portal/images/stories/imgs-unidades-coservacao/Encarte2.pdf>. Acesso em: 18 jan. 2018a.
ICMBIO. Plano de Manejo do Parque Nacional do Juruena. Encarte 3. 2011b.
ICMBIO. Sumário Executivo Livro Vermelho da Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção . Instituto ed. Brasília: Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, 2016. INMET. Banco de Dados Metereológicos para Ensino e Pesquisa. Brasília: [s.n.]. Disponíve l em: <http://www.inmet.gov.br>.
ISAAC, V. J. et al. Artisanal fisheries of the Xingu River basin in Brazilian Amazon. Brazilian
Journal of Biology, v. 75, n. 3, p. 125–137, 2015.
LATRUBESSE, E. M.; STEVAUX, J. C.; SINHA, R. Tropical rivers. v. 70, p. 187–206, 2005. MACHADO, C. D. B. et al. DNA barcoding reveals taxonomic uncertainty in Salminus (Characiformes). Systematics and Biodiversity, v. 15, n. 4, p. 372–382, 2017.
MATTHEWS, N. People and fresh water ecosystems: pressures, responses and resilie nce.
Aquatic Procedia, v. 6, p. 99 – 105, 2016.
MELO, B. F. et al. Molecular phylogenetics of the Neotropical fish family Prochilodont idae (Teleostei: Characiformes). Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 102, p. 189–201, 2016.
MELO, B. F. et al. Little Divergence Among Mitochondrial Lineages of Prochilodus (Teleostei, Characiformes). v. 9, n. April, p. 1–9, 2018.
MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE - MMA. Brasil tem mais de 116 mil espécies da
fauna. Disponível em: <http://www.mma.gov.br/index.php/comunicacao/agenc ia -informma?view=blog&id=1386>. Acesso em: 21 maio. 2018.
MINISTÉRIO DOS TRANSPORTES. PHE: Plano Hidroviário Estratégico, 2013.
MONDIN, L. A. DE C. et al. Genetic Pattern and Demographic History of Salminus
brasiliensis: Population Expansion in the Pantanal Region during the Pleistocene. Frontiers in
Genetics, v. 9, p. 1, 2018.
MONTREUIL, V.; GARCÍA, Á.; RODRÍGUEZ, R. Biología reproductiva de “Boquichico ”
Prochilodus nigricans, en la amazonía peruana. Folia Amazónica, v. 12, p. 5–14, 2001.
MOTA, S. Q.; RUFFINO, M. L. Biologia e pesca do curimatá (Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) (Prochilodontidae) no médio Amazonas. Revista UNIMAR, v. 19, n. 2, p. 493–508, 1997.
MYERS, N. et al. Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature, v. 403, n. 6772, p. 853–858, 2000.
OHARA, W. M. et al. Peixes do rio Teles Pires: diversidade e guia de Identifcação. Goiânia : Gráfca e Editora Amazonas, 2017.
OHARA, W. M.; LOEB, M. V. Ichthyofauna of the upper Juruena river on Chapada dos Parecis, Mato Grosso, Brazil. Biota Neotropica, v. 16, n. 4, p. 1–10, 2016.
PIORSKI, N. M. et al. Contribution of conservation genetics in assessing neotropical freshwater fish biodiversity. Brazilian Journal of Biology, v. 68, n. 4, S, p. 1039–1050, 2008.
PIRES, A. A. et al. Molecular analysis reveals hidden diversity in Zungaro (Silurifor me s : Pimelodidade): a genus of giant South American catfish. Genetica, v. 145, n. 3, p. 335–340, 2017.
RODRÍGUEZ-CASTRO, K. G. et al. Using DNA barcode to relate landscape attributes to small vertebrate roadkill. Biodiversity and Conservation, v. 26, n. 5, p. 1161–1178, 2017.
SALA, O. E. et al. Global Biodiversity Scenarios for the Year 2100 Global Biodivers it y Scenarios for the Year 2100. Science, v. 287, n. March, p. 1770–1774, 2000.
