UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
DIVERGÊNCIA GENÉTICA ENTRE
DUAS POPULAÇÕES DE Melipona
scutellaris
(HYMENOPTERA, APIDAE,
MELIPONINI) POR MARCADORES
RAPD
Ana
Paula Soraggi
Campos
Warwick
Estevam
Kerr
DIRBI/UFU
1000191272
UBERLÂNDIA - MG
FEVEREIRO - 2000
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
/A
- i
DIVERGÊNCIA GENÉTICA ENTRE
DUAS POPULAÇÕES DE Melipona
scutellaris
(HYMENOPTERA, APIDAE,
MELIPONINI) POR MARCADORES
RAPD
Ana Paula
Soraggi
Campos
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Uberlândia, como parte das
exigências do Curso de Pós-Graduação em
Genética e Bioquímica, para a obtenção do
Título de Mestre em Genética e
Bioquímica.
UBERLÂNDIA
-
MG
I ( í) l WniicQ I I I Melipona scutellaris\ I I
I
I
I
I
- uuas populações'ae, Meliponini) por marcadores RAPD. erSencia GenétiCa 6níre dUa; ^^menoptera, Apidi - Uberlândia: 2000 63,1
Warwick Estevam Kerr
Tese de Mestrado. Universidade Federal Graduação em Genética e Biocnn^^
Inclui Bibliografia
r
APD
1. Meliponascutellatris- gencia genética - Teses. 3 ■ epi| !
~ , Pós-GíaduaÇ I. Universidade reaeral de Uberlândia. Coor^-' ao «e rv
a e Bioquímica.
1.16Q
Uberlândia. Coordenação de P°S'
Teses. 2. Divergên- -~»e Federal de Uh^15 lia. ( Genética eT*;''~ '
DEDICATÓRIA
Aos
meus pais,
Maria
José
e
José
Luiz
que
sempre serão
eternas
referências
de perseverança e humildade.
À
minha avó,
Maria
que
sempre
representará um
recanto
de
proteção
e aconchego
em minha
vida.
Aos
meus irmãos,
Rafael
e
Thiago
que com
pequenos
gestos
me
ensinam
grandes
coisas.
E
à
você,
Zé, que
participou mais
diretamente de
mais
esse
passo
em
minha
vida.
MEUS SINCEROS AGRADECIMENTOS
À
Deus,
pela
oportunidade
de
ter
acesso
ao mundo científico, e
de
conviver
com
pessoas
ilustres
que
muito auxiliaram
no
meu
amadurecimento espiritual.
Ao
Prof. D. Warwick Estevam Kerr,
exemplo
de
vida científica
e
humanitária,
pela
orientação,
confiança
e
amizade.
Aos
Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho
pela
disponibilidade
e
valiosas sugestões
na
elaboração
deste
trabalho
como
co-orientador.
À
Profa. Dra. Ana Maria Waldschmidt
pela gentileza
de
aceitar
o
convite
de participar
de
minha
banca
examinadora
e
pelas
sugestões
apresentadas.
À
Profa. Dra. Ana Maria Bonetti
responsável
pela
minha
introdução
no
mundo
das
abelhas,
pela amizade e
sugestões.
À
Prof. Dra. Cecília Lomônaco de Paula
pela
disponibilidade
de
me
atender gentilmente
em sua
sala,
dando
grandes
sugestões
neste
trabalho.
À
todos os professores de Departamento de Genética e
Bioquímica
pelos
ensinamentos
que
muito
auxiliaram
na minha formação
acadêmica.
Às
amigas,
Gislene Almeida Carvalho, Rosana de Cássia
Oliveira, Soraya Matos Vasconcelos
e
Vania Alves Nascimento
pela
constante força,
companheirismo
e acompanhamento
brilhante
neste
trabalho.
Além do
grande
carinho
e
"puxões
de
orelhas"
nas horas
certas,
que
foram essenciais para a
elevação
da
minha auto-estima.
À
todos os colegas e funcionários do Laboratório de Genética e
do Laboratório de Genética Molecular
pelo
excelente
convívio,
que
direta ou
indiretamente,
proporcionaram
momentos
representativos
para
o
meu crescimento pessoal
e
profissional.
Meus
agradecimentos
aos meliponicultores,
Sr. José Carlos Moraes
e
ao
Engenheiro
Agrônomo
Rogério Marcos Oliveira
pela
ótima
receptividade em
suas
cidades
e
pela
valiosa disponibilidade
de
nos
fornecer
as
amostras
de
uruçú
relativas
à
Bahia, sem
as
quais
esse trabalho
não
poderia
ser
realizado.
Ao
meu
marido
José Maria
pelo
amor,
paciência
e
apoio
nas
horas
difíceis.
Pelo
constante
incentivo
para continuar
seguindo
em
frente.
Pela
inenarrável forma
de
me suportar
nas
horas de agonia.
Pelo
excelente
convívio
no
dia a
dia,
que
muito
me
faz
crescer pessoalmente e
espiritualmente.
À
Minha Família,
que apesar
da
distância
e
das
horas de
ausência,
sempre
me
apoiaram
em
todas
as
decisões que
tomei na
vida,
tanto
no
sentido
profissional
como
pessoal.
Ao
CNPq
e
a
Universidade Federal de Uberlândia
pelo
auxílio
ÍNDICE
ÍNDICE... VI
LISTADE TABELAS... VII
LISTADE FIGURAS...VIII
LISTADE ABREVIATURAS...IX
1. INTRODUÇÃO...10
1.1. Considerações Geraissobre Abelhas...10
1.2. A ESPÉCIEMEUPONASCUTELLARIS... 11
1.3.0 Uso de Dados Molecularesem Estudosde Populações...14
1.3.1. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)...16
1.3.2. RAPD em Populações de Insetos... 20
1.4. Objetivoe Justificativas...25
2. MATERIALE MÉTODOS... 26
2.1. Material Biológico...26
2.2. Análise Molecular...28
2.2.1. Extração do DNA genômico... 28
2.2.2. Quantificação do DNA genômico... 30
2.2.3. Amplificação com primers aleatórios...30
2.2.4. Separação e Visualização dos produtos amplificados... 32
2.2.5. Análise dos dados... 32
3. RESULTADOSEDISCUSSÃO...33
3.1. Otimizaçãodasreaçõesutilizadas...33
3.2. Análisedospadrõesdeamplificaçãocomprimersaleatórios...34
4. CONCLUSÕES...44 RESUMO... 46 SUMMARY...47 5. REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS...48 ÍNDICE REMISSIVO...57 VI
LISTA OE TABELAS
Tabela
1
Página
Origem das amostras de Melipona
scutellaris... 24
2
3
Lista dos primers utilizados para amplificar o DNA das 14
amostras de Melipona scutellaris e suas respectivas seqüências de nucleotídeos... 29
Relação do número de posições de bandas monomórfícas e
polimórficas por primer selecionado... 33
Matriz das distâncias genéticas expressas em porcentagem de desacordo, obtida para os 14 genótipos de Melipona scutelaris,
por meio de 136 posições de bandas
RAPD... 34
LISTA t>E FIGURAS
Figura Página
1 Vista interna de ninho de Melipona scutellaris... 22 2 Dendrograma representativo da distância genética por
porcentagem de desacordo e agrupamento pelo método de UPGMA, entre os 14 genótipos de Melipona scutellaris, por
meio de 136 posições de bandas RAPD... 36
3 Padrão de amplificação de fragmentos de DNA (RAPDs)
obtidos com o primer OPM 15, para os 14 genótipos de Melipona scutellaris, analisados por eletroforese em gel de agarose 1.2%. M-Marcador de peso molecular de DNA, 1-MG- 322, 2-MG-335, 3-MG-441, 4-MG-445, 5-MG-480, 6-MG-519,
7-MG-533, 8-BA-32, 9-BA-33, 10-BA-34, ll-BA-35, 12-BA-
36, 13-BA-38 E 14-BA-39. A seta indica o marcador
OPM15.38Kb para a população de Uberlândia, MG... 39
LISTA DE ABREVIATURAS
ABS
absorbância
°C
graus
Celsius
cm
centímetros
cM
centimorgans
DNA
ácido
desoxirribonucléico
DNTP
desoxirribonucleotídeos
EDTA
ácido etilenodiaminotetra
acético sal dissódico
g
grama
(s)
h
hora
(s)
HC1
ácido clorídrico
Kb
quilobases
M
molar
mA
miliampere (s)
mg
miligrama
(s)
MgCl
2
cloreto
de magnésio
ml
mililitro (s)
mm
milímetro
(s)
mM
milimolar
min.
minuto
(s)
h
haplóide
NaCl
cloreto de
sódio
ng
nanograma (s)
nm
nanômetro
(s)
pb
pares
de
base
pH
potencial
hidrogeniônico
pmoles
pico-moles
rpm
rotações por
minuto
RNA
ácido
ribonucléico
SDS
lauril
sulfato
de
sódio
Tris
tris
(hidróxido metil
amino
metano)
UV
ultra-violeta
V
volts
Pg
micrograma
pl
microlitro
(s)
1.
