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Itam ar Soares de Melo e João Lúcio de Azevedo
‘E m b r a p a M e io A m b i e n t e , C .P . 6 9 - C E P : 1 3 8 2 0 - 0 0 0 - J a g u a r i ú n a , S P . 2U S P / E S A L Q , D e p t o . d e G e n e 'ti c a , C .P . 8 3 - C E P : 1 3 4 0 0 -9 7 0 - P ira c ic a b a , S P
200 M icrobiologia A m biental
1. Introdução
O su cesso de um p ro g ram a de b io rre m e d ia ç ã o de áreas co n tam in ad a s dependerá, em parte, de um bom planejam ento inicial sobre isolam ento e seleção de um m icrorganism o ou de um consórcio de m icrorganism os eficientes na degradação da m olécula em estudo. O isolam ento perm ite estudar com mais detalhes as vias m etabólicas, enzim as, produtos interm ediários, entre outros.
Os estudos relativos às enzim as envolvidas no processo de biodegradação auxiliam a estabelecer correlações sobre estrutura-biodegradabilidade. Tam bém , o isolam ento pode explicar que tipo de degradação pode estar ocorrendo no am biente, se catabólica (mineralização) ou cometabólica. Kla m ineralização, o substrato absorvido é quebrado em m oléculas m enores, que posteriorm ente serão m etabolizadas por reações que geram energia. Conseqüentem ente, a biom assa da população aum enta às custas do substrato e a concentração deste dim inui consideravelm ente com a expansão da população m icrobiana. A m ineralização significa que a m olécula é degradada com pletam ente a m oléculas inorgânicas de ocorrência universal como: CO, CO, H ,0 . N H 3, H,S, HC1. £ , portanto, o único m eio de elim inar um com posto x enobiótico do am biente. Em alguns casos, um a p o rção da m olécu la pode ser degradada e outra porção pode se acum ular no solo. Por outro lado, no com etabolism o, não há nenhum dispêndio de energia. Em geral, alta persistência no am biente ocorre com pesticidas degradados por processos com etabó litos. Klo com etab o lism o , o crescim ento m icrobiano requer a presença de um outro substrato, isto é, um substrato se c u n d á rio é re q u e rid o c o m o fo n te de c a rb o n o e e n e rg ia . D e sta fo rm a , os m icrorganism os podem transform ar a m olécula sem dela retirar energia para o seu desenvolvimento. *
Algum as características essenciais das estratégias pelas quais a m icroflora degrada os p esticidas são listadas por F o urnier et al. (1993) e su m arizadas na Tabela 1.
Outros m ecanismos utilizados pelos m icrorganism os na rem oção de pesticidas são as reações de conjugação, as quais consistem na com binação da m olécula do xenobiótico ou um de seus m etabólitos com outros com postos com o carbohidratos ou am inoácidos, levando à form ação de m oléculas m ais hidrossolúveis. O acúm ulo do xenobiótico pode ocorrer dentro das células, por um processo ativo ou passivo, ocasionando uma remoção tem porária da m olécula do am biente (M U SU M EC I, 1992).
2. Estratégias de isolamento
Antes de passarm os a discorrer sobre as etapas de isolam ento de m icror ganism os é fundam ental um am plo conhecim ento sobre m etabolism o m icrobiano,
E stratégias de isolam ento de m icrorganism os envolvidos na degradação de xenobióticos
T A B E L A 1. E stratég ias m ic ro b ian as para a d eg rad ação de p esticid as no solo.
201
Termo Usual M etabolism o C om etabolism o P rincipal suporte p a ra o
crescim ento Pesticidas O utros substratos N úm ero de pesticidas de
interesse Poucos Muito
F o n tes de carb o n o energia Baixas quantidades mas específicas
As vezes grandes quantidades m as alta com petição com os demais m icrorganism o
M icroflora envolvida Poucas linhagens b acterianas específicas
F reqüentem ente organism os om nívoros com o os fungos Principal problem a agrícola
A daptação à d eg rad ação após suplem entação m icrobiana
Persistência acidental excessiva
P rincipal problem a am biental M obilidade
E xcesso de p esticida ou persistência de m etabólito e m obilidade
já que as te c n o lo g ia s de b io rre m e d iaçã o estão re sp ald ad as na e x p lo ra ção do m etabolism o m icrobiano que catalisam reações bioquím icas.
A biodegradação de um com posto pode ser estudada de diversas maneiras. U m a delas é avaliar a atividade m etabólica e dissipação do xenobiótico em condições am bien tais bem definidas, sem , contudo, levar em co nsideração a com unidade m icrobiana envolvida no processo. Em contraste, colônias isoladas são usadas para identificar vias m etabólicas específicas, enzim as envolvidas na transform ação de m oléculas e os m ecanism os de controle genético.
Os processos envolvidos incluem : níveis de concentração do contam inante, m etabolism o sim ultâneo de vários com postos, e degradação seqüencial de m isturas qu ím icas de enzim as n ão -esp ecíficas. D esse m odo, sob co n d içõ es favo ráv eis, m icrorganism os catalizam substratos com plexos, fornecendo à célula C e energia, p e g u n d o Atlas & Bartha (1981), as taxas de crescim ento m icrobiano são, parcialmente, uma função das concentrações do substrato e da diversidade do substrato. Por exemplo, se o am biente contém grandes quantidades de m aterial prontam ente degradável, não- tóxico, repressão catabólica pode ocorrer e por conseqüência a degradação também. N outras circunstâncias, m ateriais prontam ente biodegradáveis podem ser m enos disponíveis e a repressão catabólica poderá ser reprimida. C m concentrações m uito baixas do substrato, as taxas de crescim ento m icrobiano tendem a ser m ínim a, m antendo-se o lim ite m ínim o necessário para o metabolismo.*
/M uitos contam inantes são encontrados em con cen trações extrem am ente baixas, as vezes, da ordem de ppb (parte por bilhão). Contudo, pode ser possível um org an ism o m etab o lizar contam in an tes presen tes em baixas con cen traçõ es se a população m icrobiana for suportada por um outro com posto presente em concentrações adequadas. Por outro lado, é sabido que quando presente em altas concentrações, qualquer com posto pode ser tóxico (KU NC & RYBAROVA, 1983)1
Para propósito de biorrem ediação é interessante que o xenobiótico seja usado com o fonte de carbono e energia para a m icrorganism o, que por sua vez induz à
202 M icrobiologia Am bienta!
síntese de enzim as apropriadas. Estas são, via de regra, altam ente específicas, e outras não, isto é, um a dada enzim a pode exibir atividade catalítica contra um análogo estrutural do com posto alvo que, presum ivelm ente, fornece pressão seletiva para sua evolução. M ais adiante, neste capítulo, serão abordados ensaios para a seleção de m icrorganism os produtores de enzim as envolvidas na degradação de xenobióticos.