SARANHOLI, B. H.; CHÁVEZCONGRAINS, K.; GALETTI, P. M. Evidence of recent fine -scale population structuring in South American Puma concolor. Diversity, v. 9, n. 4, 2017. SCOLES, R. Caracterização ambiental da bacia do Tapajós. In: ALARCON, D. F.; MILLIKAN, B.; TORRES, M. (Eds.). . Ocekadi : hidrelétricas, conflitos socioambientais e
resistência na Bacia do Tapajós. Brasília: International Rivers Brasil, 2016. p. 29–42.
SILVA, W. C. DA et al. Early Pleistocene lineages of Bagre bagre (Linnaeus, 1766) (Siluriformes: Ariidae), from the Atlantic coast of South America, with insights into the
demography and biogeography of the species. Neotropical Ichthyology, v. 14, 2016.
SILVA, E. A.; STEWART, D. J. Age structure, growth and survival rates of the commercia l fish Prochilodus nigricans (bocachico) in North-eastern Ecuador. Environmental Biology of
Fishes, v. 77, n. 1, p. 63–77, 2006.
SILVA, E. A.; STEWART, D. J. Reproduction, feeding and migration patterns of Prochilodus
nigricans (Characiformes: Prochilodontidae) in northeastern Ecuador. Neotropical Ichthyology, v. 15, n. 3, p. 1–13, 2017.
SIVASUNDAR, A.; BERMINGHAM, E.; ORTI, G. Population structure and biogeography of migratory freshwater fishes (Prochilodus: Characiformes) in in major South American rivers.
Molecular Ecology, v. 10, p. 407–417, 2001.
TANIWAKI, R. H. et al. Climate change and multiple stressors in small tropical streams.
Hydrobiologia, v. 793, n. 1, p. 41–53, 2017.
TAUTZ, D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research, v. 17, n. 16, p. 6463–6471, 1989.
TAYLOR, B. W.; FLECKER, A. S.; HALL, R. O. Loss of a harvested fish species disrupts carbon flow in a diverse tropical river. Science, v. 313, n. 5788, p. 833–836, 2006.
WAN, Q. H. et al. Which genetic marker for which conservation genetics issue?
Electrophoresis, v. 25, n. 14, p. 2165–2176, 2004.
WINEMILLER, K. O. Patterns of variation in life history among South American fishes in seasonal environments. Oecologia, p. 225–241, 1989.
WINEMILLER, K. O. et al. Balancing hydropower and biodiversity in the Amazon, Congo, and Mekong. Science, v. 351, n. 6269, p. 128–129, 2016.
ZACARKIM, C. E. et al. The panorama of artisanal fisheries of the Araguaia River , Brazil.
Versão em português do artigo que será submetido à publicação no periódico Diversity
Capítulo I
Diversidade oculta em
Prochilodus nigricans: detecção de
uma nova linhagem na sub-bacia
do rio Tapajós
CAPÍTULO I
Short communication
Diversidade oculta em Prochilodus nigricans: detecção de uma nova linhagem na sub-bacia do rio Tapajós
Ueslei Lopes1*, Pedro M. Galetti Jr1 e Patrícia Domingues de Freitas1
1Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, Rodovia Washington Luís, Km 235 - SP-310, São Carlos, SP, 13565-905, Brasil.
Phone: +55 163351-8309
E-mail: uesleilopes@gmail.com (U.L.); pmgaletti@ufscar.br (P.M.G.Jr); patdf@ufscar.br (P.D.F.)