INTRODUÇÃO
1.1. Considerações Gerais
sobreAbelhas
No reino Animalia, o filo Arthropoda têm cerca de 34.000.000 de espécies, das
quais 80% pertencem à classe Insecta, sendo portanto, o grupo com maior número de
indivíduos, superando todos os outros grupos animais reunidos (ADIS, 1990). A classe Insecta divide-se em várias ordens. Uma delas são os Hymenoptera que compreendem as formigas, vespas e abelhas. As abelhas podem ser reunidas na superfamília Apoidea,
com 10 famílias, que se destacam por exibirem grande diversidade de habitats e uma alta complexidade de comportamentos, culminando em uma alta organização social. A
família Apidae subdivide-se em 3 subfamílias: Xylocopinae, Nomadinae e Apinae.
Dentre os Apinae, encontramos as tribos corbiculadas: Apini, Meliponini, Bombini e Euglossini (ROIG-ALSINA & MICHENER, 1993). As três primeiras estão num estágio
social avançado. A grande maioria das outras Apoidea são abelhas solitárias ou de
hábitos sociais primitivos (NOGUEIRA-NETO, 1997).
A origem das abelhas do globo é relativamente recente e está relacionada com
o aparecimento das Angiospermas (MULLER 1972, 1981 apud CRUZ, 1960). Os
primeiros fósseis conhecidos de himenópteros datam do carbonífero inferior, mas as
abelhas só apareceram muito mais tarde, há cerca de 150 milhões de anos atrás, no
Cretáceo (CRUZ, 1960).
As abelhas da tribo Meliponini, também conhecidas como abelhas indígenas
sem ferrão, em geral, são distinguíveis das outras, principalmente pela atrofia do ferrão, redução e fragilidade da venação alar e por não possuírem pêlos nos olhos (MOURE,
1961; SAKAGAMI, 1982; WILLE, 1983; CAMARGO, 1989; MICHENER, 1990).
Ao longo de sua história evolutiva, os Meliponínios conquistaram vários
habitats, ocupando grande parte da região de clima tropical e algumas importantes
regiões de clima temperado subtropical (NOGUEIRA-NETO, 1997). Contudo, sua
maior diversidade e abundância de formas encontra-se nos trópicos (região Neotropical
hemisfério sul (MOURE, 1961; KERR & MAULE, 1964; CAMARGO, 1989; MICHENER, 1990; CAMARGO E PEDRO, 1992).
A importância dessas abelhas reside no fato de apresentarem uma grande associação com plantas e outros animais, inclusive o homem. São consideradas as mais eficientes polinizadoras da flora americana, polinizando até 90% das espécies de plantas
nativas (KERR et al., 1996). ABSY et mostraram que 8% das árvores do médio Amazonas são polinizadas por no mínimo 5 espécies de abelhas. Todavia, nessa mesma amostra, 5 árvores são polinizadas por apenas 1 espécie de abelha. Assim, a
extinção dessas abelhas pode resultar na possibilidade de extinção de espécies vegetais e conseqüente desequilíbrio no ecossistema (ROUBIK, 1989).
O entendimento dos aspectos biológicos, que compreendem os mecanismos de reprodução das abelhas nativas, está associado a todos os esforços que estão sendo
executados, nos últimos 50 anos, para a possível manutenção de algumas espécies geograficamente mais próximas do homem (AIDAR, 1999).
1.2.
A
espécieMelipona
scutellaris
A espécie Melipona scutellaris Latreille, 1811 pertence à tribo Meliponini,
subfamília Apinae, família Apidae (ROIG-ALSINA & MICHENER, 1993). A
subfamília Apinae engloba as abelhas indígenas sem ferrão, das quais, muitas são
conhecidas como “uruçu”, que na língua tupi significa “abelha grande”. Muitas outras
espécies desse grupo foram domesticadas pelos índios, sendo atualmente descritas mais
de 300 espécies, com cerca de 54 gêneros que se distribuem em toda a Região
Neotropical (CAMARGO & PEDRO, 1992).
A abelha Melipona scutellaris é basicamente conhecida como “uruçu do Nordeste” devido à sua distribuição geográfica alcançar desde a Bahia até o Estado do
Rio Grande do Norte, ocupando principalmente o Bioma chamado de Zona da Mata
(CARVALHO, 1996).
As abelhas sem ferrão, em seu ambiente natural, têm dificuldades de achar um
lugar para seu novo enxame. A grande maioria usa ocos de árvores, em diferentes
alturas. KERR et al. (1996) encontraram colônias de M. scutellaris (uruçu do Nordeste) e M. rufiventris (uruçu amarela) ocupando ocos de árvores a 40m de altura. Os ninhos
são construídos basicamente de cera pura ou cerume, que é uma mistura de cera, própolis e barro. Batume é a denominação para a mistura de própolis e barro e é geralmente usada na delimitação da morada. A maior parte dos Meliponínios faz reserva
de cera, que é armazenada nas bordas dos favos de cria ou sobre o invólucro em
pequenas bolinhas, formando pequenos montes próximas à entrada do ninho. Dentro dos ninhos, os favos de cria são dispostos na forma de placas horizontais, cujas células ou alvéolos se abrem para cima. Estas placas se sobrepõem e são separadas por pilastras de cera, permitindo a passagem das abelhas entre as placas. O mel e o pólen são
armazenados em potes de cera ovais, com volume variável (MARIANNO FILHO,
1911).
Os Hymenoptera constituem a 3a maior ordem de insetos. Grande parte de suas peculiaridades, inclusive sua maior freqüência de espécies com vida social, é devida ao
seu sistema de determinação de sexo (KERR et al., 1978). O sistema genético usado por
essas abelhas, denomina-se haplo-diploidia, em que as fêmeas originam-se de ovos
fecundados, sendo diplóides e os machos originam-se de ovos não fecundados, sendo
haplóides. Este tipo de sistema genético denomina-se partenogênese arrenótoca
(DZIERZON, 1845). KERR et al. (1978) sugerem que a determinação de sexo nas abelhas ocorre em duas fases: a primeira fase ocorre poucas horas após a postura e a
segunda, no final da fase de pré-pupa, anteriormente à desenvolvimento de todos os
discos imaginais. Existe um equilíbrio entre os genes reguladores, que atuam sobre um
conjunto de genes aditivos (não compensados) determinadores do sexo feminino e sobre
os genes parcialmente não aditivos ou não aditivos (compensados), determinadores da
masculinidade. Esse balanceamento gênico para determinação do sexo é um mecanismo geral que explica a definição do sexo por arrenotoquia. O locus xo é o principal
responsável pela determinação do sexo nas abelhas.
A determinação de castas nos Meliponínios se dá pelo sistema "genético
alimentar". KERR (1975) propôs uma explicação molecular deste mecanismo,
mostrando que este processo seria em conseqüência da combinação dos alelos dos genes determinantes de casta : xa e xb. Cada um desses genes possui dois alelos : xa1, xa2, xb1,
xb2. Assim, as larvas duplo heterozigotas são rainhas e as que possuem homozigose em qualquer um dos dois alelos ou em ambos, são operárias.