As estratégias básicas de isolam ento de m icrorganism os degradadores são relativam ente fáceis e diretas. As populações de m icrorganism os degradadores de pesticidas representam um a pequena fração da população total para m uitos pesticidas. Partindo-se do princípio de que as populações m icrobianas capazes de m etabolizar um d eterm in ado xen o b ió tico são enco n trad as em b aix a freq üên cia, estratég ias especiais de isolam ento devem ser adota para m axim izar as chances de sucessd*
IA mostras de solos, água, sedim entos ou de outras áreas contam inadas em que sabidam ente existem m icrorganism os degradadores são coletadas. No caso de pesticidas, pode-se recorrer a áreas agrícolas com histórico de aplicações continuadas de determ inado produto ou àquelas áreas onde se preparam as m isturas de pesticidas para pulverização. Também pode-se coletar am ostras de solo em regiões onde se faz tratam ento de frutas com fungicidas, principalm ente aqueles fungicidas protetores contra doenças que ocorrem em pós-colheita.
Certos fungos adquirem resistência a determ inados fungicidas devido à pressão natural ocasionada por aplicações sucessivas. C itam -se os fungicidas sistêm icos com o benomil, carbendazim, iprodione e vinclozolim, dentre outros, com o os m ais utilizados na agricultura e com m aior núm ero de casos de ocorrência de resistência. E possível que estes fungos possam estar utilizando o fungicida com o fonte de carbono (M ELO
et ai, 1997) ou que outros fungos e actinobactérias possam , devido às constantes
aplicações, estar degradando estes com postos.
Locais de tratam ento de m adeira que utilizam certos protetores, com o PCP e creosoto, podem ser am ostrados para isolam ento seletivo desses com postos. Indústrias de papel e celulose podem tam bém ser escolhidas para isolam ento de m icrorganism os envolvidos na degradação de celulose, hemicelulose, dentre outros. Fungos ligninolíticos podem ser isolados a partir de podridões de raízes de árvores. Em virtude da natureza quím ica com plexa da lignina, m uitos m icrorganism os degradadores desse polím ero, dentre eles os basidiom icetos, têm se destacado com o potentes biodegradadores de pesticidas do grupo dos organoclorados (BUM PUS et ai, 1985).
Um cam inho mais rápido e direto é partir para o isolam ento seletivo de um determ inado grupo de m icrorganism os, sabidam ente já testados com o potentes agentes deg radadores. Foi dentro d esse enfo q u e que se iso lo u o fungo Phanerochaete
chrysosporium, agente causai da podridão branca d a m adeira. Esse fungo produz
peroxidases que catalizam a despolim erização oxidativa da lignina.
O solo, contudo, perm anece com o o mais im portante reservatório para o isolam ento de m icrorganism os. A com unidade m icrobiana, o núm ero e tipos de m icrorganism os presentes num solo em particular, são m uito influenciados pela localização geográfica, tem peratura, textura e estrutura, pH, conteúdo de m atéria orgânica, cultivo, aeração e um idade. Por exem plo, as actinobactérias são encontradas em pequeno núm ero em solos alagados com baixa tensão de oxigênio. Solos de florestas contêm um a predom inância de Streptomyces que são tolerantes à acidez
E stratégias de isolam ento de microrganism os envolvidos na degradação de xenobióticos 203
(DAVIS & W ILLIA M S, 1970), enquanto solos ácidos e solos alcalinos podem conter m e n o r n ú m e ro de Streptom yces e m a io r n ú m e ro de A ctinoplanes e Streptosporangium.
C om o a biodegradação de m uitos pesticidas tem sido aum entada na presença de raízes de plantas e exudados de raízes (HSU & BARTHA. 1979; REDDY & S E T H U N A T H A N , 1983; W ALTON & A N D E R S O N , 1992) d ev id o à g ran de biom assa e atividade m icrobiana, em função de substratos de carbono fornecidos pela rizodeposição, é possível, sem dúvida, am ostrar solos rizosféricos à procura de microrganism os degradadores. Na rizosfera, análogos estruturais de vários xenobióticos presentes em exsudados, com ponentes de paredes celulares e lisados, assim com o produtos secundários da decom posição desses m ateriais podem ser seletivos para m icrorganism os que m etabolizam ou com etabolizam estes com postos xenobióticos. N essa linha de pesquisa é que Hsu & Bartha (1979) relataram que a presença de p la n ta s ou irrig a ç ã o de solo com ex su d a d o s de raízes au m en ta ram a taxa de m ineralização de paration em com paração a solo não cultivado. Em outro estudo, S andm an & Loos (1984) en contraram taxas m ais elev adas de m icrorganism os degradadores de 2,4-D em solos da rizosfera de cana-de-açúcar do que em solos não-rizosféricos. Os autores explicam que os degradadores de 2,4-D parecem ter sido seletivam ente favorecidos na rizosfera de cana-de-açúcar.
O s fato res am bientais abióticos citados, que pod em atu ar na atividade m icrobiana afetam , portanto, a degradação de pesticidas no solo. É possível, assim, o b ter m icrorganism os com potencial para d eg rad ar um d eterm inado com posto xenobiótico em solos virgens. No entanto, é de se esperar que em solos contam inados os m icrorganism os possam se adaptar e adquirir a capacidade de utilizar o com posto com o fonte de carbono e energia para o seu metabolism o.
Jfeendo os xenobióticos substâncias orgânicas sintéticas, e, portanto, estranhas ao am biente, eles são difíceis de serem degradad os pelo s m icrorganism os que evoluíram e adquiriram m ecanismos genéticos para o catabolism o e reciclagem de produtos biossintéticos. P esse modo, a procura de m icrorganism os degradadores pode ser dirigida àqueles locais com problem as detectados de contam inação ou de uso intensivo de pesticidas. Porém , o insucesso no isolam ento do m icrorganism o ideal po d e e star re la c io n a d o à re c a lc itrâ n c ia da m o lécu la em estud o, fato este que increm enta ainda mais os problem as de poluição am biental.