Resumo
Prochilodus nigricans é um peixe de água doce muito abundante e amplamente distribuído pela
bacia amazônica. Sua validade taxonômica foi recentemente questionada quando diferenças genéticas entre populações da porção ocidental e oriental da bacia foram detectadas. Sabendo que o escudo brasileiro, onde a população oriental está distribuída, consiste em uma região de alta diversidade e endemismo da ictiofauna, este trabalho teve como objetivo testar a hipótese de que P. nigricans dessa região apresenta diversidade oculta. Para tanto, redes de haplótipos foram reconstruídas usando os marcadores mitocondriais COI e ATP6/8, os quais também foram utilizados para calcular as distâncias genéticas. Além disso, nós conduzimos uma abordagem de delimitação de espécies empregando o modelo GMYC (Generalized Mixed
Yule-coalescent) com sequências de COI produzidas neste estudo, e outras previamente publicadas,
incluindo indivíduos amostrados em toda a bacia Amazônica. A partir dos nossos resultados constatamos a existência de diferenciação genética significativa em P. nigricans oriental. Também reforçamos a importância de estudos que visem detectar a diversidade oculta, os quais podem abordar questões taxonômicas e certamente favorecer melhores ações de conservação.
I.1 Introdução
Os ecossistemas de água doce têm sofrido grandes impactos e transformações [1], tornando estudos com foco na descoberta e compreensão da extensão da biodiversidade vita is para sua conservação. Com mais de 5160 espécies de peixes de água doce descritas, os rios da América do Sul abrigam um terço das espécies de peixes de todo o planeta, mas a expectativa é que esse número seja 42% maior [2].
Ao longo dos anos, o emprego de ferramentas moleculares para inventariar a biodiversidade tem aumentado e revelado uma biodiversidade oculta. Esta abordagem tem ajudado a esclarecer questões taxonômicas, delimitando linhagens genéticas e auxiliado na caracterização de Unidades Taxonômicas Operacionais Moleculares (MOTUs) [3], que são conjuntos de sequências ortólogas. Sob essa perspectiva, a bacia Amazônica ocupa uma posição notável, uma vez que sua grande extensão abriga uma enorme diversidade de espécies de peixes [3], muitas das quais permanecem desconhecidas.
Prochilodus nigricans é um peixe caracídeo amazônico muito abundante, o qual
começa a migração para fins reprodutivos assim que o período de cheia dos rios se inicia [4,5]. Com uma dieta detritívora, esse peixe desempenha um papel funcional essencial nos ecossistemas, modulando os fluxos de energia e nutriente s [6]. Esta espécie também assume um importante status econômico e social no Brasil, uma vez que é uma das que dominam a produção pesqueira regional, sendo altamente utilizada para a subsistência de comunidades ribeirinhas [7,8]. Conhecido como curimbatá, este peixe é uma das três espécies do gênero encontradas na bacia do rio Amazonas e aquela que apresenta a maior distribuição geográfica nessa drenagem em comparação com espécies congenéricas [9].
Estudos recentes [10,11] questionam a validade nominal de P. nigricans e apontam a existência de duas linhagens dessa espécie, uma composta por amostras das sub-bacias do
Tapajós e Tocantins-Araguaia (aqui denominada “Clado oriental”), e outra, que inclui espécimes das terras baixas da Amazônia Ocidental e sua calha principal, além de incluir outra espécie taxonomicamente reconhecida como Prochilodus rubrotaeniatus. Considerando que o grupo oriental está distribuído no escudo brasileiro, uma área de alta diversidade ictiofauníst ica e endemismo, ainda subestimados [12], estudos que visem amostragens representativas nesta região ainda se fazem necessários para avaliar a existência de diversidade oculta dentro de P.
nigricans.
Diante desse contexto, e considerando a importância da delimitação de espécies para uma melhor estimativa da biodiversidade, o nosso objetivo consistiu em testar a hipótese de que P. nigricans oriundos do escudo brasileiro, aqui representado exclusivamente por indivíduos das sub-bacias dos rios Tapajós, Xingu e Tocantins-Araguaia, ainda esconde diversidade oculta. Para isso, nós utilizamos dois marcadores mitocondriais distintos para a reconstruir redes haplotípicas e calcular distâncias genéticas, e empregarmos uma abordagem de delimitação de espécies de um único gene baseado em sequências da subunidade 1 da citocromo c oxidase (COI) para determinar o número de unidades moleculares dentro das drenagens previamente mencionadas.