Outro aspecto importante da biologia dessas abelhas, que tem muita influência
no comportamento de populações isoladas, refere-se ao fato de serem particularmente sensíveis à homozigose dos alelos xo. Nesta condição, aparecem machos diplóides (duplo homozigotos para os alelos sexuais) considerados “estéreis”. Em algumas
espécies sociais estes machos são eliminados pelas operárias, o que também pode
ocorrer com a rainha, podendo ocasionar assim, a morte da colônia. A manutenção de pequenas populações, com menos de 44 colônias da mesma espécie na sua área reprodutiva, promove a diminuição do número dos alelos sexuais xo, induzindo a
formação desses machos diplóides (KERR & VENCOVSKY, 1982). Em regiões onde o número de colônias é baixo, a espécie pode desaparecer devido à formação da homozigose dos alelos xo, e isto ocorre com freqüência nas pequenas matas primárias
que são conservadas (AIDAR, 1996, 1997).
No Brasil, muitas espécies de Meliponínios têm sido criadas principalmente para a produção de enxames, mel, pólen, cera e própolis. Contudo, estão sendo
seriamente ameaçadas de extinção em conseqüência de alterações em seus habitats
causadas por desmatamentos, uso indiscriminado de agrotóxicos e várias outras ações
antrópicas prejudiciais ao meio ambiente. A criação e exploração racional dessas
abelhas é uma alternativa que poderá preservar muitas espécies, permitindo a obtenção
de seus produtos, sua utilização como polinizadoras e facilitar as pesquisas científicas
com as mesmas.
Melipona scutellaris, em seu ambiente natural, está separada por mais de 300Km de distância da área de ocorrência M. capixaba. Em Uberlândia, elas foram
colocadas no mesmo meliponário, na suposição de que fossem completamente isoladas reprodutivamente (NASCIMENTO, 1996). Contudo, segundo MOURE & CAMARGO
(1994) M. scutellaris é a espécie, relacionada ao grupo da Amazônia, mais próxima geograficamente da M. capixaba. Estas espécies apresentam algumas similaridades, como a estrutura das genitálias, que são praticamente idênticas, mostrando que são
evolutivamente muito próximas.
Entre novembro/95 e março/96, foi verificado por NASCIMENTO (1996) uma
troca natural de rainha nas colônias de M. capixaba. Pela observação morfológica dos
descendentes das colônias de M. capixaba, detectou-se que eram distintos dos demais e
scutellaris, que ocorriam em maior quantidade. Detectou-se também que os descendentes desta colônia (supostos híbridos) eram capazes de se reproduzirem e originarem descendentes férteis, pois, uma das rainhas virgens, filha da rainha que estava produzindo híbridos, foi fecundada. A confirmação dessa hibridação foi realizada
por NASCIMENTO & MATUSITA (1996) e NASCIMENTO et al. (1999) comparando
o padrão esterásico entre elas.
1.3.
O
Usode
DadosMoleculares
em Estudosde Populações
Até os anos 60, os marcadores utilizados em estudos genéticos eram controlados por genes associados à caracteres morfológicos de fácil identificação visual(OLIVEIRA, 1998).
A utilização da dados moleculares, em diversos estudos, vem sendo feita cada vez com mais freqüência, nos mais diferentes grupos taxonômicos e tem contribuído
para avanços consideráveis na genética e sistemática da ordem Hymenoptera (COSTA,
1998). A utilização de marcadores moleculares tem várias vantagens sobre marcadores
morfológicos convencionais: os marcadores moleculares exibem neutralidade fenotípica
sem influência ambiental, são herdados codominantemente (RFLP, Restriction
Fragment Length Polymorphism) e/ou de forma dominante (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA), raramente exibem interações epistáticas ou pleiotrópicas, podendo
ser detectados tanto em indivíduos jovens como adultos (TANKSLEY et al., 1989). Outros marcadores como isoenzimas, análises de DNAmt, mini e microssatélites também
são amplamente usados em uma grande variedade de estudos de populações.
CONTEL & MESTRINER (1974) foram os primeiros publicar a dados sobre a
variabilidade alozímica em Meíiponíneos. Eles descreveram o polimorfismo no locus Est 3 de Melipona subnitida e M. quadrifasciata. Depois, vários trabalhos surgiram sobre polimorfismos de populações do grupo. CONTEL & MESTRINER (1975) e
RESENDE (1997) caracterizaram a atividade esterásica durante o desenvolvimento
ontogenético de três espécies de Melipona. DEL LAMA & MESTRINER (1984),
LIMA & MESTRINER (1985), CURSINO & CONTEL (1991), MACHADO et al.
(1992), SANTOS (1993), dentre outros, avaliaram padrões proteicos de vários sistemas
Análises de proteínas por eletroforese têm sido usadas para detectar variações em insetos mas, alguns grupos de insetos com baixos níveis de variação genética detectáveis, não podem ser estudados a não ser por marcadores mais sensíveis, como os
provenientes de análises de DNA (HOY, 1994).
O aspecto físico do DNA também oferece várias vantagens sobre isoenzimas.
O DNA é encontrado em todas as células, de todos os organismos e pode ser extraído tanto de tecido vivo, quanto de tecido morto. Além disso, tecidos podem ser facilmente estocados sob várias condições, e em muitos casos apenas poucos nanogramas de DNA
são necessários para as análises (quando amplificados por PCR, Polymerase Chain Reactiori). A molécula é tão estável que pode se manter intacta por milhões de anos
(PARKER et al., 1998).
A diversidade genética dentro de populações e espécies é influenciada por uma
multiplicidade de fatores, incluindo ciclo de vida, tempo de geração, princípios de dispersão de pólen, proporção geográfica e nicho ecológico. Essas características
biológicas poderão ser reconhecidas mais a fundo, em estratégias desenvolvidas pela
diversidade quantificada por marcadores de DNA (WILLIAMS et al., 1993). No mais,
análises moleculares permitem comparações de seqüências de DNA e produzem dados,
que podem ser convertidos para estimar seqüências divergentes.
Na década de 80, um enorme avanço ocorreu na genética quando Kary Mullis
desenvolveu a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A facilidade,
rapidez, versatilidade e sensibilidade da PCR torna-a particularmente poderosa para
estudos genético-moleculares envolvendo grande número de indivíduos de qualquer
organismo vivo (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1996).
Esta técnica tem sido utilizada em vários estudos de seqüências específicas e
aleatórias do DNA. Ela envolve a síntese enzimática in vitro de milhões de cópias de
um segmento de DNA, na presença da enzima DNA polimerase, dNTPs e magnésio.
Esta reação baseia-se no anelamento e extensão enzimática de oligonucleotídeos (
primers, pequenas moléculas de DNA fita simples) utilizados como iniciadores, que delimitam a seqüência de DNA de fita dupla, alvo da amplificação. Estes primers são
sintetizados artificialmente, de maneira que suas seqüências de nucleotídeos sejam
complementares às seqüências específicas que flanqueiam a região alvo. Um ciclo de
é desnaturada por meio da elevação da temperatura para 90-94°C. Na etapa de anelamento, a temperatura é rapidamente reduzida para 35-60°C, dependendo essencialmente do tamanho e sequência do primer utilizado, permitindo a hibridação DNA-DNA de cada primer com as seqüências complementares que flanqueiam a região
alvo. Em seguida, a temperatura é elevada para 70-72°C para que a enzima DNA
polimerase realize a extensão a partir de cada extremidade 3’ dos primers. Esta extensão envolve a adição de nucleotídeos utilizando como molde a seqüência-alvo, de maneira que uma cópia desta sequência é feita no processo. Este ciclo é repetido algumas dezenas de vezes até que se consiga a quantidade de DNA desejada (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1996).
Com base na PCR, várias outras técnicas foram desenvolvidas para a detecção de polimorfismos de DNA, como AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism),
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisrri), RNA display, VNTR (Variable Number of Tanden Repeats) e RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), dentre outras.
1.3.1. RAPD
(Random
AmplifiedPolymorphic
DNA)
A tecnologia de primers arbitrários em PCR (AP-PCR), mais comumente
conhecida como Amplificação ao Acaso de DNA Polimórfico (RAPD) utiliza um único
primer específico (WELSH & MCCLELLAND, 1990) ou dois primers diferentes (WILLIAMS et al., 1990) para produzir uma impressão digital do DNA genômico, via PCR. Nesta reação, os primers se associam às regiões homólogas do DNA genômico,
em dois sítios diferentes nas fitas opostas do DNA. Nestes dois sítios, dentro de uma
distância amplificável, não superior a 4000pb, o produto de DNA é produzido por meio
de uma amplificação termocíclica.