2 . 1 Coleta de amostras de solo
Quando o objetivo da coleta é som ente o isolam ento de m icrorganism os úteis com potencial para degradação, não é necessário, em geral, proceder à coleta de am o stras re p resen ta tiv a s da área em estudo. P ro ce d e-se, nesse caso, à co leta diretam ente daquele local, tom ando-se o cuidado de coletar pequenas sub-amostras, m isturá-las e hom ogeneizá-las. Inform ações adicionais da área am ostrada, tais como: tipo de solo, horizonte do solo, devem ser obtidas para referências futuras. Do m esmo m odo, o transporte e arm azenam ento dessas am ostras requerem alguns cuidados, po d en d o -se m an ter o solo à tem p eratu ra am b ien te p o r v ário s m eses antes do
204 M icrobiologia A m biental
isolam ento. N o entanto, as condições de arm azenam ento podem induzir m udanças n a s p o p u la ç õ e s m ic r o b ia n a s c h e g a n d o , so b c o n d iç õ e s e x tre m a s , a m a ta r m ic ro rg a n ism o s ú teis. O ideal se ria m a n te r as am ostras de solo no laboratório co n se rv an d o as m esm as ca ra c te rístic a s físicas, quím icas e biológicas, tais com o aquelas encontradas in situ. Isso é quase im possível e, assim , recom enda-se proceder ao isolam ento im ediatam ente após as coletas ou poucos dias depois. E aconselhável, portanto, ev itar o arm azen am en to de am ostras de solo se os objetivos foram de avaliar a atividade enzim ática e contagem de m icrorganism os. A secagem do solo durante o arm azenam ento resulta no aum ento da acidez do solo, redução de Mn e aum ento da solubilidade e oxidação da m atéria o rg ânica (BA RTLETT & JA M ES, 1980).
H á evidências de m udanças na população m icrobiana dentro de poucas horas d a a m o s tra g e m e, p o rta n to , as a m o s tra s d e v e ria m ser a n a lis a d a s d e n tro de, aproxim ad am en te, 6 horas após a coleta (JEN SEN , 1968). E, pois, questionável se so lo a r m a z e n a d o m e s m o em c o n d iç õ e s c o n s id e r a d a s ó tim a s m a n té m su as p ro p rie d a d e s . E s tu d o s d e S to tz k y et al. (1 9 6 2 ) m o stra ra m qu e o n ú m ero de m ic ro rg a n is m o s , e x c e tu a n d o -s e a c tin o b a c té ria s , d im in u iu após três m eses de arm azenam ento. Já W ollum (1994), verifico u que o arm azenam ento do solo por um p e río d o de 7 a 21 d ia s n ã o a lte r o u sig n ific a n te m e n te alg u m as p ro p rie d a d e s fundam entais, tais com o b iom assa total, contagem de grupos m icrobianos específicos, N disponível e atividades enzim áticas. D esse m odo, verifica-se que o arm azenam ento do solo a 4°C p o r um p eríodo curto, de até 3 sem anas, no escuro, pode ser aceitável. P ara m in im iza r as v aria çõ es na ae ra ç ã o e conteúdo de um idade das am ostras é preferível co letar grandes b locos de solo e subdividi-los em pequenas sub-am ostras im ediatam ente antes do uso. Já para am ostras de solo que serão utilizadas para análises quím icas é m ais satisfatório, em geral, co n g elar ou secar as am ostras im ediatam ente. N o entanto, há ex ceções com o, p o r exem plo, no caso de análise de nitrito, em que a secagem não é recom endada. P ara análise de nitrato, o solo deveria ser seco dentro de um períod o de 24 horas, do contrário, o nível de nitrato é aum entado durante o processo de secagem (PA U L & C L A R K , 1989).
É com um aco n d icio n ar as am ostras no laboratório em sacos de polietileno, os quais perm item um a razoável aeração. P ara m anter a um idade, estes sacos podem ser selados com outro saco, contend o algu m as gotas de água (CA SID A et al., 1964).
Quando o objetivo da coleta tam bém inclui estudos sobre dinâmica de populações, biom assa de m icrorganism os e enum eração de microrganismos degradadores, é essencial que os p rocedim entos de am ostragem sejam planejados a fim de que os erros de am ostragem sejam m inim izados. N o m ínim o, mais de duas am ostras deveriam ser tom adas a partir de um a área e analisadas separadamente para evitar qualquer erro ocasionado pela variabilidade. V árias pequenas sub-amostras de um local são preferíveis a um a grande am ostra de solo. A um idade do solo deveria ser muito homogênea. Quando a área em estudo é heterogênea, com horizontes de solos distintos, aconselha-se subdividi- la em u n id a d e s m e n o re s , m ais h o m o g ê n e a s e a n a lisá -la s se p a ra d a m e n te . Na im possibilidade de se processar am ostras de solos trazidas do campo, é recom endado que todas as am ostras sejam pré-incubadas por 5 - 7 dias em condições de laboratório antes da análise. Essa prática atenua alguns dos distúrbios associados com a amostragem, m as, no entanto, perm ite m ensuração de situações dinâm icas.
E stratégias de isolamento de microrganism os envo lvid o s na d eg radação d e xen obióticos 205
Via de regra, am ostras deveriam ser coletadas nos prim eiros 5 '111 cm do perf il do solo, já que é nesta profundidade que tem lug ar a m aior atividade m icrobiana. Se na área am ostra da não se encontrar um grande nú m ero de m icrorganism os, pode-se recorrer ao isolam ento a partir de solo rizo sférico ou de raízes. E nesta zona que ocorre a m aior atividade microbiana. A dem ais, há preferência de certos m icrorganism os pelas raízes de plantas. Bactérias, em geral, são co lo nizado ras de raízes e são capazes de utilizai;, glucose, alanina, acetato etc.
-oolos secos ao ar e hom ogeneizados devem ser peneirados através de um a peneira de 2 m m de malha. Peneiram ento do solo é indicado para rem over restos de material vegetal, grandes torrões de terra, pedra, dim inuindo a heterogeidade d a a m o s tr a ^ Am ostras de solo pequenas (20 gr) são preferidas devido à econom ia de coleta, espaço e armazenam ento, mas, aumenta-se a variância da am ostra, quando com parado com am ostras maiores. Amostras de 50 gram as, obtidas a partir de sub-am ostras com postas bem misturadas são indicadas. Um a porção do solo (1-10 g) é diluída em solução salina (0,85% ) ou tampão Tris e agitada por alguns m inutos, a 100-150 rpm . U m a leve agitação da m istura (solo + sol. tampão), realizada em um banho-m aria ultrasônico, de baixa energia, pode ser usada para liberar m icrorganism os de partículas de solo.