I.2 Material e métodos
I.2.1 Amostragem e requerimentos éticos
Nosso estudo foi realizado de acordo com a legislação brasileira de proteção ambienta l sob a licença SISBIO Número 41778-7 fornecida pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio/Ministério do Meio Ambiente) e aprovada pelo Comitê de Ética em Uso Animal da UFSCar (CEUA 3752060715). Nós amostramos pequenos fragmentos de
tecido de nadadeira de espécimes adultos de P. nigricans coletados nas drenagens de Teles Pires e Juruena e Tapajós (Figura I.1).
Figura I.1. Mapa com os pontos de amostragem de Prochilodus nigricans nas sub-bacias dos rios Tapajós, Xingu
e Tocantins-Araguaia.
Parte das amostras de tecidos de barbatanas da sub-bacia do rio Tapajós e outras drenagens foi fornecida por coleções científicas, pesquisadores colaboradores e pescadores ribeirinhos locais, os quais, após orientação sobre procedimentos de amostragem, forneceram os tecidos (ver Tabela Suplementar I.S1). Todas as amostras biológicas foram fixadas em etanol 96% e depositadas no Banco de Tecidos do Laboratório de Biodiversidade Molecular e Conservação da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar). Sequências adicionais de COI de P. nigricans amostrados em outras localidades, principalmente da porção ocidental da bacia Amazônica [10,11,13,14], foram obtidas no GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih. go v/ nucleotide/). A relação de sequências utilizadas é encontrada na Tabela Suplementar I.S2.
I.2.2 Extração, amplificação e sequenciamento de DNA
O DNA genômico total foi extraído utilizando o protocolo de precipitação salina descrito por Aljanabi & Martinez [15], e então submetido a eletroforese em gel de agarose 1% para aferir sua qualidade. As amostras de DNA foram quantificadas utilizando biofotôme tro Eppendorf (Eppendorf, Hamburg, Alemanha), e, posteriormente, foram preparadas alíquotas padronizadas a 50 ng/μL. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada para amplificar os genes COI (parcialmente) e as subunidade seis e oito da ATPsintase (ATPase6/8) do DNA mitocondrial (mtDNA). Os primers Fish F1 e Fish R1 e ATP 8.2_L8331 e CO3.2_H9236 foram utilizados para amplificar as regiões COI e ATP6/8, respectivame nte [16,17]. As PCRs ocorreram em um volume final de 12,5 μL contendo 50 ng de DNA template, 1,25 μL de buffer (10x), 0,2 mM de dNTPs, 1 mM de MgCl2, 0,4 μM de cada primer, 0,5 U
Taq Platinum (Invitrogen) e água destilada ultrapura. As condições de amplificação seguira m
os seguintes parâmetros para o COI: 1 ciclo inicial de desnaturação a 94 °C por 2 min, sendo seguido por 35 ciclos de 94 °C a 30 seg., 59 °C a 30 seg. e 72 °C por 1 min., finalizando com 1 ciclo de extensão final a 72°C por 10 min. Para os genes ATP6/8, empregamos 1 ciclo a 94°C por 3 min, 30 ciclos de 94 °C a 45 seg., 58°C por 1 min. e 72 °C por 1 min, e um ciclo de 72 °C por 2 min. Os produtos de PCR foram purificados com polietilenoglicol 20% (PEG) [18] com a finalidade de remover dNTPs não incorporados, o excesso de primers e eventuais bandas inespecíficas, para então serem posteriormente sequenciados em um sequenciador automatizado ABI 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA).
I.2.3 Análises moleculares
As sequências foram alinhadas com o auxílio do programa ClustalW [19] e editadas usando Geneious v.7.1.7 (Biomatters, Auckland, Nova Zelândia) [20]. As redes haplotíp icas para ambos os marcadores foram reconstruídas usando PopART (Population Analysis with
Reticulate Trees) [21], enquanto as distâncias genéticas intra e intergrupos baseadas em K2P
(Kimura 2-Parâmetros) foram estimadas com amostras das sub-bacias dos rios Tapajós, Xingu e Tocantins-Araguaia no programa MEGA v.7 [22].