A idéia de se utilizar primers curtos e de sequência arbitrária para dirigir a
reação de amplificação, eliminando assim a necessidade de conhecimento prévio da
seqüência, gerou um grande avanço na área de marcadores moleculares. Além desta
vantagem do RAPD, podem ainda ser citadas a necessidade de pequena quantidade de
DNA, a não utilização de sondas e eliminação da necessidade de isótopos radioativos. O
tampouco instalações sofisticadas de laboratório, além de ser simples, rápida e de baixo custo (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1996, WILLIAMS et al., 1993). Outra importante vantagem desta técnica é que ela permite uma "busca" por todo genoma,
permitindo a análise de regiões codificadoras e não-codificadoras e de seqüências repetitivas (RAFALSKI & TINGEY, 1993; SCHIERWATER, 1995). Considerando as regiões não-codificadoras e seqüências de DNA repetitivas, variações mais
consideráveis podem ser encontradas, como mudanças de seqüências de nucleotídeos. Essas mudanças, teoricamente, tem maiores chances de persistirem no genoma, uma vez
que são consideradas mutações nulas. Tais seqüências são consideradas como um reservatório de variação genética. Princípios evolutivos operam diferentemente nestas
regiões e em regiões de genes de cópia única, e por isso podem ser mais apropriadas para descrever certos relacionamentos sistemáticos e filogenéticos (HAYMER &
McINNIS, 1994).
Contudo, algumas desvantagens também são citadas na literatura. Os
fragmentos gerados por RAPD geralmente apresentam de 200 até 2700 pb. O
polimorfismo é reconhecido como a presença de um fragmento específico amplificado em um genótipo e não amplificado no outro genótipo. Tais polimorfismos comportam-
se como marcadores genéticos dominantes, de forma que não é possível a identificação
de heterozigotos (WILLIAMS et al., 1990). Esse baixo conteúdo de informação por locus, é sua principal limitação. Outra grande desvantagem é que os padrões gerados são bastantes sensíveis às condições das reações, podendo haver uma baixa
repetibilidade nos resultados (quando as condições das reações não são mantidas
constantes).
Devido à grandes críticas sobre a falta de repetibilidade no padrão de bandas
geradas pelo RAPD, vários autores têm publicado sobre como a fidelidade nas
condições das reações é importante para minimizar essa limitação.
MEUNIER & GRIMONT (1993) testaram a repetibilidade de 2
termocicladores e três marcas da enzima Taq DNA Polimerase. Utilizando três primers
e DNA de 3 espécies diferentes de bactérias, eles concluíram que houve diferenças no
padrão de amplificação entre enzimas de marcas diferentes, como também entre
enzimas com tampões diferentes. Detectaram também diferenças com a mudança da
WEEDEN et al. (1992) investigaram a herança e confiança dos marcadores RAPD em populações de ervilhas e maçãs. Eles testaram todos os reagentes da reação e
verificaram que a menor mudança no fenótipo RAPD foi com 1,5 a 3,0 mM de MgCl2 e temperatura de anelamento entre 35 e 42°C. Detectaram que o óleo mineral usado nas
reações (para evitar a evaporação dos reagentes) quando contaminado, as inibia.
Em um estudo mais recente, KHANDKA et al. (1997) usando DNA de 4 espécies diferentes (Asparagiis officialis, Dactylis glomerata, Mercurialis annua e Escherichia colí) também examinaram a variabilidade no padrão de amplificação associada aos constituintes da reação. Detectaram que existe uma proporção de DNA e
enzima Taq polimerase e que um aumento na proporção da enzima em relação ao DNA, aumenta o número de fragmentos amplificados, enquanto que o contrário, reduz esse número. Verificaram também que um aumento na concentração de primer resulta na
amplificação de fragmentos de menor peso molecular e vice-versa. Avaliaram a
manipulação mecânica do DNA (por sonicação) antes da montagem da reação e
verificaram uma correlação positiva no grau de degradação do DNA e redução de produtos amplificados. Testaram também digestões do DNA genômico antes das
reações e observaram que DNAs digeridos apresentam mais fragmentos amplificados
que DNAs não digeridos.
A respeito do DNA, WILLIAMS et al. (1993) citam que devido à diferentes
métodos de extração oferecerem DNA de pureza e integridade diferentes, toma-se
necessário otimizar a quantidade de DNA usada nas reações RAPD para se alcançar
uma boa repetibilidade e um forte sinal de amplificação.
Embora o protocolo RAPD seja relativamente simples e rápido, sua aplicação
prática para estudos genéticos de populações heterogêneas é ainda limitada nos casos
em que grandes números de indivíduos precisam ser examinados. Uma pesquisa que
veio minimizar essa limitação foi o uso de bulks de amostras de DNA genômico.
Vários autores usaram a metodologia de bulk ou pools (conjunto de indivíduos
incluídos na mesma amostra) como um método para identificar rapidamente marcadores
ligados à qualquer gene específico ou região genômica. MICHELMORE et al. (1991)
descreveram esse método chamado BS A (Qulk Segregant Analysis) como um método
rápido de identificar marcadores ligados à qualquer gene específico ou região genômica.
agrupados, baseado na expressão da característica. Em cada bulk os indivíduos são idênticos para uma característica particular ou região genômica, mas segregam
aleatoriamente para todos os outros genes. Amostras de DNA de cada grupo, são agrupadas separadamente, e os dois pools de DNA submetem-se à varredura para polimorfísmos RAPD ou RFPL. Marcadores polimórficos entre os dois bulks são
geneticamente ligados ao loci que determina a característica usada para construir os
bulks.
GIOVANNONI et al. (1991) demonstraram a utilidade de se criar bulks de DNAs em indivíduos homozigotos, baseado no conhecimento de marcadores RFLPs
prévios, usados no mapeamento das populações analisadas.
REITER et al. (1992) usou esta estratégia para identificar 100 marcadores RAPD específicos do cromossomo 1 de krabidopsis thaliana. A saturação de mapas
genéticos utilizando o pooling (agrupamento na mesma amostra de indivíduos semelhantes à uma determinada característica) permitiu enfocar mais eficientemente
regiões específicas do genoma.
KHANDKA et al. (1997) testaram a viabilidade do uso de métodos de bulks de DNA com marcadores RAPD. Amplificaram DNAs obtidos de um bulk de 10 indivíduos e DNAs individuais de machos e fêmeas de Mercurialis annua, usando 131
primers. Foram encontrados 18 fragmentos polimórficos entre machos e fêmeas, sendo que 16 foram marcadores "falsos positivos". Tais marcadores foram polimórficos entre
plantas individuais de ambos os sexos ou estiveram presentes ou ausentes em todos
indivíduos. Contudo, foi possível detectar 2 fragmentos polimórficos verdadeiros nesse
caso.
A técnica RAPD tem sido utilizada em uma ampla variedade de estudos
genéticos. Marcadores RAPD têm sido aplicados em mapeamentos de genes, genética
de populações (fluxo gênico, discriminação de espécies e diversidade genética em
coleções de germoplasmas) sistemática e taxonomia molecular e marcadores associados
à seleção de acasalamentos de plantas e animais (TINGEY et al., 1992; WILLIAMS et
al., 1993).
No reino animal o RAPD vem sendo cada vez mais aplicado, principalmente
em genética de populações. NAGARAJA & NAGARAJU (1995) diferenciaram
RAPD que geraram 216 produtos amplificados usando 40 primers, baseados na comparação de pareamento dos produtos amplificados, coeficiente de similaridade
genética e análise de chister hierárquico.
KRAUS & HUNT (1995) avaliaram espécimes do ácaro, Varroa jacobsoni,
coletados em colônias de Apis mellifera da Califórnia, Texas e Alemanha e espécimes coletados em colônias de Apis cerana da Malásia. Encontraram uma porcentagem de bandas monomórficas que indicaram uma baixa variabilidade genética dentro das
populações. Contudo, encontraram marcadores específicos entre populações de ácaros coletados em colônias de diferentes espécies de abelhas e entre diferentes estados.