Hom ogeneização m ecânica do solo com auxílio de um liquidificador tem sido mais eficiente na dispersão das partículas do que a agitação em shaker (KANAZAW A
et al., 1986). Segundo Strickland et al. (1988), este procedim ento foi m ais útil para um
solo altamente orgânico, devido à natureza da agregação, com parado com solos minerais. Estes procedimentos têm tido muito sucesso e são ideais para o isolam ento de bactérias.
P ara facilitar a liberação de m icrorgan ism os durante a agitação, M ac-D onald (1986) usou um a resina q u e l a n t e d e t r o c a i ô n i c a e u m d e te r g e n te a n iô n ic o p a r a q u e la r cátion s di e poliv alentes que causam flo c u la ç ã o e e v ita r as in te ra ç õ e s adesivas entre as partículas do solo.
U m proced im en to p rop osto por H opkins et al. (1991) incorpora alguns passos a fim de m axim izar a d is p e rs ã o d e a g re g a d o d o so lo e lib erar m icro rg a n ism o s (F ig u ra 1). D epois de cad a etap a do processo, as células liberadas são coletadas no s o b r e n a d a n te , s e g u in d o a b a ix a c e n t r i f u g a ç ã o (5 0 0 x g p o r a té 2 m inutos). O m aterial precipitado a p ó s c a d a e t a p a é r e e x t r a í d o n a e ta p a seg u in te. O so b ren ad an te de c a d a e ta p a c o n stitu i o e x tra to e o “ p e l l e t e ” fin a l r e p r e s e n ta o resíduo.
AGITAÇÃO COM DETERG EM TE ANIÔNICO E RESINA DE TROCA AN IÔNICA
CENTRIFU GA ÇÃO SOB BAIXA VELOCIDADE AGITAÇÃO EM TAM PÃO TRIS CENTRIFU GA ÇÃO SOB BAIXA
VELOCIDADE ULTRASONISAÇÃO CENTRIFU GA ÇÃO SOB BAIXA
VELOCIDADE AGITAÇÃO EM ÁGUA CENTRIFU GA ÇÃO SOB BAIXA
V ELOCID AD E "rE S I D U Q S ( R ) SOBRENADANTE (EXTRATO) SO BRE N A D A N TE * . (D SO B R E N A D A N TE * (D SO B R E N A D A N TE * (2> SO BRE N A D A N TE * . (3)
PURIFICAÇAO POR CENTR1FUGAÇAO DE GRADIENTE DE DENSIDADE
F IG U R A 1. F luxogram a m o stran d o as e ta p a s p ara m á x im a d is p e r s ã o d e a g r e g a d o s d o s o l o e c e n trifu g a ç ã o d ife re n c ia l p ro p o sto p o r H o p k in s
206 M icrobiologiíi A m biental
E xistem técnicas especiais para recuperação de fungos não-esporulantes do solo. G eralm ente as hifas tendem a aderir às partículas mais pesadas no solo e, nesse caso, a sem eadu ra de 5 a 10 m g de solo diretam ente na superfície do meio de cultura solidificado pode resultar em m aior núm ero de colônias.
2.2 Meios de cultivo e seleção de colônias
E xistem m uitos m eios de cultivo seletivos e sem iseletivos descritos para o isolam ento de espécies individuais ou grupos de bactérias e de fungos.
T écnicas de en riquecim ento do solo e suplem entação do meio de cultivo com o xenobiótico em estudo têm sido usadas com sucesso para isolar m icrorganism os degradadores. Essas técnicas têm a vantagem de estim ular os m icrorganism os com potencial de utilização do com posto, com o fonte de nutriente, dando-lhes uma vantagem seletiva em d etrim ento dos m icrorganism os m ais abundantes naquele solo. Segundo B arth a (1990), o carbono orgânico utilizável se encontra em am ostras do am biente em pequenas quantidades, e no caso m ais sim ples, o com posto xenobiótico é oferecido com o um a fonte seletiva de carbono e energia. O autor cita que, quando o com posto xenobiótico contém outros elem entos críticos tais com o fósforo (inseticidas fosfatados) ou nitrogênio (am inas, anilinas, herbicidas a base de fenilam idas) estes nutrientes podem ser tam bém utilizados com o agentes seletivos o que é feito, geralm ente, quando o esqueleto de carbono da m o lécula é resisten te à m ineralização. Neste caso, contudo, a fonte de carb ono e en erg ia não é o pesticida, mas outras substâncias do solo. Este é o fenôm eno de “com etab o lism o ” .
U m p ro b le m a q u e su rg e no p ro c e sso de en riq u ecim en to de solos e nos respectivos m eios de isolam ento é o alto grau de toxicidade, insolubilidade em água, alta volatilidade ou instabilidade térm ica das substâncias xenobióticas. Um ou mais desses fatores, segundo B arth a (1990), pode evitar ou inibir o crescim ento no meio de cultura de tal m odo que torna-se in frutífera qualquer tentativa de isolam ento. Os solventes de baixo peso m olecular (clorofórm io, piridina, hexano, ciclohexano, benzeno), os aldeídos (form aldeído), os fenólicos (fenol, cresol), am inas arom áticas (anilina, benzidina), ésteres do ácido hidroxibenzóico (paraben, m etilparaben) e com plexos o rg a n o m e tálic o s (n a ftalen o cú p rico , fenilm ercúrio e com postos alquilm ercuriais) exib em a lta to x ic id a d e aos m ic ro rg a n ism o s (B A R TH A , 1990), e co ncen traçõ es norm ais ao redor de 1 % desses com postos chegam a esterilizar a am ostra e destruir p o te n c ia is m ic ro rg a n is m o s d e g ra d a d o re s ./R e c o m e n d a -s e , p o rtan to , p ara estes com postos, ad icio n ar às am ostras de solo ou de sedim ento, baixas concentrações e aplicar repetidam ente. O s solventes podem ser tam bém fornecidos com o vapor/
A seleção de m icrorganism os em m eio de cultivo requer m uita habilidade por p a rte do té c n ic o , n o s e n tid o d e d is t in g u i r c o lô n ia s d e g ra d a d o ra s d a q u e la s o ligocarbofílicas acidentais. fite m eios de cultura para isolam ento geralm ente são com postos de um a solução de sais m inerais suplem entada com o com posto xenobiótico em estudo, que é usado, via de regra, co m o fonte de carbono^ Em alguns casos, a identificação de colônias degradadoras pode ser m elhor visualizada através de talos ao re d o r das co lô n ia s. Em m eio p ara iso lam en to de celu lo lític o s é adicio n ad o
E stratégias de isolamento de microrganism os envolvidos na d eg radação de xenobióticos 207
carboxim etilcelulose, cuja hidrólise é visualizada p o r m eio de um a zona clara ao redor das colônias, após inundar as placas com solução aquo sa de 1 % de brom eto de am ônio h ex a d eciltrim etil (HANK1N & A N A G N O S T A K IS , 1977). P ara iso la m e n to de quitinolíticos, por exemplo, Hsu & L ockw ood (1975), em pregaram um m eio m ineral suplem eptado com quitina coloidal.