Nós empregamos o modelo Generalized Mixed Yule Coalescent (GMYC) [23] para delimitar MOTUs dentro de P. nigricans a partir de sequências de COI, incluindo as sequências do GenBank. Este modelo foi executado com o pacote SPLITS (SPecies' LImits by Threshold
Statistics) [24] no R, utilizando o método single threshold e parâmetro de intervalo padrão
(intervalo = c (1,10)). O GMYC combina o modelo Yule de eventos de especiação intraespecíficos com modelos de coalescência, sendo comumente aplicado em estudos relacionados a questões taxonômicas [25–28]. Para esta análise, foi produzida uma topologia ultramétrica usando o método de Inferência Bayesiana (IB) implementado no software BEAST v.2.0 [29] através do CIPRES Science Gateway [30] (www.phylo.org). Também utilizamos o modelo de substituição nucleotídica baseado no critério de informação Bayesiana (BIC), determinado pelo programa JModeltest [22] (COI = K80), e relógio molecular relaxado com uma distribuição lognormal e o modelo de especiação birth-death, de acordo com Costa-Silva et al. [31]. Três corridas independentes das cadeias de Markov com 30 milhões de gerações foram realizadas, sendo as árvores e parâmetros salvos a cada 10000 gerações, e com 10% das primeiras topologias descartadas como burn-in. A combinação dos arquivos tree e log foi realizada com o software LogCombiner v.1.8 [32] e a mixagem apropriada dos dados foi verificada com o Tracer v1.5 [33], considerando valores do tamanho efetivo da amostra gem (ESS) de todos os parâmetros iguais ou superiores a 200. A árvore foi sumarizada com o programa TreeAnnotator v.1.8 [34] e posteriormente visualizada no software FigTree v.1.4, disponível em http://tree.bio.ed.ac.uk/software /Figueira/.
I.3 Resultados e discussão
O conjunto de dados total gerado neste estudo consistiu de 35 sequências COI e 29 ATP6/8 após o alinhamento e edição. Os fragmentos de COI variaram de 561 a 564 pb e apresentaram 26 sítios polimórficos e 16 sítios parcimoniosamente informativos. O comprimento médio da sequência ATP6/8 foi de 985 pb e incluiu 18 sítios polimórficos, 11 dos quais foram parcimoniosamente informativos. As redes haplotípicas do COI e ATP6/8 incluíram, respectivamente, 15 e 12 haplótipos (Ver Figura Suplementar I.S1). Onze dos 28 indivíduos amostrados no rio Tapajós foram atribuídos ao haplogrupo recém-descoberto, aqui denominado como "Cluster 2".
O resultado de máxima verossimilhança obtido para o COI com o modelo GMYC foi significativamente maior (L = 552,1538) que com o modelo nulo (L0 = 504,4662), o que nos permitiu rejeitar a hipótese de que todos os indivíduos pertencem à mesma unidade molecular. A análise single threshold do GMYC (intervalo de confiança: 3-4) revelou a ocorrência de três MOTUs na bacia Amazônica (Figura I.2), evidenciando uma a mais do que as relatadas em estudos anteriores [10,11]. Apesar das questões taxonômicas envolvendo a validade da espécie, a divisão leste-oeste de P. nigricans também foi recuperada no presente estudo usando novos dados, reforçando a existência de ambas as MOTUs e apresentando uma adicional (apresentada aqui em laranja na Figura I.2). O clado destacado em azul compreendeu indivíduos amostrados no rio Amazonas e calha principal, enquanto a maioria de nossa amostragem foi restrita às drenagens do Tapajós, Xingu e Tocantins-Araguaia.
As distâncias par-a-par baseadas em K2P entre esta linhagem e o resto do grupo oriental foram 0,019 ± 0,005 e 0,01 ± 0,003 para COI e ATP6/8, respectivamente. Embora ambos os valores fossem mais baixos do que o comumente utilizado como limiar inicial para a abordagem de identificação molecular [25], nossos valores de distância foram semelhantes aos