ABADI et al. (1996) estimaram a variabilidade genética entre isolados do fungo Exserobilum turcicum, patógeno do milho e sorgo, por meio de 20 primers RAPD. A maioria dos primers detectaram polimorfismos hospedeiro-específico, mas
não raça-específicos do fungo.
1.3.2.
RAPb
emPopulações
de Insetos
CHAPCO et al. (1992) analisaram a similaridade genética entre 7 espécies de gafanhotos de 2 subfamílias (Melanophinae e Oedipodinae) dos Acrididae. Encontraram
uma similaridade entre indivíduos da mesma espécie de 51,2%, enquanto que para espécies ou gêneros diferentes encontraram 35%, avaliando o RAPD como satisfatório
em análises sobre Sistemática Molecular.
Estudos filogenéticos em populações de insetos por marcadores RAPD têm
sido amplamente desenvolvidos devido às facilidades da técnica. KAMBHAMPATI et
al. (1992) analisaram geneticamente espécies e populações do mosquito Aedes, identificando espécies desconhecidas e reconstruindo a filogenia por meio de 2 primers
aleatórios.
Com a finalidade de caracterizar biotipos de microhimenópteros dos gêneros
Anaphes e Trichogramma, parasitas usados no controle biológico de Lepidópteros, que são pragas de diversas espécies de plantas comerciais, LANDRY et cz/.(1993) selecionaram 13 primers, que geraram 57 loci polimórfícos informativos. Esses loci foram usados em análises filogenéticas, em que 3 puderam diferenciar 2 biotipos de
nov.. Foi encontrado um maior nível de heterozigosidade na nova espécie, sendo
justificado por diferentes padrões de comportamento reprodutivo e de oviposição. Nos Trichogramma encontraram maiores diferenças no padrão de amplificação, onde a heterogeneidade foi maior dentro e entre espécies indicando que um sistema de
marcação mais eficiente é requerido para monitorar a integridade genética dos biotipos
comerciais.
HAYMER & McINNIS (1994) identificaram marcadores genéticos RAPD
caracterizando populações da mosca da fruta mediterrânea Ceratitis capitata. Com os diferentes primers analisados, foi possível detectar diferentes níveis de polimorfismos
de diferentes populações. Foram detectados marcadores genéticos que puderam distinguir entre populações cultivadas em laboratório de populações selvagens, bem
como subpopulações de moscas de localidades geográficas distintas.
Para constatar a possibilidade de que a divisão de trabalho nas vespas, Polybia
aequatorialis tinha um componente genético, O’DONNELL (1996) avaliou operárias forrageadoras de diferentes fontes (resina, néctar, água e insetos pilhadores). Por
marcadores RAPD, estimou a similaridade genotípica baseada no compartilhamento de
bandas variáveis. Padrões de associação de marcadores RAPD segundo as
especializações de forrageamento foram constantes em 2 das 3 colônias analisadas, sugerindo seleção à nível de colônia, como fator favorecendo a manutenção da alta
variabilidade genética neste e em outros grupos de insetos.
DIMOPOULOS et al. (1996) demostraram como marcadores RAPD têm sido
integrados em mapas genéticos e citogenéticos do mosquito vetor da malária, Anopheles
gambie. Foram mapeados 15 marcadores por recombinação, relativos à microssatélites que tinham sido mapeados previamente. Foram purificadas do gel, clonadas e
sequenciadas 34 bandas RAPD, gerando 31 sítios de seqüências etiquetadas (STSs) que
podem ser usados como pontos dentro do genoma, enriquecendo o mapa genômico do
mosquito.
CARTER et al. (1996) estimaram alta divergência genética por análise de
cluster e isoenzimas em populações do besouro Tomicus piniperda nos Estados Unidos. Contrariando dados obtidos por proteínas, que sugerem baixos níveis de variabilidade
LU & RANK (1996) estimaram uma diversidade genética 10 vezes superior à
encontrada por dados de isoenzimas, para machos (n) de 5 populações geograficamente isoladas de uma abelha polinizadora de alfafa (Megachile rotundata). Foram testados 16 primers (130 bandas polimórficas) e os resultados foram obtidos por cálculo da
heterozigosidade, divergência de nucleotídeos e distância genética.
TABERNER et al. (1997) caracterizaram a população de um coleóptero que ataca plantações de beterraba destinada à produção de açúcar no sul da Espanha. A
distância genética entre as populações foi estimada, podendo-se inferir a evolução desta peste nas plantações vizinhas. Os resultados obtidos foram compatíveis com um único evento de colonização, seguido pela dispersão para áreas vizinhas.
Poucos trabalhos utilizando marcadores RAPD foram feitos até o momento para os Apídeos. O primeiro trabalho em Apis mellifera foi feito por HUNT & PAGE
(1992a), onde foi demonstrado, pela primeira vez, que marcadores RAPD não são herdados somente de maneira dominante. Por meio da segregação dos marcadores
RAPD em rainhas (2n) e zangões (n) por inseminação instrumental, foram encontrados
4 tipos de polimorfismos em zangões e rainhas virgens Fl. Os polimorfismos para
presença/ausência e intensidade de bandas foram herdados de maneira dominante. Os
polimorfismos por tamanho de fragmento que segregaram em 1:1 na progênie de zangões, seriam marcadores alélicos para os mesmos, ou estariam compactamente
ligados em trans. O último tipo de polimorfismo observado, caracterizou-se como uma banda diplóide-específica de zangões (2n) obtidos por retrocruzamento. Observou-se
que quando os produtos amplificados por PCR de dois zangões haplóides diferentes
eram misturados, uma banda diplóide-específica se restabelecia, sendo portanto
resultado da formação de um heteroduplex no DNA de alelos alternados no
heterozigoto.
O locus da determinação de sexo (xo) em Apis mellifera foi mapeado pela
segregação de marcadores RAPD em cruzamentos por inseminação instrumental
(HUNT & PAGE, 1992b). Foi obtido um marcador polimórfico para zangões diplóides.
Este foi clonado e parcialmente seqüenciado. Primers foram construídos para este locus
STS (Sequence-Tagged Site) e a progênie foi testada. Observou-se que os marcadores RAPD e STS foram codominantes (devido à ocorrência de alelos por tamanho de
marcadores e somente 3 operárias, das 181, foram homozigotas recombinantes. Portanto, a distância entre o locus xo e o locus sts foi estimada em 1,6 cM.
HUNT & PAGE (1995) construíram o mapa de ligação de Apis mellifera com
base em 365 marcadores RAPD polimórficos. Os testes foram feitos em machos (Fl) originados de cruzamento artificial, com outros dois marcadores segregantes: a cor preta do corpo e o locus da malato desidrogenase. O mapa de marcadores cobriu 3110 cM em
26 grupos de ligação, sendo o tamanho total do genoma estimado em 3450 cM. Foi observado, pelo tamanho do mapa, que existe uma alta taxa de recombinação nesta
espécie.
SUAZO et al. (1998) detectaram marcadores RAPD que distinguiram abelhas
melíferas Africanas e Européias. Foram selecionados 5 primers, dentre os 700 testados. Eles identificaram um marcador RAPD população-específico, altamente informativo,
que gerou resultados consistentes com marcadores RFLP populações-específicos
prévios, que sugeriram um grau de hibridação entre tais populações.
LAURENT et al. (1998) construíram 3 mapas de ligações compostos do genoma da vespa parasitóide, Trichogramma brassicae, baseado na análise da
segregação de marcadores RAPD em 3 populações F2. Essas populações foram constituídas de progênies de machos (n) de várias rainhas virgens Fl, as quais vieram de
cruzamentos de 4 linhagens parentais, que foram fixadas para diferentes marcadores RAPD polimórficos e que foram polimórficos para caracteres como longevidade e
fertilidade. Foram organizados 84 marcadores dentro de 5 grupos de ligação. O
intervalo entre os 2 marcadores foi de 17,7cM, e o mapa composto mediu 1330cM. LOU et al. (1998) descreveram a estrutura populacional e variabilidade RAPD
entre e dentro de populações naturais de Cephus cinctus Nortan (Hymenoptera: Cephidae), um inseto praga de trigo. Foram selecionados 31 dentre os 62 primers
testados. Vinte primers geraram 60 fragmentos usados para análises da homogeneidade
entre as populações, sugerindo 77% de divergência genética.