ÍJm diagnóstico rápido para identificar biodeg radad ores é o b servar a m u dança de cor do meio de cultura, ou talo de degradação ao redor das colônias, em função do uso de indicadores ácido-base/ A viragem é causada p o r um processo m etabólico específico de linhagens degradadoras. Um exem plo ilustrativo pode ser apresentado com o herbicida atrazina, onde usa-se o indicador v erm elho de b rom o creso l em um m eio de sais m inerais com 2,4-D com o única fonte de carb ono e extrato de levedura com o fator de crescim ento (S A N D M A N & LO O S, 1984). A oxidação m icrobiana do 2,4-D resulta na produção de HC1, que m uda a co r do m eio de verm elho (pH 7.0) para am arelo (pH 5.2). D esse m odo, esse ou outros indicadores ácido -b ase com o: azul de brom otim ol e eosina-azul de m etileno, incorporados ao m eio de cultura, podem ser u sa d o s p ara is o la m e n to de m ic r o r g a n is m o s d e g r a d a d o r e s de p e s tic id a s organoclorados. Utilizando reagentes indicadores, B ordeleau & B artha (1969) isolaram m icrorganism os do solo que com etabolizam anitinas substituídas e azobenzenos. Os autores recorreram ao uso de p-anisidina ou p-anisidina-FL O , que foram pulverizadas sobre as colônias de-senvolvidas em m eio de cultu ra não seletivo após incubação das m esm as. A condensação oxidativa da p-anisidina é d etectad a através d a descoloração m arrom -averm elhada das colônias. O uso de indicadores em m eio de cu ltu ra facilita e agiliza a seleção de um núm ero considerável de m icrorgan ism os degradadores, ao m esm o tem po em que sim plifica as determ inações através do núm ero m ais provável de m icrorganism os degradadores e ev ita as q u an tificaçõ es futuras de cen tenas de prováveis m icrorganism os via crom atografia.
fcm m uitos casos, o próprio xen o b ió tico , u sado no m eio de cu ltu ra sólido, é usado para indicar e identificar colônias d eg rad ad o ras. Iso lam en to de Pseudomonas sp. degradadoras do herbicida atrazina foi feito em um m eio de cultivo sólido contendo sais m inerais e 0.1% de citrato de só d io com o fonte de ca rb o n o e atrazin a (100 ppm ) com o única fonte de nitrogênio (M A N D E L B A U M E T et al., 1995). C om o o m eio contendo atrazina torna-se opaco co m o re su ltad o de p artíc u la s fin as, é possível v isu a liz a r zon as claras ao re d o r de c o lô n ia s d e g r a d a d o r a s / O u t r o s su b s tra to s xenobió ticos podem ser testados a d e sp e ito do o b je tiv o de tra b a lh o em estudo, no s e n tid o de f a c ilita r a e ta p a la b o r io s a d e s e le ç ã o d e p o te n c ia is a g e n te s d egradado res.
Um m étodo padrão que tem sido usado para isolam en to de m icrorganism os degradadores ou resistentes é proceder à m istura do solo com igual q uantidade de água e ag itar por ap roxim adam ente du as h oras. D e ix a -se as p a rtíc u la s de solo precipitarem -se por aproxim adam ente dois m inutos. O so brenad ante é usado com inóculo para suplem entação (enriquecim ento) de cu ltu ras em frascos E rlen m ey er contendo o meio basal de crescim ento que, geralm ente, é um m eio m ineral e vitam inas, suplem entado com baixa concentração de glucose (100 m g /L '), extrato de levedura (100 m g/L '), antibióticos para im pedir o crescim en to de m uitas bactérias e o próprio com posto xenobiótico que poderá ser ainda acrescen tado g radu alm en te aos frascos.
208 M icrobiologia Am biental
Verificado seu crescim ento m icrobiano no m eio de cultura, pode-se transferir 2 mL da cultura em pleno crescim ento para o m esm o m eio, porém sem glucose. As culturas são incubadas e, em seguida, procedesse à quantificação da utilização do su b strato . C aso se o b se rv e ao m ic ro sc ó p io c é lu la s de b a c té ria s, le v e d u ra s e actinom icetos, sugere-se fazer estrias com auxílio de um a alça de platina em placas de Petri contendo o m eio de cultura apropriado para esses m icrorganism os.
D ependendo do grau de toxicidade e recalcitrância do com posto, torna-se difícil a obtenção de m icrorganism os efetivos na utilização da m olécula com o fonte de carbono ou nitrogênio. O isolam ento em duas etapas pode ser efetuado usando-se análogos de com posto m ais fáceis de serem d eg radad os. A ssim , um a estratégia interessante para isolam ento efetivo de linhagens de Pseudomonas to lerantes a tolueno foi adotada por N akajim a et a i (1992). utilizando-se um m étodo de seleção que consiste em duas etapas. Na prim eira etapa, um a pequena quantidade de solo e 2.5 mL de p-xileno foram adicionados a 5 mL do prim eiro meio de seleção (0,5% de bactotriptona e 0,05% de extrato de levedura), que foi incubado aerobicam ente à tem peratura am biente por 5 dias.
M icrorganism os capazes de crescerem na presença de p-xileno foram obtidos em 85% das 760 am ostras de solo. Exposição ao xileno parece m elhorar a tolerância ao solvente orgânico para as linhagens potenciais.
N a segunda etapa, 50 pL de cada uma das 10 culturas com bom crescim ento foram adicionados a 5 mL do segundo meio de seleção (1,5% de extrato de solo de jardim fervido e filtrado foi adicionado ao prim eiro m eio de seleção) contendo 2 mL de tolueno. Essas subculturas foram incubadas aerobicam ente à tem peratura am biente por 4 dias. 50 mL de cultura foram então vertidos no segundo meio de seleção, contendo
1.5 de ágar. O ágar, vertido sobre as culturas, apresentava um a fina cam ada de 2 mm de to lu e n o . C om e sse p ro c e d im e n to , os a u to re s is o la ra m 26 lin h a g e n s de m icrorganism os tolerantes a tolueno.