OLIVEIRA (1998) determinou a distância genética por marcadores RAPD
entre populações de Tetragonisca angustula provenientes de 26 localidades (3 países da
América Latina), duas amostras de Tetragonisca buchwaldi, e usando Apis mellifera como outgroup. Foram analisados 18 primers, sendo 7 longos e 11 curtos, que
encontrado que primers longos foram mais eficientes na distinção de grupos mais distantes, enquanto que primers curtos distinguiram melhor genótipos mais próximos. Outro resultado interessante foi que o grau de distância genética entre T. angustula e T. buchwaldi, que pertencem ao mesmo gênero, foi maior do que entre T. angustula e A. mellifera.
Analisando 21 genótipos diferentes àeMelipona rufiventris, VASCONCELOS (1998) determinou a distância genética entre populações alopátricas, provenientes de 6 localidades, utilizando a técnica de marcadores RAPD. Foram identificados 84
marcadores, que permitiram separar os genótipos em 3 grupos distintos, à nível de 27%
de distância genética.
WALDSCHMIDT et al. (1998), calcularam a variabilidade genética intracolonial por marcadores RAPD, em colônias de M. quadrifasciata. Cálculos
realizados utilizando o coeficiente de Jaccard, demonstraram que a variabilidade
genética intracolonial nesta espécie é bastante reduzida, o que pode ser explicado pelo
acasalamento de rainha com um único macho.
TAVARES et al. (1999), analisaram a freqüência de polimorfismos e o padrão
de herança de marcadores RAPD em machos haplóides de uma população de Melipona
quadrifasciata. Foram detectados 3 tipos de polimorfismos: presença/ausência da banda, intensidade da banda e comprimento do fragmento. Estes tipos de polimorfismos
ocorreram 96, 12 e 20 vezes, respectivamente. Todos estes marcadores segregaram na
proporção de 1:1 entre os machos haplóides filhos da mesma rainha, de acordo com a
expectativa Mendeliana. A maioria dos polimorfismos detectados foram como
presença/ausência do produto amplificado.
Seguindo seus estudos, TAVARES et al. (1999) utilizando marcadores RAPD, construíram um mapa de ligação genética para M. quadrifasciata com 77 primers. Os
marcadores que segregaram na proporção de 1:1 entre os machos haplóides, foram
analisados utilizando o programa Mapmarker. As análises revelaram 22 grupos de
ligação, variando em tamanho de 11 a 211 cM, e 39 marcadores não ligados. Estes 22
1.4. Objetivo e Justificativas
Este trabalho tem como objetivo analisar a divergência genética entre uma população de Melipona scutellaris isolada geograficamente há 12 anos (Uberlândia, Minas Gerais) de sua população original (Lençóis e Catu, Bahia) por meio de
marcadores RAPD.
Estudos da variabilidade genética de populações de abelhas podem fornecer
dados importantes para o estabelecimento de estratégias que visem a preservação das mesmas. Portanto, esse trabalho irá elucidar aspectos genéticos sobre a conseqüência da
instalação do Meliponário, bem como a variabilidade genética da população que foi introduzida há 12 anos em Uberlândia, em relação à população original da Bahia. E com vista nos poucos trabalhos moleculares existentes para Meliponíneos, torna-se necessário uma maior caracterização genética dessa fauna de tão grande importância
ambiental.
Uma das estratégias a ser usada na preservação da biodiversidade, é preservar grupos de organismos que são importantes para a manutenção da diversidade em outros
grupos. As abelhas, dada sua importância como polinizadoras, são sobremaneira
importantes para a manutenção da diversidade de plantas que, por sua vez, têm papel fundamental na manutenção de comunidades animais. No mais, 30% da alimentação
humana depende de plantas polinizadas por abelhas (ABSY etal., 1984).
Estas justificativas são de extrema importância, considerando que a enorme
biodiversidade dos Meliponíneos está sendo ameaçada pela acelerada devastação das
2.
MATERIAL E METObOS
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genética e no Laboratório de Genética Molecular do Departamento de Genética e Bioquímica (DEGEB) da
Universidade Federal de Uberlândia.
2.1.
Material
Biológico
Figura 1: Vista interna do ninho de Mehpona scutellaris
O material biológico utilizado nesse experimento foram abelhas indígenas sem
ferrão, da espécie Melipona scutellaris (Figura 1) conhecida como "uruçu do Nordeste" por se distribuir desde a Bahia até o Estado de Rio Grande do Norte.
O Meliponário Uberlândia foi criado com 14 colônias trazidas em março de
1987, da cidade de Lençóis-BA (região da Chapada Diamantina). Posteriormente, em
novembro de 1990, foram trazidas mais 8 colônias e a partir dessas 22 colônias originais
foram feitas diversas divisões, formando assim a população de Uberlândia. A escolha da
Chapada Diamantina deveu-se devido à sua altitude e temperaturas mais baixas, o que
facilitaria a adaptação das colônias ao clima de Uberlândia-MG (CARVALHO, 1996).
Na implantação do Meliponário Uberlândia, vários aspectos foram observados,
mas principalmente se as características climáticas e florísticas eram semelhantes à da região de origem. Também tomou-se cuidado quanto ao tipo de colméia (caixa) a ser adotada, bem como a localização das mesmas (distância entre as caixas, exposição à
chuva e ao sol e acesso de inimigos naturais).
Com a estrutura do meliponário já formada, foram sendo introduzidas mais colônias e rainhas de outras localidades, e também outras espécies. A primeira
introdução de rainhas ocorreu em maio de 1992, com 13 rainhas fisogástricas de Lençóis-BA. Em julho de 1993, foram introduzidas 3 rainhas fisogástricas de Catu-BA. Em maio de 1994, ocorreu a introdução de 11 rainhas de Lençóis-BA, as quais foram introduzidas em colônias recém-formadas. Em março de 1995, foram trazidas 3 colônias
resultantes de divisões feitas em Lençóis (CARVALHO, 1996). Todas as introduções
foram da espécie Melipona scutellaris.
Em novembro de 1995, foram trazidas 5 colônias de Melipona capixaba, provenientes da região de Domingo Martins-ES. Na época, havia no Meliponário
Uberlândia, 52 colônias de M. scutellaris, 3 de M. quadrifasciata, 2 de M. bicolor e algumas outras de Trigona spinipes, Tetragonisca angustula e Frieseomelitta varia
(NASCIMENTO, 1996).
A coleta das amostras provenientes do Meliponário Uberlândia, deu-se
diretamente do interior das colméias racionais. As abelhas foram colocadas em conjuntos de 5 indivíduos por frasco, o qual continha álcool comercial (99,5%) e, em
seguida, foram estocadas em freezer a -80°C até o momento da extração do DNA.
Tabela 1: Número, Origem e Posições Geográficas das amostras de Melipona scutellaris
BA39 Catu-BA S 12° 21'/ W 38° 23' MG: Minas Gerais; BA: Bahia; os números representam o número da colônia amostrada; S: latitude e W: longitude.
Amostra Origem da amostra Posição geográfica MG322 Meliponário Uberlândia - MG S 18° 55’/W 48° 17’ MG335 Meliponário Uberlândia - MG S 18°55’/W48° 17’ MG441 Meliponário Uberlândia - MG S 18°55’/ W48° 17’ MG445 Meliponário Uberlândia - MG S 18° 55’ / W48° 17’ MG480 Meliponário Uberlândia - MG S 18°55’/W48° 17’ MG519 Meliponário Uberlândia - MG S 18° 55’ / W48° 17’ MG533 Meliponário Uberlândia - MG S 18°55’/W48° 17’ BA32 Lençóis - BA S 12°33’/W41°23’ BA33 Lençóis - BA S 12° 33’/ W41°23’ BA34 Lençóis - BA S 12°33’/W41°23’ BA35 Lençóis - BA S 12° 33’/W 41° 23’ BA36 Lençóis - BA S 12° 33’/W 41° 23’ BA38 Catu - BA S 12° 21'/W 38° 23'
2.2. Análise
Molecular2.2.1. Extração
do
DNA
genômicoUm bulk de 5 indivíduos de uma mesma colônia foi usado na extração do DNA genômico, representando cada colônia amostrada, com a finalidade de assegurar a
representatividade genotípica da população do Meliponário Uberlândia.
Nos Meliponíneos há tendência à baixa variabilidade genética dentro de uma
colônia, devido ao seu sistema de cruzamento. Ao contrário das rainhas de Apis, que
chegam a cruzar-se com mais de 19 zangões, as rainhas dos Meliponíneos cruzam-se
apenas com um macho ou, ocasionalmente, com até 5 machos (PAXTON et al., 1999).
Este fato tende a diminuir a variabilidade genética dentro de uma mesma colônia,
cruzamento compartilham os mesmos alelos paternos. Para minimizar essa baixa representatividade genética das colônias amostradas e o aparecimento dos “falsos
positivos”, teve-se o cuidado de coletar operárias de uma mesma geração. KHANDKA et al. (1997) mostraram que o uso de material genético mais homogêneo na formação de pools de DNA, reduz a probabilidade de se obter fragmentos polimórficos falsos.
Inicialmente, os indivíduos de cada colônia amostrada foram re-hidratados em tampão de lavagem (TrisCl 0,01M, pH 8,0; NaCl O,1M e MgCl2 0,001M) em três
banhos sucessivos de 15 minutos e, em seguida, secos em papel de filtro.
Foram utilizados na extração apenas os tecidos do tórax. Foram retirados os apêndices e abdomem de cada indivíduo, com uma lâmina de bisturi estéril para evitar
possível contaminação com bactérias simbióticas (CAMPOS, 1997).
O protocolo utilizado para extração do DNA genômico foi o descrito por
PAXTON et al. (1996) com as seguintes modificações. Os tórax de 5 abelhas foram
macerados em cadinho, com nitrogênio líquido e transferidos para um microtubo (estéril) de 2 ml. Foi adicionado lml de tampão de extração SET (NaCl 0,15M, Tris-
HC1 0,02M, EDTA lmM, pH 8,0), 36pl de proteinase K (lOmg/ml) e 44 pl de SDS
25%. A suspensão foi incubada a 55°C por 2 horas, invertendo os tubos ocasionalmente.
Após a incubação, seguiu-se a precipitação dos ácidos nucleicos com a adição de 660pl
de NaCl 6M e 330pl de Tris-HCl 0,01M pH 8,0, misturando a solução em vórtex e
centrifugando-a por 10 minutos a 13.000 rpm. Em seguida, completou-se o volume final
de 2ml com etanol 100% gelado e a solução foi deixada a -20°C overnight. No dia
seguinte, os microtubos foram centrifugados por 30 minutos a 13.000 rpm. Lavou-se o
pellet de DNA que se encontrava aderido ao fundo do microtubo com etanol 70%, deixando-o secar em estufa por aproximadamente 1 hora. Ressuspendeu-se o pellet seco
em 200pl de tampão TE (Tris-HCl lOmM e EDTA lmM pH 8,0) e adicionou-se 2,5pl
RNAse (100 mg/ml) com a finalidade de degradar o RNA presente, incubando a
solução por 1 hora a 37°C. Logo após, inativou-se a RNAse com a elevação da
temperatura para 95°C, por 15 minutos. As amostras foram armazenadas em freezer a -
20°C.
2.2.2.
Quantificação
do
ÒNA genômico
O DNA de cada amostra foi quantificado por leitura de absorbância a 260nm
em espectrofotômetro Hitachi U-2000. Sua qualidade foi avaliada pela razão
ABS260/A280 nm e por eletroforese em gel de agarose 0,8%. Alíquotas de 1 Opl foram
diluídas 10 vezes em água ultrapura e submetidas à leitura em espectofotômetro. Após a
quantificação, as amostras foram aliquotadas: uma solução de trabalho à 5ng/pl e outra
solução estoque contendo o restante da extração, com concentração de
aproximadamente l.OOOng/pl. A solução estoque foi mantida a -80°C para melhor
manutenção da integridade do DNA, enquanto que a solução de trabalho foi mantida a
4°C.
2.2.3. Amplificação
com
primersaleatórios
As reações de RAPD foram realizadas segundo WILLIAMS et al. (1993) com algumas modificações para otimizar o melhor sinal de amplificação dos fragmentos.
Variou-se principalmente a concentração de DNA (5, 10, 12,5, 15,20 e 25ng) sendo que
com o restante dos reagentes, não houve variações nas concentrações inicialmente
usadas.
As condições previamente otimizadas apresentaram volume final de 15pl, com
os seguintes reagentes: 5ng de DNA genômico, 1,5 unidades da enzima Taq DNA
polimerase (GibcoBRL®), Tampão da Taq IX (GibcoBRL®), 100pM de cada dNTP
(Pharmacia Biotech), 2mM de MgCl2 (GibcoBRL®), lOpmoles de primer (OPERON
Technologies INC.), l,4pl de BSA (Bovine Serum Albumin) e o volume completado
com água ultrapura. Cada reação foi coberta com lOptl de óleo mineral para evitar
evaporação dos reagentes.
Cada batería de reações continha um controle negativo, com todos os
componentes da reação, exceto o DNA. Esse procedimento foi adotado para confirmar
se os produtos amplificados nas reações representavam DNA genômico amplificado, ou
As reações foram amplificadas em termociclador PCR Express-Hybaid. Os
passos consistiram de 2 ciclos iniciais de 94°C/lmin., 35°C/lmin. e 72°C/2min., seguidos por 40 ciclos de 92°C/lmin., 35°C/lmin. e 72°C/2min., com um passo final de
72°C/5min. e 4°C/24h. (WILLIAMS et al. 1990; HUNT & PAGE, 1992a).
Os primers decâmeros (10 bases) aleatórios foram adquiridos da OPERON
Technologies INC., EUA. Cada primer foi testado de 2 a 3 vezes para garantir a
repetibilidade das bandas a serem analisadas.
Tabela 2: Lista dos primers utilizados para amplificar o DNA das 14 amostras de Melipona scutellaris e suas respectivas seqüências de nucleotídeos.
Primer Seqüência OPA 20 5’GTTGCGATCC3’ OPC 07 5’GTCCCGACGA3’ OPC 11 5’AAAGCTGCGG3’ OPC 15 5’GACGGATCAG3’ OPC 16 5’CACACTCCAG3’ OPF02 5’GAGGATCCCT3’ OPF03 5’CCTGATCACC3’ OPF16 5’GGAGTACTGG3’ OPG 04 5’AGCGTGTCTG3’ OPG 08 5’TCACGTCCAC3’ OPG09 5’CTGACGTCAC3’ OPG10 5’AGGGCCGTCT3’ OPG14 5’GGATGAGACC3’ OPI01 5’ACCTGGACAC3’ OPI 02 5’GGAGGAGAGG3’ OPI03 5’CAGAAGCCCA3’ OPM 07 5’CCGTGACTCA3’ OPM 09 5’GTCTTGCGGA3’ OPM 12 5’GGGACGTTGG3’ OPM 14 5AGGGTCGTTC3’ OPM 15 5’GACCTACCAC3’ OPM 18 5’CACCATCCGT3’ OPO 02 5’ACGTAGCGTC3’ OPO 06 5’CCACGGGAGG3’ OPV07 5’GAAGCCAGCC3’ OPV10 5’GGACCTGCTG3’ OPV15 5’CAGTGCCGGT3’ OPV18 5’TGGTGGCGTT3’ OPZ 07 5’CCAGGAGGAC3’ OPZ11 5’CTCAGTCGCA3’ OPZ15 5’CAGGGCTTTC3’ OPZ18 5’AGGGTCTGTG3’ 31
2.2.4.
Separação
e Visualização dos produtos amplificadosOs fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose 1,2% a 150V
por 2 horas, nas dimensões de 20cm x 24,5cm x 0,6cm, em tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X, conforme SAMBROOK et al. (1989). O corante usado foi brometo de
etídio na concentração final de 0,5pg/ml de gel. A cada amostra de amplificação de
15yl foi adicionado 3pl de tampão de carregamento (azul de bromofenol 3,61M, xileno
cianol 4,64M, sacarose 1,17M e EDTA O,1M, pH8,0).