O isolam ento de m icrorganism os capazes de degradarem polím eros tem sido possível em laboratório. O s polím eros estão entre os com postos orgânicos mais
recalcitrantes. Todavia, m uitos deles, incluindo nylon, borracha vulcanizada, m uitos plásticos e corantes polim éricos são suscetíveis ao ataque m icrobiana sob condições apropriadas. O biodegradação de corantes polim éricos, por exem plo, está relacionada ao sistem a de degradação de lignina por m uitos fungos. A ssim , m uitos fungos, principalm ente os basidiom icetos, têm sido usados com sucesso para descoloração
de corantes da indústria têxtil. Enzim as envolvidas no processo de degradação de m uitos corantes, com o, por exem plo, Poly B -41 1, P oly R -478 e R em azol Brilliant Blue-R, pertencem ao sistem a ligninolítico (Os capítulos 13, 14 e 16 tratam com m aior profundidade sobre as enzim as envolvidos nesse processo).
A seleção de um grande núm ero
F IG U R A 2. V isu alização da d e s c o lo ra ç ã o do d e is o la d o s f ú n g ic o s c a p a z e s de
E stratégias de isolam ento de microrganism os envolvidos na degradação de xenobióticos 209
avaliada diretam ente em placas de petri contendo meio de cultivo contendo o corante. Fungos que apresentam o sistem a enzim ático inespecífico atuando na degradação do corante form am halo visível de descoloração (Figura 2).
2.3 Avaliação da atividade enzimática
A presença de diversas enzim as m icrobianas, incluindo as pirocatecases e peroxidases, envolvidas na quebra de m uitos com postos orgânicos sintéticos tem sido usado com o indicador de degradação. As peroxidases, [lignina-peroxidase(LiP) e m anganês-peroxidase(M nP)], por exem plo, catalisam reações na presença de peróxido de hidrogênio. Podem ser dependentes, ou não, do m anganês e estão envolvidas na degradação da lignina e m uitos xenobióticos. A LiP catalisa reações de degradação da lignina e poluentes arom áticos na presença de H 2O r E ssas reações incluem oxidação do álcool benzílico, quebra de cadeias laterais, reações de abertura de anéis arom áticos, dem etilações e descolorações oxidativas. Todas elas são com patíveis com o m ecanism o envolvido na degradação não-específica desta enzima. A atividade de LiP é determ inada pela oxidação do álcool veratrílico.
As M nP s p articip am de reaçõ es de d esp o lim eriza ção de clo ro lig n in as, desm etilação de ligninas e branqueam ento de polpa. Tanto a LiP com o a M nP têm despertado interesse por causa dos possíveis aplicações para descontam inação de efluentes e de solo. A atividade do M nP é avaliada pelo verm elho de fenol na presença de m anganês e peróxido de hidrogênio.
2.3.1 Fenol - Oxidase
A o b ten ção de m icro rg a n ism o s pro d u to res de fe n o l-o x id a ses, enzim as envolvidas na degradação de substâncias fenólicas, pode ser feita em meio de cultivo sólido contendo ácido gálico. A seleção de linhagens produtoras é acom panhada por m eio do halo de intensidade da cor m arrom, característica da “reação de Bavendam m ” que indica a presença de fenol-oxidases (NOBLE, 1965).
As fenoloxidases são sub-divididas em duas classes: tirosinases e lacases, am bas reagem com oxigênio, não necessitando, todavia, de co-fatores. São enzim as que têm m enor finalidade com os substratos do que as hidrolases.
A m aioria dos substratos usados in vitro para m edir a atividade da fenol- o x id ase não é ad eq u ad a para uso em am ostras am b ien tais p o r causa da baix a s o lu b ilid a d e ou p o r c a u s a de n e c e s s id a d e de se m e d ir a a b s o r b â n c ia em esp ectrofotôm etro . Os ensaios para d eterm inação de feno l-ox idase envolvem a oxidação de L-3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA), que pode ser m edido com ou sem a adição de peróxido de hidrogênio.
A lacase (bengenediol: oxigênio oxidoredutase), uma polifenoloxidase, catalisa a oxidação via transferência de elétrons de radicais fenóis por radicais fenoxila. A especificidade da enzim a ao substrato, todavia, depende da origem da lacase. Assim, lacases produzidas por fungos diferentes podem oxidar diversos substratos, incluindo, corantes fenólicos, fenóis , clorofenóis, HAPs, organofosforados, dentre outros.
210 M icrobiologia A m biental
2 . 3 . 2 Pirocatecases
O m etabolism o do catecol pode ocorrer tanto por clivagem entre os grupos hidroxida (clivagem orto ou intradiol), com o por clivagem adjacente a um dos grupos hidroxida (clivagem m eta ou extraidiol). Com relação à clivagem orto, algum as linhagens bacterianas que m etalizam as cloroanilinas produzem altos níveis da enzim a pirocatecase II, que atua na via m etabólica da degradação das cloroanilinas. Por outro lado, a presença da enzim a pirocatecase I está envolvida na degradação da anilina evidenciando a existência de duas enzim as isofuncionais que atuam clivando orto desses com postos aromáticos.
A avaliação de atividade da pirocatecases é baseada na form ação do ácido cism ucônico a partir da oxidação do catecol da m etodologia de cultivo bacteriano, sonicação de células para extração intracelular e avaliação da pirocatecase podem ser encontrados em Scram in et al. (2003).
3. Biodegradação acelerada
I A adaptação de m icrorganism os a muitos com postos orgânicos exerce um im portante fator nas taxas de degradação. A adaptação se refere a m udanças na com unidade m icrobiana que, por sua vez, increm enta a taxa de transform ação de um dado com posto com o resultado de um a exposição prévia a esse com posto. R espostas adaptativas têm sido observadas em culturas puras, am bientes aquáticos, solos e aqüíferos (M O O R M A N . 1990). Q uando os m icro rg an ism o s são ex po stos a um determ inado xenobiótico, há geralm ente um período inicial de adaptação e nenhum a transform ação ocorre. /
fessa fase é crucial com relação à persistência do com posto no am biente, principalm ente se a fase de adaptação for longa. M uitos xenobióticos onde um a fase de adaptação foi verificada são citados por A lexander (1994) e entre eles estão: herbicidas (2,4-D, M ecoprop. 4-(2,4-D B), TCA, dalapon, m onuron, chlorprophan. endothal, pirazon), inseticidas (paration m etílico e azinfhos m etílico), com postos quaternários de amônia (cloreto de dodeciltrim etilam anio), hidrocarbonetos policíclico arom áticos (naftaleno e antraceno) e outros (fenol, 4-clorofenol, 4-nitrofenol, 1,2 e 1,4-diclorobenzeno). \
Alguns compostos chegam a ter um período de adaptação extrem am ente curto (24 horas), com o o cloreto de dodeciltrimetilamonio, outros têm um período mais longo, de seis meses, com o por exemplo, os halobenzo atos (LINKFIELD et al., 1989)i A fase de adaptação finaliza quando o início do período de biodegradação é detectado.^
Estratégias genéticas e bioquím icas para adaptação e biodegradação acelerada incluem indução enzim ática, m udanças de p opulação, m utação, tran sferên cia e rearranjo de m aterial genético. E stes m ecanism os isolado s ou em c o m b in aç ão contribuem para um a m udança nas taxas de biodegradação, observadas depois que as com unidades m icrobianas naturais são expostas a novos substratos. Spain & Vanveld (1983) citam que. quando com postos xenopióticos são adicionados a concentrações
Estratégias de isolam ento de m icrorganism os envolvidos na degradação de xenobióticos
abaixo de 100 ppb 000 ng/m L), as taxas de degradação podem ser mil vezes superiores em populações que são pré-expostas ao com posto. Um longo período de adaptação poderia acom odar mudanças genéticas com o um m ecanism o de adaptação microbiana.