Os géis foram visualizados em transluminador UV e fotografados em VDS
Image System-Pharmacia, usando filtro laranja, com tempos de exposição variando entre 2,17 a 2,86 seg., contraste entre 6 e 8 e fator de correção da câmara 0,45.
2.2.5.
Análise dos
dados
Uma matriz binária foi montada com dados referentes a presença (1) e ausência
(0) de bandas, utilizando sempre aquelas mais intensas e definidas, que apresentaram
boa repetibilidade. A matriz gerada foi analisada pelo programa STATISTICA 4.5 A (1993) para o cálculo das distâncias genéticas e análise de cluster. As distâncias
genéticas foram calculadas pelo método de porcentagem de desacordo:
N’
ab
/N
t
(PUTERKAe/a/.1993: apud CABRAL, 1997)onde, N’ab é o número total de bandas polimórficas entre os genótipos comparados e
NT é o número total de bandas. A análise de cluster foi feita pelo método não-
ponderado de agrupamento aos pares, utilizando médias aritméticas (UPGMA -
umveighted pair-group method using arithmetic averages), o qual agrupa inicialmente indivíduos mais similares e assim sucessivamente, até os indivíduos mais distantes.
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com a finalidade de facilitar a descrição dos resultados, os genótipos das populações de Melipona scutellaris foram discriminados pelo Estado de origem e número da colônia amostrada.
3.1.
Otimizaçãodas reações utilizadas
A concentração de DNA que apresentou o melhor resultado na repetibilidade
do padrão de amplificação foi com 5ng de DNA para um volume final de lSjil por
reação. O excesso de DNA na reação inibiu a amplificação de alguns fragmentos. Tem sido demonstrado, que essa inibição ocorre principalmente pela competição dos primers
, , j. cítin<j de anelamento (SAIKI et al. 1988; MEUNIER & por um grande numero de sítios ae aneiduicniw
GRIMONT, 1993; WILKIEe/tz/. 1993; KHANDKA etal. 1997).
Existe uma ««relação na proporção DNAenzima apropriada para garantir um bom padrão de amplificação. KHANDKA el al. (1997) testaram o efeito das diversas concentrações de DNA e enzima Taq DNA polimerase. O número de produtos
amplificados avaliados para diversas concentrações de DNA e enzima mostraram que a alta proporção de enzima em relação ao DNA amplifica mais fragmentos, enquanto que altas proporções de DNA em relação á enzima reduz o número de fragmentos
amplificados.
Durante a otimização, para melhorar a qualidade e uniformidade das
amplificações, foi adicionado BSA (lOmg/mi). O BSA é comumente utilizado como um estabilizador das atividades enzimáticas, contra a desnaturação durante o armazenamento, em diluição ou reações enzimáticas in vilro, tais como clivagens de
DNA síntese de cDNA ou ligações. O BSA, no ensaio RAPD, estabiliza a atividade da Taq DNA polimerase, protegendo-a de impurezas agregadas ao DNA genômico, bem como de ions presentes na parede de alguns tipos de plásticos utilizados na fabricação dos microtubos usados no laboratório (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1996). A adição do BSA resultou em amplificações mais intensas, facilitando a leitura dos perfis
RAPD.
3.2.
Análise dos padrõesde amplificação com
primersaleatórios
Foram selecionados 32 primers para a análise da diversidade genética entre os genótipos de M. scutellaris. Estes apresentaram alta repetibilidade nos padrões de amplificação. Apenas as bandas mais intensas e bem definidas foram consideradas na análise da matriz das distâncias genéticas, para evitar erros advindos da consideração incorreta dos produtos amplificados. Foram desconsiderados 6 primers por apresentarem um padrão de bandas muito compacto ou por não apresentarem
repetibilidade para as condições estabelecidas nas reações.
Dos 32 primers selecionados, 21 geraram padrão de bandas monomórficas e 11 geraram polimorfismos. As amplificações resultaram em 136 posições de bandas amplificadas, com tamanhos variando entre 300 e 2600 pb. O número de posições de
bandas polimórficas detectadas variaram em média de 1 a 3. Os 11 primers polimórfícos, apresentaram em média 1,7 posições de bandas, representando 16,2% do
Tabela 3: Relação do número de posições de bandas monomórfícas e polimórfícas por primer selecionado para amplificação do genoma de Melipona scutellaris.
Primers OPA 20 OPC 07 OPC 11 OPC 15 OPC 16 OPF02 OPF03 OPF 16 OPG 04 OPG 08 OPG 09 OPG 10 OPG 14 OPI01 OPI 02 OPI03 OPM07 OPM 09 OPM 12 OPM 14 OPM 15 OPM 18 OPO 02 OPO06 OPV 07 OPV 10 OPV 15 OPV 18 OPZ07 OPZ11 OPZ15 QPZ 18 Posiçõesde bandas monomórfícas Posições debandas polimórfícas 04 00 04 00 04 00 02 00 04 02 04 01 04 03 02 02 02 00 03 00 03 00 05 00 06 00 01 00 05 00 06 01 03 01 01 00 05 00 03 00 03 01 03 00 04 02 05 00 05 00 05 00 09 00 03 00 00 03 02 02 03 01 04 00 TOTAL 117 19(16.2%)
A matriz das distâncias genéticas (Tabela 4) entre os genótipos foi construída com base na presença e ausência de bandas e analisada pelo método de Porcentagem de Desacordo. A dissimilaridade genética máxima entre as 2 populações de M. scutellaris
foi de 6,7 %. Os dados da matriz foram utilizados para a análise de clusler e o
Tabela 4: Matriz das distâncias genéticas expressa em Porcentagem de Desacordo, obtida para os 14 genótipos de Melipona scutellaris por meio de 136 posições de bandas
RAPD. Variáveis MG MG MG MG MG MG MG BA BA BA BA BA BA BA 322 335 441 445 480 519 533 32 33 34 35 36 38 39 MG322 MG335 MG441 MG445 MG480 MG519 MG533 BA32 BA33 BA34 BA35 BA36 BA38 BA39 .00 .04 .00 .04 .02 .00 .04 .04 .02 .00 .05 .03 .02 .01 .00 .06 .05 .03 .04 .04 .00 .04 .04 .03 .05 .05 .03 .00 .07 .08 .06 .05 .07 .06 .07 .06 .05 .04 .04 .05 .04 .04 .07 .07 .06 .05 .05 .04 .06 .04 .07 .04 .02 .04 .04 .06 .03 .05 .04 .04 .05 .06 .04 .08 .10 .09 .09 .10 .09 .09 .07 .08 .07 .05 .07 .06 .07
Os maiores valores de distâncias genéticas encontradas foram entre o genótipo BA38 e todos os genótipos de Minas Gerais, e ainda com os genótipos BA32, BA34 e BA35 com dissimilaridade genética média de 0,09. O genótipo BA32 em relação à
MG335 apresentou 0,08 de dissimilaridade genética (Tabela 4).
Os menores valores, por sua vez, estão entre MG441 e MG335 com 0,02, MG441 e MG445 e MG480 com 0,02; BA35 e MG445 com 0,02 e MG480 e MG445
se, em sua maioria, entre as colônias de Minas Gerais. Na amostragem das colônias do Meliponário Uberlândia, teve-se o cuidado de não incluir entre as amostras, colônias mães e filhas. Contudo, não foi possível determinar se os machos de uma mesma colônia fecundaram mais de uma rainha das colônias analisadas Além disso, o alto nivel de endogamia na população de Uberlândia deve ser considerada, sendo que, quanto maior o índice de endocruzamentos em uma população, menor sua variabilidade
genética.
A diminuição da divergência genética dos alelos sexuais xo na população de Uberlândia tem sido também detectada pela sua contagem na população desde 1991
(CARVALHO, 1996).
Figura 2: Dendrograma representativo das distâncias genéticas por porcentagem de desacordo e agrupamento pelo método de UPGMA, entre os 14 genótipos de Mdipona scutellaris, por meio de 136 posições de bandas produzidas por 32primers RAPD.
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