As inform ações genéticas podem ser transferidas entre populações através da transdução, transform ação e conjugação, assistidas por plasm ídeos. A principal form a pela qual as bactérias se adaptam aos poluentes no am biente é através da aquisição de plasmídeos, que codificam genes envolvidos na resistência ou catabolismo.
Bactérias degradadoras de herbicidas do grupo dos carbam otioatos apresentam plasm íd eo s que contêm genes para degradação; linhagens sem p lasm ídeos não degradam esses herbicidas (TAM et al., 1987; M UELLER et al., 1988).
Plasm ídeos são m oléculas de fitas circulares de DNA que se replicam com o entidades independentes do crom ossom o do hospedeiro. Em geral, o tam anho dos plasm ídeos varia de 1 Kb a 500 Kb (pares de base). Plasm ídeos m enores são m antidos em cópias m últiplas, de até 40 por organism o. Genes codificando para o m etabolism o de pesticidas e outros com postos xenobióticos são freqüentem ente, mas nem sempre, localizados em plasm ídeos.
Plasm ídeos catabólicos são principalm ente encontrados em Pseudo-monas flu o re sc e n te s e um a c a ra c te rís tic a com u m d esse s p la sm íd e o s é qu e eles são freqüentem ente muito grandes. As funções especializadas desses m egaplasm ídeos, tais com o resistência a m etais pesados, são codificadas por som ente pequenas porções do conteúdo total. Por exem plo, no plasm ídeo pMOL3() de 240 Kb de Alcaligenes
eutrophus, cerca de 40 Kb parecem estar envolvidos na resistência a m etais pesados
e 40 Kb em funções básicas com o transferência, replicação e m anutenção. A função da porção restante ainda não foi identificada.
Plasm ídeos que codificam para degradação podem ser transferidos entre bactérias da m esm a espécie e de diferentes espécies. Desse m odo, estudos sobre a o c o rrê n c ia e im pacto das in teraçõ es g enéticas na co m u n id ad e m icro b ian a são considerados de grande im portância, no sentido de predizer o destino da dissem inação no solo de novas com binações genéticas introduzi das.
Em geral, as falhas ou ineficiência advindas das aplicações de pesticidas para o controle fitossanitário têm sido atribuídas ao desenvolvim ento de resistência dos organism os-alvo. Para muitos pesticidas, essas falhas são devidas à rápida degradação m icrobiana que se manifesta após aplicações continuadas do mesmo pesticida, cujo fenômeno é cham ado de degradação acelerada, justam ente porque tem-se verificado uma taxa mais rápida de degradação em campos agrícolas previamente tratados, do que em cam pos não tratados. Uma degradação acelerada por populações microbianas adaptadas tem resultado num reduzido controle de pragas (ROETH, 1986; FELSOT. 1989), Esse fenômeno tem sido verificado para muitos pesticidas suscetíveis à degradação acelerada (Tabela 2). Falha no controle de insetos por carbofuran foi verificada quando o com posto foi previamente aplicado, por 2 a 4 anos (FELSOT et al.. 1981 herbicida butilato é mineralizado mais rapidam ente em solos que têm sido repetidamente tratados com este produto, do que em solos sem exposição prévia (SKIPPER et al., 1986).
E possível também observar populações microbianas envolvidas na degradação acelerada com relação a um pesticida degradarem um a outra m olécula estruturalm ente similar. Esse fenôm eno tem sido denom inado de adaptação cruzada./O brigaw itch et
T A B E L A 2. R e la ç ã o p a rc ia l d e p e s tic id a s s u s c e tív e is à d e g ra d a ç ã o acelerada. 212 M icrobiologia A m biental P esticid as R eferências 2 ,4 -D A udus (1 9 4 9 ) C a rb o fu ra n F elso t et al. (1 9 8 1 ) 1989 Ip ro d io n e, vinclozolin W alker (1 9 8 7 )
P rocim idone S lad e et al. (1 9 9 2 ) D iazinon F o rre s t e t al. (1 9 8 1 ) Fensulfotion R ead (19 8 3 )
Isfoenfós R acke & C o ats (1 9 9 0 ) Butilato S k ip p e r et a i (1 9 8 6 ) EPTC Tal et al. (1 9 8 2 ) A trazina A s s a f & Turco (1 9 9 4 ) Trialato C otterill & O w en (1 9 8 9 ) C arb en d azim , benom il Y arden e t al. (1 9 8 5 ) A ldicarb S u ett & Jukes (1 9 9 3 ) D iphenam id A vidov et al. (1 9 9 0 ) Iso ticiam ato d e m etila Sm elt e t al. (1 9 8 9 ) F enam ifós D avis e t al. (1 9 9 3 ) N a p ro p a m id e W alker et al. (1 9 9 6 )
al. (1983) o b servaram que v em o lato e bu tilato foram degradados m ais rapidam ente em solos com um a população m icrobiana adaptada ao EPTC , do que em um solo não exposto a este herbicida. H á casos, no entanto , em que a adaptação cruzada tem sido v e rific a d a co m m o lé c u la s q u e n ão são estru tu ra lm e n te sim ilares. P or exem plo, populações m icrobianas de solos adaptadas ao herbicida trialato degradaram o herbicida EPTC em taxas aum entadas, m as tam bém degradaram o inseticida carbofuran em taxas superiores (C O T T E R IL L & O W E N , 1989).
A plicações repetidas de certos pesticidas podem também acelerar a degradação dos seus produtos form ados. O fungicida carbendazim , um produto da hidrólise do benomil, foi degradado mais rapidam ente em solos com histórico de aplicações de benomil do que em um solo não exposto ao produto (YARDEN et al., 1985). A meia vida do carbendazim foi reduzida de 11 para 4 dias em solos tratados com benomil. Do mesmo m odo, carbendazim foi rapidam ente degradado em solos previam ente tratados com seu m etabólito 2-am inobenzim idazole (A H A R O N SO N et al., 1990).
4. Avaliação da biodegradação
T radicionalm ente, os estudos de biodegradação freqüentem ente envolvem o e n r iq u e c im e n to d e c u ltu r a s , s e g u in d o - s e o is o la m e n to de c u ltu ra s p u ra s de m icrorganism os capazes de crescerem no xenobiótico com o única fonte de carbono e energia.
Estratégias de isolam ento de microrganism os envolvidos na d eg radação de xenobióticos 213
Os principais problem as asso ciad o s co m o en riq u e c im e n to co n v e n cio n al incluem: I -isolados obtidos podem ou não ser im portantes na degradação do xenobiótico em am bientes naturais pobres em nutrientes, porque a p ressão de enriquecim ento, subm etida na ferm entação das culturas a altas co n c en traç õ es do co m p o sto s, está re la c io n a d a às m á x im a s ta x a s d e c r e s c i m e n t o e s p e c í f i c o p a r a o s v á r io s m icrorganism os; 2 - alguns xenobióticos podem em p re en d er um a degrad ação parcial ou extensiva por com etabolism o e, portanto, a popu lação m icro biana ativ a deverá requerer um substrato para crescim ento; 3 - a degradação do xenobiótico pode requerer a in te ra ç ã o co m p le x a de v á rio s m e m b ro s de um c o n s ó r c io m ic ro b ia n o q u e, freqüentem ente, conduz à tentativas frustradas para se iso lar culturas puras capazes de degradar o poluente; 4 - em níveis relativ am ente altos do xenobiótico, geralm ente e m p re g a d o s para c u ltu ra s e n riq u e c id a s , o x e n o b ió tic o e/o u seu s p ro d u to s de transform ação podem ser tóxicos aos m icrorganism os presentes no inóculo; e 5 - interfaces ambientais, alternando m udanças na aeração ou potencial redox do am biente e/ou gradientes podem ser necessários p ara p ro m o v er a biodegradação.
Quase sempre, nos estudos de b io d egradação de m uitas substâncias orgânicas a v a lia d a s em c o n d iç õ e s de la b o ra tó rio , se v a lia d e c o n c e n tr a ç õ e s q u ím ic a s e x a g e ra d a m e n te s u p e rio re s à q u e la s e n c o n tr a d a s n o c a m p o . P o r ta n to , u m a extrapolação de resultados obtidos nessas cond ições pode não refletir a situação real sob condições naturais. Nesse sentido, é que o uso de radioisótopos, têm possibilitado as pesquisas sobre transform ação com inform ações seguras sobre a m in eralização e/o u co m eta b o lism o em co n c e n tra ç õ e s c o m u m e n te e n c o n tra d a s em a m b ie n te s naturais. O isótopo UC possui m eia-vida de 5770 anos, perm itind o a sua utilização com o traçador em experim entos de longa duração. Sua d esintegração se dá através da em issão de partículas beta negativas de 156 Kev de energia.
A conversão do xenobiótico l4C para l4C O , (m in eralização) serve com o um indicador de biodegradação. A tualm ente, são utilizados alguns m étodos de estudo para quantificação das taxas de m ineralização. Em todos eles a su bstân cia quím ica radiom arcada é incubada no solo, em frascos que são con tin u am en te am ostrados. Os dois sistem as m ais usados são o frasco de cal sodada e frasco de B arth a-P ram m er. O C O , é coletado em arm adilhas especiais contendo KOH 0.2M ou N aO H 0.2M ou m onoetanolam ina pura ou diluída em água. O dióxido de carbono desprendido é m edido por espectrom etria de cintilação líquida. A m olécula original e os m etabólitos form ados devem ser determ inados frente a p ad rõ es, p o r m eio de cro m a to g ra fia . M aio res detalhes sobre avaliação da m ineralização são en con trado s em M onteiro (2000).
5. Considerações finais
Solos, sedim entos e águas contam inadas com co m po sto s x enobióticos são substratos adequados para isolam ento de m icrorg anism os j á adaptados. G eralm ente esses xenobióticos são m oléculas sintéticas novas, o que fo rnece um a oportunidade para se estudar a evolução m icrobiana de novas vias de d eg rad ação ./’
O uso de m ic ro rg a n ism o s is o la d o s te m a s u a fin a lid a d e , em m u ito s casos, na biorrem ediação cujo objetivo é estim u la r o crescim en to de m icro rg an ism o s
214 M icrobiologia A m biental
in d íg e n a s o u i n tr o d u z id o s e m á r e a s c o n ta m in a d a s e, a s s im , f o r n e c e r um con tato d ireto en tre m icro rg a n ism o s e contam inan tes. 'P ara alguns contam inantes o rg â n ic o s q u e p o d em ser u sa d o s c o m o su b stra to s p rim ário s, a b io d eg ra d açã o a c e le r a d a é m a is fá c il d e s e r a lc a n ç a d a . E s ta . p o r su a v ez , e s tá lig a d a a co n stan te s a p lic a ç õ e s do m esm o ou de co m p o sto s estru tu ralm ente sim ilares no am biente.
N ão tem sid o fá cil is o la r m ic ro rg a n ism o s que m etabo lizam co m po sto s xenobióticos que não são persistentes no am biente, m esm o sabendo-se da existência de m icrorganism os biologicam en te ativos naquela área em e s tu d o .^ de se esperar que sinergism o ou co m etabolism o estejam envolvidos na degradação: Ás técnicas de enriquecim ento do solo e isolam ento usando tal m olécula, neste caso, não são tão eficazes. Um m étodo alternativo seria o enriquecim ento com um a substância análoga, sem , c o n tu d o a p r e s e n ta r os s u b s titu in te s x e n ó fo ro s q u e p o d eriam b lo q u e a r a b iodegradação .
A in d a co n sid eran d o -se a im p o rtân cia do com etabolism o e sinergism o na tra n sfo rm a ç ã o de x e n o b ió tic o s, os e stu d o s de b iod egrad abilidade dev eriam ser realizados com com unidades m icrobianas ou consórcio de m icrorganism os e não com linhagens individuais.
Referências
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